Caractérisation des transporteurs de zinc chez les mammifères à l’aide d’un test in vitro de transport du zinc
Summary
Le transport du zinc s’est avéré difficile à mesurer en raison des faibles liens de causalité avec la fonction des protéines et de la faible résolution temporelle. Ce protocole décrit une méthode de surveillance, avec une haute résolution temporelle, de l’extrusion de Zn 2+ à partir de cellules vivantes en utilisant un colorant fluorescent sensible au Zn 2+, fournissant ainsi une mesure directe de l’efflux de Zn2+.
Abstract
Les métaux de transition tels que les ions Zn2+ doivent être étroitement réglementés en raison de leur toxicité cellulaire. Auparavant, l’activité des transporteurs de Zn 2+ était mesurée indirectement en déterminant le niveau d’expression du transporteur sous différentes concentrations de Zn2+. Cela a été fait en utilisant l’immunohistochimie, en mesurant l’ARNm dans les tissus ou en déterminant les niveaux cellulaires de Zn2+. Avec le développement des capteurs intracellulaires de Zn 2+, les activités des transporteurs de zinc sont actuellement principalement déterminées en corrélant les changements dans le Zn 2+ intracellulaire, détectés à l’aide de sondes fluorescentes, avec l’expression des transporteurs de Zn2+. Cependant, même aujourd’hui, seuls quelques laboratoires surveillent les changements dynamiques du Zn2+ intracellulaire et l’utilisent pour mesurer directement l’activité des transporteurs de zinc. Une partie du problème est que sur les 10 transporteurs de zinc de la famille ZnT, à l’exception du ZnT10 (transport du manganèse), seul le transporteur de zinc 1 (ZnT1) est localisé à la membrane plasmique. Par conséquent, il est difficile d’établir un lien entre l’activité de transport et les changements de la concentration intracellulaire de Zn2+. Cet article décrit un moyen direct de déterminer la cinétique de transport du zinc à l’aide d’un test basé sur un colorant fluorescent spécifique au zinc, FluoZin-3. Ce colorant est chargé dans les cellules de mammifères sous sa forme d’ester, puis piégé dans le cytosol en raison de l’activité cellulaire de la di-estérase. Les cellules sont chargées en Zn 2+ en utilisant l’ionophore pyrithione Zn2+. L’activité de ZnT1 est évaluée à partir de la partie linéaire de la réduction de la fluorescence après le lessivage cellulaire. La fluorescence mesurée à une excitation de 470 nm et à une émission de 520 nm est proportionnelle au Zn2+ intracellulaire libre. La sélection des cellules exprimant ZnT1 marquées avec le fluorophore mCherry permet de ne surveiller que les cellules exprimant le transporteur. Ce test est utilisé pour étudier la contribution de différents domaines de la protéine ZnT1 au mécanisme de transport de la ZnT1 humaine, une protéine transmembranaire eucaryote qui extrude l’excès de zinc de la cellule.
Introduction
Le zinc est un oligo-élément essentiel dans le milieu cellulaire. Il incorpore un tiers de toutes les protéines et est impliqué dans divers processus cellulaires, tels que la catalyse1, la transcription2 et les motifs structurels3. Cependant, bien qu’elles soient inertes en matière d’oxydoréduction, des concentrations élevées de zinc sont toxiques pour la cellule, c’est pourquoi aucun organisme mammifère n’a survécu sans la présence de mécanismes régulant l’homéostasie du zinc. Chez les mammifères, trois mécanismes sont responsables de ce processus : (1) les métallothionéines, qui sont des protéines cytosoliques riches en cystéine qui se lient au zinc à haute affinité, empêchant ainsi l’excès de zinc cytosolique libre4 ; (2) les protéines de type Zrt/Irt (ZIPs), qui sont des transporteurs de zinc responsables de l’afflux de zinc dans le cytosol à travers la membrane plasmique ou à partir d’organites intracellulaires 4,5,6,7,8 ; et (3) les ZnT, qui sont un sous-ensemble de mammifères de la famille des facilitateurs de diffusion cationique (CDF) omniprésents et sont des transporteurs de zinc, car ils extrudent le zinc du cytosol à travers la membrane plasmique ou dans les organites intracellulaires 4,5,6,7,8,9. En raison de l’importance du zinc pour le métabolisme cellulaire, il est essentiel de comprendre la dynamique cellulaire du zinc.
Les méthodes précédentes d’évaluation de la dynamique du zinc reposaient sur l’évaluation des niveaux d’expression de l’ARNm dans différentes conditions de zinc en les corrélant avec les mesures cellulaires du zinc de tissus ou de cellules fixes10,11,12. Ces méthodes comprennent la détection chimique et la coloration immunohistochimique. Cependant, ces méthodes ne donnent que des mesures indirectes et, par conséquent, ne déterminent qu’une corrélation hors ligne entre la concentration intracellulaire de zinc et l’expression des transporteurs de zinc. Par conséquent, ces méthodes ne peuvent pas déduire de paramètres nécessitant une résolution temporelle élevée.
Une mesure plus directe du transport du Zn2+ utilise des isotopes radioactifs du zinc13. Cette méthode s’appuie sur la mesure du Zn2+ radiomarqué pour suivre le transport du zinc et sa cinétique. Cependant, en raison de l’importance du zinc pour l’homéostasie cellulaire, de multiples processus cellulaires régulent la concentration intracellulaire de zinc. Parmi ceux-ci figurent la liaison extracellulaire et plusieurs systèmes de transport qui fonctionnent de concert pour maintenir un contrôle étroit des niveaux intracellulaires de Zn2+ . La combinaison de ces processus crée un bruit de fond considérable, ce qui rend difficile le test des différentes fonctions de transport liées au zinc.
Cet article présente une méthode permettant de surveiller directement la vitesse de transport du zinc en mesurant la concentration intracellulaire de zinc libre à l’aide d’un colorant fluorescent spécifique au zinc, le FluoZin-3. Le colorant a une spécificité élevée pour le Zn2+ et peu d’interférences avec d’autres cations divalents, tels que le calcium. De plus, sous sa forme d’ester, il pénètre dans les cellules par diffusion non ionique et est ensuite piégé en raison de l’activité de la di-estérase intracellulaire. Ainsi, sa fluorescence est principalement corrélée à la concentration de zinc cytosolique libre. Ces expériences ont été menées pour étudier la relation structure-fonction du transporteur de zinc 1 (ZnT1), un membre de la famille ZnT.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ci-dessus permet de mesurer directement la concentration intracellulaire de zinc avec une haute résolution temporelle. Comparée à d’autres méthodes, cette méthode impliquant la surveillance des changements dans le Zn2+ intracellulaire peut réduire considérablement le bruit de fond. De plus, la sélectivité du colorant pour le zinc élimine les interactions croisées potentielles avec d’autres cations métalliques18,19. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Raz Zarivach est soutenu par la Fondation israélienne pour la science (subvention n° 163/22). Tomer Eli Ben Yosef et Arie Moran sont soutenus par la Fondation israélienne pour la science (subvention n° 2047/20). Nous tenons à remercier Daniel Gitler et son groupe de l’Université Ben Gourion pour leur coopération, leur soutien et leur expertise.
Materials
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM | ||
| Sigma Aldrich | 31665 |
References
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