Karakterisering van zinktransporters bij zoogdieren met behulp van een in-vitro-zinktransporttest
Summary
Zinktransport is een uitdaging gebleken om te meten vanwege de zwakke causale verbanden met de eiwitfunctie en de lage temporele resolutie. Dit protocol beschrijft een methode voor het monitoren, met hoge temporele resolutie, van Zn 2+ extrusie uit levende cellen door gebruik te maken van een Zn 2+ gevoelige fluorescerende kleurstof, waardoor een directe meting van Zn2+ efflux wordt verkregen.
Abstract
Overgangsmetalen zoals Zn2+-ionen moeten streng worden gereguleerd vanwege hun cellulaire toxiciteit. Voorheen werd de activiteit van Zn 2+ transporters indirect gemeten door het expressieniveau van de transporter onder verschillende concentraties van Zn2+ te bepalen. Dit werd gedaan door gebruik te maken van immunohistochemie, het meten van mRNA in het weefsel of het bepalen van de cellulaire Zn2+-niveaus. Met de ontwikkeling van intracellulaire Zn 2+-sensoren worden de activiteiten van zinktransporters momenteel voornamelijk bepaald door het correleren van veranderingen in intracellulair Zn 2+, gedetecteerd met fluorescentiesondes, met de expressie van de Zn2+-transporters. Maar zelfs vandaag de dag zijn er maar een paar laboratoria die dynamische veranderingen in intracellulair Zn2+ monitoren en gebruiken om de activiteit van zinktransporters rechtstreeks te meten. Een deel van het probleem is dat van de 10 zinktransporters van de ZnT-familie, behalve ZnT10 (transporteert mangaan), alleen zinktransporter 1 (ZnT1) gelokaliseerd is op het plasmamembraan. Daarom is het moeilijk om de transportactiviteit te koppelen aan veranderingen in de intracellulaire Zn2+-concentratie. Dit artikel beschrijft een directe manier om de kinetiek van het zinktransport te bepalen met behulp van een test op basis van een zinkspecifieke fluorescerende kleurstof, FluoZin-3. Deze kleurstof wordt in zijn estervorm in zoogdiercellen geladen en vervolgens gevangen in het cytosol als gevolg van cellulaire di-esterase-activiteit. De cellen worden geladen met Zn 2+ door gebruik te maken van het Zn2+ ionofoorpyrithion. De ZnT1-activiteit wordt beoordeeld aan de hand van het lineaire deel van de vermindering van de fluorescentie na het uitspoelen van de cel. De fluorescentie gemeten bij een excitatie van 470 nm en emissie van 520 nm is evenredig met het vrije intracellulaire Zn2+. Door de cellen te selecteren die ZnT1 tot expressie brengen die zijn gelabeld met de mCherry-fluorofoor, kunnen alleen de cellen worden gecontroleerd die de transporter tot expressie brengen. Deze test wordt gebruikt om de bijdrage van verschillende domeinen van het ZnT1-eiwit aan het transportmechanisme van humaan ZnT1 te onderzoeken, een eukaryotisch transmembraaneiwit dat overtollig zink uit de cel extrudeert.
Introduction
Zink is een essentieel sporenelement in het cellulaire milieu. Het bevat een derde van alle eiwitten en is betrokken bij verschillende cellulaire processen, zoals katalyse1, transcriptie2 en structurele motieven3. Ondanks dat ze redox-inert zijn, zijn hoge zinkconcentraties echter giftig voor de cel, en daarom heeft geen enkel zoogdierorganisme overleefd zonder de aanwezigheid van mechanismen die de zinkhomeostase reguleren. Bij zoogdieren zijn drie mechanismen verantwoordelijk voor dit proces: (1) metallothioneïnen, cytosolische cysteïnerijke eiwitten die zink met een hoge affiniteit binden, waardoor een teveel aan vrij cytosolisch zink wordt voorkomen4; (2) Zrt/Irt-achtige eiwitten (ZIP’s), die zinktransporters zijn die verantwoordelijk zijn voor de instroom van zink in het cytosol via het plasmamembraan of uit intracellulaire organellen 4,5,6,7,8; en (3) ZnT’s, die een zoogdiersubset zijn van de alomtegenwoordige kationdiffusiefacilitator (CDF)-familie en zinktransporters zijn, omdat ze zink uit het cytosol over het plasmamembraan of in de intracellulaire organellen extruderen 4,5,6,7,8,9. Vanwege het belang van zink voor het cellulaire metabolisme, is het van vitaal belang om de cellulaire zinkdynamiek te begrijpen.
Eerdere methoden om de zinkdynamiek te beoordelen, waren afhankelijk van het beoordelen van de expressieniveaus van mRNA onder verschillende zinkomstandigheden door ze te correleren met cellulaire zinkmetingen van vaste weefsels of cellen10,11,12. Deze methoden omvatten chemische detectie en immunohistochemische kleuring. Deze methoden leveren echter slechts indirecte metingen op en bepalen dus alleen een offline correlatie tussen de intracellulaire zinkconcentratie en de expressie van zinktransporters. Bijgevolg kunnen deze methoden geen parameters afleiden die een hoge temporele resolutie vereisen.
Een meer directe meting van het Zn2+ transport maakt gebruik van radioactieve isotopen van zink13. Deze methode is gebaseerd op de meting van radioactief gelabeld Zn2+ om het zinktransport en de kinetiek ervan te monitoren. Vanwege het belang van zink voor cellulaire homeostase reguleren meerdere cellulaire processen echter de intracellulaire zinkconcentratie. Hiertoe behoren extracellulaire binding en verschillende transportsystemen die samenwerken om de intracellulaire Zn2+- niveaus strak onder controle te houden. De combinatie van deze processen zorgt voor veel achtergrondgeluid, wat het moeilijk maakt om individuele zinkgerelateerde transportfuncties te testen.
Dit artikel demonstreert een methode om de zinktransportsnelheid direct te controleren door de intracellulaire vrije zinkconcentratie te meten met behulp van een zinkspecifieke fluorescerende kleurstof, FluoZin-3. De kleurstof heeft een hoge specificiteit voor Zn2+ en weinig interferentie van andere tweewaardige kationen, zoals calcium. Bovendien komt het in zijn estervorm de cellen binnen door niet-ionische diffusie en wordt het vervolgens gevangen door de activiteit van intracellulair di-esterase. De fluorescentie is dus voornamelijk gecorreleerd met de vrije cytosolische zinkconcentratie. Deze experimenten werden uitgevoerd om de structuur-functierelatie van zinktransporter 1 (ZnT1), een lid van de ZnT-familie, te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierboven beschreven methode maakt het mogelijk om de intracellulaire zinkconcentratie direct te meten met een hoge temporele resolutie. In vergelijking met andere methoden kan deze methode, waarbij veranderingen in intracellulair Zn2+ worden gemonitord, achtergrondruis aanzienlijk verminderen. Bovendien elimineert de selectiviteit van de kleurstof voor zink mogelijke kruisinteracties met andere metaalkationen18,19. Ten slotte maakt het ontbreken va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Raz Zarivach wordt ondersteund door de Israel Science Foundation (subsidie nr. 163/22). Tomer Eli Ben Yosef en Arie Moran worden ondersteund door de Israel Science Foundation (subsidie nr. 2047/20). We willen Daniel Gitler en zijn groep aan de Ben-Gurion Universiteit bedanken voor hun samenwerking, steun en expertise.
Materials
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM | ||
| Sigma Aldrich | 31665 |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters – A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer’s disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer’s disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d., Findley, S. d. Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -. L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. Microsphere-based real-time calcium sensing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
