Caracterización de transportadores de zinc en mamíferos mediante un ensayo de transporte de zinc in vitro
Summary
El transporte de zinc ha demostrado ser difícil de medir debido a los débiles vínculos causales con la función de las proteínas y la baja resolución temporal. Este protocolo describe un método para monitorear, con alta resolución temporal, la extrusión de Zn 2+ de células vivas mediante la utilización de un colorante fluorescente sensible al Zn 2+, proporcionando así una medida directa del flujo de Zn2+.
Abstract
Los metales de transición, como los iones Zn2+, deben estar estrictamente regulados debido a su toxicidad celular. Anteriormente, la actividad de los transportadores de Zn 2+ se medía indirectamente determinando el nivel de expresión del transportador bajo diferentes concentraciones de Zn2+. Esto se hizo mediante la utilización de inmunohistoquímica, la medición del ARNm en el tejido o la determinación de los niveles celulares de Zn2+. Con el desarrollo de sensores intracelulares de Zn 2+, las actividades de los transportadores de zinc están actualmente determinadas principalmente por la correlación de los cambios en el Zn 2+ intracelular, detectados mediante sondas fluorescentes, con la expresión de los transportadores de Zn2+. Sin embargo, incluso hoy en día, solo unos pocos laboratorios monitorean los cambios dinámicos en el Zn2+ intracelular y lo utilizan para medir directamente la actividad de los transportadores de zinc. Parte del problema es que de los 10 transportadores de zinc de la familia ZnT, a excepción del ZnT10 (transporta manganeso), solo el transportador de zinc 1 (ZnT1) se localiza en la membrana plasmática. Por lo tanto, es difícil vincular la actividad de transporte a los cambios en la concentración intracelular de Zn2+. Este artículo describe una forma directa de determinar la cinética de transporte de zinc utilizando un ensayo basado en un colorante fluorescente específico de zinc, FluoZin-3. Este colorante se carga en las células de mamíferos en su forma de éster y luego queda atrapado en el citosol debido a la actividad de la diesterasa celular. Las células se cargan con Zn 2+ utilizando el ionóforo Zn2+ piritiona. La actividad de ZnT1 se evalúa a partir de la parte lineal de la reducción de la fluorescencia después del lavado celular. La fluorescencia medida a una excitación de 470 nm y una emisión de 520 nm es proporcional al Zn2+ intracelular libre. La selección de las células que expresan ZnT1 marcadas con el fluoróforo mCherry permite monitorizar solo las células que expresan el transportador. Este ensayo se utiliza para investigar la contribución de diferentes dominios de la proteína ZnT1 al mecanismo de transporte de ZnT1 humano, una proteína transmembrana eucariota que extruye el exceso de zinc de la célula.
Introduction
El zinc es un oligoelemento esencial en el medio celular. Incorpora un tercio de todas las proteínas y participa en diversos procesos celulares, como la catálisis1, la transcripción2 y los motivos estructurales3. Sin embargo, a pesar de ser redox-inerte, las altas concentraciones de zinc son tóxicas para la célula, por lo que ningún organismo mamífero ha sobrevivido sin la presencia de mecanismos que regulen la homeostasis del zinc. En los mamíferos, tres mecanismos son responsables de este proceso: (1) metalotioneínas, que son proteínas citosólicas ricas en cisteína que se unen al zinc con una alta afinidad, evitando así el exceso de zinc citosólico libre4; (2) proteínas similares a Zrt/Irt (ZIP), que son transportadores de zinc responsables de la entrada de zinc en el citosol a través de la membrana plasmática o de orgánulos intracelulares 4,5,6,7,8; y (3) ZnTs, que son un subconjunto de mamíferos de la familia de facilitadores de difusión catiónica ubicua (CDF) y son transportadores de zinc, ya que extruyen zinc desde el citosol a través de la membrana plasmática o hacia los orgánulos intracelulares 4,5,6,7,8,9. Debido a la importancia del zinc para el metabolismo celular, es vital comprender la dinámica celular del zinc.
Los métodos anteriores para evaluar la dinámica del zinc dependían de la evaluación de los niveles de expresión de ARNm en diferentes condiciones de zinc correlacionándolos con las mediciones de zinc celular de tejidos o células fijas10,11,12. Estos métodos incluyen la detección química y la tinción inmunohistoquímica. Sin embargo, estos métodos solo producen medidas indirectas y, por lo tanto, solo determinan una correlación fuera de línea entre la concentración intracelular de zinc y la expresión de los transportadores de zinc. En consecuencia, estos métodos no pueden inferir ningún parámetro que requiera una alta resolución temporal.
Una medición más directa del transporte de Zn2+ utiliza isótopos radiactivos de zinc13. Este método se basa en la medición de Zn2+ radiomarcado para monitorear el transporte de zinc y su cinética. Sin embargo, debido a la importancia del zinc para la homeostasis celular, múltiples procesos celulares regulan la concentración intracelular de zinc. Entre ellos se encuentran la unión extracelular y varios sistemas de transporte que trabajan en conjunto para mantener un control estricto de los niveles intracelulares de Zn2+ . La combinación de estos procesos crea un ruido de fondo considerable, lo que dificulta la comprobación de las funciones de transporte individuales relacionadas con el zinc.
Este artículo demuestra un método para monitorear directamente la tasa de transporte de zinc mediante la medición de la concentración de zinc libre intracelular utilizando un colorante fluorescente específico de zinc, FluoZin-3. El colorante tiene una alta especificidad para Zn2+ y poca interferencia de otros cationes divalentes, como el calcio. Además, en su forma de éster, entra en las células por difusión no iónica y luego queda atrapado debido a la actividad de la diesterasa intracelular. Por lo tanto, su fluorescencia se correlaciona principalmente con la concentración de zinc citosólico libre. Estos experimentos se llevaron a cabo para estudiar la relación estructura-función del transportador de zinc 1 (ZnT1), un miembro de la familia ZnT.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito anteriormente permite la medición directa de la concentración intracelular de zinc con alta resolución temporal. En comparación con otros métodos, este método que implica la monitorización de los cambios en el Zn2+ intracelular puede disminuir sustancialmente el ruido de fondo. Además, la selectividad del colorante para el zinc elimina las posibles interacciones cruzadas con otros cationes metálicos18,19. Por último, su fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Raz Zarivach cuenta con el apoyo de la Fundación de Ciencias de Israel (subvención nº 163/22). Tomer Eli Ben Yosef y Arie Moran cuentan con el apoyo de la Fundación de Ciencias de Israel (subvención n.º 2047/20). Nos gustaría agradecer a Daniel Gitler y a su grupo de la Universidad Ben-Gurion por su cooperación, apoyo y experiencia.
Materials
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM | ||
| Sigma Aldrich | 31665 |
References
- Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
- Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
- Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
- Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
- Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
- Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters – A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
- Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer’s disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
- Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer’s disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
- Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
- Palmiter, R. d., Findley, S. d. Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
- Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
- Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Gee, K. R., Zhou, Z. -. L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
- Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
- Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
- Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. Microsphere-based real-time calcium sensing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).
- Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
- Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).
