Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

इन विट्रो जिंक ट्रांसपोर्ट परख का उपयोग करके स्तनधारी जस्ता ट्रांसपोर्टरों की विशेषता

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65217
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Life Sciences and National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University, 2Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University

Summary

जिंक परिवहन प्रोटीन फ़ंक्शन और कम अस्थायी संकल्प के लिए कमजोर कारण लिंक के कारण मापने के लिए चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है। यह प्रोटोकॉल उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के साथ, Zn2+ संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं से Zn 2+ एक्सट्रूज़न की निगरानी के लिए एक विधि का वर्णन करता है, इस प्रकार Zn2+ एफ्लक्स का प्रत्यक्ष माप प्रदान करता है।

Abstract

Zn2+ आयनों जैसे संक्रमण धातुओं को उनकी सेलुलर विषाक्तता के कारण कसकर विनियमित किया जाना चाहिए। पहले, Zn 2+ ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि को अप्रत्यक्ष रूप से Zn2+ की विभिन्न सांद्रता के तहत ट्रांसपोर्टर के अभिव्यक्ति स्तर को निर्धारित करके मापा गया था। यह इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके, ऊतक में एमआरएनए को मापकर, या सेलुलर जेडएन2 + स्तरों का निर्धारण करके किया गया था। इंट्रासेल्युलर जेडएन 2 + सेंसर के विकास के साथ, जस्ता ट्रांसपोर्टरों की गतिविधियों को वर्तमान में मुख्य रूप से इंट्रासेल्युलर जेडएन 2 + में परिवर्तनों को सहसंबंधित करके निर्धारित किया जाता है, जो फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करके जेडएन2 + ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति के साथ पता लगाया जाता है। हालांकि, आज भी, केवल कुछ प्रयोगशालाएं इंट्रासेल्युलर जेडएन2 + में गतिशील परिवर्तनों की निगरानी करती हैं और इसका उपयोग सीधे जस्ता ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि को मापने के लिए करती हैं। समस्या का एक हिस्सा यह है कि ZnT परिवार के 10 जस्ता ट्रांसपोर्टरों में से, ZnT10 (मैंगनीज का परिवहन) को छोड़कर, केवल जस्ता ट्रांसपोर्टर 1 (ZnT1) प्लाज्मा झिल्ली पर स्थानीयकृत है। इसलिए, इंट्रासेल्युलर जेडएन2 + एकाग्रता में परिवर्तन के लिए परिवहन गतिविधि को जोड़ना कठिन है। यह लेख जस्ता-विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई, फ्लुओज़िन -3 पर आधारित परख का उपयोग करके जस्ता परिवहन कैनेटीक्स को निर्धारित करने का एक सीधा तरीका बताता है। यह डाई अपने एस्टर रूप में स्तनधारी कोशिकाओं में लोड होती है और फिर सेलुलर डि-एस्टरेज़ गतिविधि के कारण साइटोसोल में फंस जाती है। कोशिकाओं को Zn 2+ आयोनोफोर पाइरिथियोन का उपयोग करके Zn2+ के साथ लोड किया जाता है। सेल वॉशआउट के बाद प्रतिदीप्ति में कमी के रैखिक भाग से ZnT1 गतिविधि का आकलन किया जाता है। 470 एनएम की उत्तेजना और 520 एनएम के उत्सर्जन पर मापा गया प्रतिदीप्ति मुक्त इंट्रासेल्युलर जेडएन2 + के आनुपातिक है। एमचेरी फ्लोरोफोरे के साथ टैग किए गए ZnT1 को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का चयन करने से केवल ट्रांसपोर्टर को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की निगरानी की अनुमति मिलती है। इस परख का उपयोग मानव ZnT1 के परिवहन तंत्र में ZnT1 प्रोटीन के विभिन्न डोमेन के योगदान की जांच करने के लिए किया जाता है, एक यूकेरियोटिक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन जो कोशिका से अतिरिक्त जस्ता को बाहर निकालता है।

Introduction

जस्ता सेलुलर वातावरण में एक आवश्यक ट्रेस तत्व है। यह सभी प्रोटीनों का एक तिहाई शामिल करता है और विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल होता है, जैसे कि उत्प्रेरण1, प्रतिलेखन2, और संरचनात्मक रूपांकन3। हालांकि, रेडॉक्स-निष्क्रिय होने के बावजूद, उच्च जस्ता सांद्रता कोशिका के लिए विषाक्त है, यही कारण है कि कोई भी स्तनधारी जीव जस्ता होमियोस्टैसिस को विनियमित करने वाले तंत्र की उपस्थिति के बिना जीवित नहीं है। स्तनधारियों में, इस प्रक्रिया के लिए तीन तंत्र जिम्मेदार हैं: (1) मेटलोथियोनिन, जो साइटोसोलिक सिस्टीन युक्त प्रोटीन हैं जो जस्ता को उच्च आत्मीयता पर बांधते हैं, इस प्रकार अतिरिक्त मुक्त साइटोसोलिक जस्ता4 को रोकते हैं; (2) जेडआरटी / आईआरटी जैसे प्रोटीन (ज़िप), जो प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से या इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल 4,5,6,7,8 से साइटोसोल में जस्ता प्रवाह के लिए जिम्मेदार जस्ता ट्रांसपोर्टर हैं; और (3) जेडएनटी, जो सर्वव्यापी केशन डिफ्यूजन फैसिलिटेटर (सीडीएफ) परिवार का एक स्तनधारी उप-समूह हैं और जस्ता ट्रांसपोर्टर हैं, क्योंकि वे प्लाज्मा झिल्ली के पार साइटोसोल से या इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल 4,5,6,7,8,9 में जस्ता निकालते हैं। सेलुलर चयापचय के लिए जस्ता के महत्व के कारण, सेलुलर जस्ता गतिशीलता को समझना महत्वपूर्ण है।

जस्ता गतिशीलता का आकलन करने के पिछले तरीके विभिन्न जस्ता स्थितियों के तहत एमआरएनए के अभिव्यक्ति स्तर का आकलन करने पर निर्भर करते थे, उन्हें निश्चित ऊतकों या कोशिकाओं के सेलुलर जस्ता माप के साथ सहसंबंध करके10,11,12। इन विधियों में रासायनिक पहचान और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला होना शामिल है। हालांकि, ये विधियां केवल अप्रत्यक्ष उपाय उत्पन्न करती हैं और इस प्रकार, इंट्रासेल्युलर जस्ता एकाग्रता और जस्ता ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति के बीच केवल एक ऑफ़लाइन सहसंबंध निर्धारित करती हैं। नतीजतन, ये विधियां उच्च अस्थायी संकल्प की आवश्यकता वाले किसी भी पैरामीटर का अनुमान नहीं लगा सकती हैं।

Zn2+ परिवहन का एक अधिक प्रत्यक्ष माप जस्ता13 के रेडियोधर्मी आइसोटोप का उपयोग करता है। यह विधि जस्ता परिवहन और इसके कैनेटीक्स की निगरानी के लिए रेडियोलेबल जेडएन2 + के माप पर निर्भर करती है। हालांकि, सेलुलर होमियोस्टैसिस के लिए जस्ता के महत्व के कारण, कई सेलुलर प्रक्रियाएं इंट्रासेल्युलर जस्ता एकाग्रता को नियंत्रित करती हैं। इनमें बाह्य बंधन और कई परिवहन प्रणालियां हैं जो इंट्रासेल्युलर जेडएन2 + स्तरों के कड़े नियंत्रण को बनाए रखने के लिए मिलकर काम करती हैं। इन प्रक्रियाओं का संयोजन काफी पृष्ठभूमि शोर पैदा करता है, जिससे व्यक्तिगत जस्ता से संबंधित परिवहन कार्यों का परीक्षण करना मुश्किल हो जाता है।

यह लेख जस्ता-विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई, फ्लुओज़िन -3 का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर मुक्त जस्ता एकाग्रता को मापकर जस्ता परिवहन दर की सीधे निगरानी करने की एक विधि प्रदर्शित करता है। डाई में Zn2+ के लिए उच्च विशिष्टता है और कैल्शियम जैसे अन्य द्विसंयोजक पिंजरों से थोड़ा हस्तक्षेप है। इसके अलावा, अपने एस्टर रूप में, यह नॉनआयनिक प्रसार द्वारा कोशिकाओं में प्रवेश करता है और फिर इंट्रासेल्युलर डि-एस्टरेज़ की गतिविधि के कारण फंस जाता है। इस प्रकार, इसकी प्रतिदीप्ति मुख्य रूप से मुक्त साइटोसोलिक जस्ता एकाग्रता के साथ सहसंबद्ध है। ये प्रयोग जेडएनटी परिवार के सदस्य जिंक ट्रांसपोर्टर 1 (जेडएनटी 1) की संरचना-कार्य संबंध का अध्ययन करने के लिए आयोजित किए गए थे।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेल अभिकर्मक

  1. डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में कल्चर HEK293T कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, और 1 एक्स पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (सामग्री की तालिका देखें) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में पूरक किया जाता है जब तक कि 10 सेमी प्लेट (8.8 x 106 कुल कोशिकाओं) पर संगम नहीं होता है।
  2. 12-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक 13 मिमी कवरस्लिप रखें। पूर्ण डीएमईएम के 12 एमएल में चरण 1.1 से 0.44 x 106 ट्रिप्सिनाइज्ड कोशिकाओं को पतला करें। तीन से पांच बार ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं। मिश्रित घोल के 1 एमएल के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से भरें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में उगाएं।
  3. प्रत्येक कुएं में पूर्ण डीएमईएम को प्रत्येक कुएं में 1 एमएल सीरम-मुक्त डीएमईएम ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ प्रतिस्थापित करें। चरण 1.1 के रूप में 12-वेल प्लेट को ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में वापस करें।
  4. प्रत्येक अभिकर्मक के लिए, पीएएवी 2 प्लास्मिड के 1 μg को पतला करें जिसमें 1.5 एमएल ट्यूब में सीरम-मुक्त डीएमईएम के 100 μL में एमचेरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (पूरक फ़ाइल 1) के साथ टैग किया गया प्रोटीन होता है।
  5. एक अलग 1.5 एमएल ट्यूब में प्रत्येक अभिकर्मक के साथ प्रति अभिकर्मक सीरम-मुक्त डीएमईएम के 100 μL में पॉलीथाइलीन माइन (पीईआई, सामग्री की तालिका देखें) के 3 μg जोड़ें। प्लास्मिड: पीईआई अनुपात 1: 3 (μg: μg) होना चाहिए।
  6. भंवर दोनों ट्यूबों को चरण 1.4 और चरण 1.5 से 10 सेकंड के लिए छोड़ दें, और कम से कम 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर आराम करने के लिए छोड़ दें।
  7. चरण 1.4 से डीएनए समाधान के एक भाग (100 μL प्रति कुएं) को चरण 1.5 से पीईआई समाधान के एक भाग (100 μL प्रति कुएं) के साथ मिलाएं। 10 सेकंड के लिए अंतिम समाधान को भंवर करें, और इसे कम से कम 20 मिनट और 6 घंटे तक कमरे के तापमान पर आराम करने के लिए छोड़ दें।
  8. इनक्यूबेटर से 12-वेल प्लेट लें। चरण 1.7 से अंतिम समाधान को भंवर करें, और चरण 1.3 से 12-वेल प्लेट में प्रत्येक कुएं में 200 μL जोड़ें। 12-वेल प्लेट को ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर (चरण 1.1) में वापस करें।
  9. 3 घंटे के बाद, प्रत्येक कुएं में माध्यम को पूर्ण डीएमईएम के 1 एमएल के साथ बदलें। चरण 1.1 के रूप में 12-वेल प्लेट को ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में वापस करें।
  10. 2 दिनों के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 इनक्यूबेटर से ट्रांसक्रिप्टेड सेल कल्चर लें, और इसे 10x आवर्धन का उपयोग करके उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर रखें।
  11. माइक्रोस्कोप फोकस व्हील का उपयोग करते हुए, ब्राइटफील्ड प्रकाश का उपयोग करते समय कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करें।
  12. फ्लोरोसेंट एमचेरी उत्तेजना (587 एनएम) और उत्सर्जन (610 एनएम) तरंग दैर्ध्य पर स्विच करें, और ब्राइटफील्ड लाइट को बंद करें। ZnT1 mCherry की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति की जांच करें।
  13. डाई लोडिंग समाधान तैयार करें।
    1. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत प्रकाश-संरक्षित स्टॉक से अपने एसिटोक्सीमिथाइल (एएम) एस्टर रूप में जिंक-विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई (सामग्री की तालिका देखें) के 4 μL का एलिकोट लें, जो डीएमएसओ (1 μg / μL) में घुल जाता है। यह रूप डाई को सरल प्रसार द्वारा प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से कोशिका में प्रवेश करने की अनुमति देता है।
    2. चरण 1.13.1 से एलिकोट में 10% प्लूरोनिक एसिड का 4 μL (या 20% प्लूरोनिक एसिड का 2 μL, सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। घोल को तीन बार ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं, और फिर सभी 8 μL को 1.5 mL ट्यूब में जोड़ें।
    3. रिंगर के घोल के 750 μL (इन-हाउस तैयार, संरचना के लिए सामग्री की तालिका देखें) चरण 1.13.2 से ट्यूब में 1 मिलीग्राम / एमएल (~ 0.1%) गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन के साथ पूरक जोड़ें, और भंवर को सख्ती से। अधिकतम मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए उसी समाधान के एक और 750 μL जोड़ें, और भंवर फिर से।
  14. चरण 1.13.3 से अंतिम समाधान के 750 μL को एक नई 6-वेल कल्चर प्लेट में दो कुओं में जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें।
    नोट: ब्लीचिंग से बचने के लिए, 6-वेल प्लेट को हमेशा इस चरण से एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया जाता है।
  15. एक बढ़िया चिमटी का उपयोग करके, ट्रांसक्रिप्टेड सेल कल्चर प्लेट से चार प्रतिकृति कवरलिप्स लें, और उन्हें चरण 1.14 से नई 6-वेल प्लेट के पहले भरे हुए कुएं (प्रति कुएं चार स्लाइड तक) में रखें। इस प्रक्रिया को दूसरे भरे हुए अच्छी तरह से के लिए दोहराएं।
    नोट: एक ही भरे हुए कुएं में सभी कवरलिप्स एक ही स्थिति से होने चाहिए। हालांकि, प्रत्येक कुएं में अलग-अलग स्थितियां हो सकती हैं।
  16. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें, और धीरे से 15-20 मिनट के लिए हिलाएं।
  17. डाई लोडिंग समाधान को हटा दें, और इसे रिंगर के प्लस एल्ब्यूमिन के एक नए वॉशिंग समाधान के साथ बदलें, जैसा कि चरण 1.13.3 में उपयोग किया गया है। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें। 20 मिनट के लिए फिर से हिलाने के लिए छोड़ दें। यह इंट्रासेल्युलर एस्टरेज़ द्वारा एएम एस्टर की दरार की अनुमति देता है।

2. माइक्रोस्कोप की तैयारी

  1. आवश्यक उपकरण ( सामग्री की तालिका देखें) को व्यवस्थित करें जैसा कि उल्लेख किया गया है: एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप जो जीएफपी और एमचेरी फ्लोरोफोरेस का पता लगाने में सक्षम है, एक छिड़काव प्रणाली जो कम से कम दो समाधानों, एक सक्शन सिस्टम और एक छिड़काव कक्ष के बीच स्विच करने की अनुमति देती है।
  2. माइक्रोस्कोप, उसके प्रकाश स्रोत और कैमरे को चालू करें। सक्शन सिस्टम चालू करें।
  3. छिड़काव प्रणाली को धो लें। पहले कक्ष को रिंगर के घोल से धोएं और दूसरे कक्ष को रिंगर के घोल से धोएं जिसमें 7 μM जिंक घोल 7 μM pyrithione (जिंक आयोनोफोर, सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक है। हवा के बुलबुले या अंतराल से बचने के लिए, प्रत्येक कक्ष में कुछ तरल छोड़ दें।
    नोट: चूंकि दोनों कंटेनर छिड़काव कक्ष से जुड़े एक ही ट्यूब से जुड़े होते हैं, इसलिए हमेशा सुनिश्चित करें कि साझा खंड रिंगर के समाधान से धोया जाता है।
  4. नल बंद करें, और रिंगर के समाधान और रिंगर के जस्ता समाधान के साथ उपयुक्त कक्षों को भरें, जैसा कि चरण 2.3 में है।

3. नमूना तैयार करना

  1. छिड़काव कक्ष लें, और इसे नाली के संकीर्ण पक्ष के साथ ऊपर की ओर रखें।
    नोट: नाली छिड़काव कक्ष के बीच में एक छेद है। यह कोशिकाओं को छिड़काव द्रव पहुंच की अनुमति देता है। नाली का एक पक्ष संकीर्ण है, और विपरीत पक्ष चौड़ा है।
  2. नाली के चारों ओर एक सीलिंग सिलिकॉन (सामग्री की तालिका देखें) लागू करें। पिपेट टिप का उपयोग करके नाली से किसी भी सीलिंग सिलिकॉन को साफ करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि 22 मिमी कवरस्लिप को सील करने के लिए नाली के चारों ओर पर्याप्त सिलिकॉन सील है।
  3. एक महीन चिमटी का उपयोग करके, धोने के घोल से एक कवरस्लिप लें, और इसे नाली के शीर्ष पर रखें, जिसमें कोशिकाएं नीचे की ओर हों। इस तरह, प्रयोग के दौरान कोशिकाओं को नाली को फैलाने वाले समाधान के संपर्क में लाया जाएगा।
  4. 13 मिमी कवरस्लिप के शीर्ष पर 22 मिमी कवरस्लिप रखें, और चिमटी का उपयोग करके इसे कस ें। ध्यान रखें कि कवरस्लिप को क्रैक न करें।
  5. कक्ष को पलटें, और सभी वर्तमान तरल पदार्थों को छोड़ने के लिए उस पर दबाएं। रिंगर के वाशिंग सॉल्यूशन के 100 μL के साथ नाली भरें, और यह सुनिश्चित करने के लिए फिर से दबाएं कि कोई रिसाव न हो।
    नोट: यदि रिसाव का पता चला है, तो रिसाव की साइट पर एक सीलिंग एजेंट लागू करें, और पुन: परीक्षण करें।
  6. प्लेटफॉर्म पर छिड़काव कक्ष माउंट करें, और इसे सुरक्षित करें। नाली में कोशिकाओं पर छिड़काव की अनुमति देने के लिए छिड़काव और सक्शन ट्यूब रखें।
  7. छिड़काव दर को लगभग 2 एमएल / मिनट तक बदलें, और रिंगर के समाधान के छिड़काव को चालू करें। सुनिश्चित करें कि छिड़काव प्रणाली बिना किसी रिसाव या स्पिलओवर के काम कर रही है।

4. माप की तैयारी

  1. आइकन पर डबल-क्लिक करके इमेजिंग सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)। संबंधित क्रेडेंशियल्स के साथ लॉग इन करें। संलग्न कैमरा चुनें, और ठीक दबाएं।
  2. माइक्रोस्कोप के बाईं ओर बटन का उपयोग करके माइक्रोस्कोप आवर्धन को 10x पर सेट करें।
  3. लाइव व्यू चुनना और जॉयस्टिक का उपयोग करके, प्लेटफॉर्म को नाली में कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए ले जाएं।
  4. जब छिड़काव चालू हो, तो रोशनी बंद करें और इंटरफ़ेस में समर्पित बटन दबाकर तरंग दैर्ध्य को एमचेरी में बदलें। माइक्रोस्कोप फोकस व्हील का उपयोग करके फोकस समायोजित करें।
  5. एक बार जब माइक्रोस्कोप कोशिकाओं पर केंद्रित हो जाता है, तो उचित सेल पैच के चयन की अनुमति देने के लिए जॉयस्टिक का उपयोग करके प्लेटफ़ॉर्म को स्थानांतरित करें।
    नोट: एक उपयुक्त क्षेत्र को आरओआई के लिए कम से कम 10 कोशिकाओं और पृष्ठभूमि के लिए एक खाली क्षेत्र के साथ एक क्षेत्र माना जाता है।
  6. आरओआई चालू /बंद ड्रॉप-डाउन मेनू का चयन करें, और परिपत्र आरओआई खींचें चुनें।
  7. एमचेरी-व्यक्त कोशिकाओं के साथ सेल समूहों के आरओआई खींचें (जेडएनटी 1 की अभिव्यक्ति को इंगित करता है)।
  8. चरण 4.6 के समान टूलबार से, पृष्ठभूमि आरओआई चालू / बंद करें बटन पर क्लिक करें, और पृष्ठभूमि आरओआई के स्थान और आकार को ऐसे क्षेत्र में समायोजित करें जिसमें कोई सेल नहीं है।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए एमचेरी और ईजीएफपी तरंग दैर्ध्य के साथ जांच ें कि चयनित पृष्ठभूमि आरओआई में कोई कोशिका नहीं है।
      नोट: तरंग दैर्ध्य को समायोजित किया गया था ताकि एमचेरी ने 520 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 610 एनएम की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग किया और ईजीएफपी ने 470 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 520 एनएम की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग किया।
  9. तरंगदैर्ध्य (3) उप-टैब का चयन करें। इसके चेकबॉक्स को चिह्नित करें, और सुनिश्चित करें कि जीएफपी तरंग दैर्ध्य मौजूद है और इसका चेकबॉक्स चिह्नित है। यदि नहीं, तो इसे जोड़ें और चिह्नित करें।
  10. अवधि उप-टैब का चयन करें . माप अंतराल को हर 5 सेकंड के रूप में परिभाषित करें, और प्रयोग अवधि के अनुरूप अंतराल की संख्या बदलें।
  11. आईपीस के नीचे माइक्रोस्कोप पैनल पर फोकस अनुभाग में, सही फोकस सिस्टम (पीएफएस) को सक्षम करने के लिए ऑन बटन पर क्लिक करें।
  12. पीएफएस फोकस व्हील का उपयोग करके, फ़ोकस समायोजित करें। सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस में, एनडी अधिग्रहण के तहत, सुनिश्चित करें कि पीएफएस पर टिक किया गया है।
  13. अभी रन पर क्लिक करें।

5. प्रायोगिक प्रक्रिया

  1. रिंगर के समाधान छिड़काव का उपयोग करके 90 एस बेसलाइन अवधि माप के साथ शुरू करें।
  2. बेसलाइन अवधि समाप्त होने के बाद, रिंगर के समाधान छिड़काव को बंद करें, और फिर रिंगर के जस्ता समाधान छिड़काव को चालू करें। मुख्य इंटरफ़ेस पैनल के निचले दाईं ओर लाल ध्वज पर क्लिक करके समाधान के स्विचिंग को चिह्नित करें। प्रतिदीप्ति में वृद्धि दिखाई देने की उम्मीद है।
  3. एक बार जब प्रतिदीप्ति वृद्धि संतृप्त होने लगती है, तो रिंगर के समाधान के साथ छिड़काव में वापस बदलें। रिंगर के जस्ता समाधान छिड़काव को बंद करें, और फिर रिंगर के समाधान छिड़काव को चालू करें।
  4. प्रयोग का समय समाप्त होने तक प्रतीक्षा करें. यदि ZnT1 ठीक से काम कर रहा है तो प्रतिदीप्ति में एक उल्लेखनीय लेकिन स्थिर कमी की उम्मीद है।

6. डेटा निर्यात

  1. बेसलाइन घटाव के साथ डेटा निर्यात करने के लिए, बेसलाइन घटाएं बटन दबाएं, और "एनडी अधिग्रहण विंडो" में परिवर्तन देखें।
  2. "एनडी अधिग्रहण विंडो" में सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस में निर्यात बटन पर क्लिक करें। एक Excel डेटापत्रक खुल जाएगा. इच्छित स्थान पर सहेजें.

7. डेटा विश्लेषण

  1. प्रत्येक आरओआई के लिए, पहले 90-100 एस से एक औसत बेसलाइन फ्लोरेसेंस बनाएं।
  2. प्रत्येक आरओआई के लिए गणना की गई प्रतिदीप्ति को उस आरओआई के लिए पृष्ठभूमि के प्रतिशत के रूप में व्यक्त करें।
  3. सभी आरओआई का एक पंक्ति औसत बनाएं, और परिणाम को लाइन ग्राफ के रूप में प्लॉट करें। यह समय के कार्य के रूप में सभी आरओआई का औसत बनाता है।
  4. रैखिक फिट फ़ंक्शन का उपयोग करके, रिंगर के समाधान के साथ धोने के बाद प्रतिदीप्ति में कमी के लिए प्रारंभिक दर का चयन करें। समीकरण का ढलान मूल्य परिवहन दर के साथ संबंधित है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ZnT1 एक स्तनधारी जस्ता ट्रांसपोर्टर है जो कोशिका प्लाज्मा झिल्ली13 पर स्थित है। यह केशन डिफ्यूजन फैसिलिटेटर (सीडीएफ) प्रोटीन परिवार का एक सदस्य है जो साइटोसोल से जिंक को बाह्य मिलावट14 में बाहर निकालता है। ZnT1 में एक दो-डोमेन आर्किटेक्चर है: ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन, जो झिल्ली के पार आयनों को स्थानांतरित करता है, और एक सी-टर्मिनल डोमेन14। अन्य ज्ञात सीडीएफ प्रोटीन के विपरीत, जेडएनटी 1 में एक विस्तारित असंरचित सी-टर्मिनल डोमेन (यूएससीटीडी) है। वर्तमान में USCTD की भूमिका अज्ञात है। हमने जस्ता परिवहन गतिविधि में इसकी भागीदारी का आकलन करने के लिए USCTD के बिना ZnT1 WT से ZnT1 की तुलना करने के लिए ऊपर दिए गए प्रोटोकॉल का उपयोग किया।

एचईके 293टी कोशिकाओं को पीएएवी 2 प्लास्मिड के साथ स्थानांतरित किया गया था जिसमें असंरचित सी-टर्मिनल के बिना या तो जेडएनटी 1 डब्ल्यूटी या जेडएनटी 1 था और ऊपर वर्णित परिवहन गतिविधि दर का परीक्षण किया गया था। पूरक चित्र 1 से पता चलता है कि ZnT1 के दोनों संस्करण बिना किसी समस्या के प्लाज्मा झिल्ली को व्यक्त और स्थानीयकृत करते हैं। चित्रा 1 इस तरह के प्रयोग के एक उदाहरण के लिए विशिष्ट परिणामों को दर्शाता है। प्रतिदीप्ति में वृद्धि इंट्रासेल्युलर Zn 2+ एकाग्रता में वृद्धि का परिणाम है, जबकि कमी कोशिका झिल्ली में Zn2+ परिवहन करने वाले ZnT1 की गतिविधि का परिणाम है (मानक त्रुटियों सहित व्यक्तिगत ग्राफ़, पूरक चित्रा 2 और पूरक चित्रा 3 में पाए जाते हैं)। इस आंकड़े से स्पष्ट है कि ZnT1 WT में उत्परिवर्ती की तुलना में एक चिकनी प्रतिदीप्ति वक्र है। हालांकि, यह एक अंतर्निहित विभेदक विशेषता नहीं है, लेकिन जस्ता भार के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं में परिवर्तनशीलता से संबंधित है, जो पिछले प्रयोगों में देखा गया है। चित्रा 2 15-17 ऐसे प्रयोगों के परिणामों को सारांशित करने वाला एक बॉक्स प्लॉट दिखाता है। आंकड़े से, यह स्पष्ट है कि डब्ल्यूटी की तुलना में त्रिभुज यूएससीटीडी परिवहन दरों का व्यापक प्रसार प्रस्तुत करता है। हालांकि इसे पहले उल्लिखित सेलुलर प्रतिक्रिया परिवर्तनशीलता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, यह एक कार्यात्मक अंतर का संकेत भी दे सकता है। उदाहरण के लिए, इसका मतलब यह हो सकता है कि ZnT1 USCTD खंड परिवहन दर का एक मॉड्यूलेटर है। स्पष्ट रूप से, WT और ΜUSCTD की Zn2+ एक्सट्रूडिंग गतिविधियों के बीच कोई स्पष्ट अंतर नहीं है। सांख्यिकीय विश्लेषण के आधार पर, डेटा सामान्य रूप से वितरित नहीं किया गया था (डब्ल्यूटी डेटासेट, शापिरो-विल्क परीक्षण15, आंकड़ा = 0.72404, पी मान = 0.0004), इसलिए डेटासेट के बीच तुलना के लिए दो नमूना गैर-पैरामीट्रिक परीक्षणों का उपयोग किया गया था। परिणामों से पता चला कि परिवहन दरों के बीच कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं था (मान-व्हिटनी16 यू परीक्षण: यू = 132, जेड = 0.15105, एसिम्प)। प्रो> |U| = 0.87994; कोल्मोगोरोव-स्मिरनोव17 परीक्षण: डी = 0.27059, जेड = 0.76384, सटीक प्रोब>D|= 0.5161)।

असंरचित विस्तार (~ 80 अमीनो एसिड) बनाने की पर्याप्त ऊर्जावान लागत के कारण, यह मानना उचित है कि यह डोमेन एक सेलुलर फ़ंक्शन प्रदान करता है। हालाँकि, इस डोमेन से जुड़े सेलुलर फ़ंक्शन की पहचान अब तक नहीं की गई है। यह डोमेन ZnT1 के लिए अद्वितीय है और ZnT परिवार के किसी अन्य सदस्य में नहीं पाया जाता है। जैसे, यह इस तथ्य के कारण हो सकता है कि, अन्य ZnTs के विपरीत, ZnT1 प्लाज्मा झिल्ली पर स्थित है, जबकि ZnT10 को छोड़कर, अन्य सभी सदस्य आंतरिक ऑर्गेनेल में व्यक्त किए जाते हैं।

यहां दिखाए गए कच्चे डेटा और बाद के ग्राफ जस्ता-संवेदनशील डाई के कारण प्रतिदीप्ति के 5 एस अंतराल माप पर आधारित हैं। इसका मतलब यह है कि अपेक्षाकृत कम समय सीमा (मिनट) में, उच्च अस्थायी संकल्प के साथ समय-निर्भर जस्ता परिवहन का एक दृश्य उत्पन्न किया जा सकता है। विश्लेषण में एक आधारभूत अवधि सामान्यीकरण शामिल होना चाहिए क्योंकि डाई को जस्ता लोडिंग से पहले कोशिकाओं में लोड किया जाता है और इसमें मुक्त जस्ता की थोड़ी मात्रा के कारण प्रारंभिक इंट्रासेल्युलर प्रतिदीप्ति हो सकती है। इसके अलावा, जिंक डाई केवल इंट्रासेल्युलर एस्टरेज़ द्वारा दरार के बाद फ्लोरोसेंटली सक्रिय हो जाती है। इसलिए, पूरे प्रयोग के दौरान डाई एस्टर क्लीवेज के कारण अनियमित प्रतिदीप्ति पैटर्न से बचने के लिए अधिकांश डाई के लिए डी-एस्टरीफिकेशन प्रक्रिया के लिए कुछ समय देने की सिफारिश की जाती है।

Figure 1
चित्र 1: जस्ता परिवहन परख का उपयोग करके डब्ल्यूटी और यूयूएससीटीडी की जेडएन2 + एक्सट्रूडिंग गतिविधियां। एक्स-अक्ष सेकंड में समय है। वाई-अक्ष प्रतिदीप्ति परिवर्तन है जिसे बेसलाइन के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है। लाइन ग्राफ समय के कार्य के रूप में प्रतिदीप्ति परिवर्तन हैं। डेटा >10 आरओआई से अधिक औसत हैं। मानक त्रुटि वाले व्यक्तिगत रेखांकन पूरक चित्र 2 और पूरक चित्र 3 में दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: ZnT1 WT और त्रिभुज USCTD की गतिविधियों की तुलना एक बॉक्स प्लॉट के रूप में चित्रित की गई है। प्रत्येक डेटा बिंदु एक एकल प्रयोग का प्रतिनिधित्व करता है। काली रेखा औसत स्कोर को इंगित करती है। खोखला वर्गाकार बॉक्स औसत स्कोर को इंगित करता है। वाई-अक्ष प्रति सेकंड बेसलाइन प्रतिशत में परिवर्तन को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: एचईके 293टी कोशिकाओं को (ए) जेडएनटी 1 डब्ल्यूटी या (बी) जेडएनटी 1 के साथ स्थानांतरित किया जाता है जो एमचेरी उत्तेजना (520 एनएम) और उत्सर्जन (610 एनएम) तरंग दैर्ध्य में उत्तेजित होता है। दोनों उदाहरणों में, ZnT1 संस्करण की अभिव्यक्ति और झिल्ली स्थानीयकरण है। माइक्रोस्कोप आवर्धन 20x है। एक्सपोजर समय 100 एमएस है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्र 2: ZnT1 WT Zn2+ मानक त्रुटि के साथ परिवहन गतिविधि। एक्स-अक्ष सेकंड में समय है। वाई-अक्ष बेसलाइन प्रतिदीप्ति से प्रतिशत प्रतिदीप्ति परिवर्तन है। काली रेखा औसत प्रतिदीप्ति परिवर्तन है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 3: ZnT1 त्रिभुज USCTD Zn2+ मानक त्रुटि विज़ुअलाइज़ की गई गतिविधि के साथ परिवहनगतिविधि। एक्स-अक्ष सेकंड में समय है। वाई-अक्ष बेसलाइन प्रतिदीप्ति से प्रतिशत प्रतिदीप्ति परिवर्तन है। लाल रेखा औसत प्रतिदीप्ति परिवर्तन है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: पीएएवी 2 प्लास्मिड अनुक्रम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

उपरोक्त वर्णित विधि उच्च अस्थायी संकल्प के साथ इंट्रासेल्युलर जस्ता एकाग्रता के प्रत्यक्ष माप की अनुमति देती है। अन्य तरीकों की तुलना में, इंट्रासेल्युलर जेडएन2 + में परिवर्तन की निगरानी से जुड़ी यह विधि पृष्ठभूमि शोर को काफी हद तक कम कर सकती है। इसके अलावा, जस्ता के लिए डाई की चयनात्मकता अन्य धातु के पिंजरों18,19 के साथ संभावित क्रॉस-इंटरैक्शन को समाप्त करती है। अंत में, तत्काल साइटोटॉक्सिसिटी की कमी जीवितसेलुलर प्रक्रियाओं के परीक्षण को सक्षम बनाती है।

हालांकि, इस विधि की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, इंट्रासेल्युलर गतिशीलता का पता लगाना इस प्रोटोकॉल के साथ अपेक्षाकृत अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि इस विधि में उपयोग की जाने वाली डाई को सेल में फंसने के लिए डिज़ाइन किया गया है, लेकिन इसे क्षेत्रों या विशिष्ट प्रक्रियाओं के लिए निर्देशित नहीं किया जा सकता है। अन्य फ्लोरोसेंट रंगों को कोशिकाओं में एक विशिष्ट क्षेत्र में निर्देशित किया जा सकता है, लेकिन दुर्भाग्य से, बहुत कम गतिशील सीमा20 है। दूसरा, प्रकाश के लिए डाई के संपर्क में विरंजन के कारण प्रतिदीप्ति में कमी आती है, जो प्रकाश के संपर्क के समय को प्रतिबंधित करती है और परिणामस्वरूप, प्रयोग चलाने के लिए सक्रिय खिड़की। तीसरा, इस प्रोटोकॉल में डाई लोडिंग अन्य रंजकों, विशेष रूप से आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड रंगों21 का उपयोग करने की तुलना में बोझिल और समय लेने वाली है। अंत में, एस्टर को छोड़ने के बाद भी, डाई लीक हो जाती है, जिससे प्रतिदीप्ति22 में जेडएन2 + -स्वतंत्र कमी होती है।

प्रयोग की सफलता सुनिश्चित करने के लिए कई कदम उठाए जाने चाहिए। सबसे पहले, चूंकि अभिकर्मक असमान रूप से वितरित किया जा सकता है, चयनित कोशिकाओं में रुचि का प्रोटीन होना चाहिए। डाई ब्लीचिंग से बचने के लिए, भरी हुई कोशिकाओं को प्रकाश से सुरक्षित रखना महत्वपूर्ण है। प्रयोग चलाते समय, छिड़काव दर कवरस्लिप से कोशिकाओं की टुकड़ी के कारण प्रयोग को पूरा करने के लिए पर्याप्त होनी चाहिए। कई रन के मामले में, रिंगर के समाधान और रिंगर के जस्ता समाधान के लिए एक ही जलाशय रखने की सिफारिश की जाती है। डाई लोडिंग समय और धोने का समय प्रारंभिक प्रयोगों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। पाइरिथियोन के साथ छिड़काव के माध्यम से कोशिकाओं में जिंक लोडिंग में 1 मिनट से 5 मिनट तक का समय लग सकता है, जैसा कि समय के साथ जेडएन2 + -प्रेरित प्रतिदीप्ति की निगरानी द्वारा मूल्यांकन किया गया है।

इन कठिनाइयों के बावजूद, यह विधि हमें पहली बार, Zn2 + एक्सट्रूडिंग प्रक्रिया की गतिशीलता का अध्ययन करने की अनुमति देती है। यह प्रक्रिया को सरल बनाता है और पिछले तरीकों23,24 की तुलना में कारण लिंक को बेहतर ढंग से स्थापित करने का एक सीधा तरीका बनाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

राज ज़रीवाच इज़राइल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 163/22) द्वारा समर्थित है। टोमर एली बेन योसेफ और एरी मोरन को इज़राइल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2047/20) द्वारा समर्थित किया जाता है। हम डैनियल गिटलर और बेन-गुरियन विश्वविद्यालय में उनके समूह को उनके सहयोग, समर्थन और विशेषज्ञता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm plate greiner bio-one 664160
12-well cell culture plate greiner bio-one 665180
13 mm coverslips Superior Marienfeld 111530
22 mm cover slides Superior Marienfeld 101050
6-well culture plate greiner bio-one 657160
Bovine serum albumin bioWorld 22070008
Calcium chloride anhydrous, granular Sigma Aldrich C1016 Concentration in Ringer solution: 1 mM
D-(+)-Glucose Glentham Life Science GC6947 Concentration in Ringer solution: 10 mM
Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM)  Sartorius 01-055-1A
Eclipse Ti inverted microscope Nikon TI-DH Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2
Fetal Bovine Serum (FBS) Cytiva SH30088.03
Fine tweezers Dumont 0203-55-PS
Fluozin-3AM Invitrogen F24195
HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution Cytiva SV30010 
LED illumination system CoolLED pE-4000
L-glutamine Biological Industries 03-020-1B
Magnesium chloride hexahydrate Merck 1.05833 Concentration in Ringer solution: 0.8 mM
N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) Formedium HEPES10 Concentration in Ringer solution: 10 mM
Neo 5.5 sCMOS camera ANDOR DC-152Q-FI
NIS-Elements imaging software Nikon AR
Pluronic acid F-127 Millipore 540025
Pottasium chloride Bio-Lab 163823 Concentration in Ringer solution: 5.4 mM
Pyrithione Sigma Aldrich H3261 Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM
Silicone Grease Kit Warner Instruments W4 64-0378
Sodium chloride Bio-Lab 190305 Concentration in Ringer solution: 120 mM
Zinc sulfate Sigma Aldrich 31665 Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lindskog, S. Structure and mechanism of carbonic anhydrase. Pharmacology & Therapeutics. 74 (1), 1-20 (1997).
  2. Rutherford, J. C., Bird, A. J. Metal-responsive transcription factors that regulate iron, zinc, and copper homeostasis in eukaryotic cells. Eukaryotic Cell. 3 (1), 1-13 (2004).
  3. Maret, W. Zinc Biochemistry: From a single zinc enzyme to a key element of life. Advances in Nutrition. 4 (1), 82-91 (2013).
  4. Kimura, T., Kambe, T. The functions of metallothionein and ZIP and ZnT transporters: An overview and perspective. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 336 (2016).
  5. Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
  6. Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The physiological, biochemical, and molecular roles of zinc transporters in zinc homeostasis and metabolism. Physiological Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
  7. Hara, T., Yoshigai, E., Ohashi, T., Fukada, T. Zinc transporters as potential therapeutic targets: An updated review. Journal of Pharmacological Sciences. 148 (2), 221-228 (2022).
  8. Kambe, T., Taylor, K. M., Fu, D. Zinc transporters and their functional integration in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 296, 100320 (2021).
  9. Huang, L., Tepaamorndech, S. The SLC30 family of zinc transporters - A review of current understanding of their biological and pathophysiological roles. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2), 548-560 (2013).
  10. Lovell, M. A., Smith, J. L., Xiong, S., Markesbery, W. R. Alterations in zinc transporter protein-1 (ZnT-1) in the brain of subjects with mild cognitive impairment, early, and late-stage Alzheimer's disease. Neurotoxicity Research. 7 (4), 265-271 (2005).
  11. Lyubartseva, G., Smith, J. L., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. Alterations of zinc transporter proteins ZnT-1, ZnT-4 and ZnT-6 in preclinical Alzheimer's disease brain. Brain Pathology. 20 (2), 343-350 (2010).
  12. Tsuda, M., et al. Expression of zinc transporter gene, ZnT-1, is induced after transient forebrain ischemia in the gerbil. The Journal of Neuroscience. 17 (17), 6678-6684 (1997).
  13. Palmiter, R. d, Findley, S. d Cloning and functional characterization of a mammalian zinc transporter that confers resistance to zinc. The EMBO Journal. 14 (4), 639-649 (1995).
  14. Cotrim, C. A., Jarrott, R. J., Martin, J. L., Drew, D. A structural overview of the zinc transporters in the cation diffusion facilitator family. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75 (4), 357-367 (2019).
  15. Shapiro, S. S., Wilk, M. B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika. 52 (3-4), 591-611 (1965).
  16. Mann, H. B., Whitney, D. R. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. The Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
  17. Darling, D. A. The Kolmogorov-Smirnov, Cramer-von Mises tests. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (4), 823-838 (1957).
  18. Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
  19. Gee, K. R., Zhou, Z. -L., Ton-That, D., Sensi, S. L., Weiss, J. H. Measuring zinc in living cells.: A new generation of sensitive and selective fluorescent probes. Cell Calcium. 31 (5), 245-251 (2002).
  20. Sensi, S. L., Ton-That, D., Weiss, J. H., Rothe, A., Gee, K. R. A new mitochondrial fluorescent zinc sensor. Cell Calcium. 34 (3), 281-284 (2003).
  21. Hessels, A. M., et al. eZinCh-2: A versatile, genetically encoded FRET sensor for cytosolic and intraorganelle Zn2+ imaging. ACS Chemical Biology. 10 (9), 2126-2134 (2015).
  22. Sánchez-Martín, R. M., Cuttle, M., Mittoo, S., Bradley, M. Microsphere-based real-time calcium sensing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (33), 5472-5474 (2006).
  23. Namdarghanbari, M. A., et al. Reaction of the zinc sensor FluoZin-3 with Zn7-metallothionein: Inquiry into the existence of a proposed weak binding site. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (3), 224-231 (2010).
  24. Devinney, M. J., Reynolds, I. J., Dineley, K. E. Simultaneous detection of intracellular free calcium and zinc using fura-2FF and FluoZin-3. Cell Calcium. 37 (3), 225-232 (2005).

Tags

जिंक ट्रांसपोर्टर्स इन विट्रो परख जेडएन 2 + आयन सेलुलर विषाक्तता अप्रत्यक्ष माप इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एमआरएनए अभिव्यक्ति जेडएन 2 + स्तर इंट्रासेल्युलर जेडएन 2 + सेंसर फ्लोरोसेंट जांच जस्ता ट्रांसपोर्टर गतिविधि इंट्रासेल्युलर जेडएन 2 + में गतिशील परिवर्तन जेडएनटी परिवार प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण इंट्रासेल्युलर जेडएन 2 + एकाग्रता जस्ता-विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई फ्लुओज़िन -3 एस्टर फॉर्म साइटोसोल ट्रैपिंग जेडएन 2 + आयोनोफोर पाइरिथियोन
<em>इन विट्रो</em> जिंक ट्रांसपोर्ट परख का उपयोग करके स्तनधारी जस्ता ट्रांसपोर्टरों की विशेषता
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ben Yosef, T. E., Zarivach, R.,… More

Ben Yosef, T. E., Zarivach, R., Moran, A. Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay. J. Vis. Exp. (196), e65217, doi:10.3791/65217 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter