Summary
この論文は、フローサイトメトリーと免疫蛍光顕微鏡を使用して、正常なヒトおよびマウスの血液および骨髄中の上皮細胞の存在に関する新しい発見を含む再現可能な方法を提示します。Krt1-14;mTmGトランスジェニックマウスを in vivo 法として使用し、これらの知見を確認しました。
Abstract
上皮細胞は、癌および他の疾患を有する患者の血液および骨髄において同定されている。しかし、健常人の血液および骨髄中の正常な上皮細胞の存在は、一貫した方法ではまだ特定されていません。ここでは、フローサイトメトリーと免疫蛍光(IF)顕微鏡を使用して、健康なヒトおよびマウスの血液および骨髄(BM)から上皮細胞を単離するための再現性のある方法を示します。健常人の上皮細胞を最初に同定し、上皮細胞接着分子(EpCAM)を用いたフローサイトメトリー によって 単離した。これらのEpCAM+細胞は、Krt1-14;mTmGトランスジェニックマウスにおいて免疫蛍光顕微鏡を用いてケラチンを発現することを確認した。ヒト血液サンプルは、0.18%±0.0004個のEpCAM+細胞を有していた(SEM;n=7生物学的反復、4実験反復)。ヒトBMでは、単核球の0.006±3.53%(SEM;n=3生物学的反復、4実験反復)がEpCAM+であった。マウスの血液では、EpCAM+細胞は0.45%±0.0006(SEM;n=2の生物学的反復、4つの実験反復)を構成し、マウスBMでは、0.001±5.17%(SEM;n=3の生物学的反復、4つの実験反復)がEpCAM+であった。マウスでは、IF顕微鏡で測定したように、すべてのEpCAM+細胞が汎サイトケラチンに対して免疫反応性を示しました。結果はKrt1-14;mTmGトランスジェニックマウスを用いて確認され、低い(分析された10 6細胞あたり8.6 の天然GFP+細胞、生存細胞の0.085%)が、正常マウスBMに存在するGFP+細胞の有意な数(p < 0.0005)は、複数の陰性対照と比較してランダム性の結果ではなかった。さらに、マウス血液中のEpCAM+細胞は、CD45+細胞よりも不均一であった(BMで0.58%、血液中で0.13%)。これらの観察結果は、サイトケラチンタンパク質を発現する細胞が、ヒトおよびマウスの血液およびBMからの単核球の間で再現性よく検出可能であると結論付けています。健常人におけるこれらの汎サイトケラチン上皮細胞の機能を同定および決定するために使用できる組織採取、フローサイトメトリー、および免疫染色の方法を実証します。
Introduction
上皮細胞は、私たちの体と環境の間の物理的な障壁に見られ、微小環境の変化を認識して応答することができます1。それらは増殖する幹細胞ニッチを持っており、新しい組織をひっくり返して損傷を修復する方法を提供します2。私たちの研究室では、皮膚の毛包の幹細胞を研究しています。皮膚は、見やすく、細胞のターンオーバーが一定であるため、上皮組織と幹細胞の増殖を研究するための優れたモデルです。上皮がんは最も一般的ながんの形態であり、おそらく皮膚などの上皮組織が環境発がん物質に対する最初の防御線であり、高い代謝回転率と上皮細胞の増殖につながります3。上部の保護層である皮膚表皮のほとんどは、さまざまな種類のケラチンを発現してサポートと構造を提供するケラチノサイトで構成されています4。上皮がんの患者は、血液や骨髄に上皮細胞が存在し、ケラチンも発現することがよくあります。リキッドバイオプシーは、さまざまな体液中のこれらの上皮細胞を検出および監視するための非侵襲的な方法です5。循環腫瘍細胞(CTC)とも呼ばれる循環上皮細胞は、末梢血中に見られ、癌予後のバイオマーカーとなるだけでなく、個別化された治療治療を導くことができます。CTCは、疾患の進行、治療効果、および患者の全生存率を示すこともできます5,6。
上皮細胞接着分子(EpCAM)は、CTCの臨床的に使用されるマーカーであり、癌患者の上皮起源の腫瘍を特定することができます。EpCAMは、細胞の接着、遊走、シグナル伝達、増殖、および分化において役割を果たします6。循環上皮細胞がCTCに分類されるためには、サイトケラチン8、18、および19に対して陽性であり、一般的な白血球マーカーであるCD45に対して陰性でなければなりません6。CTCは通常、最初に磁気マイクロビーズでCD45を枯渇させ、次に免疫蛍光顕微鏡7を使用してEpCAMとサイトケラチン19をテストすることによって識別されます。CTCの検出における主な制限は、その希少性です。それらは血液中の全細胞の0.01%未満を占め、遠隔臓器に到達するために循環して生き残るものはほとんどありません8,9,10。これらの細胞は希少であるため、これらの細胞を分離および同定するための実験および技術を設計する際には考慮する必要があります。現在、CTCの同定に使用される食品医薬品局(FDA)承認の自動シングルセルソーターは1つだけであり、バイオマーカーとしてEpCAMを使用しています。他の方法には、磁気ビーズ分離およびフローサイトメトリー、またはこれらの方法の組み合わせが含まれる。希少CTCの検出には、より高い感度と特異性を持つ新しい技術が必要です11。
フローサイトメトリーは、血液、骨髄、その他の組織サンプル中の希少細胞集団の検出に適した方法です。これらの希少細胞には、幹細胞、循環内皮細胞、CTC、および残存疾患細胞が含まれます。フローサイトメトリーは、各細胞タイプの定量的測定を可能にし、さらなる検査のためにこれらの細胞を選別します7,9。これらの希少細胞の正確な評価を確実にするために、増分カウントが実施されました。ゲーティングを使用して細胞をさらなる分析から除外する機能は、細胞を分析する際の特異性を高める方法です。フローサイトメトリーの限界は、大きなサンプルの分析に必要な時間と、細胞同一性の視覚的確認の欠如です。これを克服するために、選別された細胞に対して免疫蛍光顕微鏡検査を行い、それらの同一性を確認した。
以前、私たちの研究室は、マウスで骨髄細胞が動員され、皮膚腫瘍に寄与することを示しました12。これらの骨髄由来細胞は、汎サイトケラチンおよび表皮サイトケラチンに対して陽性である。腫瘍進行における上皮幹細胞、骨髄由来細胞、サイトケラチン発現細胞の役割をさらに解明するために、正常マウスおよびヒトの血液および骨髄サンプル中のEpCAM+サイトケラチン陽性細胞を探しました。ほとんどの実験と同様に、この方法は複数の反復を通じて開発されました。以前は、トランスジェニックマウスを増分カウントと共に使用して、骨髄12におけるK14GFP発現細胞を探していた。より多くの細胞をカウントするにつれて、代表的な結果セクションの 図1 に示すように、希少細胞の代表的な集団を特定することができました。正常な血液および骨髄中の上皮細胞を調査する理論的根拠は、正常な健康なドナーがEpCAM+細胞のバックグラウンドレベルを持っていたCTCに関する初期の文献に基づいていました13。前述のように、EpCAMの特性評価は、多くの場合、CD45の枯渇から始まります。このステップは、一部の造血細胞がEpCAMおよびサイトケラチン発現を有するため、さらに調査する必要がある未知の理由により省略された。したがって、細胞系譜に関係なく、EpCAMの有無に基づいて細胞を選別し、サイトケラチンについて免疫染色した。以下のプロトコルと 図2 に示すワークフローでは、補償と対照を備えたフローサイトメトリー、統計的方法、および免疫蛍光イメージングを使用して、これらのまれな上皮細胞集団を分離および同定する手法について説明しています。
Protocol
すべての動物プロトコルは、NIHおよび連邦ガイドラインに従って、ミネソタ大学施設動物管理および使用委員会によって承認されました。新鮮な人間の血液と骨髄は商業的な供給源から購入されました。サンプルは、HIV、B型肝炎、C型肝炎に陰性のドナーから承認されたIRBプロトコルの下で会社によって収集され、COVID-19のスクリーニングを受けました。すべてのサンプルは、会社によって出荷される前に、最初に匿名化され、匿名化されました。これらは商業的に入手されたため、IRBの承認は必要ありませんでした。
1.溶液の調製
注:すべての溶液は、無菌環境の生物学的フードで調製する必要があります。ヒトの血液および骨髄を扱う作業のためのバイオセーフティレベル2(BSL2)認証を取得します。
- 1 mLのゲンタマイシンと5 mLのウシ胎児血清(FBS)を500 mLのハンクスバランス塩溶液(HBSS)に加えて、骨髄採取溶液を調製します。
- 500 mLのHBSSに50 mLのFBSを加えて染色緩衝液を調製します。
- 10 mLの10x溶解バッファーと90 mLの滅菌水を組み合わせて、1x溶解バッファーを調製します。
2.フードの準備
- フードをオンにし、適切な空気の流れを得るために数分間稼働させます。
- 骨髄採取を行うためにすべての材料を収集します。無菌環境を維持するために、フード内に70%エタノールをスプレーします。フードの中に入れる前に、毎回手をスプレーしてください。
- オートクレーブ処理したトレイを、オートクレーブ処理したはさみ、組み立てたメス、ピンセット、湾曲した鉗子とともに、70%エタノールで満たされた小さなカップに入れて無菌状態に保ちます。
- 10 mLの骨髄採取溶液を1本の50 mL遠沈管に加え、「四肢」とラベル付けします。別の50mL遠心チューブに「骨髄」というラベルを付けます。
- 10 mLの骨髄採取液を注射器に吸い込み、26 Gの針を取り付けます。
3.マウスからの骨髄の採取
- CO2 窒息を用いてマウスを安楽死させる。死は、心拍がなく、反応がないことを確認するために足をつまむことによって確認されます。子宮頸部脱臼は、完全な安楽死の二次的な手段として行うことができます。
- マウスを500 mLの容器に入れ、マウスの半分を覆うのに十分なヨウ素を加えます。容器をゆっくりと振って回転させ、完全にカバーします。脱イオン水ですすいでください。ヨウ素洗浄をもう1回実行し、次に同じ手順に従って70%エタノールで2回洗浄します。
- マウスをフードに置き、トレイの上に仰向けに置きます。後ろ足をつかみ、ポップが感じられるまで引き離します。これは足を背骨から分離するためです。
- 鼠径部近くのマウスの皮膚を1cm切開します。閉じたハサミを切開部に挿入し、次に皮膚の下のハサミを開いて腹膜から分離します。
- 太ももの周りの脚の皮膚を切り、次に脚の下の皮膚を切り開いて筋肉と骨を露出させます。
- 大腿骨を切断しないようにしながら、股関節の周りを切断して後ろ足を取り外します。「手足」とラベル付けされたチューブに手足を置きます両足を取り外したら、マウスをカーカスバッグに入れて冷凍庫に入れます。
注:骨髄のほとんどは大腿骨から得られるため、はさみをガイドし、大腿骨を切断しないように切断する前に、最初に腰骨を感じる必要があります。 - はさみを使用して、手足の1つに沿って筋肉、組織、脂肪を切り取り始めます。骨と平行に切ります。次に、メスを使用して、骨に対して垂直にこする動きを使用して、残りの脂肪または筋肉を取り除きます。
- 骨が適切に洗浄されたら、膝で大腿骨と脛骨を分離します。メスを使用して、骨髄が見えない大腿骨と脛骨の両端に切り込みを入れます。
- 準備した注射器と針を骨に挿入します。抵抗がある場合は、抵抗がなくなるまで骨の端をもう少し切り取ります。
- 「骨髄」とラベル付けされたチューブの上に骨を保持しながら、骨髄採取溶液を骨から排出し、骨髄をチューブに洗い流します。骨のもう一方の端で繰り返して、骨がすべて白または空になるまで、骨髄の残りの部分を取得します。
- 残りのすべての骨と手足について手順7〜9を繰り返します。すべての骨髄は同じ円錐形のチューブに洗い流されます。
- 空の10 mLシリンジと20 G針を使用して、シリンジ内で骨髄を上下に5〜10回描画することにより、チューブ内の骨髄の塊を破壊します。
- 滅菌40 μmフィルターを清潔な50 mL遠沈管に加え、1 mLの骨髄採取液ですすいでください。次に、骨髄をろ過して、残っている塊を取り除きます。このチューブに「ろ過骨髄」というラベルを付けます。
- ろ過した骨髄は、使用するまで冷蔵庫または氷の上に保管してください。収穫の同じ日に使用する必要があります。同じ日に使用しない場合は、ジメチルスルホキシド(DMSO)などの凍結保存剤を使用して細胞を凍結します。
注意: これらの実験からのすべての廃棄物は、バイオハザード廃棄物容器に適切に廃棄する必要があります。すべての鋭利物は、適切にラベル付けされたバイオハザード鋭利物容器に入れる必要があります。
4.骨髄の赤血球溶解
- 骨髄細胞を170 x g で室温で10分間遠心分離します。上澄み液を掃除機で処理します。細胞を10 mLの1x赤血球溶解バッファーに再懸濁し、4分間インキュベートします。
- 30 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を加えて、溶解緩衝液の反応を停止します。細胞を室温で170 x g で8分間遠心分離します。上澄み液を掃除機で処理します。10〜20 mLの染色バッファーに再懸濁します。
5.細胞数
- 500 μlの細胞を9.5 mLの骨髄採取溶液と組み合わせて、1:20希釈液を得ます。
注:これは細胞数に使用され、無菌状態に保つ必要はありません。 - 1:20希釈液から200 μLの細胞を引き出し、200 μLのトリパンブルーに加え、よく混ぜます。
- 混合物を血球計算盤に加え、両側の生細胞と死細胞を数えます。この表( 補足ファイル1に表示)と式を使用して、元の細胞懸濁液を計算します。
ミリリットルあたりのセル数:
総セル数:
- 細胞を170 x g で4°Cで10分間スピンダウンし、抗体希釈に関するメーカーの提案に基づいて、1 mLあたり10 x 10 6(100 μLあたり1 x 106 細胞)の濃度に再懸濁します。
- フローサイトメトリーに進みます(ステップ8)。
6.マウスからの採血
- CO2 ガスまたは頸部脱臼を使用してマウスを安楽死させる。
- 0.5 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)でコーティングされた1 mLシリンジに26 Gの針を取り付けて、45°の角度で心臓採血を行います。
- 血液をスピンダウンし、培地または染色バッファーに再懸濁します。
注:細胞はスピンダウンされ、赤血球の溶解と細胞数の後に染色バッファーに最終濃度まで再懸濁されます。 - 赤血球溶解を行う(ステップ4)。
- セルカウントを実行します(ステップ5)。
- フローサイトメトリーに進みます(ステップ8)。
7.ヒトの血液および骨髄サンプルの処理
- 個人用保護具を着用しながら、BSL2認定のフードの下ですべての手順を実行してください。
- 前夜にサンプルを収集し、赤血球溶解を行います。単核サンプルを氷上で一晩輸送する前に、サンプルが匿名化されていることを確認してください。
- 到着したら、生細胞を170 x g で4°Cで10分間スピンダウンします。
注:これらはBSL2サンプルであり、地域のガイドラインに従う必要があります。 - 細胞を培地または染色バッファーに再懸濁します。
注:細胞をスピンダウンし、染色バッファーで細胞計数した後、最終濃度に再懸濁する必要があります。 - セルカウントを実行します(ステップ5)。
- フローサイトメトリーに進みます(ステップ8)。
8. フローサイトメトリー
- 染色
- 使用する染色パネルに基づいて、補正コントロール(非染色、アイソタイプコントロール、単一染色、蛍光マイナス1[FMO])を含む、細胞を個別に標識したチューブに分割します。残りの細胞を凍結するか、蛍光活性化細胞ソーティングに使用します。使用した抗体希釈液を用いた染色パネルの例については 、表1 を参照されたい。
注:蛍光色素を追加するたびに、残りの蛍光色素と組み合わせたFMOを、その蛍光色素の単一の染色剤とともに添加する必要があります。アイソタイプコントロールは、非特異的染色をブロックするために使用できます。使用する新しい抗体はそれぞれ、最適な希釈のためにサンプルで滴定する必要があります。 - メーカー推奨希釈率に従って抗体を加え、チューブの底をフリックしてよく混ぜます。抗体濃度は通常、100 μLあたり1 x 106 細胞として与えられます。 抗体およびコントロールによる希釈を 表1に示す。抗体は蛍光色素と結合しており、光から保護する必要があります。
注:フィコエリスリン(PE)に結合したEpCAMを使用すると、細胞の低集団を視覚化できます( 表1に示すように、100万細胞あたり3〜5 μLの滴定液)。PE-CD49fはPE-EpCAMよりも普及しており、補償に使いやすいため、単一染色PEコントロール(100万細胞あたり20 μL)として使用されました。 - 暗所で4°Cで30分間インキュベートします。
- インキュベーション後、チューブをBSL2フードに戻し、各チューブに1 mLの染色バッファーを加えます。
- 次に、チューブを170 x g で4°Cで5〜10分間遠心分離します。
- 遠心分離後、細胞を入れたキャップ付きチューブをBSL2フードに戻し、上清を吸引します。相互汚染を防ぐために、各チューブ間の吸引ピペットの先端を必ず交換してください。
- 細胞ペレットを1 mLの染色バッファーに再懸濁し、チューブの底をフリックして混合します。
- 手順8.1.4〜8.1.7を繰り返して、細胞をさらに2回洗浄します。
注:細胞の損失を防ぐため、ピペットを使用して再懸濁しないでください。 - フローサイトメトリー前の最終再懸濁のために、500 μLの染色バッファーに再懸濁します。メーカーの推奨に従って、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)または死細胞識別器を追加します。
- 使用する染色パネルに基づいて、補正コントロール(非染色、アイソタイプコントロール、単一染色、蛍光マイナス1[FMO])を含む、細胞を個別に標識したチューブに分割します。残りの細胞を凍結するか、蛍光活性化細胞ソーティングに使用します。使用した抗体希釈液を用いた染色パネルの例については 、表1 を参照されたい。
- フローサイトメーター
- 機械をセットアップしたら、コントロールとFMOを使用して補正とゲートを設定します。ハンクの平衡塩溶液(HBSS)をシース液として使用して、壊れやすい細胞をサポートします。HBSS が使用できない場合は、PBS を使用します。
注意: 使用したフローサイトメーターとソフトウェアは、 材料の表に記載されています。 - サンプルを一度に 1 つずつ読み込み、50,000、100,000、500,000、および 100 万のイベントのデータ ポイントを収集します。チューブは氷の上に置くか、使用するまで冷蔵してください。
注:サンプルの生存率を確保するために、収集時に時間制限を設定できます。 - 細胞を15 mLの遠沈管で10%FBSで3 mLのRPMIに集めます。
- EpCAM+細胞に対して免疫蛍光を行う場合は、フローサイトメーターを使用して、8ウェルスライドの各ウェルに800〜1,000個の細胞を分類します。
- EpCAM-細胞集団を、免疫蛍光の染色時に使用するネガティブコントロールとして別々のスライドに分類します。
注:細胞はFBSを含む15 mLチューブに分類し、細胞遠心分離機またはピペットを使用してスライド上にスピンして、細胞が飛び出すのを防ぐこともできます。 - スライドを50%メタノール/50%アセトン混合液に-20°Cで10分間固定します。スライドを免疫蛍光で染色するまで-20°Cで保存します。
- 機械をセットアップしたら、コントロールとFMOを使用して補正とゲートを設定します。ハンクの平衡塩溶液(HBSS)をシース液として使用して、壊れやすい細胞をサポートします。HBSS が使用できない場合は、PBS を使用します。
- フローサイトメトリー解析
- ライセンスを受けたフローサイトメトリー解析ソフトウェアを開きます。
- フローサイトメトリーから取得した標準(FCS)ファイルをコントロールおよびサンプルとともにロードします。
- [ グループの作成 ] をクリックし、キーワードを使用してサンプルとコントロールをグループに配置します。
注: 図3に示すように、「染色なし」コントロールを使用して、フローサイトメトリー分析ソフトウェアをゲートします。 - 染色コントロールなしサンプルをダブルクリックして、未 染色 のグラフを開きます。
- グラフのy軸をSSC-Aに、x軸をFSC-A(前方散乱面積による側面散乱領域)に設定し、セルサイズと内部の複雑さを示します。
- 左上のパネルのポリゴン形状をクリックして、セルの周囲にゲートを作成します。周辺のセルは破片である可能性が高いため、必ず除外してください。 図 3A に示すように、このゲートに「セル」というラベルを付けます。
- セルがゲートされたら、ポリゴン形状の内側をダブルクリックして、新しいウィンドウで別のグラフを開きます。
- ダブレット識別のために、新しいグラフのy軸をSSC-Aに、x軸をSSC-Wに設定します。多角形をクリックし、単一セルの周囲に四角形を作成します。 図 3B に示すように、この "単一セル" というラベルを付けます。
- セルがゲートされたら、ポリゴン形状の内側をダブルクリックして、新しいウィンドウで別のグラフを開きます。
- y軸をFSC-Aに、x軸をDAPI-A(または使用する死細胞識別器)に設定します。
- グラフの左側にある DAPI 負のセルの周囲にポリゴン ゲートを作成します。 図3Cに示すように、これらの「生細胞」を標識します。
- セルがゲートされたら、ポリゴン形状の内側をダブルクリックして、新しいウィンドウで別のグラフを開きます。
- y軸をSSC-Aに、x軸をEpCAM-PE(またはEpCAM細胞の同定に使用される蛍光色素)に設定します。左側のセルはEpCAM陰性です。右側にセルが表示されている場合、それらはEpCAM陽性です。
- EpCAM-PE グラフを使用して、左側のセルを除外し、右側の空のスペースのみを含むポリゴン ゲートを作成します。 図 3D に示すように、ポリゴン内の右側の空の領域に「EpCAM」というラベルを付けます。
注:これは染色コントロールではないため、EpCAM発現があってはなりません。染色なしコントロールを使用して、どの細胞がEpCAM陽性であるかを判断します。これで補正のゲーティング戦略は完了するため、この時点ですべてのグラフを閉じることができます。 - ワークスペースページで、「細胞」、「単一細胞」、「生細胞」、および「EpCAM」で染色なしの系統を強調表示します。右クリックして、[ 分析をグループにコピー]を選択します。これにより、以前に作成したグループ内の他のすべてのロードされたサンプルにゲーティング戦略がコピーされます。グループが最初に作成されていない場合は、左上の [ グループの作成 ] を選択して今すぐ作成できます。
- グループ内のサンプルを確認し、前に描画したポリゴン ゲートをチェックして、すべてのサンプルとコントロールに適合していることを確認します。これにより、セルのパーセンテージ数と数が提供されます。
- 「ワークスペース」の上の左上隅にあるレイアウトエディターボタン L をクリックします。これらのグラフは、レイアウトエディタを使用して配置およびエクスポートできます。
- 免疫蛍光試薬の調製
- ウシ血清アルブミン(BSA)1 g、脱脂乳2 g、10 mLの10xトリス緩衝生理食塩水(TBS)、100 μLのトゥイーン、および90 mLの蒸留水を組み合わせて抗体希釈液を調製します。
- 50 mLの20x TBS、950 mLの蒸留水、および200 μLのトゥイーンを組み合わせてTBSTを調製します。
- 1 mLのNHSと9 mLの抗体希釈液を組み合わせて、10%正常馬血清(NHS)を調製します(ステップ8.4.1)。
- 1 mLの10%NHSと9 mLのTBSTを組み合わせて、1%NHSを調製します。
- 免疫蛍光染色
- スライドを-20°Cから取り外し、室温まで温めます。
- スライドを蒸留水でそれぞれ5分間3回洗います。
- 抗体希釈液中の10%NHS中で室温で1時間スライドをブロックします(ステップ8.4.3)。
- 一次抗体(パンサイトケラチン)をTBST中の1%NHSで1:750に希釈します(ステップ8.4.4)。希釈した一次抗体でスライドを4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、スライドを1x洗浄バッファー(PBSまたはTBST)でそれぞれ5分間3回洗浄します。
- 二次抗体をTBSTの1%NHSで1:1,000に希釈します(ステップ8.4.4)。希釈した二次抗体中でスライドを室温で1時間インキュベートします。
- スライドを1x洗浄バッファーでそれぞれ5分間3回洗浄します。DAPI を使用して、ハードセットのマウント メディアでスライドをマウントしてカバースリップします。綿棒を使用して、カバーガラスの下に泡をそっと広げます。
Representative Results
これらの方法を用いて、正常なヒトおよびマウスの血液および骨髄中の上皮細胞のまれな集団を可視化した。記載されているように適切な補正とコントロールを使用すると、図4および図5に示すように、カウントされた細胞数に関係なく、マウス骨髄の細胞の4%〜5%がEpCAM+であることが一貫して示されました。マウスの血液サンプルでは、図6に示すように、細胞の0.5%未満がEpCAM+でした。ヒト骨髄サンプルでは、図7および図8に示すように、細胞の2%〜5%がEpCAM+であった。2%〜5%は大きな範囲ですが、個々のドナー内のパーセンテージは、徐々により多くの細胞がカウントされるにつれて一貫していました。ヒトの血液サンプルでは、図9に示すように、細胞の約0.3%がEpCAM+でした。当社の対照サンプル(染色なし、アイソタイプコントロール、およびFMO)では、図4および図7に示すように、偽陽性のEpCAM+結果はほとんどありませんでした。図10に示すように、スライドに分類されたEpCAM+およびEpCAM-グループの細胞は、EpCAM+サンプルではパンサイトケラチンに対して陽性の染色を示し、EpCAM-サンプルではパンサイトケラチンに対して陰性でした。これらの結果は、実験が適切に設計され、再現性があることを示しています。
図1:骨髄の増分カウントを持つKrt14Cre;mTmGトランスジェニックマウス。 Krt1-14;mTmGマウスの骨髄を段階的に計数した。GFP陽性細胞はケラチン14発現を示し、フローサイトメトリーを用いて同定した。より多くの骨髄細胞がカウントされるにつれて、このケラチン14陽性細胞集団はより容易に識別可能であった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:EpCAM+およびサイトケラチン+細胞のワークフロー。 骨髄および血球を最初に蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて選別し、EpCAM+細胞およびEpCAM-細胞を分離した。これらの細胞は、2つの異なる試験管と2つの異なるスライドに分類されました。試験管に選別された細胞は、細胞遠心分離機を使用してスライド上に回転させた。次に、スライドをパンサイトケラチン一次抗体を用いて染色し、次いで二次抗体で染色した。スライドを蛍光顕微鏡を用いて分析し、パンサイトケラチン発現を観察した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:フローサイトメトリー解析ソフトウェア。 解析ソフトウェアを使用してフローサイトメトリーデータを解析する場合、染色コントロールを使用して目的の細胞を選択します。細胞は最初にSSC-AとFSC-Aで選択され、細胞の内部の複雑さとサイズを示します。(A) セルの周囲にポリゴン ゲートが描画されます。(B)単一細胞は、SSC-AをSSC-Wでゲーティングすることによって獲得される。(C)生細胞は、FSC-A対DAPIをゲーティングすることによって獲得される。(d)EpCAM陰性細胞は、EpCAM陰性細胞の右側にゲーティングして除外する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マウス骨髄中のEpCAM+細胞のフローサイトメトリー解析。 染色なし、アイソタイプ、および FMO のコントロールが上部パネルに表示され、下部パネルには 50,000、100,000、および 500,000 個の増分カウントが表示されます。これらのグラフは、カウントされた合計セル数が全体的に増加しているにもかかわらず、カウント間のパーセンテージの一貫性を視覚化します。右側のパネルは、フローサイトメトリー解析のセクションで前述したゲーティング戦略と 図3に示すように、ゲーティング戦略を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:マウス骨髄中のEpCAM+細胞は、集団の5.17%±0.001%を占めています。 3匹の個々のマウスの骨髄細胞を解析した。適切な科学的厳密さのために適切なコントロールが含まれていました。陽性細胞の割合は、マウスが遺伝的に同一であるため、サンプル全体で一貫していました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:マウス血液中のEpCAM+細胞は、人口の0.45%±0.0006%を占めています。 2匹の個体マウスの血球を分析した。決定的な結果を生み出すために適切な手順が守られたことを示すために、コントロールが含まれていました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:EpCAM+ヒト骨髄のフローサイトメトリー解析。 染色なし、アイソタイプ、および FMO のコントロールが上部パネルに表示され、50,000、100,000、および 500,000 個の細胞の増分カウントが下部パネルに表示されます。これらのグラフは、カウントされた合計セルの全体的な増加にもかかわらず、カウント間のパーセンテージの一貫性を視覚化します。右側のパネルは、フローサイトメトリー解析のセクションで前述したゲーティング戦略と 図3に示すように、ゲーティング戦略を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:ヒト骨髄中のEpCAM+細胞は、人口の3.53%±0.006%を占めています。 3つの異なるヒト骨髄サンプルを分析した。科学的厳密さのための適切なコントロールが含まれていました。陽性細胞の割合は、ヒト間の遺伝的不均一性のために変化する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:ヒト血液のEpCAM+細胞は、人口の0.18%±0.0004%を占めています。 3つの異なるヒト血液サンプルを分析した。科学的厳密さのための適切なコントロールが含まれていました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:EpCAM+およびEpCAM-スライドの免疫蛍光。 FACSは、EpCAM+細胞とEpCAM-細胞を分離するために使用されました。パンサイトケラチンは、DAKOパンサイトケラチン抗体を用いて染色した。パンサイトケラチンはポリクローナル抗体であるため、正常血清中の一次抗体コントロールは使用しませんでした。これらの結果は、FACSの精度を裏付けています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 人間の骨髄または血液 | |||
| 抗体 | 管# | # セル数 | ABコンク |
| 染色なし | 1 | 1×106 | X |
| ダピのみ | 2 | 1×106 | 1uL/mL |
| PEアイソタイプコントロール | 3 | 1×106 | 1 uL |
| CD49F-PEシングルステインコントロール | 4 | 1×106 | 1x106あたり100uLで20 uL |
| エプカム-PE 低滴定 | 5 | 1×106 | 1x106あたり100uLで3 uL |
| エプカム-PE 培地滴定 | 6 | 1×106 | 1x106あたり100uLで4 uL |
| エプカム-PE 高滴定 | 7 | 1×106 | 1x106あたり100uLで5 uL |
| スライド上のEpCAM-PEハイソート | 8 | 10×106 | 1 mL 中に 50 uL |
表1:フローサイトメトリー染色パネル。 血液または骨髄単核球のフローサイトメトリー染色パネルの一例。含まれる対照は、DAPIのみ、無染色対照、およびPE単一染色対照である(PE-CD49fがより良い陽性対照として使用された)。蛍光マイナス1は、単色(PE)のみであるため、このパネルには含まれていません。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)やアロフィコシアニン(APC)などの蛍光色素を追加する場合は、FMOコントロールごとに1つの蛍光色素を除外してFMOを含める必要があります。
補足ファイル1:血球計算盤を使用した生細胞カウント。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
骨髄中の上皮細胞の存在の文献にはいくつかの証拠があります。これまでの論文では、肝臓、肺、消化管(GI)管、胸腺、皮膚など、疾患や損傷の文脈における上皮細胞の役割が一般的に調査されてきました14,15,16,17。しかしながら、健常人の骨髄におけるこれらの上皮細胞の存在についてはあまり知られていない。この論文は、正常な血液および骨髄から上皮細胞を同定および分離することを目的として、再現性のある方法の確立を目指しています。この方法は、上皮細胞が存在する理由と、病気がない場合の血液および骨髄におけるそれらの役割を特定するために分野を前進させます。おそらく、これらの細胞は正常な組織維持の一部であるか、損傷時に活性化されます。骨髄は幹細胞の貯蔵庫です。しかし、これらの上皮細胞の系統が何であるかは不明です。最近の論文では、胸腺の骨髄由来上皮細胞について論じており、胸腺は最初にEpCAMと造血マーカーCD45を発現し、損傷後、時間の経過とともにCD45の発現を失います15。私たちの研究室からの研究はまた、損傷がない場合に健康な血液と骨髄の中にCD45+ EpCAM+細胞の存在を確認しました12。ただし、これらの細胞の役割はまだ決定されていません。
健康な骨髄内の上皮細胞を調べるための再現性のある方法が必要でした。記載された方法は、これらの細胞をそれらの正常な状態でさらに特徴付けるのを助けるであろう。この方法には、再現性を維持するための重要なステップがあります。このプロトコルの最も重要なステップの1つは、マウスから骨髄を採取しながら、フード内の無菌環境を維持することです。複数のマウスから採取する場合は、マウスごとに新しい針と注射器を使用することで、サンプル間の相互汚染を回避できます。これにより、サンプルがクリーンで、結果に影響を与える可能性のある汚染物質がないことも保証されます。さらに、追加のマウスごとに準備されたシリンジとラベル付きコニカルチューブの数を増やす必要があります。別の重要なステップは、骨髄細胞のほとんどが除去されたことを確認するために、きれいな白色が明らかになるまで骨を洗い流すことです。希少細胞を検出する可能性は、より純粋なサンプルで増加します。赤血球溶解プロトコルを最適化するために変更が加えられました。いくつかの溶解バッファーをテストして、このステップで細胞のほぼ半分が失われていたため、一貫して高い生存率を与える適切なバッファーを見つけました。他の設定での結果を改善するために、さまざまな試薬とインキュベーション期間を最適化する必要がある場合があります。
このプロトコルの最も重要な制限は、希少な細胞集団を見つけるためにフローサイトメトリーを使用することです。前述のように、コントロールと増分カウントを追加すると、分析の特異性と精度が向上します。別の制限は、関心のある母集団の適切なマーカーを事前に特定する必要があることです。したがって、キーマーカー、フローサイトメトリー用の抗体、および標的種に適合する抗体について知る必要があります。
これらの方法は、既存の自動CTCアイソレーターおよびシングルセルRNAシーケンシングの数分の一のコストでシングルセル分析を可能にするため、既存の方法よりも改善されています。さらに、フローサイトメトリーはより容易に利用できます。FACSは、磁気マイクロビーズ分離を使用した以前に報告された結果と比較して、細胞に対してより高い生存率を維持しました。最後に、これらの技術により、バルクRNAシーケンシング、scRNAシーケンシング、細胞培養などのダウンストリーム分析のための細胞の分離が可能になります。
Disclosures
既知の利益相反はありません。
Acknowledgments
ジョシュモンズ、ホーメル研究所コアファシリティフローサイトメーター技術者
トッド・シュスター、ホーメル研究所コアファシリティマネージャー
デレク・ゴードン、統計学者、ラトガース大学
ニューメキシコ州サンタフェのクララス編集サービスのカレン・クラインの編集支援に感謝します。
この研究は、国立衛生研究所の国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所(賞番号R21 AR075281)およびミネソタ大学副学長室の研究・芸術・奨学金(Fund-in-Aid-In-Aid-In-Research)によって部分的に支援されました(提案#324240)。ホーメル研究所からの支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40 μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Used to filter out any large clumps of cells from bone marrow |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes used for flow cytometry |
| 500 mL jar with lid | Nalgene | 11-823-32 | Used to wash the mouse |
| 190 proof Ethanol | Decon laboratories Inc | 2801 | Diluted to 70% with dH2O |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | Dilution: 1:1000 |
| Brightline Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-10 | Used to count alive cells |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | Component of antibody diluent |
| Characterized Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | Component of staining buffer and harvesting solution |
| Curity gauze sponges | Covidien | 2187 | Used to keep a clean work area when harvesting limbs and bone marrow |
| Curved Forceps | Miltex | 18-784 | Used during harvest |
| Cytokeratin, Wide Spectrum Screening | Dako | Z0622 | Dilution 1:750 *Now discontinued |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS 1x) | Gibco | 14190-144 500mL | Used to stop the red blood cell lysis reaction |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E9884-100G | Used at 0.5 M |
| Gentamicin sulfate | Lonza | 17-518Z | Component of harvesting solution |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS 1x) | Gibco | 14175-095 500mL | Component of harvesting solution and staining buffer solution |
| Luer-Lok tip 10 mL syringe | Becton, Dickinson and Co | 309604 | Used with 26G needle to flush bones, used with 20G needle to break up clumps |
| Magic touch 2 ice bucket | BelArt | M16807-2001 | Used to store the specimens on ice |
| Nonfat dry milk | Apex | 20-241 | Component of Antibody Diluent |
| Normal horse serum | Vector | ZE0122 | Component of Antibody Diluent |
| PE anti-human CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 324206 | Dilution: 5 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE anti-mouse CD 326 (EpCAM) | Biolegend | 118205 | Dilution: 3 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE mouse IgG2b, κ isotype control | Biolegend | 400313 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat anti-human CD49f | BD Biosciences | 555763 | Dilution: 20 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| PE rat IgG2am, κ Isotype control | Biolegend | 400508 | Dilution: 1 µl in 100 µl per 1x106 cells |
| Polypropylene Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Basix | 14-955-240 | Used in the centrifuge |
| Povidone-Iodine Scrub | Aplicare | 82-227 | Antiseptic used to sterilize the mice |
| PrecisionGlide Needle 20G x 1 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305176 | 20G needle used to break up bone marrow clumps |
| PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 | Becton, Dickinson and Co | 305111 | 26G needle used to flush bone marrow from bones |
| PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Services | 63422-06 | 8 well slides cells sorted onto for immunofluorescence |
| RBC Lysis buffer 10X | Invitrogen | 00-4300-54 | Dilution 1:10 using sterile deionized water |
| Scissors | Roboz | RS-6762 | Used during harvest |
| Stainless steel surgical blade #4 | Bard-Parker | 371222 | Used during harvest |
| Sterile tray | Polar ware | 10F | Used during harvest |
| StretchEase Powder-free nitrile examination gloves | Denville Scientific | G4161 | Used during harvest |
| Surgical Scalpel handle #4 | Fischer | 12-000-164 | Used with surgical blade |
| TBS 20x | Thermo | Component of TBST, used at 1X | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | Used to count dead cells. Filtered with .45 µm |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-500mL | Component of TBST |
| Tweezers | Miltex | 6-8 | Used during harvest |
| Vectashield Vibrance Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1800 | Nuclear stain for immunofluorescence |
References
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