Характеристика переносчиков цинка млекопитающих с помощью анализа транспорта цинка in vitro
Summary
Транспорт цинка оказалось сложно измерить из-за слабых причинно-следственных связей с функцией белка и низкого временного разрешения. В этом протоколе описывается метод мониторинга с высоким временным разрешением экструзии Zn 2+ из живых клеток с использованием чувствительного флуоресцентного красителя Zn 2+, что обеспечивает прямое измерение оттока Zn2+.
Abstract
Переходные металлы, такие как ионы Zn2+, должны жестко регулироваться из-за их клеточной токсичности. Ранее активность транспортеров Zn 2+ измерялась косвенно путем определения уровня экспрессии транспортера при различных концентрациях Zn2+. Это было сделано с помощью иммуногистохимии, измерения мРНК в ткани или определения клеточного уровня Zn2+. С развитием внутриклеточных сенсоров Zn 2+ активность транспортеров цинка в настоящее время в основном определяется путем корреляции изменений внутриклеточного Zn 2+, обнаруженных с помощью флуоресцентных зондов, с экспрессией транспортеров Zn2+. Тем не менее, даже сегодня лишь немногие лаборатории отслеживают динамические изменения внутриклеточного Zn2+ и используют его для измерения активности переносчиков цинка. Частично проблема заключается в том, что из 10 переносчиков цинка семейства ZnT, за исключением ZnT10 (переносит марганец), только транспортер цинка 1 (ZnT1) локализован на плазматической мембране. Поэтому связать транспортную активность с изменениями внутриклеточной концентрации Zn2+ сложно. В данной статье описан прямой способ определения кинетики переноса цинка с помощью анализа на основе цинк-специфического флуоресцентного красителя FluoZin-3. Этот краситель загружается в клетки млекопитающих в эфирной форме, а затем захватывается в цитозоле из-за клеточной активности диэстеразы. Клетки загружаются Zn 2+ с помощью пиритиона ионофора Zn2+. Активность ZnT1 оценивают по линейной части снижения флуоресценции после вымывания клеток. Флуоресценция, измеренная при возбуждении 470 нм и излучении 520 нм, пропорциональна свободному внутриклеточному Zn2+. Выбор клеток, экспрессирующих ZnT1, помеченных флуорофором mCherry, позволяет контролировать только клетки, экспрессирующие транспортер. Этот анализ используется для изучения вклада различных доменов белка ZnT1 в транспортный механизм человеческого ZnT1, эукариотического трансмембранного белка, который выдавливает избыток цинка из клетки.
Introduction
Цинк является важным микроэлементом в клеточной среде. Он включает в себя одну треть всех белков и участвует в различных клеточных процессах, таких как катализ1, транскрипция2 и структурные мотивы3. Однако, несмотря на окислительно-восстановительную инертность, высокие концентрации цинка токсичны для клетки, поэтому ни один организм млекопитающих не выжил без наличия механизмов, регулирующих гомеостаз цинка. У млекопитающих за этот процесс ответственны три механизма: (1) металлотионеины, которые представляют собой цитозольные белки, богатые цистеином, которые связывают цинк с высоким сродством, тем самым предотвращая избыток свободного цитозольного цинка4; (2) Zrt/Irt-подобные белки (ZIP), которые являются транспортерами цинка, ответственными за приток цинка в цитозоль через плазматическую мембрану или из внутриклеточных органелл 4,5,6,7,8; и (3) ZnT, которые являются подмножеством млекопитающих семейства фасилитаторов диффузии катионов (CDF) и являются переносчиками цинка, поскольку они выдавливают цинк из цитозоля через плазматическую мембрану или во внутриклеточные органеллы 4,5,6,7,8,9. Из-за важности цинка для клеточного метаболизма жизненно важно понимать клеточную динамику цинка.
Предыдущие методы оценки динамики цинка основывались на оценке уровней экспрессии мРНК в различных условиях цинка путем корреляции их с клеточными измерениями цинка в фиксированных тканях или клетках10,11,12. Эти методы включают химическое обнаружение и иммуногистохимическое окрашивание. Однако эти методы дают лишь косвенные измерения и, таким образом, определяют только оффлайн корреляцию между внутриклеточной концентрацией цинка и экспрессией переносчиков цинка. Следовательно, эти методы не могут вывести какие-либо параметры, требующие высокого временного разрешения.
Для более прямого измерения переноса Zn2+ используются радиоактивные изотопыцинка-13. Этот метод основан на измерении радиоактивно меченного Zn2+ для мониторинга переноса цинка и его кинетики. Однако из-за важности цинка для клеточного гомеостаза множественные клеточные процессы регулируют внутриклеточную концентрацию цинка. Среди них внеклеточное связывание и несколько транспортных систем, которые работают вместе, чтобы поддерживать жесткий контроль внутриклеточных уровней Zn2+ . Сочетание этих процессов создает значительный фоновый шум, что затрудняет тестирование отдельных транспортных функций, связанных с цинком.
В данной статье демонстрируется метод прямого контроля скорости переноса цинка путем измерения внутриклеточной концентрации свободного цинка с использованием цинк-специфического флуоресцентного красителя FluoZin-3. Краситель обладает высокой специфичностью к Zn2+ и незначительным вмешательством со стороны других двухвалентных катионов, таких как кальций. Кроме того, в эфирной форме он проникает в клетки путем неионогенной диффузии, а затем улавливается за счет активности внутриклеточной диэстеразы. Таким образом, его флуоресценция коррелирует в первую очередь с концентрацией свободного цитозольного цинка. Эти эксперименты были проведены для изучения структурно-функциональной взаимосвязи переносчика цинка 1 (ZnT1), члена семейства ZnT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный выше метод позволяет проводить прямое измерение внутриклеточной концентрации цинка с высоким временным разрешением. По сравнению с другими методами, этот метод, включающий мониторинг изменений внутриклеточного уровня Zn2+, может существенно снизить фоновый шум. Кроме ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Raz Zarivach поддерживается Израильским научным фондом (грант No 163/22). Томер Эли Бен Йосеф и Ари Моран получают поддержку Израильского научного фонда (грант No 2047/20). Мы хотели бы поблагодарить Даниэля Гитлера и его группу в Университете Бен-Гуриона за сотрудничество, поддержку и экспертизу.
Materials
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM | ||
| Sigma Aldrich | 31665 |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters – A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer’s disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer’s disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d., Findley, S. d. Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -. L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. Microsphere-based real-time calcium sensing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
