Summary
Zinktransport is een uitdaging gebleken om te meten vanwege de zwakke causale verbanden met de eiwitfunctie en de lage temporele resolutie. Dit protocol beschrijft een methode voor het monitoren, met hoge temporele resolutie, van Zn 2+ extrusie uit levende cellen door gebruik te maken van een Zn 2+ gevoelige fluorescerende kleurstof, waardoor een directe meting van Zn2+ efflux wordt verkregen.
Abstract
Overgangsmetalen zoals Zn2+-ionen moeten streng worden gereguleerd vanwege hun cellulaire toxiciteit. Voorheen werd de activiteit van Zn 2+ transporters indirect gemeten door het expressieniveau van de transporter onder verschillende concentraties van Zn2+ te bepalen. Dit werd gedaan door gebruik te maken van immunohistochemie, het meten van mRNA in het weefsel of het bepalen van de cellulaire Zn2+-niveaus. Met de ontwikkeling van intracellulaire Zn 2+-sensoren worden de activiteiten van zinktransporters momenteel voornamelijk bepaald door het correleren van veranderingen in intracellulair Zn 2+, gedetecteerd met fluorescentiesondes, met de expressie van de Zn2+-transporters. Maar zelfs vandaag de dag zijn er maar een paar laboratoria die dynamische veranderingen in intracellulair Zn2+ monitoren en gebruiken om de activiteit van zinktransporters rechtstreeks te meten. Een deel van het probleem is dat van de 10 zinktransporters van de ZnT-familie, behalve ZnT10 (transporteert mangaan), alleen zinktransporter 1 (ZnT1) gelokaliseerd is op het plasmamembraan. Daarom is het moeilijk om de transportactiviteit te koppelen aan veranderingen in de intracellulaire Zn2+-concentratie. Dit artikel beschrijft een directe manier om de kinetiek van het zinktransport te bepalen met behulp van een test op basis van een zinkspecifieke fluorescerende kleurstof, FluoZin-3. Deze kleurstof wordt in zijn estervorm in zoogdiercellen geladen en vervolgens gevangen in het cytosol als gevolg van cellulaire di-esterase-activiteit. De cellen worden geladen met Zn 2+ door gebruik te maken van het Zn2+ ionofoorpyrithion. De ZnT1-activiteit wordt beoordeeld aan de hand van het lineaire deel van de vermindering van de fluorescentie na het uitspoelen van de cel. De fluorescentie gemeten bij een excitatie van 470 nm en emissie van 520 nm is evenredig met het vrije intracellulaire Zn2+. Door de cellen te selecteren die ZnT1 tot expressie brengen die zijn gelabeld met de mCherry-fluorofoor, kunnen alleen de cellen worden gecontroleerd die de transporter tot expressie brengen. Deze test wordt gebruikt om de bijdrage van verschillende domeinen van het ZnT1-eiwit aan het transportmechanisme van humaan ZnT1 te onderzoeken, een eukaryotisch transmembraaneiwit dat overtollig zink uit de cel extrudeert.
Introduction
Zink is een essentieel sporenelement in het cellulaire milieu. Het bevat een derde van alle eiwitten en is betrokken bij verschillende cellulaire processen, zoals katalyse1, transcriptie2 en structurele motieven3. Ondanks dat ze redox-inert zijn, zijn hoge zinkconcentraties echter giftig voor de cel, en daarom heeft geen enkel zoogdierorganisme overleefd zonder de aanwezigheid van mechanismen die de zinkhomeostase reguleren. Bij zoogdieren zijn drie mechanismen verantwoordelijk voor dit proces: (1) metallothioneïnen, cytosolische cysteïnerijke eiwitten die zink met een hoge affiniteit binden, waardoor een teveel aan vrij cytosolisch zink wordt voorkomen4; (2) Zrt/Irt-achtige eiwitten (ZIP's), die zinktransporters zijn die verantwoordelijk zijn voor de instroom van zink in het cytosol via het plasmamembraan of uit intracellulaire organellen 4,5,6,7,8; en (3) ZnT's, die een zoogdiersubset zijn van de alomtegenwoordige kationdiffusiefacilitator (CDF)-familie en zinktransporters zijn, omdat ze zink uit het cytosol over het plasmamembraan of in de intracellulaire organellen extruderen 4,5,6,7,8,9. Vanwege het belang van zink voor het cellulaire metabolisme, is het van vitaal belang om de cellulaire zinkdynamiek te begrijpen.
Eerdere methoden om de zinkdynamiek te beoordelen, waren afhankelijk van het beoordelen van de expressieniveaus van mRNA onder verschillende zinkomstandigheden door ze te correleren met cellulaire zinkmetingen van vaste weefsels of cellen10,11,12. Deze methoden omvatten chemische detectie en immunohistochemische kleuring. Deze methoden leveren echter slechts indirecte metingen op en bepalen dus alleen een offline correlatie tussen de intracellulaire zinkconcentratie en de expressie van zinktransporters. Bijgevolg kunnen deze methoden geen parameters afleiden die een hoge temporele resolutie vereisen.
Een meer directe meting van het Zn2+ transport maakt gebruik van radioactieve isotopen van zink13. Deze methode is gebaseerd op de meting van radioactief gelabeld Zn2+ om het zinktransport en de kinetiek ervan te monitoren. Vanwege het belang van zink voor cellulaire homeostase reguleren meerdere cellulaire processen echter de intracellulaire zinkconcentratie. Hiertoe behoren extracellulaire binding en verschillende transportsystemen die samenwerken om de intracellulaire Zn2+- niveaus strak onder controle te houden. De combinatie van deze processen zorgt voor veel achtergrondgeluid, wat het moeilijk maakt om individuele zinkgerelateerde transportfuncties te testen.
Dit artikel demonstreert een methode om de zinktransportsnelheid direct te controleren door de intracellulaire vrije zinkconcentratie te meten met behulp van een zinkspecifieke fluorescerende kleurstof, FluoZin-3. De kleurstof heeft een hoge specificiteit voor Zn2+ en weinig interferentie van andere tweewaardige kationen, zoals calcium. Bovendien komt het in zijn estervorm de cellen binnen door niet-ionische diffusie en wordt het vervolgens gevangen door de activiteit van intracellulair di-esterase. De fluorescentie is dus voornamelijk gecorreleerd met de vrije cytosolische zinkconcentratie. Deze experimenten werden uitgevoerd om de structuur-functierelatie van zinktransporter 1 (ZnT1), een lid van de ZnT-familie, te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cel transfectie
- Kweek HEK293T cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine en 1x penicilline/streptomycine (zie materiaaltabel) in een bevochtigde incubator bij 37 °C/5% CO2 tot samenvloeiing op een plaat van 10 cm (8,8 x 106 cellen in totaal).
- Plaats een dekglaasje van 13 mm in elk van de putjes van een plaat met 12 putjes. Verdun 0,44 x 106 trypsinized cellen uit stap 1.1 in 12 ml volledige DMEM. Meng goed door drie tot vijf keer op en neer te pipetteren. Vul elk putje met 1 ml van de gemengde oplossing. Kweek 's nachts in een bevochtigde incubator bij 37 °C/5% CO2 .
- Vervang de volledige DMEM in elk putje door 1 ml serumvrije DMEM (zie Materiaaltabel) in elk putje. Plaats de plaat met 12 putjes terug in de bevochtigde incubator zoals in stap 1.1.
- Verdun voor elk transfectieputje 1 μg pAAV2-plasmide met het eiwit van belang gelabeld met mCherry fluorescerend eiwit (aanvullend bestand 1) in 100 μL serumvrije DMEM in een buisje van 1,5 ml.
- Voeg 3 μg polyethyleenimine (PEI, zie materiaaltabel) toe aan 100 μL serumvrije DMEM per transfectie, waarbij elke transfectie in een ander buisje van 1,5 ml wordt geplaatst. De plasmide:PEI-verhouding moet 1:3 (μg:μg) zijn.
- Draai beide buizen uit stap 1.4 en stap 1.5 gedurende 10 s en laat minimaal 5 minuten rusten bij kamertemperatuur.
- Meng één deel (100 μL per putje) van de DNA-oplossing uit stap 1.4 met één deel (100 μL per putje) van de PEI-oplossing uit stap 1.5. Draai de uiteindelijke oplossing gedurende 10 s en laat deze minimaal 20 minuten en maximaal 6 uur bij kamertemperatuur rusten.
- Neem de plaat met 12 putjes uit de couveuse. Draai de uiteindelijke oplossing uit stap 1.7 en voeg 200 μL toe aan elk van de putjes in de plaat met 12 putjes uit stap 1.3. Plaats de plaat met 12 putjes terug in de bevochtigde incubator (stap 1.1).
- Vervang na 3 uur het medium in elk putje door 1 ml volledige DMEM. Plaats de plaat met 12 putjes terug in de bevochtigde incubator zoals in stap 1.1.
- Neem na 2 dagen de getransfecteerde celkweek uit de incubator van 37 °C/5% CO2 en plaats deze op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een vergroting van 10x.
- Gebruik het scherpstelwiel van de microscoop om scherp te stellen op de cellen terwijl u helderveldlicht gebruikt.
- Schakel over naar de fluorescerende mCherry-excitatie (587 nm) en emissiegolflengten (610 nm) en schakel het helderveldlicht uit. Controleer op de fluorescentie van de cellen om de expressie van ZnT1 mCherry te bevestigen.
- Bereid de oplossing voor het laden van de kleurstof.
- Neem een aliquotum van 4 μl zinkspecifieke fluorescerende kleurstof (zie materiaaltabel) in de vorm van een acetoxymethylester (AM), opgelost in DMSO (1 μg/μl), uit een tegen licht beschermde voorraad die in een vriezer van -20 °C is bewaard. Deze vorm zorgt ervoor dat de kleurstof de cel kan binnendringen via het plasmamembraan door eenvoudige diffusie.
- Voeg 4 μl 10% pluronzuur (of 2 μl 20% pluronzuur, zie materiaaltabel) toe aan het aliquot van stap 1.13.1. Meng de oplossing goed door drie keer op en neer te pipetteren en voeg vervolgens alle 8 μL toe aan een buisje van 1,5 ml.
- Voeg 750 μL Ringer's oplossing (in eigen huis bereid, zie Materiaaltabel voor samenstelling) aangevuld met 1 mg/ml (~0,1%) runderserumalbumine toe aan de buis uit stap 1.13.2 en draai krachtig mee. Voeg nog eens 750 μL van dezelfde oplossing toe en draai opnieuw om een maximale menging te garanderen.
- Voeg 750 μl van de uiteindelijke oplossing van stap 1.13.3 toe aan twee putjes in een nieuwe kweekplaat met 6 putjes. Dek af met aluminiumfolie.
NOTITIE: Om bleken te voorkomen, wordt de plaat met 6 putjes vanaf deze stap altijd afgedekt met aluminiumfolie. - Neem met een fijn pincet maximaal vier gerepliceerde dekglaasjes van de getransfecteerde celkweekplaat en plaats ze in het eerste gevulde putje (maximaal vier glaasjes per putje) van de nieuwe plaat met 6 putjes uit stap 1.14. Herhaal dit proces voor de tweede gevulde put.
OPMERKING: Alle dekglaasjes in hetzelfde gevulde putje moeten in dezelfde staat verkeren. Elke put kan echter verschillende aandoeningen bevatten. - Dek af met aluminiumfolie en schud voorzichtig gedurende 15-20 minuten.
- Verwijder de oplossing voor het laden van de kleurstof en vervang deze door een nieuwe wasoplossing van Ringer's plus albumine, zoals gebruikt in stap 1.13.3. Dek af met aluminiumfolie. Laat opnieuw 20 minuten schudden. Dit maakt de splitsing van de AM-ester door de intracellulaire esterasen mogelijk.
2. Voorbereiding van de microscoop
- Rangschik de benodigde gereedschappen (zie Tabel met materialen) zoals vermeld: een omgekeerde fluorescentiemicroscoop die GFP- en mCherry-fluoroforen kan detecteren, een perfusiesysteem waarmee kan worden geschakeld tussen ten minste twee oplossingen, een afzuigsysteem en een perfusiekamer.
- Schakel de microscoop, de lichtbron en de camera in. Schakel het afzuigsysteem in.
- Was het perfusiesysteem. Was de eerste kamer met Ringer's oplossing en de tweede kamer met Ringer's oplossing die 7 μM zinkoplossing bevat, aangevuld met 7 μM pyrithion (zinkionofoor, zie Materiaaltabel). Om luchtbellen of openingen te voorkomen, laat u wat vloeistof in elke kamer achter.
NOTITIE: Aangezien beide containers zijn aangesloten op dezelfde buis die aan de perfusiekamer is aangesloten, moet u er altijd voor zorgen dat het gedeelde segment wordt gewassen met de oplossing van Ringer. - Sluit de kranen en vul de juiste kamers met Ringer's oplossing en Ringer's zinkoplossing, zoals in stap 2.3.
3. Voorbereiding van het monster
- Neem de perfusiekamer en plaats deze met de smalle kant van de groef naar boven gericht.
NOTITIE: De groef is een gat in het midden van de perfusiekamer. Het geeft de perfusievloeistof toegang tot de cellen. De ene kant van de groef is smal en de andere kant is breed. - Breng een afdichtende siliconen (zie Tabel met materialen) aan rond de groef. Reinig eventuele afdichtende siliconen uit de groef met behulp van een pipetpunt.
NOTITIE: Zorg ervoor dat er voldoende siliconenafdichting rond de groef is om een dekglaasje van 22 mm af te dichten. - Neem met een fijn pincet een dekglaasje uit de wasoplossing en plaats het op de groef met de cellen naar beneden gericht. Op deze manier worden de cellen tijdens het experiment blootgesteld aan de oplossing die de groef doorlaat.
- Plaats een dekglaasje van 22 mm op het dekglaasje van 13 mm en draai het vast met het pincet. Zorg ervoor dat de dekglaasjes niet barsten.
- Draai de kamer om en druk erop om alle aanwezige vloeistoffen vrij te geven. Vul de groef met 100 μL Ringer's wasoplossing en druk opnieuw om lekkage te voorkomen.
NOTITIE: Als er een lekkage wordt gedetecteerd, breng dan een afdichtingsmiddel aan op de plaats van de lekkage en test opnieuw. - Monteer de perfusiekamer op het platform en zet deze vast. Plaats de perfusie- en zuigbuizen om perfusie over de cellen in de groef mogelijk te maken.
- Verander de perfusiesnelheid in ongeveer 2 ml/min en schakel de perfusie van de Ringer-oplossing in. Zorg ervoor dat het perfusiesysteem werkt zonder lekkage of overloop.
4. Voorbereiding van de meting
- Open de beeldvormingssoftware (zie Materiaaltabel) door te dubbelklikken op het pictogram. Log in met de relevante inloggegevens. Kies de aangesloten camera en druk op OK.
- Stel de vergroting van de microscoop in op 10x met behulp van de knop aan de linkerkant van de microscoop.
- Kies live view en gebruik de joystick om het platform te verplaatsen om scherp te stellen op de cellen in de groef.
- Terwijl de perfusie is ingeschakeld, schakelt u de lichten uit en wijzigt u de golflengte in mCherry door op de speciale knop in de interface te drukken. Pas de scherpstelling aan met behulp van het microscoopfocuswiel.
- Zodra de microscoop op de cellen is gericht, beweegt u het platform met behulp van de joystick om de juiste celpatches te selecteren.
OPMERKING: Een geschikt gebied wordt beschouwd als een gebied met ten minste 10 cellen voor een ROI en een leeg gebied voor de achtergrond. - Selecteer het vervolgkeuzemenu ROI's in-/uitschakelen en kies Circulaire ROI's tekenen.
- Teken ROI's van celclusters met de mCherry-expressiecellen (geeft de expressie van ZnT1 aan).
- Klik in dezelfde werkbalk als stap 4.6 op de knop Achtergrond-ROI's in-/uitschakelen en pas de locatie en grootte van de achtergrond-ROI aan naar een gebied zonder cellen.
- Controleer met de mCherry- en EGFP-golflengten om er zeker van te zijn dat er geen cellen in de geselecteerde achtergrond-ROI staan.
OPMERKING: De golflengten werden zo aangepast dat mCherry een excitatiegolflengte van 520 nm en een emissiegolflengte van 610 nm gebruikte en EGFP een excitatiegolflengte van 470 nm en een emissiegolflengte van 520 nm.
- Controleer met de mCherry- en EGFP-golflengten om er zeker van te zijn dat er geen cellen in de geselecteerde achtergrond-ROI staan.
- Selecteer het subtabblad Golflengte (λ ). Markeer het selectievakje en zorg ervoor dat de GFP-golflengte aanwezig is en dat het selectievakje is gemarkeerd. Zo niet, voeg het dan toe en markeer het.
- Selecteer het subtabblad Duur . Definieer het meetinterval als elke 5 s en wijzig het aantal intervallen dat past bij de duur van het experiment.
- Klik in het gedeelte Focus op het microscooppaneel onder het oculair op de knop Aan om het perfecte focussysteem (PFS) in te schakelen.
- Gebruik het PFS-scherpstelwiel om de scherpstelling aan te passen. Zorg ervoor dat PFS aan is aangevinkt in de software-interface, onder ND-acquisitie.
- Klik op Nu uitvoeren.
5. Experimentele procedure
- Begin met een nulmeting van 90 seconden met behulp van Ringer's oplossingsperfusie.
- Nadat de basislijnperiode is afgelopen, schakelt u de Ringer-oplossingsperfusie uit en schakelt u vervolgens de zinkoplossingsperfusie van de Ringer in. Markeer het wisselen van de oplossing door op de rode vlag rechtsonder in het hoofdinterfacepaneel te klikken. Verwacht wordt dat er een stijging van de fluorescentie zal optreden.
- Zodra de fluorescentiestijging begint te verzadigen, schakelt u terug naar perfusie met de oplossing van Ringer. Schakel de zinkoplossingsperfusie van de Ringer uit en schakel vervolgens de oplossingsperfusie van de Ringer in.
- Wacht tot de experimenttijd is verstreken. Een merkbare maar gestage afname van de fluorescentie wordt verwacht als de ZnT1 goed werkt.
6. Gegevens exporteren
- Om de gegevens met basislijnaftrek te exporteren, drukt u op de knop Basislijn aftrekken en bekijkt u de wijzigingen in het "ND-acquisitievenster".
- Klik op de knop Exporteren in de software-interface in het "ND-acquisitievenster". Er wordt een Excel-gegevensblad geopend. Opslaan op de gewenste locatie.
7. Data-analyse
- Creëer voor elke ROI een gemiddelde basislijnfluorescentie van de eerste 90-100 s.
- Druk de fluorescentie uit die voor elke ROI is berekend als een percentage van de achtergrond voor die ROI.
- Maak een rijgemiddelde van alle ROI's en teken het resultaat als een lijngrafiek. Dit creëert een gemiddelde van alle ROI's als functie van de tijd.
- Selecteer met behulp van de lineaire pasvormfunctie de beginsnelheid voor de afname van de fluorescentie na het wassen met Ringer's oplossing. De hellingswaarde van de vergelijking correleert met de transportsnelheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ZnT1 is een zinktransporter van zoogdieren die zich op het celplasmamembraanbevindt 13. Het is een lid van de kationdiffusiefacilitator (CDF) eiwitfamilie die zink extrudeert van het cytosol naar het extracellulaire millieu14. ZnT1 heeft een architectuur met twee domeinen: het transmembraandomein, dat de ionen over het membraan transporteert, en een C-terminaal domein14. In tegenstelling tot andere bekende CDF-eiwitten heeft ZnT1 een uitgebreid ongestructureerd C-terminaal domein (USCTD). De rol van de USCTD is momenteel onbekend. We hebben het bovenstaande protocol gebruikt om ZnT1 WT te vergelijken met ZnT1 zonder de USCTD om de betrokkenheid bij zinktransportactiviteit te beoordelen.
HEK 293T-cellen werden getransfecteerd met het pAAV2-plasmide dat ZnT1 WT of ZnT1 bevatte zonder de ongestructureerde C-terminal (ΔUSCTD) en testten de transportactiviteitssnelheid zoals hierboven beschreven. Aanvullende figuur 1 laat zien dat beide versies van ZnT1 zonder problemen tot expressie komen en lokaliseren in het plasmamembraan. Figuur 1 toont de typische resultaten voor een voorbeeld van een dergelijk experiment. Een toename van de fluorescentie is het gevolg van een toename van de intracellulaire Zn 2+- concentratie, terwijl een afname het gevolg is van de activiteit van ZnT1 die Zn2+ door het celmembraan transporteert (individuele grafieken, inclusief standaardfouten, zijn te vinden in aanvullende figuur 2 en aanvullende figuur 3). Uit deze figuur blijkt dat ZnT1 WT een vloeiendere fluorescentiecurve heeft dan de mutant. Dit is echter geen inherent onderscheidend kenmerk, maar houdt verband met variabiliteit in de cellulaire reacties op zinkbelasting, die in eerdere experimenten is waargenomen. Figuur 2 toont een boxplot met een samenvatting van de resultaten van 15-17 van dergelijke experimenten. Uit de figuur blijkt duidelijk dat ΔUSCTD een grotere spreiding van transporttarieven vertoont in vergelijking met WT. Hoewel dit kan worden toegeschreven aan de eerder genoemde variabiliteit van de cellulaire respons, kan het ook wijzen op een functioneel verschil. Het kan bijvoorbeeld impliceren dat het ZnT1 USCTD-segment een modulator is van de transportsnelheid. Het is duidelijk dat er geen zichtbaar verschil is tussen de Zn2+ extruderende activiteiten van WT en ΔUSCTD. Op basis van de statistische analyse waren de gegevens niet normaal verdeeld (WT-dataset, Shapiro-Wilk-test15, statistiek = 0,72404, p-waarde = 0,0004), dus werden twee niet-parametrische steekproeftests gebruikt voor vergelijkingen tussen de datasets. De resultaten toonden aan dat er geen statistisch verschil was tussen de transportsnelheden (Mann-Whitney16 U-test: U = 132, Z = 0,15105, Asymp. Prob>|U| = 0,87994; Kolmogorov-Smirnov17 test: D = 0,27059, Z = 0,76384, exact prob>|D|= 0,5161).
Vanwege de substantiële energetische kosten van het creëren van de ongestructureerde extensie (~80 aminozuren), is het redelijk om aan te nemen dat dit domein een cellulaire functie dient. Een cellulaire functie die aan dit domein is gekoppeld, is tot nu toe echter niet geïdentificeerd. Dit domein is uniek voor ZnT1 en wordt niet aangetroffen in andere leden van de ZnT-familie. Als zodanig kan het te wijten zijn aan het feit dat, in tegenstelling tot andere ZnT's, ZnT1 zich op het plasmamembraan bevindt, terwijl behalve ZnT10 alle andere leden tot expressie worden gebracht in interne organellen.
De ruwe gegevens en de daaropvolgende grafieken die hier worden getoond, zijn gebaseerd op intervalmetingen van 5 s van de fluorescentie veroorzaakt door de zinkgevoelige kleurstof. Dit betekent dat in een relatief kort tijdsbestek (minuten) een visualisatie van tijdsafhankelijk zinktransport kan worden gegenereerd met een hoge temporele resolutie. De analyse moet een normalisatie van de basisperiode omvatten, aangezien de kleurstof in de cellen wordt geladen voordat het zink wordt geladen en initiële intracellulaire fluorescentie kan hebben die wordt veroorzaakt door een kleine hoeveelheid vrij zink. Bovendien wordt de zinkkleurstof pas fluorescerend actief na splitsing door de intracellulaire esterase. Daarom wordt aanbevolen om het ontesteringsproces voor het grootste deel van de kleurstof enige tijd te geven om onregelmatige fluorescentiepatronen te voorkomen die worden veroorzaakt door splitsing van kleurstofesters tijdens het experiment.
Figuur 1: Zn2+ extrusieactiviteiten van WT en ΔUSCTD met behulp van de zinktransporttest. De x-as is de tijd in seconden. De y-as is de fluorescentieverandering uitgedrukt als een percentage van de uitgangswaarde. De lijngrafieken zijn de fluorescentieverandering als functie van de tijd. De gegevens zijn gemiddeld over >10 ROI's. Afzonderlijke grafieken met standaardfouten zijn weergegeven in aanvullende figuur 2 en aanvullende figuur 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vergelijking van de activiteiten van ZnT1 WT en ΔUSCTD afgebeeld als een boxplot. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt één experiment. De zwarte lijn geeft de mediane score aan. Het holle vierkante vakje geeft de gemiddelde score aan. De y-as geeft de verandering in het basislijnpercentage per seconde aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: HEK 293T-cellen getransfecteerd met (A) ZnT1 WT of (B) ZnT1 ΔUSCTD gestimuleerd in de mCherry-excitatie (520 nm) en emissie (610 nm) golflengten. In beide gevallen is er sprake van expressie en membraanlokalisatie van de ZnT1-variant. De vergroting van de microscoop is 20x. De belichtingstijd is 100 ms. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: ZnT1 WT Zn2+ transportactiviteit met de standaardfout gevisualiseerd. De x-as is de tijd in seconden. De y-as is de procentuele fluorescentieverandering ten opzichte van de basislijnfluorescentie. De zwarte lijn is de gemiddelde fluorescentieverandering. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: ZnT1 ΔUSCTD Zn2+ transportactiviteit met de standaardfout gevisualiseerd. De x-as is de tijd in seconden. De y-as is de procentuele fluorescentieverandering ten opzichte van de basislijnfluorescentie. De rode lijn is de gemiddelde fluorescentieverandering. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 1: pAAV2-plasmidesequentie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierboven beschreven methode maakt het mogelijk om de intracellulaire zinkconcentratie direct te meten met een hoge temporele resolutie. In vergelijking met andere methoden kan deze methode, waarbij veranderingen in intracellulair Zn2+ worden gemonitord, achtergrondruis aanzienlijk verminderen. Bovendien elimineert de selectiviteit van de kleurstof voor zink mogelijke kruisinteracties met andere metaalkationen18,19. Ten slotte maakt het ontbreken van onmiddellijke cytotoxiciteit het mogelijk om levende cellulaire processen te testen19.
Deze methode heeft echter bepaalde beperkingen. Ten eerste kan het detecteren van intracellulaire dynamiek relatief uitdagender zijn met dit protocol, omdat de kleurstof die bij deze methode wordt gebruikt, is ontworpen om in de cel te worden opgesloten, maar niet naar regio's of specifieke processen kan worden gericht. Andere fluorescerende kleurstoffen kunnen op een specifiek gebied in de cellen worden gericht, maar hebben helaas een veel lager dynamisch bereik20. Ten tweede veroorzaakt de blootstelling van de kleurstof aan licht een afname van de fluorescentie als gevolg van bleken, waardoor de tijd van blootstelling aan licht en bijgevolg het actieve venster voor het uitvoeren van het experiment wordt beperkt. Ten derde is het laden van kleurstoffen in dit protocol omslachtig en tijdrovend in vergelijking met het gebruik van andere kleurstoffen, met name genetisch gecodeerde kleurstoffen21. Ten slotte lekt de kleurstof, zelfs na het splitsen van de esters, wat leidt tot een Zn 2+-onafhankelijke vermindering van fluorescentie22.
Er moeten verschillende stappen worden ondernomen om het succes van het experiment te garanderen. Ten eerste, aangezien transfectie ongelijk verdeeld kan zijn, moeten de geselecteerde cellen het eiwit van belang bevatten. Om kleurverbleking te voorkomen, is het belangrijk om de geladen cellen te beschermen tegen licht. Bij het uitvoeren van het experiment moet de perfusiesnelheid voldoende zijn om het experiment te voltooien zonder dat de cellen loskomen van het dekglaasje. In het geval van meerdere runs wordt aanbevolen om dezelfde reservoirs voor de Ringer's oplossing en Ringer's zinkoplossing aan te houden. De laadtijd van de kleurstof en de wastijd kunnen worden aangepast aan de hand van de eerste experimenten. Het laden van zink in de cellen via perfusie met pyrithion kan 1 minuut tot 5 minuten duren, zoals beoordeeld door de door Zn2+ geïnduceerde fluorescentie in de loop van de tijd te volgen.
Ondanks deze moeilijkheden stelt deze methode ons voor het eerst in staat om de dynamiek van het Zn2+ extruderingsproces te bestuderen. Het vereenvoudigt het proces en creëert een directe manier om causale verbanden beter vast te stellen in vergelijking met de vorige methoden23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Raz Zarivach wordt ondersteund door de Israel Science Foundation (subsidie nr. 163/22). Tomer Eli Ben Yosef en Arie Moran worden ondersteund door de Israel Science Foundation (subsidie nr. 2047/20). We willen Daniel Gitler en zijn groep aan de Ben-Gurion Universiteit bedanken voor hun samenwerking, steun en expertise.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Sigma Aldrich | 31665 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d, Findley, S. d Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M.
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
