Summary
Este trabalho apresenta um método reprodutível com novos achados sobre a presença de células epiteliais em sangue e medula óssea normais de humanos e camundongos usando citometria de fluxo e microscopia de imunofluorescência. Camundongos transgênicos Krt1-14;mTmG foram usados como método in vivo para confirmar esses achados.
Abstract
Células epiteliais foram identificadas no sangue e na medula óssea de pacientes com câncer e outras doenças. No entanto, a presença de células epiteliais normais no sangue e na medula óssea de indivíduos saudáveis ainda não foi identificada de forma consistente. Apresentamos aqui um método reprodutível para isolar células epiteliais de sangue humano e murino saudável e medula óssea (MB) usando citometria de fluxo e microscopia de imunofluorescência (IF). Células epiteliais em indivíduos saudáveis foram primeiramente identificadas e isoladas por citometria de fluxo utilizando molécula de adesão celular epitelial (EpCAM). Essas células EpCAM+ foram confirmadas para expressar queratina usando microscopia de imunofluorescência em camundongos transgênicos Krt1-14;mTmG. Amostras de sangue humano apresentaram 0,18% ± 0,0004 células EpCAM+ (MEV; n=7 réplicas biológicas, 4 repetições experimentais). Em MB humana, 3,53% ± 0,006 (MEV; n=3 réplicas biológicas, 4 réplicas experimentais) de células mononucleares foram EpCAM+. No sangue de camundongos, as células EpCAM+ constituíram 0,45% ± 0,0006 (MEV; n=2 réplicas biológicas, 4 réplicas experimentais), e em camundongos BM, 5,17% ± 0,001 (MEV; n=3 réplicas biológicas, 4 repetições experimentais) foram EpCAM+. Em camundongos, todas as células EpCAM+ foram imunorreativas à pancitoqueratina, conforme determinado por microscopia IF. Os resultados foram confirmados usando camundongos transgênicos Krt1-14;mTmG, com baixo (8,6 células GFP+ nativas por 10a 6 células analisadas; 0,085% de células viáveis), mas números significativos (p < 0,0005) de células GFP+ presentes em BM murina normal, que não foram o resultado da aleatoriedade em comparação com múltiplos controles negativos. Além disso, as células EpCAM+ no sangue de camundongos foram mais heterogêneas do que as células CD45+ (0,58% no BM; 0,13% no sangue). Estas observações concluem que as células que expressam proteínas citoqueratinas são reprodutíveis entre células mononucleares do sangue humano e murino e BM. Demonstramos um método de coleta de tecidos, citometria de fluxo e imunomarcação que pode ser usado para identificar e determinar a função dessas células epiteliais de pan-citoqueratina em indivíduos saudáveis.
Introduction
As células epiteliais encontram-se nas barreiras físicas entre nosso corpo e o ambiente e são capazes de reconhecer e responder às mudanças em seu microambiente1. Eles têm um nicho de células-tronco em proliferação que fornece uma maneira de transformar novos tecidos e reparar danos2. Nosso laboratório estuda células-tronco nos folículos pilosos da pele; A pele é um bom modelo para estudar o tecido epitelial e a proliferação de células-tronco, pois é facilmente visível e há um turnover constante de células. Os cânceres epiteliais são a forma mais comum de câncer, possivelmente devido aos tecidos epiteliais, como a pele, sendo a primeira linha de defesa contra carcinógenos ambientais, levando a altas taxas de turnover e proliferação de células epiteliais3. A maior parte da epiderme da pele, camada protetora superior, é composta por queratinócitos, que expressam diferentes tipos de queratinas para fornecer suporte eestrutura4. Pacientes com câncer epitelial geralmente têm células epiteliais presentes no sangue e na medula óssea que também expressam queratinas. A biópsia líquida é uma forma não invasiva de detectar e monitorar essas células epiteliais em diferentes fluidoscorporais5. As células epiteliais circulantes, também chamadas de células tumorais circulantes (CTCs), são encontradas no sangue periférico e podem ser biomarcadores para o prognóstico do câncer, além de orientar tratamentos terapêuticos individualizados. As CTCs também podem indicar a progressão da doença, a eficácia do tratamento e a sobrevida global do paciente 5,6.
A molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM) é um marcador clinicamente utilizado para CTCs e pode identificar tumores de origem epitelial em pacientes com câncer. A EpCAM desempenha um papel na adesão, migração, sinalização, proliferação e diferenciação celular6. Para que uma célula epitelial circulante seja classificada como CTC, ela deve ser positiva para citoqueratinas 8, 18 e 19 e negativa para CD45, um marcador leucocitário comum6. As CTCs são geralmente identificadas pela primeira depleção de CD45 com microesferas magnéticas, seguida pela pesquisa de EpCAM e citoqueratina 19 usando microscopia de imunofluorescência7. A principal limitação na detecção de CTCs é sua raridade; Constituem menos de 0,01% de todas as células do sangue, e pouquíssimas sobrevivem na circulação para atingir órgãosdistantes 8,9,10. Deve-se levar em consideração no planejamento de experimentos e técnicas para isolar e identificar essas células devido à sua natureza rara. Atualmente, há apenas um classificador automatizado de célula única aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) usado para identificar CTCs, e ele usa EpCAM como seu biomarcador. Outros métodos incluem separação de esferas magnéticas e citometria de fluxo, ou uma combinação desses métodos. Há necessidade de novas técnicas que apresentem maior sensibilidade e especificidade para a detecção de CTCsraras11.
A citometria de fluxo é um método preferido para a detecção de populações celulares raras no sangue, medula óssea e outras amostras de tecido. Essas células raras podem incluir células-tronco, células endoteliais circulantes, CTCs e células residuais de doenças. A citometria de fluxo permite medidas quantitativas de cada tipo celular e classifica essas células para testesposteriores 7,9. Contagens incrementais foram realizadas para garantir uma avaliação precisa dessas células raras. A capacidade de usar o gating para excluir células de análises adicionais é uma maneira de aumentar a especificidade ao analisar células. As limitações da citometria de fluxo são o tempo necessário para a análise de grandes amostras e a falta de confirmação visual da identidade celular. Para superar isso, microscopia de imunofluorescência foi realizada nas células selecionadas para confirmar suas identidades.
Anteriormente, nosso laboratório demonstrou que em camundongos as células da medula óssea são recrutadas e contribuem para tumorescutâneos12. Essas células derivadas da medula óssea são positivas para pancitoqueratina e citoqueratina epidérmica. Para elucidar melhor o papel das células-tronco epiteliais, das células derivadas da medula óssea e das células que expressam citoqueratina na progressão tumoral, foram procuradas células positivas para citoqueratina EpCAM+ em amostras normais de sangue murino e humano e de medula óssea. Como na maioria dos experimentos, este método foi desenvolvido através de múltiplas iterações. Anteriormente, camundongos transgênicos foram usados juntamente com contagens incrementais para procurar células que expressam K14GFP na medula óssea12. À medida que mais células foram contadas, uma população representativa de células raras pôde ser identificada, como mostra a Figura 1 na seção de resultados representativos. A justificativa para a investigação de células epiteliais em sangue e medula óssea normais foi baseada na literatura inicial sobre CTCs, onde doadores normais saudáveis tinham níveis de fundo de células EpCAM+13. Como mencionado anteriormente, a caracterização da EpCAM geralmente começa com a depleção de CD45. Essa etapa foi omitida porque algumas células hematopoéticas apresentam expressão de EpCAM e citoqueratina por razões desconhecidas que precisam ser mais bem investigadas. Portanto, as células foram selecionadas com base na presença ou ausência de EpCAM, independentemente da linhagem celular, e então imunomarcadas para citoqueratina. O protocolo abaixo e o fluxo de trabalho mostrado na Figura 2 descrevem uma técnica que utiliza citometria de fluxo com compensação e controles, métodos estatísticos e imagens de imunofluorescência para isolar e identificar essas raras populações de células epiteliais.
Protocol
Todos os protocolos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Minnesota de acordo com as diretrizes do NIH e federais. Sangue humano fresco e medula óssea foram adquiridos de fontes comerciais. As amostras foram coletadas pela empresa sob um protocolo aprovado do IRB de doadores negativos para HIV, Hepatite B, Hepatite C e rastreadas para COVID-19. Todas as amostras foram primeiramente desidentificadas e anonimizadas antes de serem enviadas pela empresa. Uma vez que estes foram obtidos comercialmente, nenhuma aprovação do IRB foi necessária.
1. Preparação das soluções
NOTA: Todas as soluções devem ser preparadas em uma capela biológica com um ambiente estéril. Obter certificação de nível de biossegurança 2 (BSL2) para trabalhos com sangue humano e medula óssea.
- Preparar a solução de colheita de medula óssea adicionando 1 mL de gentamicina e 5 mL de soro fetal bovino (FBS) a 500 mL de solução de sal de equilíbrio de Hank (HBSS).
- Preparar a solução tampão de coloração adicionando 50 mL de FBS a 500 mL de HBSS.
- Preparar 1x tampão de lise combinando 10 mL de tampão de lise 10x com 90 mL de água estéril.
2. Preparação do capô
- Ligue o capô e deixe-o funcionar por alguns minutos para obter o fluxo de ar adequado.
- Coletar todos os materiais para realizar a colheita da medula óssea. Borrife-os dentro da coifa com etanol 70% para manter um ambiente estéril. Borrife as mãos todas as vezes antes de serem levadas para dentro do capuz.
- Coloque a bandeja autoclavada no capô junto com uma tesoura autoclavada, um bisturi montado, pinças e pinças curvas em um pequeno copo cheio de etanol 70% para mantê-los estéreis.
- Adicionar 10 ml de solução de colheita de medula óssea a um tubo de centrífuga de 50 ml e rotulá-lo como "Membros". Rotular outro tubo centrífugo de 50 mL como "Medula óssea".
- Retirar 10 ml de solução de colheita de medula óssea para uma seringa e, em seguida, colocar uma agulha de 26 G.
3. Colheita de medula óssea de camundongos
- Eutanásia do camundongo por asfixia por CO2 . A morte é confirmada pela ausência de batimentos cardíacos e beliscões nos pés para garantir que não haja reação. A luxação cervical pode ser realizada como meio secundário de eutanásia completa.
- Coloque o rato num recipiente de 500 ml e adicione iodo suficiente para cobrir metade do rato. Agite suavemente e gire o recipiente para garantir uma cobertura completa. Enxágue com água deionizada. Realizar mais uma lavagem de iodo e, em seguida, duas lavagens com etanol 70% seguindo os mesmos passos.
- Coloque o mouse no capô e coloque-o de costas na bandeja. Pegue as patas traseiras e separe-as até que um estalo seja sentido; Isso é para separar as pernas da coluna.
- Faça uma incisão de 1 cm na pele do rato perto da área da virilha. Insira uma tesoura fechada na incisão e, em seguida, abra a tesoura sob a pele para separá-la do peritônio.
- Corte a pele da perna ao redor da coxa e, em seguida, corte a pele para baixo da perna para expor os músculos e ossos.
- Retire as patas traseiras cortando ao redor da articulação do quadril, certificando-se de não cortar o fêmur. Coloque os membros no tubo rotulado como "Membros" Quando ambas as pernas forem removidas, coloque o rato em um saco de carcaça e coloque-o no congelador.
OBS: O osso do quadril deve ser sentido primeiro antes do corte para guiar a tesoura e evitar cortar o osso do fêmur, pois a maior parte da medula óssea é obtida do fêmur. - Comece a cortar os músculos, tecidos e gordura ao longo de um dos membros usando a tesoura. Corte paralelo ao osso. Em seguida, use o bisturi e remova a gordura ou músculo restante, usando um movimento de raspagem perpendicular contra o osso.
- Uma vez que o osso é limpo corretamente, separe o fêmur e a tíbia no joelho. Use o bisturi para fazer cortes em ambas as extremidades do fêmur e tíbia onde não há medula óssea visível.
- Insira a seringa preparada e a agulha no osso. Se houver resistência, corte um pouco mais a extremidade do osso até que não haja mais resistência.
- Ao segurar o osso acima do tubo rotulado como "Medula óssea", expulse a solução de coleta de medula óssea através do osso para liberar a medula óssea no tubo. Repita na outra extremidade do osso para obter o resto da medula óssea, até que o osso apareça todo branco ou vazio.
- Repita os passos 7-9 para todos os ossos e membros restantes; Toda a medula será lavada no mesmo tubo cônico.
- Usando uma seringa vazia de 10 mL e uma agulha de 20 G, quebre os aglomerados de medula óssea no tubo puxando a medula óssea para cima e para baixo na seringa 5-10 vezes.
- Adicionar um filtro estéril de 40 μm a um tubo de centrífuga limpo de 50 ml e enxaguar-o com 1 ml de solução de colheita de medula óssea. Em seguida, filtre a medula óssea para remover quaisquer aglomerados restantes. Rotule este tubo como "Medula óssea filtrada".
- Guarde a medula óssea filtrada na geladeira ou no gelo até o uso. Deve ser utilizado no mesmo dia da colheita. Se não for usado no mesmo dia, congele as células usando um crioconservante, como o dimetilsulfóxido (DMSO).
CUIDADO: Todos os resíduos desses experimentos devem ser descartados adequadamente em um recipiente de resíduos de risco biológico. Todos os materiais perfurocortantes devem ir em um recipiente de material perfurocortante de risco biológico devidamente rotulado.
4. Lise de hemácias da medula óssea
- Centrifugar as células da medula óssea a 170 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Aspirar e eliminar o sobrenadante. Ressuspender as células em 10 mL de tampão de lise 1x hemácias e incubar por 4 min.
- Adicionar 30 ml de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco para interromper a reação do tampão de lise. Centrifugar as células durante 8 min a 170 x g à temperatura ambiente. Aspirar e eliminar o sobrenadante. Ressuspender em 10-20 mL de tampão corante.
5. Contagem de células
- Combinar 500 μl de células com 9,5 ml de solução de colheita de medula óssea para obter uma diluição de 1:20.
NOTA: Este será usado para contagens de células e não precisa ser mantido estéril. - Retire 200 μL de células da diluição 1:20, adicione-as a 200 μL de azul de tripano e misture bem.
- Adicione a mistura a um hemocitômetro e conte as células vivas e mortas de ambos os lados. Calcule a suspensão da célula original usando esta tabela (mostrada no Arquivo Suplementar 1) e equações:
Células por mililitro:
Células totais:
- Girar as células a 170 x g por 10 min a 4 °C e ressuspender para uma concentração de 10 x 10 6 por 1 mL (1 x 106 células por 100 μL), com base nas sugestões do fabricante para diluições de anticorpos.
- Prossiga para a citometria de fluxo (passo 8).
6. Colheita de sangue de ratinhos
- Eutanásia do camundongo usando gás CO2 ou luxação cervical.
- Realizar uma colheita de sangue cardíaco num ângulo de 45° com uma agulha de 26 G ligada a uma seringa de 1 ml revestida com ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 M.
- Gire o sangue e ressuspenda em meio ou tampão de coloração.
NOTA: As células serão giradas para baixo e ressuspensas até a concentração final em tampão de coloração após lise de hemácias e contagem celular. - Realizar a lise das hemácias (passo 4).
- Execute a contagem de células (etapa 5).
- Prossiga para a citometria de fluxo (passo 8).
7. Processamento de amostras de sangue humano e de medula óssea
- Execute todos os procedimentos sob um capuz com certificação BSL2 enquanto estiver usando equipamentos de proteção individual.
- Coletar as amostras na noite anterior e realizar lise de hemácias. Certifique-se de que as amostras sejam desidentificadas e anonimizadas antes de enviar as amostras mononucleares durante a noite no gelo.
- À chegada, gire as células vivas a 170 x g a 4 °C durante 10 minutos.
NOTA: Estes são exemplos BSL2 que devem seguir as diretrizes locais. - Ressuspenda as células na mídia ou no buffer de coloração.
NOTA: As células devem ser giradas para baixo e ressuspensas até a concentração final após a contagem celular com tampão de coloração. - Execute a contagem de células (etapa 5).
- Prossiga para a citometria de fluxo (passo 8).
8. Citometria de fluxo
- Mancha
- Divida as células em tubos marcados individualmente com base no painel de coloração usado, incluindo controles de compensação (sem manchas, controles de isotipos, corados simples e fluorescência menos uns [FMOs]). Congele todas as células restantes ou use-as para a classificação de células ativadas por fluorescência. Veja a Tabela 1 para um exemplo de um painel de coloração com as diluições de anticorpos utilizadas.
NOTA: Para cada fluoróforo adicional adicionado, os FMOs em combinação com os fluoróforos restantes devem ser adicionados juntamente com uma única coloração desse fluoróforo. Controles isotípicos podem ser usados para bloquear colorações não específicas. Cada novo anticorpo utilizado deve ser titulado com as amostras para uma diluição óptima. - Adicione anticorpos de acordo com as diluições recomendadas pelo fabricante e misture bem mexendo no fundo dos tubos. As concentrações de anticorpos são geralmente administradas como 1 x 106 células por 100 μL. As diluições com anticorpos e controles são mostradas na Tabela 1. Os anticorpos são conjugados com fluoróforos e devem ser protegidos da luz.
NOTA: É melhor usar EpCAM conjugado à ficoeritrina (PE) para permitir a visualização de baixas populações de células (titular em 3-5 μL por 1 milhão de células, conforme indicado na Tabela 1). PE-CD49f foi usado como um único controle de PE (20 μL por 1 milhão de células), uma vez que essas células são mais prevalentes do que PE-EpCAM e, portanto, mais fáceis de usar para compensação. - Incubar durante 30 min a 4 °C no escuro.
- Após a incubação, trazer os tubos de volta para a coifa BSL2 e adicionar 1 mL de tampão de coloração a cada tubo.
- Em seguida, centrifugar os tubos a 170 x g a 4 °C por 5-10 min.
- Após a centrifugação, traga os tubos tampados com as células de volta para o capô BSL2 e aspirar o sobrenadante. Certifique-se de trocar as pontas da pipeta de aspiração entre cada tubo para evitar contaminação cruzada.
- Ressuspenda o pellet de células em 1 mL de tampão de coloração e agite o fundo dos tubos para misturar.
- Lave as células mais duas vezes repetindo os passos 8.1.4-8.1.7.
NOTA: Não use pipetas para ressuspender, para evitar a perda de células. - Ressuspender em 500 μL de tampão corante para a ressuspensão final antes da citometria de fluxo. Adicionar 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ou discriminador de células mortas, de acordo com as recomendações do fabricante.
- Divida as células em tubos marcados individualmente com base no painel de coloração usado, incluindo controles de compensação (sem manchas, controles de isotipos, corados simples e fluorescência menos uns [FMOs]). Congele todas as células restantes ou use-as para a classificação de células ativadas por fluorescência. Veja a Tabela 1 para um exemplo de um painel de coloração com as diluições de anticorpos utilizadas.
- Citômetro de fluxo
- Depois de configurar a máquina, use os controles e FMOs para definir a compensação e os portões. Use a solução salina balanceada de Hank (HBSS) como fluido de bainha para ajudar a apoiar as células frágeis. Use o PBS se o HBSS não estiver disponível.
NOTA: O citômetro de fluxo usado e o software estão listados na Tabela de Materiais. - Carregue as amostras uma de cada vez e colete pontos de dados para 50.000, 100.000, 500.000 e um milhão de eventos. Mantenha os tubos no gelo ou refrigerados até o uso.
NOTA: Um limite de tempo pode ser definido durante a coleta para garantir a viabilidade da amostra. - Coletar as células em 3 mL de RPMI com FBS a 10% em tubos de centrífuga de 15 mL.
- Se estiver realizando imunofluorescência em células EpCAM+, use o citômetro de fluxo para classificar 800 a 1.000 células em cada poço de uma lâmina de 8 poços.
- Classifique a população de células EpCAM em lâminas separadas como um controle negativo a ser usado na coloração para imunofluorescência.
NOTA: As células também podem ser classificadas em tubos de 15 mL contendo FBS e giradas em uma lâmina usando a citocentrífuga ou uma pipeta para evitar que as células estourem. - Fixar as lâminas numa mistura de 50% metanol/50% acetona a -20 °C durante 10 min. Conservar as lâminas a -20 °C até coloração por imunofluorescência.
- Depois de configurar a máquina, use os controles e FMOs para definir a compensação e os portões. Use a solução salina balanceada de Hank (HBSS) como fluido de bainha para ajudar a apoiar as células frágeis. Use o PBS se o HBSS não estiver disponível.
- Análise por citometria de fluxo
- Abra o software de análise de citometria de fluxo licenciado.
- Arquivos padrão de citometria de fluxo de carga (FCS) adquiridos do citômetro de fluxo com controles e amostras.
- Clique em Criar grupo e use palavras-chave para colocar exemplos e controles em um grupo .
NOTA: Use o controle "sem mancha" para gate no software de análise de citometria de fluxo, conforme mostrado na Figura 3. - Clique duas vezes na amostra de controle sem manchas para abrir um gráfico unguiado.
- Defina o eixo y do gráfico como SSC-A e o eixo x como FSC-A (área de dispersão lateral por área de dispersão direta), o que indica o tamanho da célula e a complexidade interna.
- Clique na forma de polígono no painel superior esquerdo e crie um portão ao redor das células. Certifique-se de excluir as células na periferia, pois estas são provavelmente detritos. Rotule essa porta como "Células", conforme mostrado na Figura 3A.
- Depois que as células estiverem fechadas, clique duas vezes dentro da forma de polígono para abrir outro gráfico em uma nova janela.
- Defina o eixo y do novo gráfico como SSC-A e o eixo x como SSC-W para discriminação dupla. Clique na forma de polígono e crie um retângulo ao redor das células únicas. Rotule isso como "Células únicas", conforme mostrado na Figura 3B.
- Depois que as células estiverem fechadas, clique duas vezes dentro da forma de polígono para abrir outro gráfico em uma nova janela.
- Defina o eixo y como FSC-A e o eixo x como DAPI-A (ou qualquer discriminador de célula morta usado).
- Crie uma porta de polígono ao redor das células negativas DAPI no lado esquerdo do gráfico. Rotule essas "células vivas", como mostra a Figura 3C.
- Depois que as células estiverem fechadas, clique duas vezes dentro da forma de polígono para abrir outro gráfico em uma nova janela.
- Defina o eixo y como SSC-A e o eixo x como EpCAM-PE (ou qualquer fluoróforo usado para identificar as células EpCAM). As células à esquerda são negativas para EpCAM. Se alguma célula for mostrada à direita, ela será EpCAM positiva.
- Use o gráfico EpCAM-PE para criar uma porta de polígono, que exclui as células à esquerda e inclui apenas o espaço vazio à direita. Rotule a área vazia à direita dentro do polígono "EpCAM", como mostra a Figura 3D.
Observação : este é um controle sem mancha, portanto, não deve haver expressão EpCAM. Use o controle sem mancha para determinar quais células são positivas para EpCAM. Isso completa a estratégia de gating para compensação, de modo que todos os gráficos podem ser fechados neste momento. - Na página do espaço de trabalho, realce a linhagem sem manchas com "Células", "Células únicas", "Células vivas" e "EpCAM". Clique com o botão direito do mouse e selecione copiar análise para agrupar. Isso copia a estratégia de gating para todas as outras amostras carregadas dentro do grupo criado anteriormente. Se um grupo não foi criado inicialmente, ele pode ser criado agora selecionando Criar grupo no canto superior esquerdo.
- Passe pelas amostras dentro do grupo e verifique as portas do polígono desenhadas anteriormente para se certificar de que elas se encaixam com todas as amostras e controles. Isso fornece o número percentual e o número de células.
- Clique no botão L do editor de layout no canto superior esquerdo acima de "Área de trabalho". Esses gráficos podem então ser organizados e exportados usando o editor de layout.
- Preparo de reagentes de imunofluorescência
- Preparar o diluente de anticorpos combinando 1 g de albumina de soro bovino (BSA), 2 g de leite desnatado, 10 mL de solução salina tamponada com tris, 100 μL de Tween e 90 mL de água destilada.
- Preparar TBST combinando 50 mL de 20x TBS, 950 mL de água destilada e 200 μL de Tween.
- Preparar 10% de soro normal de cavalo (NHS) combinando 1 mL de NHS com 9 mL de diluente de anticorpos (passo 8.4.1).
- Preparar 1% NHS combinando 1 mL de 10% NHS com 9 mL de TBST.
- Coloração por imunofluorescência
- Retire as lâminas de -20 °C e deixe-as aquecer até à temperatura ambiente.
- Lave as lâminas três vezes em água destilada por 5 min cada.
- Bloquear as lâminas durante 1 h à temperatura ambiente em SNS a 10% em diluente de anticorpos (passo 8.4.3).
- Diluir o anticorpo primário (pan-citoqueratina) para 1:750 em SNF a 1% no TBST (passo 8.4.4). Incubar lâminas no anticorpo primário diluído durante a noite a 4 °C.
- No dia seguinte, lave as lâminas três vezes com um tampão de lavagem de 1x (PBS ou TBST) por 5 min cada.
- Diluir o anticorpo secundário para 1:1.000 em 1% de SNF no TBST (passo 8.4.4). Incubar as lâminas no anticorpo secundário diluído durante 1h à temperatura ambiente.
- Lave as lâminas três vezes com 1x tampão de lavagem por 5 min cada. Monte e cubra as corrediças com mídia de montagem rígida com DAPI. Use um cotonete para estender suavemente quaisquer bolhas sob a tampa.
Representative Results
Usando esses métodos, populações raras de células epiteliais no sangue e na medula óssea de humanos normais e camundongos foram visualizadas. Com as devidas compensações e controles conforme descrito, os resultados consistentemente que mostraram 4%-5% de células na medula óssea murina foram EpCAM+, independentemente de quantas células foram contadas, como mostrado na Figura 4 e Figura 5. Nas amostras de sangue murino, menos de 0,5% das células eram EpCAM+, como mostra a Figura 6. Em amostras de medula óssea humana, 2%-5% das células eram EpCAM+, como mostrado na Figura 7 e Figura 8. Embora 2%-5% seja um grande intervalo, as porcentagens dentro de cada doador individual foram consistentes à medida que mais células foram contadas. Em amostras de sangue humano, cerca de 0,3% das células eram EpCAM+, como mostra a Figura 9. Nossas amostras controle (sem coloração, controle isotípico e FMOs) produziram pouquíssimos resultados falso-positivos de EpCAM+, como mostrado na Figura 4 e na Figura 7. As células dos grupos EpCAM+ e EpCAM- que foram classificadas em lâminas apresentaram coloração positiva para pancitoqueratina em amostras de EpCAM+ e negativas para pan-citoqueratina em amostras de EpCAM-, como mostrado na Figura 10. Esses resultados indicam que os experimentos foram adequadamente delineados e reprodutíveis.
Figura 1: Camundongos transgênicos Krt14Cre;mTmG com contagem incremental de medula óssea. A medula óssea de camundongos Krt1-14;mTmG foi contada incrementalmente. Células positivas para GFP indicam expressão de queratina 14 e foram identificadas por citometria de fluxo. À medida que mais células da medula óssea foram contadas, essa população de células positivas para queratina 14 foi mais facilmente identificável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo de trabalho para células EpCAM+ e citoqueratina+. A medula óssea e as células sanguíneas foram primeiramente selecionadas usando a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para separar as células EpCAM+ e EpCAM-. Essas células foram classificadas em dois tubos de ensaio diferentes, bem como em duas lâminas diferentes. As células classificadas em tubos de ensaio foram giradas em lâminas usando uma citocentrífuga. As lâminas foram então coradas com um anticorpo primário de pancitoqueratina e, em seguida, coradas com um anticorpo secundário. As lâminas foram analisadas por microscopia de fluorescência para observar a expressão de pan-citoqueratinas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Software de análise por citometria de fluxo. Ao analisar dados de citometria de fluxo usando software de análise, o controle sem manchas é usado para selecionar as células de interesse. As células são primeiramente selecionadas com SSC-A e FSC-A, que mostram a complexidade interna e o tamanho das células. (A) Uma porta poligonal é desenhada ao redor das células. (B) As células individuais são adquiridas por acoplamento SSC-A por SSC-W. (C) As células vivas são adquiridas por acoplamento FSC-A versus DAPI. (D) As células negativas para EpCAM são excluídas por limitação à direita das células negativas para EpCAM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise por citometria de fluxo de células EpCAM+ em medula óssea de camundongos. Os controles sem mancha, isotipo e FMOs são mostrados no painel superior, com as contagens incrementais de 50.000, 100.000 e 500.000 células mostradas no painel inferior. Esses gráficos visualizam a consistência em porcentagens entre as contagens, apesar do aumento geral no total de células contadas. Os painéis à direita indicam a estratégia de limitação, conforme discutido anteriormente na seção de análise por citometria de fluxo e como mostrado na Figura 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: As células EpCAM+ na medula óssea de camundongos compreendem 5,17% ± 0,001% da população. As células da medula óssea de três camundongos individuais foram analisadas. Os controles apropriados foram incluídos para o devido rigor científico. A porcentagem de células positivas permaneceu consistente entre as amostras, devido aos camundongos serem geneticamente idênticos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: As células EpCAM+ no sangue de camundongos compreendem 0,45% ± 0,0006% da população. As células sanguíneas de dois camundongos individuais foram analisadas. Os controles foram incluídos para mostrar que o procedimento adequado foi seguido para produzir resultados conclusivos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Análise por citometria de fluxo na medula óssea humana EpCAM+. Os controles sem mancha, isotipo e FMOs são mostrados no painel superior, e as contagens incrementais de 50.000, 100.000 e 500.000 células são mostradas no painel inferior. Esses gráficos visualizam a consistência em porcentagens entre as contagens, apesar do aumento geral do total de células contadas. Os painéis à direita indicam a estratégia de limitação, conforme discutido anteriormente na seção de análise por citometria de fluxo e como mostrado na Figura 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: As células EpCAM+ na medula óssea humana compreendem 3,53% ± 0,006% da população. Três diferentes amostras de medula óssea humana foram analisadas. Foram incluídos controles adequados para o rigor científico. A porcentagem de células positivas varia devido à heterogeneidade genética entre humanos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: As células EpCAM+ do sangue humano compreendem 0,18% ± 0,0004% da população. Três diferentes amostras de sangue humano foram analisadas. Foram incluídos controles adequados para o rigor científico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Imunofluorescência das lâminas de EpCAM+ e EpCAM-. A FACS foi usada para separar as células EpCAM+ e EpCAM-. A pancitoqueratina foi corada para o uso do anticorpo pancitoqueratina DAKO. Não foi utilizado controle primário de anticorpos no soro normal, pois a pancitoqueratina é um anticorpo policlonal. Esses resultados confirmam a acurácia do FACS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Medula óssea humana ou sangue | |||
| Anticorpo | Tubo # | # de células | AB Conc |
| Sem manchas | 1 | 1x106 | X |
| Somente DAPI | 2 | 1x106 | 1uL/mL |
| Controle isotípico do PE | 3 | 1x106 | 1 uL |
| Controle de mancha única CD49f-PE | 4 | 1x106 | 20 uL em 100uL por 1x106 |
| EpCAM-PE Baixa Titulação | 5 | 1x106 | 3 uL em 100uL por 1x106 |
| Titulação Média EpCAM-PE | 6 | 1x106 | 4 uL em 100uL por 1x106 |
| EpCAM-PE Alta Titulação | 7 | 1x106 | 5 uL em 100uL por 1x106 |
| EpCAM-PE High Sort em Slides | 8 | 10x106 | 50 uL em 1 mL |
Tabela 1: Painel de coloração por citometria de fluxo. Um exemplo de um painel de coloração por citometria de fluxo para células mononucleares do sangue ou da medula óssea. Os controles incluídos são DAPI somente, controle não corado e controle de coloração única de PE (PE-CD49f foi usado como um melhor controle positivo). A fluorescência menos um não está incluída neste painel, pois é apenas uma única cor (PE). Ao adicionar mais cores de fluoróforos, como isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou aloficocianina (APC), os FMOs devem ser incluídos excluindo um fluoróforo para cada controle de FMO.
Arquivo Suplementar 1: Contagem de células vivas usando hematocitômetro. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
Existem algumas evidências na literatura da presença de células epiteliais na medula óssea. Anteriormente, trabalhos tipicamente investigaram o papel das células epiteliais no contexto de doenças e lesões, como no fígado, pulmão, trato gastrointestinal (GI), timo e pele14,15,16,17. No entanto, pouco se sabe sobre a presença dessas células epiteliais na medula óssea de indivíduos saudáveis. Este trabalho procura estabelecer um método reprodutível, com o objetivo de identificar e isolar células epiteliais de sangue e medula óssea normais. Este método irá impulsionar o campo para identificar por que as células epiteliais estão presentes e qual é o seu papel no sangue e na medula óssea na ausência de doença; Talvez essas células façam parte da manutenção normal do tecido ou sejam ativadas em momentos de lesão. A medula óssea é um repositório de células-tronco; no entanto, não está claro qual pode ser a linhagem dessas células epiteliais. Um trabalho recente discute as células epiteliais derivadas da medula óssea no timo, que primeiro expressam EpCAM e o marcador hematopoiético CD45, e depois perdem sua expressão de CD45 ao longo do tempo após alesão15. Pesquisas realizadas em nosso laboratório também confirmaram a presença de células CD45+ EpCAM+ no sangue e na medula óssea saudáveis na ausência delesão12. No entanto, o papel dessas células ainda não foi determinado.
Houve necessidade de um método reprodutível para examinar as células epiteliais dentro da medula óssea saudável. O método descrito ajudará a caracterizar essas células ainda mais em seu estado normal. Existem etapas importantes nesse método para manter a reprodutibilidade. Uma das etapas mais críticas desse protocolo é manter um ambiente estéril no capô durante a coleta da medula óssea de camundongos. Se a colheita for de vários camundongos, a contaminação cruzada entre amostras é evitada usando novas agulhas e seringas para cada camundongo. Isso também garante que a amostra esteja limpa e livre de quaisquer contaminantes que possam afetar os resultados. Além disso, o número de seringas preparadas e tubos cônicos marcados para cada mouse adicional deve ser aumentado. Outro passo importante envolve lavar os ossos até que uma cor branca limpa seja evidente para garantir que a maioria das células da medula óssea tenha sido removida; As chances de detectar células raras aumentam em uma amostra mais pura. Uma modificação foi feita para otimizar o protocolo de lise de hemácias; Vários tampões de lise foram testados para encontrar o correto que desse consistentemente alta viabilidade, já que quase metade das células estavam sendo perdidas durante essa etapa. Diferentes reagentes e períodos de incubação podem precisar ser otimizados para obter melhores resultados em outras configurações.
A limitação mais significativa deste protocolo é o uso da citometria de fluxo para encontrar populações celulares raras. Como discutido anteriormente, a adição de controles e contagens incrementais ajuda a aumentar a especificidade e a precisão da análise. Outra limitação é que marcadores apropriados para a população de interesse devem ser identificados previamente. Assim, é necessário conhecer os principais marcadores, anticorpos para citometria de fluxo e anticorpos compatíveis com a espécie-alvo.
Esses métodos são uma melhoria em relação aos métodos existentes, pois permitem a análise de célula única a uma fração do custo do isolador automático de CTC existente e do sequenciamento de RNA de célula única. Além disso, a citometria de fluxo está mais prontamente disponível. O FACS manteve maior viabilidade para as células em comparação com resultados relatados anteriormente usando separação magnética de microesferas . Por fim, essas técnicas permitem a separação de células para análises a jusante, como sequenciamento de RNA em massa, sequenciamento de scRNA ou cultura celular.
Disclosures
Não há conflitos de interesse conhecidos.
Acknowledgments
Josh Monts, Técnico de Citômetro de Fluxo de Instalações Principais, The Hormel Institute
Todd Schuster, Gerente de Instalações Principais, The Hormel Institute
Derek Gordon, estatístico, Universidade Rutgers
Gostaríamos de agradecer a Karen Klein da Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM por sua assistência editorial.
Este trabalho foi apoiado em parte pelo Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e de Pele dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de prêmio R21 AR075281, e um Grant-in-Aid of Research, Artistry and Scholarship, Office of the Vice President for Research, University of Minnesota (Proposta #324240). Agradecemos o apoio do Instituto Hormel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes used for flow cytometry |
| 500 mL jar with lid | Nalgene | 11-823-32 | Used to wash the mouse |
| 190 proof Ethanol | Decon laboratories Inc | 2801 | Diluted to 70% with dH2O |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | Dilution: 1:1000 |
| Brightline Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-10 | Used to count alive cells |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Component of antibody diluent |
| Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Component of staining buffer and harvesting solution |
| Curity gauze sponges | Covidien | 2187 | Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow |
| Curved Forceps | Miltex | 18-784 | Used during harvest |
| Cytokeratin, Wide Spectrum Screening | Dako | Z0622 | Dilution 1:750 *Now discontinued |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) | Gibco | 14190-144 500mL | Used to stop the red blood cell lysis reaction |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E9884-100G | Used at 0.5 M |
| Gentamicin sulfate | Lonza | 17-518Z | Component of harvesting solution |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) | Gibco | 14175-095 500mL | Component of harvesting solution and staining buffer solution |
| Luer-Lok tip 10 mL syringe | Becton, Dickinson and Co | 309604 | Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps |
| Magic touch 2 ice bucket | BelArt | M16807-2001 | Used to store the specimens on ice |
| Nonfat dry milk | Apex | 20-241 | Component of Antibody Diluent |
| Normal horse serum | Vector | ZE0122 | Component of Antibody Diluent |
| PE anti-human CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 324206 | Dilution: 5 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 118205 | Dilution: 3 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE mouse IgG2b, κ isotype control | Biolegend | 400313 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat anti-human CD49f | BD Biosciences | 555763 | Dilution: 20 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat IgG2am, κ Isotype control | Biolegend | 400508 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Basix | 14-955-240 | Used in the centrifuge |
| Povidone-Iodine Scrub | Aplicare | 82-227 | Antiseptic used to sterilize the mice |
| PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305176 | 20G needle used to break up bone marrow clumps |
| PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305111 | 26G needle used to flush bone marrow from bones |
| PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Services | 63422-06 | 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence |
| RBC Lysis buffer 10X | Invitrogen | 00-4300-54 | Dilution 1:10 using sterile deionized water |
| Scissors | Roboz | RS-6762 | Used during harvest |
| Stainless steel surgical blade #4 | Bard-Parker | 371222 | Used during harvest |
| Sterile tray | Polar ware | 10F | Used during harvest |
| StretchEase Powder-free nitrile examination gloves | Denville Scientific | G4161 | Used during harvest |
| Surgical Scalpel handle #4 | Fischer | 12-000-164 | Used with surgical blade |
| TBS 20x | Thermo | Component of TBST, used at 1X | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Used to count dead cells. Filtered with .45 µm |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-500mL | Component of TBST |
| Tweezers | Miltex | 6-8 | Used during harvest |
| Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1800 | Nuclear stain for immunofluorescence |
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