Summary
In dieser Arbeit wird eine reproduzierbare Methode mit neuen Erkenntnissen über das Vorhandensein von Epithelzellen in normalem Blut und Knochenmark von Mensch und Maus mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzmikroskopie vorgestellt. Krt1-14;mTmG transgene Mäuse wurden als in vivo Methode verwendet, um diese Ergebnisse zu bestätigen.
Abstract
Epithelzellen wurden im Blut und Knochenmark von Patienten mit Krebs und anderen Krankheiten identifiziert. Das Vorhandensein normaler Epithelzellen im Blut und Knochenmark gesunder Personen muss jedoch noch auf konsistente Weise nachgewiesen werden. Hier wird eine reproduzierbare Methode zur Isolierung von Epithelzellen aus gesundem menschlichem und murinem Blut und Knochenmark (BM) mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzmikroskopie (IF) vorgestellt. Epithelzellen von gesunden Individuen wurden zunächst mittels Durchflusszytometrie mit Hilfe von Epithelzelladhäsionsmolekülen (EpCAM) identifiziert und isoliert. Diese EpCAM+-Zellen exprimieren Keratin mittels Immunfluoreszenzmikroskopie in Krt1-14;mTmG-transgenen Mäusen. Humane Blutproben wiesen 0,18% ± 0,0004 EpCAM+ Zellen auf (REM; n=7 biologische Replikate, 4 experimentelle Replikate). Im humanen BM waren 3,53% ± 0,006 (REM; n=3 biologische Replikate, 4 experimentelle Replikate) der mononukleären Zellen EpCAM+. Im Blut der Maus machten die EpCAM+-Zellen 0,45 % ± 0,0006 (REM; n = 2 biologische Replikate, 4 experimentelle Replikate) aus, und im BM der Maus waren 5,17 % ± 0,001 (REM; n = 3 biologische Replikate, 4 experimentelle Replikate) EpCAM+. In Mäusen waren alle EpCAM+-Zellen immunreaktiv gegenüber Pan-Zytokeratin, wie durch IF-Mikroskopie festgestellt wurde. Die Ergebnisse wurden anhand von Krt1-14;mTmG-transgenen Mäusen bestätigt, wobei eine geringe Anzahl (8,6 native GFP+-Zellen pro 106 analysierte Zellen; 0,085 % der lebensfähigen Zellen), aber eine signifikante Anzahl (p < 0,0005) von GFP+-Zellen in normaler muriner BM vorhanden war, die im Vergleich zu mehreren Negativkontrollen nicht das Ergebnis von Zufälligkeit waren. Darüber hinaus waren EpCAM+-Zellen im Mausblut heterogener als CD45+-Zellen (0,58% im BM; 0,13% im Blut). Diese Beobachtungen schlussfolgern, dass Zellen, die Zytokeratinproteine exprimieren, reproduzierbar zwischen mononukleären Zellen aus menschlichem und murinem Blut und BM nachweisbar sind. Wir demonstrieren eine Methode der Gewebegewinnung, Durchflusszytometrie und Immunfärbung, mit der die Funktion dieser Pan-Zytokeratin-Epithelzellen bei gesunden Personen identifiziert und bestimmt werden kann.
Introduction
Epithelzellen befinden sich in den physischen Barrieren zwischen unserem Körper und der Umwelt und sind in der Lage, Veränderungen in ihrer Mikroumgebung zu erkennen und darauf zu reagieren1. Sie haben eine proliferierende Stammzellnische, die eine Möglichkeit bietet, neues Gewebe umzudrehen und Schäden zu reparieren2. Unser Labor untersucht Stammzellen in den Haarfollikeln der Haut; Die Haut ist ein gutes Modell für die Untersuchung der Proliferation von Epithelgewebe und Stammzellen, da sie leicht sichtbar ist und ein ständiger Zellumsatz stattfindet. Epithelkarzinome sind die häufigste Krebsform, was möglicherweise darauf zurückzuführen ist, dass Epithelgewebe wie die Haut die erste Verteidigungslinie gegen Umweltkarzinogene sind, was zu hohen Umsatzraten und der Vermehrung von Epithelzellen führt3. Der größte Teil der Epidermis der Haut, die oberste Schutzschicht, besteht aus Keratinozyten, die verschiedene Arten von Keratinen exprimieren, um Halt und Struktur zu bieten4. Patienten mit Epithelkarzinomen haben oft Epithelzellen im Blut und Knochenmark, die ebenfalls Keratine exprimieren. Flüssigbiopsien sind eine nicht-invasive Methode, um diese Epithelzellen in verschiedenen Körperflüssigkeiten nachzuweisen und zu überwachen5. Zirkulierende Epithelzellen, auch zirkulierende Tumorzellen (CTCs) genannt, kommen im peripheren Blut vor und können Biomarker für die Krebsprognose sein und individualisierte Therapien steuern. CTCs können auch Aufschluss über das Fortschreiten der Erkrankung, die Wirksamkeit der Behandlung und das Gesamtüberleben der Patienten geben 5,6.
Das Epithelzelladhäsionsmolekül (EpCAM) ist ein klinisch verwendeter Marker für CTCs und kann Tumore epithelialen Ursprungs bei Krebspatienten identifizieren. EpCAM spielt eine Rolle bei der Zelladhäsion, -migration, -signaltransduktion, -proliferation und -differenzierung6. Damit eine zirkulierende Epithelzelle als CTC klassifiziert werden kann, muss sie positiv für die Zytokeratine 8, 18 und 19 und negativ für CD45, einen häufigen Leukozytenmarker6, sein. CTCs werden in der Regel identifiziert, indem zuerst CD45 mit magnetischen Mikrokügelchen depletiert wird, gefolgt von einem Test auf EpCAM und Cytokeratin 19 mittels Immunfluoreszenzmikroskopie7. Die Haupteinschränkung bei der Erkennung von CTCs ist ihre Seltenheit; Sie machen weniger als 0,01 % aller Zellen im Blut aus, und nur sehr wenige überleben im Blutkreislauf, um entfernte Organe zu erreichen 8,9,10. Bei der Planung von Experimenten und Techniken zur Isolierung und Identifizierung dieser Zellen muss aufgrund ihrer seltenen Natur berücksichtigt werden. Derzeit gibt es nur einen von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen automatisierten Einzelzellsortierer, der zur Identifizierung von CTCs verwendet wird und EpCAM als Biomarker verwendet. Andere Methoden sind die magnetische Bead-Trennung und die Durchflusszytometrie oder eine Kombination dieser Methoden. Es besteht ein Bedarf an neuen Techniken, die eine höhere Sensitivität und Spezifität für den Nachweis seltener CTCs aufweisen11.
Die Durchflusszytometrie ist eine bevorzugte Methode zum Nachweis seltener Zellpopulationen im Blut, Knochenmark und anderen Gewebeproben. Zu diesen seltenen Zellen können Stammzellen, zirkulierende Endothelzellen, CTCs und Krankheitsrestzellen gehören. Die Durchflusszytometrie ermöglicht quantitative Messungen jedes Zelltyps und sortiert diese Zellen für weitere Tests 7,9. Es wurden inkrementelle Zählungen durchgeführt, um eine genaue Beurteilung dieser seltenen Zellen zu gewährleisten. Die Möglichkeit, Zellen mithilfe von Gating von der weiteren Analyse auszuschließen, ist eine Möglichkeit, die Spezifität bei der Analyse von Zellen zu erhöhen. Die Einschränkungen der Durchflusszytometrie sind der Zeitaufwand für die Analyse großer Proben und das Fehlen einer visuellen Bestätigung der Zellidentität. Um dies zu überwinden, wurde eine Immunfluoreszenzmikroskopie an den sortierten Zellen durchgeführt, um ihre Identität zu bestätigen.
Zuvor hat unser Labor gezeigt, dass bei Mäusen die Knochenmarkszellen rekrutiert werden und zu Hauttumoren beitragen12. Diese aus dem Knochenmark stammenden Zellen sind positiv für Pan-Zytokeratin und epidermales Zytokeratin. Um die Rolle von epithelialen Stammzellen, aus dem Knochenmark stammenden Zellen und Zytokeratin-exprimierenden Zellen bei der Tumorprogression weiter aufzuklären, wurde nach EpCAM+-Zytokeratin-positiven Zellen in normalen murinen und menschlichen Blut- und Knochenmarkproben gesucht. Wie bei den meisten Experimenten wurde auch diese Methode durch mehrere Iterationen entwickelt. Bisher wurden transgene Mäuse zusammen mit inkrementellen Zählungen verwendet, um nach K14GFP-exprimierenden Zellen im Knochenmark zu suchen12. Je mehr Zellen gezählt wurden, desto mehr konnte eine repräsentative Population seltener Zellen identifiziert werden, wie in Abbildung 1 im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" dargestellt. Die Begründung für die Untersuchung von Epithelzellen in normalem Blut und Knochenmark basierte auf der frühen Literatur zu CTCs, bei denen normale gesunde Spender Hintergrundspiegel von EpCAM+-Zellen aufwiesen13. Wie bereits erwähnt, beginnt die EpCAM-Charakterisierung oft mit der Depletion von CD45. Dieser Schritt wurde ausgelassen, da einige hämatopoetische Zellen aus unbekannten Gründen, die weiter untersucht werden müssen, eine EpCAM- und Zytokeratin-Expression aufweisen. Daher wurden die Zellen unabhängig von der Zelllinie nach dem Vorhandensein oder Fehlen von EpCAM sortiert und dann auf Zytokeratin immungefärbt. Das nachstehende Protokoll und der in Abbildung 2 gezeigte Arbeitsablauf beschreiben eine Technik, die Durchflusszytometrie mit Kompensation und Kontrollen, statistische Methoden und Immunfluoreszenzbildgebung verwendet, um diese seltenen Populationen von Epithelzellen zu isolieren und zu identifizieren.
Protocol
Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Minnesota in Übereinstimmung mit den NIH- und Bundesrichtlinien genehmigt. Frisches menschliches Blut und Knochenmark wurden aus kommerziellen Quellen bezogen. Die Proben wurden vom Unternehmen nach einem genehmigten IRB-Protokoll von Spendern entnommen, die negativ auf HIV, Hepatitis B oder Hepatitis C getestet wurden, und auf COVID-19 untersucht. Alle Proben wurden zunächst anonymisiert und anonymisiert, bevor sie vom Unternehmen versandt wurden. Da diese kommerziell erworben wurden, war keine IRB-Genehmigung erforderlich.
1. Herstellung von Lösungen
Anmerkungen: Alle Lösungen müssen in einer biologischen Haube mit steriler Umgebung hergestellt werden. Erhalten Sie die Zertifizierung der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) für die Arbeit mit menschlichem Blut und Knochenmark.
- Bereiten Sie eine Knochenmark-Erntelösung vor, indem Sie 1 ml Gentamicin und 5 ml fötales Kälberserum (FBS) zu 500 ml Hank's Balance Salt Solution (HBSS) hinzufügen.
- Bereiten Sie die Färbepufferlösung vor, indem Sie 50 ml FBS zu 500 ml HBSS hinzufügen.
- Bereiten Sie 1x Lysepuffer vor, indem Sie 10 ml 10x Lysepuffer mit 90 ml sterilem Wasser kombinieren.
2. Vorbereiten der Haube
- Schalten Sie die Haube ein und lassen Sie sie einige Minuten laufen, um einen ordnungsgemäßen Luftstrom zu erhalten.
- Sammle alle Materialien, um die Knochenmarkentnahme durchzuführen. Sprühen Sie sie in der Haube mit 70% Ethanol ein, um eine sterile Umgebung zu erhalten. Sprühen Sie die Hände jedes Mal ein, bevor sie in die Kapuze genommen werden.
- Legen Sie das autoklavierte Tablett zusammen mit einer autoklavierten Schere, einem zusammengebauten Skalpell, einer Pinzette und einer gebogenen Pinzette in einen kleinen Becher, der mit 70 % Ethanol gefüllt ist, um sie steril zu halten.
- Geben Sie 10 ml Knochenmark-Entnahmelösung in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und beschriften Sie es mit "Gliedmaßen". Beschriften Sie ein weiteres 50-ml-Zentrifugenröhrchen als "Knochenmark".
- Ziehen Sie 10 ml Knochenmark-Entnahmelösung in eine Spritze auf und setzen Sie dann eine 26-G-Nadel auf.
3. Entnahme von Knochenmark von Mäusen
- Euthanasieren Sie die Maus durch CO2 - Erstickung. Der Tod wird durch das Fehlen eines Herzschlags und das Kneifen der Füße bestätigt, um sicherzustellen, dass es keine Reaktion gibt. Die Zervixluxation kann als sekundäres Mittel zur vollständigen Sterbehilfe durchgeführt werden.
- Legen Sie die Maus in einen 500-ml-Behälter und fügen Sie so viel Jod hinzu, dass die Hälfte der Maus bedeckt ist. Schütteln und schwenken Sie den Behälter vorsichtig, um eine gründliche Abdeckung zu gewährleisten. Mit deionisiertem Wasser abspülen. Führen Sie eine weitere Jodwäsche und dann zwei Waschgänge mit 70%igem Ethanol durch, indem Sie die gleichen Schritte befolgen.
- Setzen Sie die Maus in die Haube ein und legen Sie sie auf den Rücken auf das Tablett. Greifen Sie die Hinterbeine und ziehen Sie sie auseinander, bis ein Knacken zu spüren ist. Dies dient dazu, die Beine von der Wirbelsäule zu trennen.
- Machen Sie einen 1 cm großen Schnitt auf der Haut der Maus in der Nähe der Leistengegend. Führen Sie eine geschlossene Schere in den Schnitt ein und öffnen Sie dann die Schere unter der Haut, um sie vom Bauchfell zu trennen.
- Schneiden Sie die Haut am Bein um den Oberschenkel herum und schneiden Sie dann die Haut am Bein ab, um die Muskeln und Knochen freizulegen.
- Entfernen Sie die Hinterbeine, indem Sie um das Hüftgelenk herum schneiden, und achten Sie darauf, den Oberschenkelknochen nicht zu durchtrennen. Legen Sie die Gliedmaßen in das Röhrchen, das mit "Gliedmaßen" beschriftet ist. Wenn beide Beine entfernt sind, legen Sie die Maus in einen Kadaverbeutel und legen Sie sie in den Gefrierschrank.
Anmerkungen: Der Hüftknochen sollte vor dem Schneiden zuerst ertastet werden, um die Schere zu führen und das Schneiden des Oberschenkelknochens zu vermeiden, da der größte Teil des Knochenmarks aus dem Oberschenkelknochen gewonnen wird. - Schneide mit der Schere die Muskeln, das Gewebe und das Fett entlang eines der Gliedmaßen ab. Parallel zum Knochen schneiden. Verwenden Sie dann das Skalpell und entfernen Sie das restliche Fett oder den restlichen Muskel mit einer senkrechten Kratzbewegung gegen den Knochen.
- Sobald der Knochen richtig gereinigt ist, trennen Sie den Oberschenkelknochen und das Schienbein am Knie. Verwenden Sie das Skalpell, um Schnitte an beiden Enden des Oberschenkelknochens und der Tibia zu machen, wo kein sichtbares Knochenmark vorhanden ist.
- Führen Sie die vorbereitete Spritze und Nadel in den Knochen ein. Wenn es Widerstand gibt, schneiden Sie etwas mehr vom Ende des Knochens ab, bis kein Widerstand mehr vorhanden ist.
- Halten Sie den Knochen über dem als "Knochenmark" gekennzeichneten Röhrchen und stoßen Sie die Knochenmarkentnahmelösung durch den Knochen aus, um das Knochenmark in das Röhrchen zu spülen. Wiederholen Sie den Vorgang am anderen Ende des Knochens, um den Rest des Knochenmarks zu erhalten, bis der Knochen ganz weiß oder leer erscheint.
- Wiederholen Sie die Schritte 7-9 für alle verbleibenden Knochen und Gliedmaßen. Das gesamte Knochenmark wird in dasselbe konische Röhrchen gespült.
- Brechen Sie mit einer leeren 10-ml-Spritze und einer 20-g-Nadel die Knochenmarkklumpen im Röhrchen auf, indem Sie das Knochenmark in der Spritze 5-10 Mal auf und ab ziehen.
- Geben Sie einen sterilen 40-μm-Filter in ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen und spülen Sie ihn mit 1 ml Knochenmark-Entnahmelösung aus. Filtern Sie dann das Knochenmark, um alle verbleibenden Klumpen zu entfernen. Beschriften Sie diese Tube mit "Gefiltertes Knochenmark".
- Bewahren Sie das gefilterte Knochenmark bis zur Verwendung im Kühlschrank oder auf Eis auf. Es sollte noch am selben Tag der Ernte verwendet werden. Wenn Sie die Zellen nicht am selben Tag anwenden, frieren Sie sie mit einem Kryokonservierungsmittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO) ein.
ACHTUNG: Alle Abfälle aus diesen Experimenten sollten ordnungsgemäß in einem Behälter für biologisch gefährliche Abfälle entsorgt werden. Alle scharfen und scharfen Gegenstände sollten in einem ordnungsgemäß beschrifteten Behälter für scharfe und biologische Gegenstände aufbewahrt werden.
4. Lyse der roten Blutkörperchen im Knochenmark
- Die Knochenmarkzellen werden bei 170 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand ab und entsorgen Sie ihn. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml 1x Lysepuffer für die roten Blutkörperchen und inkubieren Sie sie 4 Minuten lang.
- Fügen Sie 30 ml der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco hinzu, um die Reaktion des Lysepuffers zu stoppen. Zentrifugieren Sie die Zellen 8 Minuten lang bei 170 x g bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand ab und entsorgen Sie ihn. In 10-20 ml Färbepuffer resuspendieren.
5. Anzahl der Zellen
- Kombinieren Sie 500 μl Zellen mit 9,5 ml Knochenmarkentnahmelösung, um eine Verdünnung von 1:20 zu erhalten.
HINWEIS: Dies wird für die Zellzählung verwendet und muss nicht steril gehalten werden. - Ziehen Sie 200 μl Zellen aus der 1:20-Verdünnung, geben Sie sie zu 200 μl Trypanblau und mischen Sie sie gut.
- Geben Sie die Mischung in ein Hämozytometer und zählen Sie die lebenden und toten Zellen auf beiden Seiten. Berechnen Sie die ursprüngliche Zellsuspension anhand dieser Tabelle (siehe Ergänzungsdatei 1) und Gleichungen:
Zellen pro Milliliter:
Gesamtzahl der Zellen:
- Die Zellen werden bei 170 x g für 10 Minuten bei 4 °C heruntergeschleudert und auf eine Konzentration von 10 x 10 6 pro 1 ml (1 x 106 Zellen pro 100 μl) resuspendiert, basierend auf den Empfehlungen des Herstellers für Antikörperverdünnungen.
- Fahren Sie mit der Durchflusszytometrie fort (Schritt 8).
6. Blutentnahme von Mäusen
- Euthanasieren Sie die Maus mit CO2 - Gas oder zervikaler Luxation.
- Führen Sie eine Herzblutentnahme in einem Winkel von 45° mit einer 26-G-Nadel durch, die an einer 1-ml-Spritze befestigt ist, die mit 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) beschichtet ist.
- Schleudern Sie das Blut ab und resuspendieren Sie es in Medien oder Färbepuffer.
HINWEIS: Die Zellen werden nach der Lyse der roten Blutkörperchen und der Zellzählung im Färbepuffer auf die Endkonzentration resuspendiert. - Führen Sie die Lyse der roten Blutkörperchen durch (Schritt 4).
- Führen Sie die Zellenzählung durch (Schritt 5).
- Fahren Sie mit der Durchflusszytometrie fort (Schritt 8).
7. Verarbeitung von menschlichen Blut- und Knochenmarkproben
- Führen Sie alle Verfahren unter einer BSL2-zertifizierten Haube durch, während Sie persönliche Schutzausrüstung tragen.
- Sammeln Sie die Proben in der vorherigen Nacht und führen Sie eine Lyse der roten Blutkörperchen durch. Stellen Sie sicher, dass die Proben anonymisiert und anonymisiert sind, bevor Sie die mononukleären Proben über Nacht auf Eis versenden.
- Nach der Ankunft werden die lebenden Zellen bei 170 x g bei 4 °C für 10 Minuten heruntergeschleudert.
HINWEIS: Hierbei handelt es sich um BSL2-Proben, die den örtlichen Richtlinien entsprechen müssen. - Resuspendieren Sie die Zellen in Medien oder Färbepuffer.
Anmerkungen: Die Zellen sollten nach der Zellzählung mit Färbepuffer abgeschleudert und auf die Endkonzentration resuspendiert werden. - Führen Sie die Zellenzählung durch (Schritt 5).
- Fahren Sie mit der Durchflusszytometrie fort (Schritt 8).
8. Durchflusszytometrie
- Färbung
- Unterteilen Sie die Zellen in individuell markierte Röhrchen basierend auf dem verwendeten Färbepanel, einschließlich Kompensationskontrollen (ungefärbt, Isotyp-Kontrollen, Einzelfärbung und Fluoreszenz-Minus-Einsen [FMOs]). Frieren Sie alle verbleibenden Zellen ein oder verwenden Sie sie für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. In Tabelle 1 finden Sie ein Beispiel für ein Färbepanel mit den verwendeten Antikörperverdünnungen.
HINWEIS: Für jeden zusätzlichen Fluorophor müssen FMOs in Kombination mit den verbleibenden Fluorophoren zusammen mit einer einzelnen Färbung dieses Fluorophors hinzugefügt werden. Isotyp-Kontrollen können verwendet werden, um unspezifische Färbungen zu blockieren. Jeder neue verwendete Antikörper sollte mit den Proben titriert werden, um eine optimale Verdünnung zu gewährleisten. - Fügen Sie Antikörper gemäß den vom Hersteller empfohlenen Verdünnungen hinzu und mischen Sie gut, indem Sie den Boden der Röhrchen schnippen. Die Antikörperkonzentrationen werden in der Regel mit 1 x 106 Zellen pro 100 μl angegeben. Verdünnungen mit Antikörpern und Kontrollen sind in Tabelle 1 dargestellt. Antikörper sind mit Fluorophoren konjugiert und müssen vor Licht geschützt werden.
HINWEIS: Es ist am besten, EpCAM konjugiert mit Phycoerythrin (PE) zu verwenden, um die Visualisierung niedriger Zellpopulationen zu ermöglichen (Titrate bei 3-5 μl pro 1 Million Zellen, wie in Tabelle 1 angegeben). PE-CD49f wurde als Einzelfärbungs-PE-Kontrolle (20 μL pro 1 Million Zellen) verwendet, da diese Zellen häufiger vorkommen als PE-EpCAM und daher einfacher zur Kompensation verwendet werden können. - 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
- Bringen Sie die Röhrchen nach der Inkubation zurück in die BSL2-Haube und geben Sie 1 ml Färbepuffer in jedes Röhrchen.
- Anschließend zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 170 x g bei 4 °C für 5-10 min.
- Bringen Sie nach dem Zentrifugieren die verschlossenen Röhrchen mit den Küvetten zurück in die BSL2-Haube und saugen Sie den Überstand ab. Achten Sie darauf, die Spitzen der Aspirationspipette zwischen den einzelnen Röhrchen zu wechseln, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Färbepuffer und schnippen Sie den Boden der Röhrchen, um es zu mischen.
- Waschen Sie die Zellen noch zweimal, indem Sie die Schritte 8.1.4-8.1.7 wiederholen.
Anmerkungen: Verwenden Sie keine Pipetten zum Resuspendieren, um Zellverluste zu vermeiden. - Resuspendierung in 500 μl Färbepuffer für die endgültige Resuspension vor der Durchflusszytometrie. Fügen Sie 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) oder einen Totzelldiskriminator gemäß den Empfehlungen des Herstellers hinzu.
- Unterteilen Sie die Zellen in individuell markierte Röhrchen basierend auf dem verwendeten Färbepanel, einschließlich Kompensationskontrollen (ungefärbt, Isotyp-Kontrollen, Einzelfärbung und Fluoreszenz-Minus-Einsen [FMOs]). Frieren Sie alle verbleibenden Zellen ein oder verwenden Sie sie für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. In Tabelle 1 finden Sie ein Beispiel für ein Färbepanel mit den verwendeten Antikörperverdünnungen.
- Durchflusszytometer
- Verwenden Sie nach dem Einrichten der Maschine die Bedienelemente und FMOs, um die Kompensation und die Tore einzustellen. Verwenden Sie Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS) als Scheidenflüssigkeit, um die empfindlichen Zellen zu unterstützen. Verwenden Sie PBS, wenn HBSS nicht verfügbar ist.
HINWEIS: Das verwendete Durchflusszytometer und die Software sind in der Materialtabelle aufgeführt. - Laden Sie die Stichproben nacheinander, und sammeln Sie Datenpunkte für 50.000, 100.000, 500.000 und eine Million Ereignisse. Bewahren Sie die Röhrchen bis zur Verwendung auf Eis oder gekühlt auf.
HINWEIS: Bei der Entnahme kann ein Zeitlimit festgelegt werden, um die Durchführbarkeit der Probe zu gewährleisten. - Sammeln Sie die Zellen in 3 ml RPMI mit 10 % FBS in 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Wenn Sie eine Immunfluoreszenz an EpCAM+-Zellen durchführen, sortieren Sie mit dem Durchflusszytometer 800 bis 1.000 Zellen in jede Vertiefung eines 8-Well-Objektträgers.
- Sortieren Sie die EpCAM-Zellpopulation auf separaten Objektträgern als Negativkontrolle aus, um sie bei der Färbung für Immunfluoreszenz zu verwenden.
HINWEIS: Die Zellen können auch in 15-ml-Röhrchen mit FBS sortiert und mit der Zytozentrifuge oder einer Pipette auf einen Objektträger geschleudert werden, um ein Platzen der Zellen zu verhindern. - Fixieren Sie die Objektträger in einem Gemisch aus 50 % Methanol und 50 % Aceton bei -20 °C für 10 Minuten. Lagern Sie die Objektträger bei -20 °C bis zur Färbung mit Immunfluoreszenz.
- Verwenden Sie nach dem Einrichten der Maschine die Bedienelemente und FMOs, um die Kompensation und die Tore einzustellen. Verwenden Sie Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS) als Scheidenflüssigkeit, um die empfindlichen Zellen zu unterstützen. Verwenden Sie PBS, wenn HBSS nicht verfügbar ist.
- Durchflusszytometrische Analyse
- Öffnen Sie die lizenzierte Durchflusszytometrie-Analysesoftware.
- Vom Durchflusszytometer erfasste Lastflusszytometrie-Standarddateien (FCS) mit Kontrollen und Proben.
- Klicken Sie auf "Gruppe erstellen" und verwenden Sie Schlüsselwörter, um Samples und Steuerelemente in einer Gruppe zu platzieren.
HINWEIS: Verwenden Sie die Steuerelement "Keine Färbung", um die Durchflusszytometrie-Analysesoftware einzublenden, wie in Abbildung 3 dargestellt. - Doppelklicken Sie auf die Probe ohne Fleckenkontrolle, um ein Diagramm ohne Fleckenkontrolle zu öffnen.
- Legen Sie die y-Achse des Diagramms auf SSC-A und die x-Achse auf FSC-A (seitliche Streufläche durch vorwärts gerichtete Streufläche) fest, was die Zellengröße und die interne Komplexität angibt.
- Klicken Sie oben links auf die Polygonform und erstellen Sie ein Tor um die Zellen. Achten Sie darauf, die Zellen an der Peripherie auszuschließen, da es sich höchstwahrscheinlich um Trümmer handelt. Bezeichnen Sie dieses Gatter mit "Zellen", wie in Abbildung 3A dargestellt.
- Sobald die Zellen verknüpft sind, doppelklicken Sie in die Polygonform, um ein weiteres Diagramm in einem neuen Fenster zu öffnen.
- Legen Sie die y-Achse des neuen Diagramms für die Dublettenunterscheidung auf SSC-A und die x-Achse auf SSC-W fest. Klicken Sie auf die Polygonform, und erstellen Sie ein Rechteck um die einzelnen Zellen. Beschriften Sie dies mit "Einzelne Zellen", wie in Abbildung 3B dargestellt.
- Sobald die Zellen verknüpft sind, doppelklicken Sie in die Polygonform, um ein weiteres Diagramm in einem neuen Fenster zu öffnen.
- Stellen Sie die y-Achse auf FSC-A und die x-Achse auf DAPI-A (oder den verwendeten Diskriminator für tote Zellen) ein.
- Erstellen Sie ein Polygon-Gate um die negativen DAPI-Zellen auf der linken Seite des Diagramms. Beschriften Sie diese mit "Lebende Zellen", wie in Abbildung 3C dargestellt.
- Sobald die Zellen verknüpft sind, doppelklicken Sie in die Polygonform, um ein weiteres Diagramm in einem neuen Fenster zu öffnen.
- Stellen Sie die y-Achse auf SSC-A und die x-Achse auf EpCAM-PE (oder den Fluorophor, der zur Identifizierung der EpCAM-Zellen verwendet wird) ein. Die Zellen auf der linken Seite sind EpCAM-negativ. Wenn auf der rechten Seite Zellen angezeigt werden, sind sie EpCAM-positiv.
- Verwenden Sie das EpCAM-PE-Diagramm, um ein Polygon-Gate zu erstellen, das die Zellen auf der linken Seite ausschließt und nur den leeren Bereich auf der rechten Seite enthält. Beschriften Sie den leeren Bereich rechts innerhalb des Polygons mit "EpCAM", wie in Abbildung 3D gezeigt.
HINWEIS: Dies ist eine Fleckenfreiheit, daher sollte kein EpCAM-Ausdruck vorhanden sein. Verwenden Sie die Fleckenkontrolle, um zu bestimmen, welche Zellen EpCAM-positiv sind. Damit ist die Gating-Strategie für die Kompensation abgeschlossen, sodass alle Graphen zu diesem Zeitpunkt geschlossen werden können. - Markieren Sie auf der Arbeitsbereichsseite die Fleckenfreiheit mit "Zellen", "Einzelzellen", "Lebende Zellen" und "EpCAM". Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Analyse kopieren, um sie zu gruppieren. Dadurch wird die Gating-Strategie auf alle anderen geladenen Samples innerhalb der zuvor erstellten Gruppe kopiert. Wenn eine Gruppe ursprünglich nicht erstellt wurde, kann sie jetzt erstellt werden, indem Sie oben links Gruppe erstellen auswählen.
- Gehen Sie die Stichproben innerhalb der Gruppe durch, und überprüfen Sie die zuvor gezeichneten Polygongatter, um sicherzustellen, dass sie mit allen Stichproben und Kontrollen übereinstimmen. Dies gibt die prozentuale Anzahl und die Anzahl der Zellen an.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche L des Layouteditors in der oberen linken Ecke über "Arbeitsbereich". Diese Diagramme können dann mit dem Layout-Editor angeordnet und exportiert werden.
- Herstellung von Immunfluoreszenzreagenzien
- Bereiten Sie das Antikörperverdünnungsmittel vor, indem Sie 1 g Rinderserumalbumin (BSA), 2 g fettfreie Milch, 10 ml 10x tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS), 100 μl Tween und 90 ml destilliertes Wasser kombinieren.
- Bereiten Sie TBST zu, indem Sie 50 ml 20x TBS, 950 ml destilliertes Wasser und 200 μl Tween kombinieren.
- Bereiten Sie 10 % normales Pferdeserum (NHS) vor, indem Sie 1 ml NHS mit 9 ml Antikörperverdünnungsmittel kombinieren (Schritt 8.4.1).
- Bereiten Sie 1 % NHS zu, indem Sie 1 ml 10 % NHS mit 9 ml TBST kombinieren.
- Immunfluoreszenz-Färbung
- Nehmen Sie die Objektträger bei -20 °C heraus und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen.
- Waschen Sie die Objektträger dreimal in destilliertem Wasser für jeweils 5 Minuten.
- Blockieren Sie die Objektträger 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 10 % NHS in Antikörperverdünnungsmittel (Schritt 8.4.3).
- Der primäre Antikörper (Pan-Cytokeratin) wird auf 1:750 in 1 % NHS bei TBST verdünnt (Schritt 8.4.4). Objektträger werden im verdünnten Primärantikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert.
- Waschen Sie die Objektträger am nächsten Tag dreimal mit einem 1x Waschpuffer (PBS oder TBST) für jeweils 5 Minuten.
- Der Sekundärantikörper wird auf 1:1.000 in 1 % NHS bei TBST verdünnt (Schritt 8.4.4). Inkubieren Sie die Objektträger im verdünnten Sekundärantikörper 1 Stunde lang bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Objektträger dreimal mit 1x Waschpuffer für jeweils 5 min. Montieren und decken Sie die Dias mit Hardset-Eindeckmedien mit DAPI ab. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um alle Blasen unter dem Deckglas vorsichtig auszurollen.
Representative Results
Mit diesen Methoden wurden seltene Populationen von Epithelzellen im Blut und Knochenmark von normalen Menschen und Mäusen sichtbar gemacht. Mit den richtigen Kompensationen und Kontrollen wie beschrieben zeigten die Ergebnisse durchweg, dass 4%-5% der Zellen im murinen Knochenmark EpCAM+ waren, unabhängig davon, wie viele Zellen gezählt wurden, wie in Abbildung 4 und Abbildung 5 gezeigt. In murinen Blutproben wiesen weniger als 0,5 % der Zellen EpCAM+ auf, wie in Abbildung 6 dargestellt. In menschlichen Knochenmarkproben wiesen 2%-5% der Zellen EpCAM+ auf, wie in Abbildung 7 und Abbildung 8 dargestellt. Während 2 % bis 5 % eine große Spanne sind, waren die Prozentsätze bei jedem einzelnen Spender konsistent, da schrittweise mehr Zellen gezählt wurden. In menschlichen Blutproben enthielten etwa 0,3 % der Zellen EpCAM+, wie in Abbildung 9 dargestellt. Unsere Kontrollproben (keine Färbung, Isotypkontrolle und FMOs) ergaben nur sehr wenige falsch-positive EpCAM+-Ergebnisse, wie in Abbildung 4 und Abbildung 7 dargestellt. Zellen aus den EpCAM+- und EpCAM-Gruppen, die auf Objektträger sortiert wurden, zeigten eine positive Färbung für Pan-Zytokeratin in EpCAM+-Proben und waren negativ für Pan-Zytokeratin in EpCAM-Proben, wie in Abbildung 10 gezeigt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Experimente angemessen konzipiert und reproduzierbar waren.
Abbildung 1: Krt14Cre;mTmG-transgene Mäuse mit inkrementellen Knochenmarkzählungen. Das Knochenmark von Krt1-14;mTmG-Mäusen wurde inkrementell gezählt. GFP-positive Zellen weisen auf eine Keratin-14-Expression hin und wurden mittels Durchflusszytometrie identifiziert. Je mehr Knochenmarkzellen gezählt wurden, desto leichter war diese Keratin-14-positive Zellpopulation zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Arbeitsablauf für EpCAM+- und Zytokeratin+-Zellen. Die Knochenmark- und Blutzellen wurden zunächst mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) sortiert, um EpCAM+- und EpCAM-Zellen zu trennen. Diese Zellen wurden in zwei verschiedene Reagenzgläser sowie auf zwei verschiedene Objektträger sortiert. Die in Reagenzgläser sortierten Zellen wurden mit einer Zytozentrifuge auf Objektträger geschleudert. Die Objektträger wurden dann mit einem Pan-Cytokeratin-Primärantikörper angefärbt und anschließend mit einem Sekundärantikörper angefärbt. Die Objektträger wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert, um die Pan-Zytokeratin-Expression zu beobachten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Software für die Durchflusszytometrie-Analyse. Bei der Analyse von Durchflusszytometriedaten mit einer Analysesoftware wird die No-Stain-Kontrolle verwendet, um die interessierenden Zellen auszuwählen. Die Zellen werden zunächst mit SSC-A und FSC-A selektiert, die die interne Komplexität und Größe der Zellen zeigen. (A) Ein Polygon-Gate wird um die Zellen gezeichnet. (B) Einzelne Zellen werden durch Gating von SSC-A durch SSC-W gewonnen. (C) Lebende Zellen werden durch Gating von FSC-A im Vergleich zu DAPI gewonnen. (D) EpCAM-negative Zellen werden ausgeschlossen, indem rechts neben den EpCAM-negativen Zellen angesteuert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Durchflusszytometrische Analyse von EpCAM+-Zellen im Knochenmark der Maus. Die Steuerelemente "Keine Färbung", "Isotyp" und "FMOs" werden im oberen Bereich angezeigt, während die inkrementellen Zählungen von 50.000, 100.000 und 500.000 Zellen im unteren Bereich angezeigt werden. Diese Diagramme veranschaulichen die Konsistenz der Prozentsätze über die Zählungen hinweg, trotz des allgemeinen Anstiegs der Gesamtzahl der gezählten Zellen. Die Felder auf der rechten Seite zeigen die Gating-Strategie, wie sie zuvor im Abschnitt Durchflusszytometrie-Analyse erörtert wurde und wie in Abbildung 3 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: EpCAM+-Zellen im Knochenmark der Maus machen 5,17 % ± 0,001 % der Bevölkerung aus. Analysiert wurden die Knochenmarkszellen von drei einzelnen Mäusen. Die entsprechenden Kontrollen wurden einbezogen, um eine angemessene wissenschaftliche Genauigkeit zu gewährleisten. Der Prozentsatz der positiven Zellen blieb über die Proben hinweg konstant, da die Mäuse genetisch identisch waren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: EpCAM+-Zellen im Mäuseblut machen 0,45 % ± 0,0006 % der Bevölkerung aus. Analysiert wurden die Blutzellen von zwei Mäusen. Es wurden Kontrollen einbezogen, um zu zeigen, dass das richtige Verfahren befolgt wurde, um schlüssige Ergebnisse zu erzielen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Durchflusszytometrische Analyse am humanen Knochenmark EpCAM+. Die Steuerelemente "Keine Färbung", "Isotyp" und "FMOs" werden im oberen Bereich angezeigt, und die inkrementellen Zählungen von 50.000, 100.000 und 500.000 Zellen werden im unteren Bereich angezeigt. Diese Diagramme veranschaulichen die Konsistenz der Prozentsätze über die Zählungen hinweg, trotz des Gesamtanstiegs der Gesamtzahl der gezählten Zellen. Die Felder auf der rechten Seite zeigen die Gating-Strategie, wie sie zuvor im Abschnitt Durchflusszytometrie-Analyse erörtert wurde und wie in Abbildung 3 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: EpCAM+-Zellen im menschlichen Knochenmark machen 3,53 % ± 0,006 % der Bevölkerung aus. Es wurden drei verschiedene menschliche Knochenmarkproben analysiert. Geeignete Kontrollen für die wissenschaftliche Genauigkeit wurden einbezogen. Der Prozentsatz der positiven Zellen variiert aufgrund der genetischen Heterogenität beim Menschen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: EpCAM+-Zellen des menschlichen Blutes machen 0,18 % ± 0,0004 % der Bevölkerung aus. Es wurden drei verschiedene menschliche Blutproben analysiert. Geeignete Kontrollen für die wissenschaftliche Genauigkeit wurden einbezogen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 10: Immunfluoreszenz von EpCAM+ und EpCAM- Objektträgern. FACS wurde verwendet, um EpCAM+- und EpCAM-Zellen zu trennen. Pan-Zytokeratin wurde für die Verwendung des DAKO-Pan-Zytokeratin-Antikörpers gefärbt. Es wurde keine primäre Antikörperkontrolle in normalem Serum verwendet, da es sich bei dem Pan-Zytokeratin um einen polyklonalen Antikörper handelt. Diese Ergebnisse bestätigen die Genauigkeit von FACS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Menschliches Knochenmark oder Blut | |||
| Antikörper | Rohr # | # Anzahl der Zellen | AB Conc |
| Ungefleckt | 1 | 1x106 | X |
| Nur DAPI | 2 | 1x106 | 1 μl/ml |
| Kontrolle des PE-Isotyps | 3 | 1x106 | 1 μL |
| CD49f-PE Einzelfleckenbekämpfung | 4 | 1x106 | 20 uL in 100uL pro 1x106 |
| EpCAM-PE Niedrige Titration | 5 | 1x106 | 3 uL in 100uL pro 1x106 |
| EpCAM-PE Medium-Titration | 6 | 1x106 | 4 μL in 100uL pro 1x106 |
| EpCAM-PE Hohe Titration | 7 | 1x106 | 5 uL in 100uL pro 1x106 |
| EpCAM-PE Hohe Sortierung auf Objektträgern | 8 | 10x106 | 50 μl in 1 ml |
Tabelle 1: Färbepanel für die Durchflusszytometrie. Ein Beispiel für ein Durchflusszytometrie-Färbepanel für mononukleäre Zellen im Blut oder Knochenmark. Enthaltene Kontrollen sind nur DAPI, ungefärbte Kontrolle und PE-Einzelfleckenkontrolle (PE-CD49f wurde als bessere Positivkontrolle verwendet). Fluoreszenz minus eins ist in diesem Panel nicht enthalten, da es sich nur um eine einzige Farbe (PE) handelt. Bei der Zugabe weiterer Fluorophorfarben, wie z. B. Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) oder Allophycocyanin (APC), sollten FMOs einbezogen werden, indem ein Fluorophor für jede FMO-Kontrolle ausgeschlossen wird.
Ergänzungsdatei 1: Lebendzellzählung mit Hämatozytometer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
In der Literatur gibt es einige Hinweise auf das Vorhandensein von Epithelzellen im Knochenmark. Bisher wurde in der Regel die Rolle von Epithelzellen im Zusammenhang mit Krankheiten und Verletzungen untersucht, z. B. in Leber, Lunge, Magen-Darm-Trakt, Thymusdrüse und Haut14,15,16,17. Über das Vorkommen dieser Epithelzellen im Knochenmark gesunder Personen ist jedoch nicht viel bekannt. Ziel dieser Arbeit ist es, eine reproduzierbare Methode zu etablieren, mit dem Ziel, Epithelzellen aus normalem Blut und Knochenmark zu identifizieren und zu isolieren. Diese Methode wird das Feld vorantreiben, um herauszufinden, warum Epithelzellen vorhanden sind und welche Rolle sie im Blut und Knochenmark spielen, wenn keine Krankheit vorliegt. Möglicherweise sind diese Zellen Teil der normalen Gewebeerhaltung oder werden bei Verletzungen aktiviert. Das Knochenmark ist ein Speicher für Stammzellen. Es ist jedoch unklar, was die Abstammung dieser Epithelzellen sein könnte. In einer kürzlich erschienenen Arbeit werden aus dem Knochenmark stammende Epithelzellen im Thymus diskutiert, die zunächst EpCAM und den hämatopoetischen Marker CD45 exprimieren und dann nach einer Verletzung im Laufe der Zeit ihre CD45-Expression verlieren15. Untersuchungen aus unserem Labor haben auch das Vorhandensein von CD45+ EpCAM+-Zellen in gesundem Blut und Knochenmark bestätigt, wenn keine Verletzung vorliegt12. Die Rolle dieser Zellen muss jedoch noch geklärt werden.
Es bestand Bedarf an einer reproduzierbaren Methode zur Untersuchung von Epithelzellen im gesunden Knochenmark. Die beschriebene Methode wird helfen, diese Zellen in ihrem Normalzustand weiter zu charakterisieren. Es gibt wichtige Schritte in dieser Methode, um die Reproduzierbarkeit zu erhalten. Einer der wichtigsten Schritte in diesem Protokoll ist die Aufrechterhaltung einer sterilen Umgebung in der Haube bei der Entnahme des Knochenmarks von Mäusen. Bei der Ernte von mehreren Mäusen wird eine Kreuzkontamination zwischen den Proben vermieden, indem für jede Maus neue Nadeln und Spritzen verwendet werden. Dadurch wird auch sichergestellt, dass die Probe sauber und frei von Verunreinigungen ist, die die Ergebnisse beeinträchtigen könnten. Darüber hinaus sollte die Anzahl der vorbereiteten Spritzen und beschrifteten konischen Röhrchen für jede weitere Maus erhöht werden. Ein weiterer wichtiger Schritt besteht darin, die Knochen zu spülen, bis eine saubere weiße Farbe sichtbar ist, um sicherzustellen, dass die meisten Knochenmarkzellen entfernt wurden. Die Chancen, seltene Zellen zu erkennen, erhöhen sich in einer reineren Probe. Es wurde eine Modifikation vorgenommen, um das Protokoll zur Lyse der roten Blutkörperchen zu optimieren. Es wurden mehrere Lysepuffer getestet, um den richtigen zu finden, der eine gleichbleibend hohe Viabilität lieferte, da fast die Hälfte der Zellen während dieses Schritts verloren ging. Unterschiedliche Reagenzien und Inkubationszeiten müssen möglicherweise optimiert werden, um in anderen Umgebungen bessere Ergebnisse zu erzielen.
Die bedeutendste Einschränkung dieses Protokolls ist die Verwendung der Durchflusszytometrie zum Auffinden seltener Zellpopulationen. Wie bereits erwähnt, trägt das Hinzufügen von Kontrollen und inkrementellen Zählungen dazu bei, die Spezifität und Genauigkeit der Analyse zu erhöhen. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass geeignete Marker für die interessierende Population im Voraus identifiziert werden müssen. Daher muss man über wichtige Marker, Antikörper für die Durchflusszytometrie und Antikörper, die mit der Zielspezies kompatibel sind, Bescheid wissen.
Diese Methoden stellen eine Verbesserung gegenüber bestehenden Methoden dar, da sie die Einzelzellanalyse zu einem Bruchteil der Kosten des bestehenden automatischen CTC-Isolators und der Einzelzell-RNA-Sequenzierung ermöglichen. Darüber hinaus ist die Durchflusszytometrie leichter verfügbar. FACS behielt eine höhere Viabilität der Zellen im Vergleich zu früheren berichteten Ergebnissen unter Verwendung der magnetischen Mikroperlentrennung bei. Schließlich ermöglichen diese Techniken die Trennung von Zellen für nachgelagerte Analysen, wie z. B. die Bulk-RNA-Sequenzierung, die scRNA-Sequenzierung oder die Zellkultur.
Disclosures
Interessenkonflikte sind nicht bekannt.
Acknowledgments
Josh Monts, Durchflusszytometer-Techniker der Core Facility, Hormel Institute
Todd Schuster, Core Facility Manager, The Hormel Institute
Derek Gordon, Statistiker, Rutgers University
Wir bedanken uns bei Karen Klein von Clarus Editorial Services, Santa Fe, NM für ihre redaktionelle Unterstützung.
Diese Arbeit wurde teilweise vom National Institute of Arthritis and Muskuloskeletal and Skin Diseases der National Institutes of Health unter der Fördernummer R21 AR075281 und einem Grant-in-Aid of Research, Artistry and Scholarship, Office of the Vice President for Research, University of Minnesota (Vorschlag #324240) unterstützt. Wir bedanken uns für die Unterstützung durch das Hormel Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes used for flow cytometry |
| 500 mL jar with lid | Nalgene | 11-823-32 | Used to wash the mouse |
| 190 proof Ethanol | Decon laboratories Inc | 2801 | Diluted to 70% with dH2O |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | Dilution: 1:1000 |
| Brightline Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-10 | Used to count alive cells |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Component of antibody diluent |
| Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Component of staining buffer and harvesting solution |
| Curity gauze sponges | Covidien | 2187 | Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow |
| Curved Forceps | Miltex | 18-784 | Used during harvest |
| Cytokeratin, Wide Spectrum Screening | Dako | Z0622 | Dilution 1:750 *Now discontinued |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) | Gibco | 14190-144 500mL | Used to stop the red blood cell lysis reaction |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E9884-100G | Used at 0.5 M |
| Gentamicin sulfate | Lonza | 17-518Z | Component of harvesting solution |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) | Gibco | 14175-095 500mL | Component of harvesting solution and staining buffer solution |
| Luer-Lok tip 10 mL syringe | Becton, Dickinson and Co | 309604 | Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps |
| Magic touch 2 ice bucket | BelArt | M16807-2001 | Used to store the specimens on ice |
| Nonfat dry milk | Apex | 20-241 | Component of Antibody Diluent |
| Normal horse serum | Vector | ZE0122 | Component of Antibody Diluent |
| PE anti-human CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 324206 | Dilution: 5 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 118205 | Dilution: 3 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE mouse IgG2b, κ isotype control | Biolegend | 400313 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat anti-human CD49f | BD Biosciences | 555763 | Dilution: 20 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat IgG2am, κ Isotype control | Biolegend | 400508 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Basix | 14-955-240 | Used in the centrifuge |
| Povidone-Iodine Scrub | Aplicare | 82-227 | Antiseptic used to sterilize the mice |
| PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305176 | 20G needle used to break up bone marrow clumps |
| PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305111 | 26G needle used to flush bone marrow from bones |
| PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Services | 63422-06 | 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence |
| RBC Lysis buffer 10X | Invitrogen | 00-4300-54 | Dilution 1:10 using sterile deionized water |
| Scissors | Roboz | RS-6762 | Used during harvest |
| Stainless steel surgical blade #4 | Bard-Parker | 371222 | Used during harvest |
| Sterile tray | Polar ware | 10F | Used during harvest |
| StretchEase Powder-free nitrile examination gloves | Denville Scientific | G4161 | Used during harvest |
| Surgical Scalpel handle #4 | Fischer | 12-000-164 | Used with surgical blade |
| TBS 20x | Thermo | Component of TBST, used at 1X | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Used to count dead cells. Filtered with .45 µm |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-500mL | Component of TBST |
| Tweezers | Miltex | 6-8 | Used during harvest |
| Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1800 | Nuclear stain for immunofluorescence |
References
- Larsen, S. B., Cowley, C. J., Fuchs, E.
- Blanpain, C., Fuchs, E. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration. Science. 344 (6189), 1242281 (2014).
- Coradini, D., Casarsa, C., Oriana, S. Epithelial cell polarity and tumorigenesis: New perspectives for cancer detection and treatment. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (5), 552-564 (2011).
- Dmello, C., et al. Multifaceted role of keratins in epithelial cell differentiation and transformation. Journal of Biosciences. 44 (2), 33 (2019).
- Poulet, G., Massias, J., Taly, V.
- Eslami-S, Z., Cortés-Hernández, L. E., Alix-Panabières, C. Epithelial cell adhesion molecule: an anchor to isolate clinically relevant circulating tumor cells. Cells. 9 (8), 1836 (2020).
- Morris, R. J. Circulating tumor cells: quintessential precision oncology presenting challenges for biology. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 16 (2017).
- Lin, D., et al. Circulating tumor cells: biology and clinical significance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 404 (2021).
- Spence, M., Adai, S., Landon, T., Richter, G. Few and far between: Tools and strategies for rare-event detection using flow cytometry. BioprobesJournal of Cell Biology. 71, 14-18 (2015).
- Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. Journal of Cell Biology. 192 (3), 373-382 (2011).
- Ye, Q., Ling, S., Zheng, S., Xu, X. Liquid biopsy in hepatocellular carcinoma: circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Molecular Cancer. 18 (1), 114 (2019).
- Park, H., et al. marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
- Marsman, W. A., et al. Epithelial cells in bone marrow: do they matter. Gut. 54 (12), 1821-1822 (2005).
- Borue, X., et al. marrow-derived cells contribute to epithelial engraftment during wound healing. The American Journal of Pathology. 165 (5), 1767-1772 (2004).
- Chakrabarti, S., et al. marrow-derived cells contribute to the maintenance of thymic stroma including TECs. Journal of Immunology Research. 2022, 6061746 (2022).
- Krause, D. S., et al. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell. 105 (3), 369-377 (2001).
- Wong, A. P., et al. Targeted cell replacement with bone marrow cells for airway epithelial regeneration. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L740-L752 (2007).
