Summary
В этой статье представлен воспроизводимый метод с новыми данными о наличии эпителиальных клеток в нормальной крови и костном мозге человека и мыши с использованием проточной цитометрии и иммунофлуоресцентной микроскопии. Трансгенные мыши Krt1-14;mTmG были использованы в качестве метода in vivo для подтверждения этих результатов.
Abstract
Эпителиальные клетки были идентифицированы в крови и костном мозге пациентов с раком и другими заболеваниями. Тем не менее, наличие нормальных эпителиальных клеток в крови и костном мозге здоровых людей еще предстоит определить последовательным образом. Здесь представлен воспроизводимый метод выделения эпителиальных клеток из здоровой крови и костного мозга человека и мышей с помощью проточной цитометрии и иммунофлуоресцентной (ИФ) микроскопии. Эпителиальные клетки у здоровых людей были впервые идентифицированы и выделены с помощью проточной цитометрии с использованием молекулы адгезии эпителиальных клеток (EpCAM). Было подтверждено, что эти клетки EpCAM+ экспрессируют кератин с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии у трансгенных мышей Krt1-14;mTmG. Образцы крови человека содержали 0,18% ± 0,0004 клеток EpCAM+ (SEM; n = 7 биологических репликатов, 4 экспериментальных репликации). В КМ человека 3,53% ± 0,006 (SEM; n = 3 биологических репликаты, 4 экспериментальные репликации) мононуклеарных клеток были EpCAM+. В крови мышей клетки EpCAM+ составляли 0,45% ± 0,0006 (SEM; n = 2 биологических репликаты, 4 экспериментальные репликации), а в крови мышей BM 5,17% ± 0,001 (SEM; n = 3 биологических репликаты, 4 экспериментальные репликации) были EpCAM+. У мышей все клетки EpCAM+ были иммунореактивны к пан-цитокератину, что было определено с помощью IF-микроскопии. Результаты были подтверждены на трансгенных мышах Krt1-14;mTmG, с низким (8,6 нативных клеток GFP+ на 10 проанализированных клеток6 ; 0,085% жизнеспособных клеток), но значимым количеством (p < 0,0005) клеток GFP+, присутствующих в нормальной БМ мышей, которые не были результатом случайности по сравнению с множественным отрицательным контролем. Кроме того, клетки EpCAM+ в крови мышей были более гетерогенными, чем клетки CD45+ (0,58% в BM; 0,13% в крови). Эти наблюдения позволяют сделать вывод о том, что клетки, экспрессирующие белки цитокератина, воспроизводимо обнаруживаются среди мононуклеарных клеток из крови человека и мышей и БМ. Мы демонстрируем метод забора тканей, проточной цитометрии и иммуноокрашивания, который может быть использован для идентификации и определения функции этих эпителиальных клеток панцитокератина у здоровых людей.
Introduction
Эпителиальные клетки находятся в физических барьерах между нашим телом и окружающей средой и способны распознавать и реагировать на изменения в их микроокружении1. У них есть пролиферирующая ниша стволовых клеток, которая обеспечивает способ переворачивания новой ткани и восстановления повреждений2. Наша лаборатория изучает стволовые клетки в волосяных фолликулах кожи; Кожа является хорошей моделью для изучения эпителиальной ткани и пролиферации стволовых клеток, потому что она хорошо видна и происходит постоянный оборот клеток. Эпителиальный рак является наиболее распространенной формой рака, возможно, из-за того, что эпителиальные ткани, такие как кожа, являются первой линией защиты от канцерогенов окружающей среды, что приводит к высокой скорости обновления и пролиферации эпителиальных клеток3. Большая часть эпидермиса кожи, верхнего защитного слоя, состоит из кератиноцитов, которые экспрессируют различные типы кератинов для обеспечения поддержки и структуры4. Пациенты с эпителиальным раком часто имеют эпителиальные клетки, присутствующие в крови и костном мозге, которые также экспрессируют кератины. Жидкостная биопсия является неинвазивным способом обнаружения и мониторинга этих эпителиальных клеток в различных жидкостях организма5. Циркулирующие эпителиальные клетки, также называемые циркулирующими опухолевыми клетками (ЦОК), обнаруживаются в периферической крови и могут быть биомаркерами для прогноза рака, а также служить руководством для индивидуального лечения. ЦОК также могут указывать на прогрессирование заболевания, эффективность лечения и общую выживаемость пациентов 5,6.
Молекула адгезии эпителиальных клеток (EpCAM) является клинически используемым маркером ЦОК и может идентифицировать опухоли эпителиального происхождения у онкологических больных. EpCAM играет роль в клеточной адгезии, миграции, передаче сигналов, пролиферации и дифференцировке6. Чтобы циркулирующая эпителиальная клетка была классифицирована как CTC, она должна быть положительной для цитокератинов 8, 18 и 19 и отрицательной для CD45, общего лейкоцитарного маркера6. ЦОК обычно идентифицируют путем сначала истощения CD45 магнитными микрошариками с последующим тестированием на EpCAM и цитокератин 19 с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии7. Основным ограничением в обнаружении ЦОК является их редкость; Они составляют менее 0,01% всех клеток крови, и очень немногие выживают в кровообращении, чтобы достичь отдаленных органов 8,9,10. Необходимо учитывать при разработке экспериментов и методов выделения и идентификации этих клеток из-за их редкой природы. В настоящее время существует только один одобренный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) автоматизированный одноклеточный сортировщик, используемый для идентификации ЦОК, и он использует EpCAM в качестве биомаркера. Другие методы включают магнитное разделение шариков и проточную цитометрию или комбинацию этих методов. Существует потребность в новых методах, обладающих более высокой чувствительностью и специфичностью для обнаружения редких ЦОК11.
Проточная цитометрия является предпочтительным методом обнаружения редких клеточных популяций в крови, костном мозге и других образцах тканей. Эти редкие клетки могут включать стволовые клетки, циркулирующие эндотелиальные клетки, ЦОК и остаточные клетки заболевания. Проточная цитометрия позволяет проводить количественные измерения каждого типа клеток и сортировать эти клетки для дальнейшего тестирования 7,9. Инкрементные подсчеты были выполнены, чтобы обеспечить точную оценку этих редких клеток. Возможность использования стробирования для исключения клеток из дальнейшего анализа — это способ повысить специфичность при анализе клеток. Ограничениями проточной цитометрии являются время, необходимое для анализа больших образцов, и отсутствие визуального подтверждения идентичности клеток. Чтобы преодолеть это, иммунофлуоресцентная микроскопия была проведена на отсортированных клетках для подтверждения их идентичности.
Ранее наша лаборатория показала, что у мышей клетки костного мозга рекрутируются и способствуют образованию опухолей кожи12. Эти клетки, полученные из костного мозга, являются положительными для пан-цитокератина и эпидермального цитокератина. Для дальнейшего выяснения роли эпителиальных стволовых клеток, клеток, полученных из костного мозга, и клеток, экспрессирующих цитокератин, в прогрессировании опухоли были найдены цитокератин-положительные клетки EpCAM+ в нормальных образцах крови и костного мозга мышей и человека. Как и в большинстве экспериментов, этот метод был разработан путем нескольких итераций. Ранее трансгенные мыши использовались вместе с инкрементным подсчетом для поиска K14GFP-экспрессирующих клеток в костном мозге12. По мере подсчета большего количества клеток удалось идентифицировать репрезентативную популяцию редких клеток, как показано на рисунке 1 в разделе репрезентативных результатов. Обоснование исследования эпителиальных клеток в нормальной крови и костном мозге было основано на ранней литературе по ЦОК, где нормальные здоровые доноры имели фоновые уровни клеток EpCAM+13. Как упоминалось ранее, характеристика EpCAM часто начинается с истощения CD45. Этот шаг был опущен, потому что некоторые гемопоэтические клетки имеют экспрессию EpCAM и цитокератина по неизвестным причинам, которые нуждаются в дальнейшем исследовании. Таким образом, клетки были отсортированы на основе наличия или отсутствия EpCAM, независимо от клеточной линии, а затем иммуноокрашены на цитокератин. Приведенный ниже протокол и рабочий процесс, показанный на рисунке 2 , описывают метод, который использует проточную цитометрию с компенсацией и контролем, статистические методы и иммунофлуоресцентную визуализацию для выделения и идентификации этих редких популяций эпителиальных клеток.
Protocol
Все протоколы для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Миннесоты в соответствии с NIH и федеральными руководящими принципами. Свежая человеческая кровь и костный мозг были закуплены из коммерческих источников. Образцы были собраны компанией в соответствии с утвержденным протоколом IRB у доноров с отрицательным результатом на ВИЧ, гепатит В, гепатит С и проверены на COVID-19. Все образцы были сначала обезличены и анонимизированы перед отправкой компанией. Поскольку они были получены коммерчески, одобрение IRB не требовалось.
1. Приготовление растворов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы должны быть приготовлены в биологическом колпаке со стерильной средой. Получить сертификат уровня биобезопасности 2 (BSL2) для работы с кровью и костным мозгом человека.
- Приготовьте раствор для сбора костного мозга, добавив 1 мл гентамицина и 5 мл эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) к 500 мл раствора балансовой соли Хэнка (HBSS).
- Приготовьте буферный раствор для окрашивания, добавив 50 мл FBS к 500 мл HBSS.
- Приготовьте 1x буфер для лизиса, смешав 10 мл 10-кратного буфера для лизиса с 90 мл стерильной воды.
2. Подготовка вытяжки
- Включите вытяжку и дайте ей поработать несколько минут, чтобы получить надлежащий поток воздуха.
- Соберите все материалы для проведения заготовки костного мозга. Распылите на них внутри капюшона 70% этанол для поддержания стерильной среды. Опрыскивайте руки каждый раз, прежде чем они будут взяты внутрь капюшона.
- Поместите автоклавный лоток в капюшон вместе с автоклавными ножницами, собранным скальпелем, пинцетом и изогнутыми щипцами в небольшую чашку, наполненную 70% этанолом, чтобы они оставались стерильными.
- Добавьте 10 мл раствора для заготовки костного мозга в одну центрифужную пробирку объемом 50 мл и пометьте ее «Конечности». Пометьте еще одну центрифужную пробирку объемом 50 мл как «Костный мозг».
- Наберите 10 мл раствора для сбора костного мозга в шприц, а затем приложите иглу 26 г.
3. Забор костного мозга у мышей
- Усыпьте мышь с помощью удушья CO2 . Смерть подтверждается отсутствием сердцебиения и защемлением ног, чтобы убедиться в отсутствии реакции. Вывих шейки матки может быть выполнен как вторичный способ полной эвтаназии.
- Поместите мышь в контейнер объемом 500 мл и добавьте достаточно йода, чтобы покрыть половину мыши. Аккуратно встряхните и встряхните контейнер, чтобы обеспечить тщательное покрытие. Смойте деионизированной водой. Выполните еще одну йодную промывку, а затем две стирки с 70% этанолом, выполнив те же действия.
- Поместите мышь в капюшон и положите ее на спину на лоток. Возьмитесь за задние лапы и раздвиньте их до тех пор, пока не почувствуется хлопок; Это делается для того, чтобы отделить ноги от позвоночника.
- Сделайте надрез в 1 см на коже мыши в области паха. Вставьте закрытые ножницы в разрез, а затем откройте ножницы под кожей, чтобы отделить ее от брюшины.
- Разрежьте кожу на ноге вокруг бедра, а затем срежьте кожу вниз по ноге, чтобы обнажить мышцы и кости.
- Удалите задние лапы, разрезав вокруг тазобедренного сустава, стараясь не прорезать бедренную кость. Поместите конечности в трубку с надписью «Конечности» Когда обе ноги будут удалены, поместите мышь в пакет для тушки и положите ее в морозильную камеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тазобедренная кость должна быть прощупана перед разрезанием, чтобы направлять ножницы и избегать разрезания бедренной кости, так как большая часть костного мозга получается из бедренной кости. - Начните отрезать мышцы, ткани и жир вдоль одной из конечностей с помощью ножниц. Разрежьте параллельно косточке. Затем используйте скальпель и удалите оставшийся жир или мышцы, используя перпендикулярные соскабливающие движения по кости.
- После того, как кость будет очищена должным образом, отделите бедренную и большеберцовую кости в колене. Используйте скальпель, чтобы сделать надрезы на обоих концах бедренной и большеберцовой костей, где нет видимого костного мозга.
- Вставьте подготовленный шприц и иглу в кость. Если есть сопротивление, отрежьте еще немного от конца кости, пока сопротивление не исчезнет.
- Удерживая кость над трубкой, помеченной как «костный мозг», вытесните раствор для сбора костного мозга через кость, чтобы промыть костный мозг в трубку. Повторите то же самое на другом конце кости, чтобы получить остальную часть костного мозга, пока кость не станет белой или пустой.
- Повторите шаги 7-9 для всех оставшихся костей и конечностей; Весь костный мозг будет промываться в одну и ту же коническую трубку.
- Используя пустой шприц объемом 10 мл и иглу 20 г, разбейте комки костного мозга в трубке, протягивая костный мозг вверх и вниз в шприце 5-10 раз.
- Добавьте стерильный фильтр 40 мкм в чистую центрифужную пробирку объемом 50 мл и промойте ее 1 мл раствора для заготовки костного мозга. Затем отфильтруйте костный мозг, чтобы удалить оставшиеся комки. Пометьте этот тюбик «Фильтрованный костный мозг».
- Храните отфильтрованный костный мозг в холодильнике или на льду до использования. Его следует использовать в тот же день, что и сбор урожая. Если они не используются в тот же день, заморозьте клетки с помощью криоконсерванта, такого как диметилсульфоксид (ДМСО).
ВНИМАНИЕ: Все отходы этих экспериментов следует правильно утилизировать в контейнере для биологически опасных отходов. Все острые предметы должны быть помещены в контейнер для острых предметов биологической опасности с надлежащей маркировкой.
4. Лизис эритроцитов костного мозга
- Центрифугируют клетки костного мозга при дозе 170 x g в течение 10 мин при комнатной температуре. Пропылесосьте и утилизируйте надосадочную жидкость. Ресуспендировать клетки в 10 мл 1x буфера для лизиса эритроцитов и инкубировать в течение 4 минут.
- Добавьте 30 мл фосфатного буферного физиологического раствора Дульбекко (DPBS), чтобы остановить реакцию буфера лизиса. Центрифугируют клетки в течение 8 мин при 170 x g при комнатной температуре. Пропылесосьте и утилизируйте надосадочную жидкость. Ресуспендировать в 10-20 мл окрашивающего буфера.
5. Количество ячеек
- Смешайте 500 мкл клеток с 9,5 мл раствора для заготовки костного мозга, чтобы получить разведение 1:20.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет использоваться для подсчета клеток и не должно быть стерильным. - Вытяните 200 мкл клеток из разведения 1:20, добавьте их к 200 мкл трипанового синего и хорошо перемешайте.
- Добавьте смесь в гемоцитометр и подсчитайте живые и мертвые клетки с обеих сторон. Рассчитайте исходную суспензию ячейки, используя эту таблицу (показанную в дополнительном файле 1) и уравнения:
Клеток на миллилитр:
Всего ячеек:
- Отжимают клетки при 170 x g в течение 10 мин при 4 ° C и ресуспендируют до концентрации 10 x 10 6 на 1 мл (1 x 106 клеток на 100 мкл) в зависимости от предложений производителя по разведению антител.
- Приступайте к проточной цитометрии (шаг 8).
6. Забор крови у мышей
- Усыпьте мышь с помощью газа CO2 или вывиха шейки матки.
- Выполните забор сердечной крови под углом 45 ° с помощью иглы 26 G, прикрепленной к шприцу объемом 1 мл, покрытому 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА).
- Отжимайте кровь и ресуспендируйте в среде или в буфере для окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки будут раскручиваться и ресуспендироваться до конечной концентрации в окрашивающем буфере после лизиса эритроцитов и подсчета клеток. - Выполните лизис эритроцитов (шаг 4).
- Выполните подсчет ячеек (шаг 5).
- Приступайте к проточной цитометрии (шаг 8).
7. Обработка образцов крови и костного мозга человека
- Выполняйте все процедуры под сертифицированным BSL2 капюшоном в средствах индивидуальной защиты.
- Соберите образцы предыдущей ночью и проведите лизис эритроцитов. Убедитесь, что образцы деидентифицированы и анонимизированы, прежде чем отправлять моноядерные образцы на ночь по льду.
- По прибытии отжимайте живые клетки при 170 x g при 4 ° C в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это образцы BSL2, которые должны соответствовать местным правилам. - Ресуспендируют клетки в среде или окрашивающем буфере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть раскручены и ресуспендированы до конечной концентрации после подсчета клеток с помощью окрашивающего буфера. - Выполните подсчет ячеек (шаг 5).
- Приступайте к проточной цитометрии (шаг 8).
8. Проточная цитометрия
- Окрашивание
- Разделите клетки на индивидуально помеченные пробирки в зависимости от используемой панели окрашивания, включая компенсационные средства контроля (неокрашенные, изотипические контрольные, одиночные окрашенные и флуоресцентные минусовые [FMO]). Заморозьте все оставшиеся клетки или используйте их для сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. В таблице 1 приведен пример окрашивающей панели с используемыми разведениями антител.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого дополнительного добавленного флуорофора ФМО в сочетании с оставшимися флуорофорами должны быть добавлены вместе с одним окрашиванием этого флуорофора. Контроль изотипов может быть использован для блокировки неспецифического окрашивания. Каждое новое используемое антитело следует титровать образцами для оптимального разведения. - Добавьте антитела в соответствии с рекомендованными производителем разведениями и хорошо перемешайте, щелкая по дну пробирок. Концентрации антител обычно дают как 1 х 106 клеток на 100 мкл. Разведения антителами и контроль показаны в таблице 1. Антитела конъюгированы с флуорофорами и должны быть защищены от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего использовать EpCAM, конъюгированный с фикоэритрином (ПЭ), чтобы визуализировать низкие популяции клеток (титрование в концентрации 3-5 мкл на 1 миллион клеток, как указано в таблице 1). PE-CD49f использовался в качестве одиночного контроля окрашивания PE (20 мкл на 1 миллион клеток), поскольку эти клетки более распространены, чем PE-EpCAM, и, следовательно, их легче использовать для компенсации. - Инкубировать 30 мин при 4 °C в темноте.
- После инкубации верните пробирки в колпак BSL2 и добавьте 1 мл буфера для окрашивания в каждую пробирку.
- Затем центрифугируйте пробирки при 170 x g при 4 ° C в течение 5-10 мин.
- После центрифугирования верните закрытые пробирки с клетками обратно в колпак BSL2 и аспирируйте надосадочную жидкость. Обязательно меняйте наконечники аспирационной пипетки между каждой трубкой, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл окрашивающего буфера и перемешайте по дну пробирок.
- Промойте ячейки еще два раза, повторив шаги 8.1.4-8.1.7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте пипетки для ресуспендирования, чтобы избежать потери клеток. - Ресуспендировать в 500 мкл окрашивающего буфера для окончательной ресуспензии перед проточной цитометрией. Добавьте 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) или дискриминатор мертвых клеток в соответствии с рекомендациями производителя.
- Разделите клетки на индивидуально помеченные пробирки в зависимости от используемой панели окрашивания, включая компенсационные средства контроля (неокрашенные, изотипические контрольные, одиночные окрашенные и флуоресцентные минусовые [FMO]). Заморозьте все оставшиеся клетки или используйте их для сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. В таблице 1 приведен пример окрашивающей панели с используемыми разведениями антител.
- Проточный цитометр
- После настройки машины используйте элементы управления и FMO для настройки компенсации и ворот. Используйте сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) в качестве жидкости для оболочки, чтобы помочь поддержать хрупкие клетки. Используйте PBS, если HBSS недоступен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый проточный цитометр и программное обеспечение перечислены в таблице материалов. - Загружайте образцы по одному и собирайте точки данных для 50 000, 100 000, 500 000 и одного миллиона событий. Храните трубки на льду или в холодильнике до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе может быть установлен лимит времени, чтобы обеспечить жизнеспособность образца. - Соберите клетки в 3 мл RPMI с 10% FBS в центрифужных пробирках объемом 15 мл.
- При выполнении иммунофлуоресценции на клетках EpCAM+ используйте проточный цитометр для сортировки от 800 до 1000 клеток в каждую лунку 8-луночного предметного стекла.
- Отсортируйте популяцию клеток EpCAM на отдельных предметных стеклах в качестве отрицательного контроля для использования при окрашивании для иммунофлуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки также могут быть отсортированы по 15 мл пробирок, содержащих FBS, и вращаться на предметном стекле с помощью цитоцентрифуги или пипетки, чтобы предотвратить лопание клеток. - Закрепите предметные стекла в смеси 50% метанола и ацетона при -20 °C в течение 10 мин. Хранить предметные стекла при температуре -20 °C до окрашивания иммунофлуоресценцией.
- После настройки машины используйте элементы управления и FMO для настройки компенсации и ворот. Используйте сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) в качестве жидкости для оболочки, чтобы помочь поддержать хрупкие клетки. Используйте PBS, если HBSS недоступен.
- Анализ проточной цитометрии
- Откройте лицензированное программное обеспечение для анализа проточной цитометрии.
- Загрузите файлы стандарта проточной цитометрии (FCS), полученные с проточного цитометра, с элементами управления и образцами.
- Нажмите кнопку Создать группу и используйте ключевые слова для размещения образцов и элементов управления в группе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте элемент управления «без пятен» для входа в программное обеспечение для анализа проточной цитометрии, как показано на рисунке 3. - Дважды щелкните образец контроля без пятен, чтобы открыть незапятнанный график.
- Установите для графика ось Y значение SSC-A, а для оси x — значение FSC-A (площадь бокового рассеяния по площади прямого рассеяния), что указывает на размер ячейки и внутреннюю сложность.
- Нажмите на фигуру многоугольника в верхней левой панели и создайте ворота вокруг ячеек. Обязательно исключите клетки на периферии, так как это, скорее всего, мусор. Назовите эти ворота «Ячейки», как показано на рисунке 3A.
- После того, как ячейки закрыты, дважды щелкните внутри многоугольника, чтобы открыть другой график в новом окне.
- Установите ось Y нового графика на SSC-A, а ось x — на SSC-W для дуплетного различения. Щелкните фигуру многоугольника и создайте прямоугольник вокруг отдельных ячеек. Назовите это «Одиночные ячейки», как показано на рисунке 3B.
- После того, как ячейки закрыты, дважды щелкните внутри многоугольника, чтобы открыть другой график в новом окне.
- Установите ось Y на FSC-A и ось X на DAPI-A (или любой другой используемый дискриминатор мертвых клеток).
- Создайте полигональный вентиль вокруг отрицательных ячеек DAPI в левой части графика. Пометьте их «живыми клетками», как показано на рисунке 3C.
- После того, как ячейки закрыты, дважды щелкните внутри многоугольника, чтобы открыть другой график в новом окне.
- Установите ось Y на SSC-A и ось X на EpCAM-PE (или любой другой флуорофор, используемый для идентификации клеток EpCAM). Ячейки слева отрицательны по EpCAM. Если какие-либо ячейки показаны справа, они являются положительными по EpCAM.
- Используйте график EpCAM-PE для создания полигонального вентиля, который исключает ячейки слева и включает только пустое пространство справа. Пометьте пустую область справа внутри полигона «EpCAM», как показано на рисунке 3D.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это не контроль пятен, поэтому не должно быть выражения EpCAM. Используйте контроль отсутствия пятен, чтобы определить, какие клетки являются положительными по EpCAM. Это завершает стратегию стробирования для компенсации, поэтому все графики могут быть закрыты в это время. - На странице рабочей области выделите родословную без пятен с помощью «Клетки», «Одиночные ячейки», «Живые клетки» и «EpCAM». Щелкните правой кнопкой мыши и выберите Копировать анализ для группировки. При этом стратегия стробирования копируется на все остальные загруженные образцы в ранее созданной группе. Если группа не была создана изначально, ее можно создать сейчас, выбрав « Создать группу » в левом верхнем углу.
- Просмотрите образцы в группе и проверьте нарисованные ранее полигональные вентили, чтобы убедиться, что они соответствуют всем образцам и элементам управления. Это обеспечивает процентное количество и количество ячеек.
- Нажмите кнопку редактора макетов L в верхнем левом углу над «Рабочим пространством». Затем эти графики могут быть упорядочены и экспортированы с помощью редактора макета.
- Приготовление иммунофлюоресцентных реагентов
- Приготовьте разбавитель антител, смешав 1 г бычьего сывороточного альбумина (BSA), 2 г обезжиренного молока, 10 мл 10x трис-буферизованного физиологического раствора (TBS), 100 мкл Tween и 90 мл дистиллированной воды.
- Приготовьте TBST, объединив 50 мл 20x TBS, 950 мл дистиллированной воды и 200 мкл Tween.
- Приготовьте 10% нормальную сыворотку для лошадей (NHS), объединив 1 мл NHS с 9 мл разбавителя антител (этап 8.4.1).
- Приготовьте 1% NHS, объединив 1 мл 10% NHS с 9 мл TBST.
- Иммунофлюоресцентное окрашивание
- Снимите предметные стекла с -20 °C и дайте им нагреться до комнатной температуры.
- Промойте предметные стекла три раза в дистиллированной воде по 5 минут каждый.
- Блокировать предметные стекла на 1 ч при комнатной температуре в 10% NHS в разбавителе антител (этап 8.4.3).
- Разбавьте первичное антитело (пан-цитокератин) до 1:750 в 1% NHS при TBST (этап 8.4.4). Инкубируйте предметные стекла в разбавленном первичном антителе в течение ночи при 4 ° C.
- На следующий день промойте предметные стекла три раза с помощью 1x буфера для стирки (PBS или TBST) в течение 5 минут каждый.
- Разбавьте вторичное антитело до 1: 1,000 в 1% NHS в TBST (шаг 8.4.4). Инкубируют предметные стекла в разбавленном вторичном антителе в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Промойте предметные стекла три раза с 1x буфером для стирки в течение 5 минут каждый. Установите и накройте слайды жесткими монтажными носителями с DAPI. Используйте ватный тампон, чтобы аккуратно раскатать пузырьки под покровным стеклом.
Representative Results
С помощью этих методов были визуализированы редкие популяции эпителиальных клеток в крови и костном мозге нормальных людей и мышей. При надлежащей компенсации и контроле, как описано, результаты, которые последовательно показали, что 4-5% клеток в костном мозге мыши были EpCAM +, независимо от того, сколько клеток было подсчитано, как показано на рисунке 4 и рисунке 5. В образцах крови мышей менее 0,5% клеток были EpCAM+, как показано на рисунке 6. В образцах костного мозга человека 2-5% клеток были EpCAM+, как показано на рисунках 7 и 8. В то время как 2-5% - это большой диапазон, проценты в каждом отдельном доноре были постоянными, поскольку подсчитывалось все больше клеток. В образцах крови человека около 0,3% клеток были EpCAM+, как показано на рисунке 9. Наши контрольные образцы (без окрашивания, контроль изотипа и FMO) дали очень мало ложноположительных результатов EpCAM+, как показано на рисунках 4 и 7. Клетки из групп EpCAM+ и EpCAM-, которые были отсортированы по предметным стеклам, показали положительное окрашивание на пан-цитокератин в образцах EpCAM+ и были отрицательными на пан-цитокератин в образцах EpCAM-, как показано на рисунке 10. Эти результаты указывают на то, что эксперименты были надлежащим образом спланированы и воспроизводимы.
Рисунок 1: Трансгенные мыши Krt14Cre;mTmG с постепенным подсчетом костного мозга. Костный мозг мышей Krt1-14;mTmG подсчитывали постепенно. GFP-положительные клетки указывают на экспрессию кератина 14 и были идентифицированы с помощью проточной цитометрии. По мере того, как подсчитывалось больше клеток костного мозга, эта кератиновая 14-положительная клеточная популяция была более легко идентифицирована. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Рабочий процесс для клеток EpCAM+ и цитокератина+. Клетки костного мозга и крови были сначала отсортированы с использованием флуоресцентной активированной клеточной сортировки (FACS) для разделения EpCAM+ и EpCAM-клеток. Эти клетки были отсортированы по двум разным пробиркам, а также по двум разным предметным стеклам. Клетки, отсортированные по пробиркам, были раскручены на предметных стеклах с помощью цитоцентрифуги. Затем предметные стекла окрашивали с использованием первичного антитела пан-цитокератина, а затем окрашивали вторичным антителом. Предметные стекла были проанализированы с помощью флуоресцентной микроскопии для наблюдения экспрессии панцитокератина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Программное обеспечение для анализа проточной цитометрии. При анализе данных проточной цитометрии с использованием аналитического программного обеспечения для выбора интересующих клеток используется контроль отсутствия пятен. Клетки сначала отбираются с помощью SSC-A и FSC-A, которые показывают внутреннюю сложность и размер клеток. (A) Вокруг ячеек нарисованы многоугольники. (B) Одиночные клетки приобретаются путем стробирования SSC-A с помощью SSC-W. (C) Живые клетки приобретаются путем стробирования FSC-A по сравнению с DAPI. (D) Отрицательные клетки EpCAM исключаются путем стробирования справа от отрицательных клеток EpCAM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Проточный цитометрический анализ клеток EpCAM+ в костном мозге мыши. Элементы управления без окрашивания, изотипа и FMO показаны на верхней панели, а добавочные счетчики 50 000, 100 000 и 500 000 ячеек показаны на нижней панели. Эти диаграммы визуализируют согласованность в процентах по счетчикам, несмотря на общее увеличение общего количества подсчитанных ячеек. Панели справа указывают на стратегию стробирования, как обсуждалось ранее в разделе анализа проточной цитометрии и как показано на рисунке 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Клетки EpCAM+ в костном мозге мыши составляют 5,17% ± 0,001% населения. Были проанализированы клетки костного мозга трех отдельных мышей. Соответствующие средства контроля были включены для надлежащей научной строгости. Процент положительных клеток оставался неизменным во всех образцах из-за того, что мыши были генетически идентичны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Клетки EpCAM+ в крови мышей составляют 0,45% ± 0,0006% населения. Были проанализированы клетки крови двух отдельных мышей. Контрольные испытания были включены, чтобы показать, что для получения окончательных результатов была соблюдена надлежащая процедура. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Проточный цитометрический анализ костного мозга человека EpCAM+. Элементы управления без окрашивания, изотипа и FMO отображаются на верхней панели, а добавочные счетчики 50 000, 100 000 и 500 000 ячеек отображаются на нижней панели. Эти диаграммы визуализируют согласованность в процентах по подсчетам, несмотря на общее увеличение общего количества подсчитанных ячеек. Панели справа указывают на стратегию стробирования, как обсуждалось ранее в разделе анализа проточной цитометрии и как показано на рисунке 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Клетки EpCAM+ в костном мозге человека составляют 3,53% ± 0,006% населения. Были проанализированы три разных образца костного мозга человека. Были включены соответствующие меры контроля за научной строгостью. Процент положительных клеток варьируется из-за генетической гетерогенности среди людей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Клетки крови человека EpCAM+ составляют 0,18% ± 0,0004% населения. Были проанализированы три разных образца крови человека. Были включены соответствующие меры контроля за научной строгостью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Иммунофлуоресценция EpCAM+ и EpCAM-слайдов. FACS использовался для разделения EpCAM+ и EpCAM-клеток. Пан-цитокератин был окрашен для использования панцитокератинового антитела DAKO. Первичный контроль антител в нормальной сыворотке крови не использовался, так как пан-цитокератин является поликлональным антителом. Эти результаты подтверждают точность СУИМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Костный мозг или кровь человека | |||
| Антитело | Тюбик # | # ячеек | АБ Конк |
| Безупречный | 1 | 1х106 | X |
| Только DAPI | 2 | 1х106 | 1 мкл / мл |
| Контроль изотипа ПЭ | 3 | 1х106 | 1 мкл |
| CD49f-PE Контроль одиночных пятен | 4 | 1х106 | 20 мкл в 100мкл на 1x106 |
| Низкое титрование EpCAM-PE | 5 | 1х106 | 3 мкл в 100мкл на 1x106 |
| Среднее титрование EpCAM-PE | 6 | 1х106 | 4 мкл в 100мкл на 1x106 |
| Высокое титрование EpCAM-PE | 7 | 1х106 | 5 мкл в 100мкл на 1x106 |
| EpCAM-PE High Sort на слайдах | 8 | 10х106 | 50 мкл в 1 мл |
Таблица 1: Панель окрашивания методом проточной цитометрии. Пример панели окрашивания методом проточной цитометрии для мононуклеарных клеток крови или костного мозга. Включены элементы управления: только DAPI, контроль неокрашенных пятен и контроль одиночных пятен PE (PE-CD49f использовался в качестве лучшего положительного контроля). Флуоресценция минус один не включена в эту панель, так как это только один цвет (PE). При добавлении большего количества флуорофорных красителей, таких как изотиоцианат флуоресцеина (FITC) или аллофикоцианин (APC), FMO следует включать, исключая по одному флуорофору для каждого контроля FMO.
Дополнительный файл 1: Подсчет живых клеток с помощью гематоцитометра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
В литературе имеются некоторые данные о наличии эпителиальных клеток в костном мозге. Ранее в работах обычно изучалась роль эпителиальных клеток в контексте заболеваний и травм, таких как печень, легкие, желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), тимус и кожа 14,15,16,17. Однако мало что известно о наличии этих эпителиальных клеток в костном мозге здоровых людей. В этой статье предпринята попытка установить воспроизводимый метод с целью идентификации и выделения эпителиальных клеток из нормальной крови и костного мозга. Этот метод поможет определить, почему эпителиальные клетки присутствуют и какова их роль в крови и костном мозге при отсутствии заболевания; Возможно, эти клетки являются частью нормального поддержания тканей или активируются во время травмы. Костный мозг является хранилищем стволовых клеток; Однако неясно, какова может быть родословная этих эпителиальных клеток. В недавней статье обсуждаются эпителиальные клетки костного мозга в тимусе, которые сначала экспрессируют EpCAM и гемопоэтический маркер CD45, а затем теряют экспрессию CD45 с течением времени после травмы15. Исследования, проведенные в нашей лаборатории, также подтвердили наличие клеток CD45+ EpCAM+ в здоровой крови и костном мозге при отсутствии повреждений12. Однако роль этих клеток еще предстоит определить.
Возникла необходимость в воспроизводимом методе исследования эпителиальных клеток в здоровом костном мозге. Описанный способ поможет в дальнейшей характеристике этих клеток в их нормальном состоянии. В этом методе есть важные шаги для поддержания воспроизводимости. Одним из наиболее важных шагов в этом протоколе является поддержание стерильной среды в капюшоне при сборе костного мозга у мышей. При сборе урожая у нескольких мышей перекрестного загрязнения между образцами можно избежать за счет использования новых игл и шприцев для каждой мыши. Это также гарантирует, что образец чист и не содержит каких-либо загрязнений, которые могут повлиять на результаты. Кроме того, следует увеличить количество подготовленных шприцев и маркированных конических трубок для каждой дополнительной мыши. Другой важный шаг включает в себя промывание костей до тех пор, пока не станет очевидным чистый белый цвет, чтобы убедиться, что большая часть клеток костного мозга была удалена; Шансы обнаружить редкие клетки увеличиваются в более чистом образце. Была произведена модификация для оптимизации протокола лизиса эритроцитов; Было протестировано несколько буферов лизиса, чтобы найти правильный, который давал неизменно высокую жизнеспособность, так как почти половина клеток терялась на этом этапе. Возможно, потребуется оптимизировать различные реагенты и инкубационные периоды для улучшения результатов в других условиях.
Наиболее существенным ограничением этого протокола является использование проточной цитометрии для поиска редких клеточных популяций. Как обсуждалось ранее, добавление элементов управления и инкрементных счетчиков помогает повысить специфичность и точность анализа. Еще одно ограничение заключается в том, что соответствующие маркеры для интересующей группы населения должны быть определены заранее. Таким образом, необходимо знать о ключевых маркерах, антителах для проточной цитометрии и антителах, совместимых с целевыми видами.
Эти методы являются улучшением по сравнению с существующими методами, поскольку они позволяют проводить анализ отдельных клеток за небольшую часть стоимости существующего автоматического изолятора CTC и секвенирования РНК одной клетки. Кроме того, проточная цитометрия более доступна. FACS поддерживал более высокую жизнеспособность клеток по сравнению с предыдущими зарегистрированными результатами с использованием магнитного разделения микрогранул. Наконец, эти методы позволяют разделять клетки для последующего анализа, такого как объемное секвенирование РНК, секвенирование скРНК или культивирование клеток.
Disclosures
Конфликты интересов отсутствуют.
Acknowledgments
Джош Монтс, техник по проточному цитометру основного объекта, Институт Хормеля
Тодд Шустер (Todd Schuster), руководитель основного объекта, Институт Хормеля
Дерек Гордон, статистик, Университет Рутгерса
Мы хотели бы поблагодарить Карен Кляйн из редакционной службы Clarus, Санта-Фе, штат Нью-Мексико, за ее редакционную помощь.
Эта работа была частично поддержана Национальным институтом артрита, скелетно-мышечных и кожных заболеваний Национальных институтов здравоохранения под номером R21 AR075281 и грантом в помощь исследованиям, искусству и стипендиям, Офис вице-президента по исследованиям, Университет Миннесоты (предложение #324240). Мы благодарны за поддержку со стороны Института Хормеля.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes used for flow cytometry |
| 500 mL jar with lid | Nalgene | 11-823-32 | Used to wash the mouse |
| 190 proof Ethanol | Decon laboratories Inc | 2801 | Diluted to 70% with dH2O |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | Dilution: 1:1000 |
| Brightline Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-10 | Used to count alive cells |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Component of antibody diluent |
| Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Component of staining buffer and harvesting solution |
| Curity gauze sponges | Covidien | 2187 | Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow |
| Curved Forceps | Miltex | 18-784 | Used during harvest |
| Cytokeratin, Wide Spectrum Screening | Dako | Z0622 | Dilution 1:750 *Now discontinued |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) | Gibco | 14190-144 500mL | Used to stop the red blood cell lysis reaction |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E9884-100G | Used at 0.5 M |
| Gentamicin sulfate | Lonza | 17-518Z | Component of harvesting solution |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) | Gibco | 14175-095 500mL | Component of harvesting solution and staining buffer solution |
| Luer-Lok tip 10 mL syringe | Becton, Dickinson and Co | 309604 | Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps |
| Magic touch 2 ice bucket | BelArt | M16807-2001 | Used to store the specimens on ice |
| Nonfat dry milk | Apex | 20-241 | Component of Antibody Diluent |
| Normal horse serum | Vector | ZE0122 | Component of Antibody Diluent |
| PE anti-human CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 324206 | Dilution: 5 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 118205 | Dilution: 3 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE mouse IgG2b, κ isotype control | Biolegend | 400313 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat anti-human CD49f | BD Biosciences | 555763 | Dilution: 20 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat IgG2am, κ Isotype control | Biolegend | 400508 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Basix | 14-955-240 | Used in the centrifuge |
| Povidone-Iodine Scrub | Aplicare | 82-227 | Antiseptic used to sterilize the mice |
| PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305176 | 20G needle used to break up bone marrow clumps |
| PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305111 | 26G needle used to flush bone marrow from bones |
| PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Services | 63422-06 | 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence |
| RBC Lysis buffer 10X | Invitrogen | 00-4300-54 | Dilution 1:10 using sterile deionized water |
| Scissors | Roboz | RS-6762 | Used during harvest |
| Stainless steel surgical blade #4 | Bard-Parker | 371222 | Used during harvest |
| Sterile tray | Polar ware | 10F | Used during harvest |
| StretchEase Powder-free nitrile examination gloves | Denville Scientific | G4161 | Used during harvest |
| Surgical Scalpel handle #4 | Fischer | 12-000-164 | Used with surgical blade |
| TBS 20x | Thermo | Component of TBST, used at 1X | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Used to count dead cells. Filtered with .45 µm |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-500mL | Component of TBST |
| Tweezers | Miltex | 6-8 | Used during harvest |
| Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1800 | Nuclear stain for immunofluorescence |
References
- Larsen, S. B., Cowley, C. J., Fuchs, E.
- Blanpain, C., Fuchs, E. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration. Science. 344 (6189), 1242281 (2014).
- Coradini, D., Casarsa, C., Oriana, S. Epithelial cell polarity and tumorigenesis: New perspectives for cancer detection and treatment. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (5), 552-564 (2011).
- Dmello, C., et al. Multifaceted role of keratins in epithelial cell differentiation and transformation. Journal of Biosciences. 44 (2), 33 (2019).
- Poulet, G., Massias, J., Taly, V.
- Eslami-S, Z., Cortés-Hernández, L. E., Alix-Panabières, C. Epithelial cell adhesion molecule: an anchor to isolate clinically relevant circulating tumor cells. Cells. 9 (8), 1836 (2020).
- Morris, R. J. Circulating tumor cells: quintessential precision oncology presenting challenges for biology. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 16 (2017).
- Lin, D., et al. Circulating tumor cells: biology and clinical significance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 404 (2021).
- Spence, M., Adai, S., Landon, T., Richter, G. Few and far between: Tools and strategies for rare-event detection using flow cytometry. BioprobesJournal of Cell Biology. 71, 14-18 (2015).
- Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. Journal of Cell Biology. 192 (3), 373-382 (2011).
- Ye, Q., Ling, S., Zheng, S., Xu, X. Liquid biopsy in hepatocellular carcinoma: circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Molecular Cancer. 18 (1), 114 (2019).
- Park, H., et al. marrow-derived epithelial cells and hair follicle stem cells contribute to development of chronic cutaneous neoplasms. Nature Communications. 9 (1), 5293 (2018).
- Marsman, W. A., et al. Epithelial cells in bone marrow: do they matter. Gut. 54 (12), 1821-1822 (2005).
- Borue, X., et al. marrow-derived cells contribute to epithelial engraftment during wound healing. The American Journal of Pathology. 165 (5), 1767-1772 (2004).
- Chakrabarti, S., et al. marrow-derived cells contribute to the maintenance of thymic stroma including TECs. Journal of Immunology Research. 2022, 6061746 (2022).
- Krause, D. S., et al. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell. 105 (3), 369-377 (2001).
- Wong, A. P., et al. Targeted cell replacement with bone marrow cells for airway epithelial regeneration. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (3), L740-L752 (2007).
