In Vitro亜鉛輸送アッセイを用いた哺乳類亜鉛トランスポーターの特性評価(英語)
Summary
亜鉛輸送は、タンパク質機能との因果関係が弱く、時間分解能が低いため、測定が困難であることが証明されています。従ってこのプロトコルは高い時間分解能と、Zn 2+敏感な蛍光染料の利用によって生きているセルからのZn 2+の放出を、監視するための方法を記述し、Zn2+の流出の直接測定を提供する。
Abstract
Zn2+イオンなどの遷移金属は、細胞毒性があるため、厳密に制御する必要があります。以前は、Zn2+トランスポーターの活性は、異なる濃度のZn2+下でのトランスポーターの発現レベルを決定することによって間接的に測定されていました。これは、免疫組織化学を利用したり、組織内のmRNAを測定したり、細胞のZn2+レベルを決定したりすることによって行われました。細胞内Zn2+センサーの開発により、亜鉛トランスポーターの活性は、現在、主に蛍光プローブを使用して検出される細胞内Zn2+の変化とZn2+トランスポーターの発現を相関させることによって決定されています。しかし、今日でも、細胞内のZn2+の動的変化をモニターし、それを使用して亜鉛トランスポーターの活性を直接測定しているラボはごくわずかです。問題の一部は、ZnTファミリーの10個の亜鉛トランスポーターのうち、ZnT10(マンガンを輸送する)を除いて、亜鉛トランスポーター1(ZnT1)のみが原形質膜に局在していることである。したがって、輸送活性を細胞内のZn2+濃度の変化に結びつけることは困難です。本稿では、亜鉛特異的蛍光色素であるFluoZin-3に基づくアッセイを用いて、亜鉛輸送速度を直接測定する方法について解説します。この色素は、エステルの形で哺乳類細胞にロードされ、細胞のジエステラーゼ活性によりサイトゾルに閉じ込められます。細胞は、Zn2+イオノフォアピリチオンを利用してZn2+をロードします。ZnT1活性は、細胞ウォッシュアウト後の蛍光の減少の直線部分から評価されます。470 nmの励起と520 nmの発光で測定された蛍光は、遊離細胞内Zn2+に比例します。mCherry蛍光色素でタグ付けされたZnT1を発現する細胞を選択することで、トランスポーターを発現する細胞のみをモニタリングすることができます。このアッセイは、細胞から過剰な亜鉛を押し出す真核生物の膜貫通タンパク質であるヒトZnT1の輸送メカニズムに対するZnT1タンパク質のさまざまなドメインの寄与を調査するために使用されます。
Introduction
亜鉛は、細胞環境において不可欠な微量元素です。全タンパク質の3分の1を包含し、触媒作用1、転写2、構造モチーフ3など、さまざまな細胞プロセスに関与しています。しかし、酸化還元不活性であるにもかかわらず、高濃度の亜鉛は細胞に有毒であるため、亜鉛の恒常性を調節するメカニズムの存在なしには哺乳類は生き残れませんでした。哺乳類では、3つのメカニズムがこのプロセスに関与しています:(1)メタロチオネインは、細胞質システインに富むタンパク質であり、亜鉛に高い親和性で結合し、過剰な遊離細胞質亜鉛を防ぎます4;(2)Zrt / Irt様タンパク質(ZIP)は、原形質膜を介して、または細胞内オルガネラ4,5,6,7,8から細胞質への亜鉛流入に関与する亜鉛トランスポーターです。(3)ZnTは、ユビキタス陽イオン拡散促進剤(CDF)ファミリーの哺乳類サブセットであり、細胞質膜を横切って細胞質膜または細胞内オルガネラ4,5,6,7,8,9に亜鉛を押し出すため、亜鉛輸送体です。細胞の代謝には亜鉛が重要であるため、細胞の亜鉛動態を理解することは不可欠です。
亜鉛動態を評価する以前の方法は、固定組織または細胞の細胞亜鉛測定値と相関させることにより、異なる亜鉛条件下でのmRNAの発現レベルを評価することに依存していました10,11,12。これらの方法には、化学的検出および免疫組織化学染色が含まれます。しかし、これらの方法では間接的な測定しか得られないため、細胞内亜鉛濃度と亜鉛トランスポーターの発現との間のオフラインの相関関係しか決定できません。したがって、これらの方法では、高い時間分解能を必要とするパラメーターを推測することはできません。
Zn2+ 輸送のより直接的な測定には、亜鉛13の放射性同位体を使用します。この方法は、放射性標識されたZn2+ の測定に依存して、亜鉛輸送とその速度論をモニターします。しかし、亜鉛は細胞の恒常性にとって重要であるため、複数の細胞プロセスが細胞内の亜鉛濃度を調節しています。これらの中には、細胞外結合と、細胞内のZn2+ レベルの厳密な制御を維持するために協調して機能するいくつかの輸送システムがあります。これらのプロセスが組み合わさると、かなりのバックグラウンドノイズが発生し、個々の亜鉛関連の輸送機能をテストすることが困難になります。
本稿では、亜鉛特異的蛍光色素であるFluoZin-3を用いて細胞内の遊離亜鉛濃度を測定することにより、亜鉛輸送速度を直接モニターする方法を紹介します。この色素は、Zn2+ に対する特異性が高く、カルシウムなどの他の二価陽イオンからの干渉がほとんどありません。さらに、そのエステル形態では、非イオン性拡散によって細胞内に侵入し、細胞内ジエステラーゼの活性により捕捉されます。したがって、その蛍光は主に遊離細胞質亜鉛濃度と相関しています。これらの実験は、ZnTファミリーの一員である亜鉛トランスポーター1(ZnT1)の構造と機能の関係を調べるために行われました。
Protocol
Representative Results
Discussion
上述した方法により、高い時間分解能で細胞内亜鉛濃度を直接測定することができます。他の方法と比較して、細胞内Zn2+の変化をモニタリングするこの方法は、バックグラウンドノイズを大幅に低減することができます。さらに、亜鉛に対する色素の選択性は、他の金属陽イオンとの潜在的な相互相互作用を排除します18,19。最後に、即時…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ラズ・ザリヴァチは、イスラエル科学財団(助成金番号163/22)の支援を受けています。Tomer Eli Ben YosefとArie Moranは、イスラエル科学財団(助成金番号2047/20)の支援を受けています。ベングリオン大学のダニエル・ギトラー氏と彼のグループの協力、支援、専門知識に感謝します。
Materials
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM | ||
| Sigma Aldrich | 31665 |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters – A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer’s disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer’s disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d., Findley, S. d. Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -. L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. Microsphere-based real-time calcium sensing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
