Caracterização de Transportadores de Zinco em Mamíferos Utilizando um Ensaio de Transporte de Zinco In Vitro
Summary
O transporte de zinco tem se mostrado desafiador de mensurar devido às fracas ligações causais com a função proteica e à baixa resolução temporal. Este protocolo descreve um método para monitorar, com alta resolução temporal, a extrusão de Zn 2+ de células vivas utilizando um corante fluorescente sensível a Zn 2+, fornecendo assim uma medida direta do efluxo de Zn2+.
Abstract
Metais de transição como íons Zn2+ devem ser fortemente regulados devido à sua toxicidade celular. Anteriormente, a atividade dos transportadores de Zn 2+ era medida indiretamente, determinando-se o nível de expressão do transportador sob diferentes concentrações de Zn2+. Isso foi feito utilizando imunohistoquímica, medindo o RNAm no tecido ou determinando os níveis celulares de Zn2+. Com o desenvolvimento dos sensores intracelulares de Zn 2+, as atividades dos transportadores de zinco são atualmente determinadas principalmente pela correlação de alterações no Zn 2+ intracelular, detectadas usando sondas fluorescentes, com a expressão dos transportadores de Zn2+. No entanto, ainda hoje, apenas alguns laboratórios monitoram mudanças dinâmicas no Zn2+ intracelular e o utilizam para medir a atividade de transportadores de zinco diretamente. Parte do problema é que dos 10 transportadores de zinco da família ZnT, com exceção do ZnT10 (transporta manganês), apenas o transportador de zinco 1 (ZnT1) está localizado na membrana plasmática. Portanto, relacionar a atividade de transporte a mudanças na concentração intracelular de Zn2+ é difícil. Este artigo descreve uma maneira direta de determinar a cinética de transporte de zinco usando um ensaio baseado em um corante fluorescente específico de zinco, FluoZin-3. Este corante é carregado em células de mamíferos em sua forma de éster e, em seguida, aprisionado no citosol devido à atividade celular de di-esterase. As células são carregadas com Zn 2+ utilizando a piritionato ionóforo Zn2+. A atividade do ZnT1 é avaliada a partir da parte linear da redução da fluorescência após o washout celular. A fluorescência medida em uma excitação de 470 nm e emissão de 520 nm é proporcional ao Zn2+ intracelular livre. A seleção das células que expressam ZnT1 marcadas com o fluoróforo mCherry permite monitorar apenas as células que expressam o transportador. Este ensaio é usado para investigar a contribuição de diferentes domínios da proteína ZnT1 para o mecanismo de transporte de ZnT1 humano, uma proteína transmembrana eucariótica que extrai o excesso de zinco da célula.
Introduction
O zinco é um oligoelemento essencial no meio celular. Incorpora um terço de todas as proteínas e está envolvido em vários processos celulares, como catálise1, transcrição2 e motivos estruturais3. No entanto, apesar de ser inerte redox, altas concentrações de zinco são tóxicas para a célula, razão pela qual nenhum organismo mamífero sobreviveu sem a presença de mecanismos que regulam a homeostase do zinco. Em mamíferos, três mecanismos são responsáveis por esse processo: (1) metalotioneínas, que são proteínas citosólicas ricas em cisteína que se ligam ao zinco em alta afinidade, prevenindo o excesso de zinco citosólico livre4; (2) proteínas Zrt/Irt-like (ZIPs), transportadores de zinco responsáveis pelo influxo de zinco para o citosol através da membrana plasmática ou de organelas intracelulares 4,5,6,7,8; e (3) ZnTs, que são um subconjunto de mamíferos da família dos facilitadores de difusão catiônica (CDF) ubíquas e são transportadores de zinco, pois extrudem zinco do citosol através da membrana plasmática ou para as organelas intracelulares 4,5,6,7,8,9. Devido à importância do zinco para o metabolismo celular, é vital entender a dinâmica do zinco celular.
Métodos prévios para avaliar a dinâmica do zinco dependiam da avaliação dos níveis de expressão do RNAm sob diferentes condições de zinco, correlacionando-os com as medidas celulares de zinco de tecidos ou células fixas10,11,12. Esses métodos incluem detecção química e coloração imunohistoquímica. No entanto, esses métodos produzem apenas medidas indiretas e, portanto, determinam apenas uma correlação offline entre a concentração intracelular de zinco e a expressão de transportadores de zinco. Consequentemente, esses métodos não podem inferir nenhum parâmetro que exija alta resolução temporal.
Uma medida mais direta do transporte de Zn2+ utiliza isótopos radioativos de zinco13. Este método baseia-se na medição de Zn2+ radiomarcado para monitorar o transporte de zinco e sua cinética. No entanto, devido à importância do zinco na homeostase celular, múltiplos processos celulares regulam a concentração intracelular de zinco. Entre eles estão a ligação extracelular e vários sistemas de transporte que trabalham em conjunto para manter um controle rigoroso dos níveis intracelulares de Zn2+ . A combinação desses processos cria um ruído de fundo considerável, o que dificulta o teste de funções individuais de transporte relacionadas ao zinco.
Este artigo demonstra um método para monitorar diretamente a taxa de transporte de zinco medindo a concentração intracelular de zinco livre usando um corante fluorescente específico para zinco, FluoZin-3. O corante tem alta especificidade para Zn2+ e pouca interferência de outros cátions divalentes, como o cálcio. Além disso, em sua forma de éster, ele entra nas células por difusão não iônica e é então aprisionado devido à atividade da diesterase intracelular. Assim, sua fluorescência é correlacionada primariamente com a concentração citosólica livre de zinco. Estes experimentos foram conduzidos para estudar a relação estrutura-função do transportador de zinco 1 (ZnT1), um membro da família ZnT.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito acima permite a medida direta da concentração intracelular de zinco com alta resolução temporal. Comparado a outros métodos, este método envolvendo o monitoramento de mudanças no Zn2+ intracelular pode diminuir substancialmente o ruído de fundo. Além disso, a seletividade do corante para o zinco elimina potenciais interações cruzadas com outros cátions metálicos18,19. Finalmente, sua ausência de citotoxicidade imediata …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Raz Zarivach é apoiado pela Israel Science Foundation (processo nº 163/22). Tomer Eli Ben Yosef e Arie Moran são apoiados pela Israel Science Foundation (bolsa nº 2047/20). Gostaríamos de agradecer a Daniel Gitler e seu grupo na Universidade Ben-Gurion por sua cooperação, apoio e experiência.
Materials
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM | ||
| Sigma Aldrich | 31665 |
References
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