इन विट्रो जिंक ट्रांसपोर्ट परख का उपयोग करके स्तनधारी जस्ता ट्रांसपोर्टरों की विशेषता
Summary
जिंक परिवहन प्रोटीन फ़ंक्शन और कम अस्थायी संकल्प के लिए कमजोर कारण लिंक के कारण मापने के लिए चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है। यह प्रोटोकॉल उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के साथ, Zn2+ संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं से Zn 2+ एक्सट्रूज़न की निगरानी के लिए एक विधि का वर्णन करता है, इस प्रकार Zn2+ एफ्लक्स का प्रत्यक्ष माप प्रदान करता है।
Abstract
Zn2+ आयनों जैसे संक्रमण धातुओं को उनकी सेलुलर विषाक्तता के कारण कसकर विनियमित किया जाना चाहिए। पहले, Zn 2+ ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि को अप्रत्यक्ष रूप से Zn2+ की विभिन्न सांद्रता के तहत ट्रांसपोर्टर के अभिव्यक्ति स्तर को निर्धारित करके मापा गया था। यह इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके, ऊतक में एमआरएनए को मापकर, या सेलुलर जेडएन2 + स्तरों का निर्धारण करके किया गया था। इंट्रासेल्युलर जेडएन 2 + सेंसर के विकास के साथ, जस्ता ट्रांसपोर्टरों की गतिविधियों को वर्तमान में मुख्य रूप से इंट्रासेल्युलर जेडएन 2 + में परिवर्तनों को सहसंबंधित करके निर्धारित किया जाता है, जो फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करके जेडएन2 + ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति के साथ पता लगाया जाता है। हालांकि, आज भी, केवल कुछ प्रयोगशालाएं इंट्रासेल्युलर जेडएन2 + में गतिशील परिवर्तनों की निगरानी करती हैं और इसका उपयोग सीधे जस्ता ट्रांसपोर्टरों की गतिविधि को मापने के लिए करती हैं। समस्या का एक हिस्सा यह है कि ZnT परिवार के 10 जस्ता ट्रांसपोर्टरों में से, ZnT10 (मैंगनीज का परिवहन) को छोड़कर, केवल जस्ता ट्रांसपोर्टर 1 (ZnT1) प्लाज्मा झिल्ली पर स्थानीयकृत है। इसलिए, इंट्रासेल्युलर जेडएन2 + एकाग्रता में परिवर्तन के लिए परिवहन गतिविधि को जोड़ना कठिन है। यह लेख जस्ता-विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई, फ्लुओज़िन -3 पर आधारित परख का उपयोग करके जस्ता परिवहन कैनेटीक्स को निर्धारित करने का एक सीधा तरीका बताता है। यह डाई अपने एस्टर रूप में स्तनधारी कोशिकाओं में लोड होती है और फिर सेलुलर डि-एस्टरेज़ गतिविधि के कारण साइटोसोल में फंस जाती है। कोशिकाओं को Zn 2+ आयोनोफोर पाइरिथियोन का उपयोग करके Zn2+ के साथ लोड किया जाता है। सेल वॉशआउट के बाद प्रतिदीप्ति में कमी के रैखिक भाग से ZnT1 गतिविधि का आकलन किया जाता है। 470 एनएम की उत्तेजना और 520 एनएम के उत्सर्जन पर मापा गया प्रतिदीप्ति मुक्त इंट्रासेल्युलर जेडएन2 + के आनुपातिक है। एमचेरी फ्लोरोफोरे के साथ टैग किए गए ZnT1 को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का चयन करने से केवल ट्रांसपोर्टर को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की निगरानी की अनुमति मिलती है। इस परख का उपयोग मानव ZnT1 के परिवहन तंत्र में ZnT1 प्रोटीन के विभिन्न डोमेन के योगदान की जांच करने के लिए किया जाता है, एक यूकेरियोटिक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन जो कोशिका से अतिरिक्त जस्ता को बाहर निकालता है।
Introduction
जस्ता सेलुलर वातावरण में एक आवश्यक ट्रेस तत्व है। यह सभी प्रोटीनों का एक तिहाई शामिल करता है और विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल होता है, जैसे कि उत्प्रेरण1, प्रतिलेखन2, और संरचनात्मक रूपांकन3। हालांकि, रेडॉक्स-निष्क्रिय होने के बावजूद, उच्च जस्ता सांद्रता कोशिका के लिए विषाक्त है, यही कारण है कि कोई भी स्तनधारी जीव जस्ता होमियोस्टैसिस को विनियमित करने वाले तंत्र की उपस्थिति के बिना जीवित नहीं है। स्तनधारियों में, इस प्रक्रिया के लिए तीन तंत्र जिम्मेदार हैं: (1) मेटलोथियोनिन, जो साइटोसोलिक सिस्टीन युक्त प्रोटीन हैं जो जस्ता को उच्च आत्मीयता पर बांधते हैं, इस प्रकार अतिरिक्त मुक्त साइटोसोलिक जस्ता4 को रोकते हैं; (2) जेडआरटी / आईआरटी जैसे प्रोटीन (ज़िप), जो प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से या इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल 4,5,6,7,8 से साइटोसोल में जस्ता प्रवाह के लिए जिम्मेदार जस्ता ट्रांसपोर्टर हैं; और (3) जेडएनटी, जो सर्वव्यापी केशन डिफ्यूजन फैसिलिटेटर (सीडीएफ) परिवार का एक स्तनधारी उप-समूह हैं और जस्ता ट्रांसपोर्टर हैं, क्योंकि वे प्लाज्मा झिल्ली के पार साइटोसोल से या इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल 4,5,6,7,8,9 में जस्ता निकालते हैं। सेलुलर चयापचय के लिए जस्ता के महत्व के कारण, सेलुलर जस्ता गतिशीलता को समझना महत्वपूर्ण है।
जस्ता गतिशीलता का आकलन करने के पिछले तरीके विभिन्न जस्ता स्थितियों के तहत एमआरएनए के अभिव्यक्ति स्तर का आकलन करने पर निर्भर करते थे, उन्हें निश्चित ऊतकों या कोशिकाओं के सेलुलर जस्ता माप के साथ सहसंबंध करके10,11,12। इन विधियों में रासायनिक पहचान और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला होना शामिल है। हालांकि, ये विधियां केवल अप्रत्यक्ष उपाय उत्पन्न करती हैं और इस प्रकार, इंट्रासेल्युलर जस्ता एकाग्रता और जस्ता ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति के बीच केवल एक ऑफ़लाइन सहसंबंध निर्धारित करती हैं। नतीजतन, ये विधियां उच्च अस्थायी संकल्प की आवश्यकता वाले किसी भी पैरामीटर का अनुमान नहीं लगा सकती हैं।
Zn2+ परिवहन का एक अधिक प्रत्यक्ष माप जस्ता13 के रेडियोधर्मी आइसोटोप का उपयोग करता है। यह विधि जस्ता परिवहन और इसके कैनेटीक्स की निगरानी के लिए रेडियोलेबल जेडएन2 + के माप पर निर्भर करती है। हालांकि, सेलुलर होमियोस्टैसिस के लिए जस्ता के महत्व के कारण, कई सेलुलर प्रक्रियाएं इंट्रासेल्युलर जस्ता एकाग्रता को नियंत्रित करती हैं। इनमें बाह्य बंधन और कई परिवहन प्रणालियां हैं जो इंट्रासेल्युलर जेडएन2 + स्तरों के कड़े नियंत्रण को बनाए रखने के लिए मिलकर काम करती हैं। इन प्रक्रियाओं का संयोजन काफी पृष्ठभूमि शोर पैदा करता है, जिससे व्यक्तिगत जस्ता से संबंधित परिवहन कार्यों का परीक्षण करना मुश्किल हो जाता है।
यह लेख जस्ता-विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई, फ्लुओज़िन -3 का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर मुक्त जस्ता एकाग्रता को मापकर जस्ता परिवहन दर की सीधे निगरानी करने की एक विधि प्रदर्शित करता है। डाई में Zn2+ के लिए उच्च विशिष्टता है और कैल्शियम जैसे अन्य द्विसंयोजक पिंजरों से थोड़ा हस्तक्षेप है। इसके अलावा, अपने एस्टर रूप में, यह नॉनआयनिक प्रसार द्वारा कोशिकाओं में प्रवेश करता है और फिर इंट्रासेल्युलर डि-एस्टरेज़ की गतिविधि के कारण फंस जाता है। इस प्रकार, इसकी प्रतिदीप्ति मुख्य रूप से मुक्त साइटोसोलिक जस्ता एकाग्रता के साथ सहसंबद्ध है। ये प्रयोग जेडएनटी परिवार के सदस्य जिंक ट्रांसपोर्टर 1 (जेडएनटी 1) की संरचना-कार्य संबंध का अध्ययन करने के लिए आयोजित किए गए थे।
Protocol
Representative Results
Discussion
उपरोक्त वर्णित विधि उच्च अस्थायी संकल्प के साथ इंट्रासेल्युलर जस्ता एकाग्रता के प्रत्यक्ष माप की अनुमति देती है। अन्य तरीकों की तुलना में, इंट्रासेल्युलर जेडएन2 + में परिवर्तन की निगरानी से जुड़?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
राज ज़रीवाच इज़राइल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 163/22) द्वारा समर्थित है। टोमर एली बेन योसेफ और एरी मोरन को इज़राइल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2047/20) द्वारा समर्थित किया जाता है। हम डैनियल गिटलर और बेन-गुरियन विश्वविद्यालय में उनके समूह को उनके सहयोग, समर्थन और विशेषज्ञता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 10 cm plate | greiner bio-one | 664160 | |
| 12-well cell culture plate | greiner bio-one | 665180 | |
| 13 mm coverslips | Superior Marienfeld | 111530 | |
| 22 mm cover slides | Superior Marienfeld | 101050 | |
| 6-well culture plate | greiner bio-one | 657160 | |
| Bovine serum albumin | bioWorld | 22070008 | |
| Calcium chloride anhydrous, granular | Sigma Aldrich | C1016 | Concentration in Ringer solution: 1 mM |
| D-(+)-Glucose | Glentham Life Science | GC6947 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Dubelco’s Modified Eagle Media (DMEM) | Sartorius | 01-055-1A | |
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | TI-DH | Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH30088.03 | |
| Fine tweezers | Dumont | 0203-55-PS | |
| Fluozin-3AM | Invitrogen | F24195 | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution | Cytiva | SV30010 | |
| LED illumination system | CoolLED | pE-4000 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Merck | 1.05833 | Concentration in Ringer solution: 0.8 mM |
| N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | Formedium | HEPES10 | Concentration in Ringer solution: 10 mM |
| Neo 5.5 sCMOS camera | ANDOR | DC-152Q-FI | |
| NIS-Elements imaging software | Nikon | AR | |
| Pluronic acid F-127 | Millipore | 540025 | |
| Pottasium chloride | Bio-Lab | 163823 | Concentration in Ringer solution: 5.4 mM |
| Pyrithione | Sigma Aldrich | H3261 | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM |
| Silicone Grease Kit | Warner Instruments | W4 64-0378 | |
| Sodium chloride | Bio-Lab | 190305 | Concentration in Ringer solution: 120 mM |
| Zinc sulfate | Concentration in Ringer zinc solution: 7 μM | ||
| Sigma Aldrich | 31665 |
References
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