Summary
玉米叶原基被深深包裹和卷起，使其难以研究。在这里，我们提出了制备玉米叶原基的横向切片和展开的整个安装以进行荧光和共聚焦成像的方法。
Abstract
在玉米（Zea mays）和其他草（禾本科）中，叶原基深深地包裹在叶旋内并滚动，因此难以研究早期叶片发育。在这里，我们描述了制备用于荧光和共聚焦成像的玉米叶原基的横向切片和展开的整个安装的方法。第一种方法使用剥线钳去除老叶的上部，露出叶原基的尖端并允许其测量以进行更准确的横向截面采样。第二种方法使用透明的双面纳米胶带展开并安装全叶原基进行成像。我们展示了这两种方法在玉米中可视化和分析荧光蛋白报告基因方面的效用。这些方法为玉米叶原基独特形态带来的挑战提供了解决方案，并将有助于可视化和量化玉米和其他草种的叶片解剖学和发育性状。
Introduction
草作物是全球人口的主要食物和生物燃料来源1，改善叶片解剖结构有可能提高其生产力2,3。然而，我们目前对草叶解剖结构如何调节的理解是有限的4，需要对叶原基进行分析，因为叶的许多解剖学和生理学特征是在发育早期预先确定的5,6,7。细胞成像技术，如荧光和共聚焦成像，对于研究草叶解剖结构和细胞性状是必不可少的，但这些技术很难应用于草叶原基，因为它们深深地包裹在叶涡内并滚动。我们通过开发用于玉米叶片原初荧光和共聚焦分析的横向切片和展开的全叶支架的制备方法解决了这个问题，这是一种研究草叶解剖学和发育的模型系统2,8。
玉米叶和所有草叶一样，由带状叶片组成，带鞘缠绕茎和发育芽9,10,11,12,13。叶子从芽顶端分生组织（SAM）以分散模式发育，其中每片新叶子在与前一片叶子相反的位置开始，导致沿垂直轴形成两排叶子（图1A）14。每个叶原基的发育阶段由其相对于SAM的位置确定，最近的原基指定为质体1（P1），随后的原基指定为P2，P3等（图1B，C）2。在发育过程中（图1D），叶原基首先表现为围绕SAM（P1）基部的新月形支撑，然后长成延伸到分生组织（P2）的罩状原基9,10,11。然后，随着尖端向上生长，罩的基缘横向扩展并相互重叠，形成锥形原基（P3-P5）10。然后原基迅速变长，基部的鞘叶边界随着叶子的近轴侧的边缘状突起的形成而变得更加突出（P6/P7）。最后，叶子在稳态生长过程中从漩涡中出来时展开，其中分裂细胞被限制在叶片的小基部区域内，形成沿近端-远端轴（P7 / P8）扩展和分化细胞的梯度15。玉米幼苗的枝顶端包含多个处于不同发育阶段的原基，是研究叶片发育的优良模型8。
对早期叶片发育的准确分析需要分期或使用标准化标准来定义与其他生长或形态参数相关的原始发育的不同阶段。由于叶原基隐藏在草芽中，研究人员通常使用植物的年龄或新生叶子的大小等参数作为叶原基9,16阶段和大小的预测指标。在玉米中，植物的实际年龄由种植或发芽后的天数（DAP/DAG）决定17,18。营养阶段（V期）由最上部的叶子确定，叶子有一个可见的衣领，叶片和鞘之间的远轴侧有一条苍白的线，对应于叶片和耳廓的位置，叶片底部的一对楔形区域（图1A，B）17,19。在20到25 DAG之间，SAM过渡到花序分生组织并停止产生新叶20。玉米叶原的生长速度可以根据环境和植物的基因型而变化。因此，植物年龄和新叶的大小无法准确预测叶子原初的大小;但是，使用这些参数可以帮助预测原始阶段的范围和大小，以便进行实验。
横截面分析是检查玉米和其他草的叶片解剖结构和发育的常用方法，因为它允许在枝条21,22,23的单个截面中对多个质体进行采样。该方法也便于新鲜样品的细胞成像，因为周围的叶子充当支架，在切片和安装期间将叶原基保持在原基的位置24。然而，这种方法的缺点是，当从完整的枝条上切片时，精确定位目标质体和原基内的区域可能具有挑战性。此外，由于叶片生长在塑体上和沿近端-远端轴2,5而变化，因此不精确的采样可能导致对给定部分中原基的发育阶段和区域的错误解释。因此，开发一种精确的横截面采样方法对于确保草叶原初解剖学和发育分析的准确性和可重复性至关重要。
全叶安装分析能够对全器官规模发生的组织和细胞过程进行全面和综合的研究，例如增殖生长25 和静脉模式化 26、27、28。该方法提供了叶子的副皮概述，允许发现不同的过程和模式，否则使用横截面分析很难检测到24,27。与拟南芥不同，拟南芥已经建立了对全叶坐骑进行成像的方法29,30，目前没有标准方法对草丛中展开的全叶坐骑进行成像。先前用于展开分离玉米叶原基的方案涉及不常见的材料，不适合细胞成像31。先进的成像技术，如计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI），可以在不分离和展开原始11,32,33的情况下获取3D解剖信息，但它们价格昂贵且需要专用设备。开发一种技术来克服玉米和其他草中叶原基的卷曲和圆锥形形态所施加的限制，将推进对其解剖学和发育性状的研究。
在这里，我们提出了制备玉米叶原基的横向切片和展开的整个安装以进行荧光和共聚焦成像的方法。我们使用这些方法量化静脉数量，并用荧光蛋白（FPs）绘制玉米叶原基中的时空激素分布图24。第一种方法涉及用剥线钳从玉米幼苗上去除老叶的上部（图1E）。通过暴露原基的尖端（P5-P7），可以确定其长度，而无需完全去除周围的较老的叶子，从而实现轻松准确的切片。第二种方法涉及用透明的双面纳米胶带展开和安装全叶原基（P3-P7）（图1F）。这些方法适用于可视化各种FPs24，但需要优化使用荧光染料和清除试剂。此外，我们还概述了在 ImageJ/FIJI 34 中展平 z 堆栈、拼接图像和合并通道的一些过程，这些过程适用于这两种方法生成的图像。这些方法可用于玉米叶片的常规荧光或共聚焦成像，但它们也可以适用于其他模型草种，如水稻、Setaria 和 Brachypodium。
图1：玉米叶原基的组织和形态以及方法概述 。 （A）玉米幼苗示意图。玉米具有二叶叶，新叶子在与前一片叶子相反的位置开始。叶号表示叶子发芽的时间顺序（即第一叶，L1;第二叶，L2;第三叶，L3;等）。每片叶子都有一个远端叶片和一个基鞘，基鞘由与耳廓和耳廓相对应的衣领勾勒出来。最上面的叶子，衣领可见，表示营养阶段。此示例中的幼苗处于 V2 阶段，L2 项圈（箭头）可见。剪刀图标指示中胚叶（me）的位置，必须在那里切割幼苗才能收集。（B）解剖芽的示意图，显示孤立的L1至L4，叶原基L5至L9在（C）中显示为放大图像。质体数表示原基相对于SAM的位置，最年轻的叶原基（P1）最接近SAM，较老的叶原基（P2、P3、P4等）相继远离2。（D）玉米叶原基从P1到P5的形态示意图。（五）玉米叶原基横断面分析方法示意图。（1）用剥线钳修剪老叶。（2）测量原基，切片芽。（3）将切片安装在载玻片上进行成像和处理（4,5）。（F）玉米叶原基全装分析方法示意图概述。（1）去除周围的叶子，提取原基。（2）在纳米带上切割并展开原基。（3）安装样品进行成像和处理（4,5）。缩写：L = 叶子;bl = 刀片;sh = 护套;CO = 项圈;我=中胚叶;V = 植物人;P = 塑体;SAM = 枝顶端分生组织。 请点击此处查看此图的大图。
Protocol
1. 玉米叶片发育阶段及实验设计
- 种植植物和分期叶子发育
- 确定用于实验的植物的年龄和发育阶段，并对叶子发育进行详细的分期。
注意：建议在与实验中使用的突变或转基因系具有相同遗传背景的植物上进行分期。SAM停止产生20到25 DAG之间的新叶，具体取决于遗传背景和生长条件。因此，此处描述的方法非常适合7-14 DAG的玉米幼苗。 - 按照合适的植物护理方案在温室或生长室中种植玉米植物35.
- 用小刀或一把剪刀在中胚叶（土壤表面下的茎）上切割，收集所需年龄或V期的植物（图1A）。小心地将切割工具插入幼苗旁边的土壤中，然后将其以 45° 角向下滑动到基部以切割中胚叶。
- 将幼苗从土壤中取出，并除尘可能附着在植物上的任何残留污垢或土壤颗粒。用手取下胚鞘，即覆盖幼苗新芽的保护鞘。
- 对于每株植物，记录V阶段，叶子的数量以及从螺旋中出现的最后一片叶子的长度。拍摄植物的照片以备将来参考。
- 逐个去除较旧的叶子。为此，用中胚叶或茎的残余物握住植物，并从鞘的底部切除每片叶子，并用牙科探针以盘旋的方式轻轻展开鞘（图1B）。
注意：有关去除周围叶子的快速方法，请参阅步骤 2.1。 - 在放大倍率约为2倍的体视显微镜下，在湿巾上仔细解剖其余的芽尖，以防止样品变干。用弯曲的针或一对细镊子用牙科探针轻轻切除并展开每个叶原基，直到可以看到SAM，P1和P2（图1D）。记录每个质体的外观和尺寸。
注：参见 补充文件1中玉米幼苗叶片发育分期的示例。
- 确定用于实验的植物的年龄和发育阶段，并对叶子发育进行详细的分期。
- 规划实验
注意：仔细规划实验可以提高效率。例如，在横截面分析中，在对特定质体或区域成像时确定要切割的大致位置可以减少解剖时间。 图 2 显示了标准化采样的示例。此外，根据FP或荧光探针的特性优化成像参数可以提高实验效率。- 利用分期信息作为指导，将实验集中在特定的质体、原基区域和组织上。使用FP或其他感兴趣的荧光探针对一些样品进行以下第2和/或3节的跟踪。
注：见 https://www.maizegdb.org/data_center/stock 处可用的玉米FP标记线36-42种子库存。 - 确定每个FP报告器或探头的最佳图像采集参数，包括适当的检测器或滤光片、激发和发射波长、针孔尺寸和其他设置。保存设置以重现每个实验的工作条件。
注意：参见Linh和Scarpella30 ，了解发育中的叶子共聚焦激光扫描显微镜的一些技术指南。 - 根据FP报告器的半衰期和其他特性规划成像时间43。
注意：在计划实验时，还必须考虑解剖和成像之间的时间，因为在此期间新鲜的植物样品会经历干燥和细胞变化。
- 利用分期信息作为指导，将实验集中在特定的质体、原基区域和组织上。使用FP或其他感兴趣的荧光探针对一些样品进行以下第2和/或3节的跟踪。
图2：玉米叶原初横截面分析的采样方案。 （A，左）7 DAG玉米幼苗的近端芽，在P7处显示暴露的第四叶（L4）。虚线表示沿原基的七个采样点，从0.5毫米到10毫米。 （A，右）叶原基的示意图，以及每个质体的投影大小和位置：P7（白色）;P6（洋红色）;P5（蓝色）;P4（绿色）;和 P3 直到 SAM（黄色）。（波黑）横向切片的荧光图像，表示A中显示的采样点，从10毫米（B）到0.5毫米（高）。原基根据（A）中的质体配色方案进行假着色。使用长波通发射紫外滤光片对切片进行成像，以进行自发荧光。比例尺 = 200 μm （B-H）。该图经Robil和McSteen24许可修改和复制。缩写：DAG = 发芽后几天;P = 塑体;SAM = 枝顶端分生组织;† = 叶鞘或前鞘;* = 枝顶端分生组织;** = 茎。请点击此处查看此图的大图。
2. 玉米叶原基横断面成像
- 剥去周围较老的叶子并测量叶原基
- 如步骤1.1.3-1.1.4（图1A）所述，用小刀或一把剪刀在土壤表面下方的中胚叶处小心地切割幼苗，以收集幼苗。
- 确定要使用的正确剥线钳孔尺寸以及沿拍摄进行切割的位置。确保孔足够大以适合目标原基。
- 从芽的较远端开始切割，并逐渐向基部工作，直到原基的尖端暴露出来。
- 要进行切割，请握住剥线钳，钳口朝向拍摄。将芽定位到选定的孔上，然后将剥离器手柄挤压在一起以切开叶涡。
注意： 为避免意外切割目标原基，请小心地将芽的中心与剥线钳上的孔对齐。对于较大的植物，建议在使用剥离器之前手动去除周围的一些叶子。
注意：剥线钳有锋利的钳口，如果不小心使用，可能会导致割伤或其他伤害。 - 在继续将手柄挤压在一起的同时，将剥离器从芽上滑开以修剪叶子的上部。确保原基中的目标区域仍然被周围的叶子包裹（补充图S1C，D）。
注意：修剪上部叶子后，芽留下一个暴露的原基尖端（P5、P6 或 P7，具体取决于切割的位置和所用剥线钳孔的大小; 图 1E）。该原基将作为估计年轻原代大小和阶段的参考。P6因其大小范围和针状形态而成为玉米幼苗中最实用的参考。 - 用尺子测量从原基尖端到芽基的长度。记录测量结果。
注意：原基的长度会略微高估，因为原基底部有几毫米的茎（图2A）。
- 叶原基的徒手切片和成像
- 在约0.8倍放大倍率的体视显微镜下，将拍摄牢固地放在光滑的表面上，例如玻璃砧板或其他防刮擦材料。使用剃须刀片或手术刀在原基长度的所需点切割短片（0.25-0.8毫米）。
- 在目标区域上方进行初始切割以丢弃芽的远端部分，然后在目标区域周围获得薄切片。要进行干净的切割，请垂直于芽的刀片，然后以平滑、均匀的动作向内滑动。
注意：对于较大的原基（P6或P7），可能有几毫米的切片余地。然而，对于较小的原基（P5及更早），1毫米可以在采样中产生显着差异，因为这些原基在芽基部的前几毫米内堆叠起来（见图2A，F-H）。建议使用双刃剃须刀片进行更精细的切片。
注意：使用剃须刀片和手术刀时要小心，以避免任何意外割伤或受伤。 - 定期更换剃须刀片，因为叶鞘很容易使刀片变钝。每轮切片后，用湿巾覆盖芽，以防止样品变干。
- 将叶子部分安装在干净的载玻片（75 mm x 25 mm）上，使用移液管将一滴水（或50%甘油）直接涂在切片上，然后将盖玻片（22 mm x 22 mm）放在顶部。
- 如果使用荧光染料，请将染料溶液涂在切片上，将盖玻片放在顶部，然后根据需要孵育。
注意：根据染料的类型，在继续下一步之前，可能需要额外的步骤来处理叶子部分。这些参考文献44,45,46,47提供了荧光染料在植物细胞成像中的一般细节和用途。细胞核染色荧光染料5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）已有效地用于玉米叶原基的横截面48。相比之下，质膜染色染料，如Fei Mao 4-64（FM 4-64）和碘化丙啶，不能产生令人满意的结果（图3A-D）。 - 将载玻片放在落射荧光或共聚焦激光扫描显微镜的载物台上，并根据需要调整焦点和设置以可视化荧光团30。有关用于选定玉米FP报告系的照明和图像采集设置，请参见 表1 。
注意：厚切片可能会产生高水平的背景自发荧光。考虑一些有助于缓解此问题的成像和标本制备策略30,49（见表2）。
注意：使用强光源和激光时要小心并佩戴防护眼镜，以降低眼睛受伤的风险。 - 以不同的放大倍率和检测通道（包括明场照明）通过叶片切片成像30。使用 4 倍放大倍率对整个横截面进行成像，使用 20 倍或 40 倍 放大倍率对特定组织进行成像。 减少落射荧光成像在较高放大倍率下的曝光时间，以保护样品免受快速光漂白（见 表1）。
- 捕获整个部分或特定感兴趣区域 （ROI） 的图像。如有必要，获取z-stack，它是在不同焦深30处捕获的一系列图像。
- 要获取z堆栈，首先确定样品中的上部和下部位置，然后确定必须在这些位置之间捕获的光学切片数量。光学部分越少，z 步长越大，即每个部分之间的距离。根据 FP 的特性和所使用的放大倍率，捕获 3 到 25 个 z 步长尺寸 在 1 到 12 μm 之间的光学切片，用于对玉米叶原基的横向切片进行成像。
注意：要展平z堆栈，请使用适当的体积渲染技术50 ，该技术可以通过显微镜软件或使用ImageJ / FIJI34 来完成（参见步骤4.1和4.2）。 - 保存所有图像文件及其关联的元数据（如果可用）。
表1：用于选定玉米FP报告基因的荧光和共聚焦成像的照明和图像采集设置。 缩写：FP = 荧光蛋白;TRITC = 四甲基罗丹明;FITC = 异硫氰酸荧光素;WLL = 白光激光;氩离子=氩离子激光器;HyD = 混合探测器;AU = 通风单位;Hz = 赫兹，每秒扫描线数。 请按此下载此表格。
3. 玉米叶原基全坐骑成像
- 解剖原基并用纳米胶带制备载玻片
- 如步骤1.1.3-1.1.4（图1A）所述，用小刀或一把剪刀在土壤表面下方的中胚叶处小心地切割幼苗，从而收集幼苗。
- 在解剖植物之前，用透明的双面纳米胶带（补充图S1H）准备载玻片（75 mm x 25 mm）。剪一块矩形纳米胶带并将其粘在干净的载玻片的中心。请勿取下胶带顶部的保护性塑料膜。
注意：根据要成像的样品的大小确定要使用的磁带的大小（请参阅 补充图S1I，J中的超大样品示例）。纳米胶带有丙烯酸或聚氨酯凝胶材料可供选择。这两种类型对荧光和共聚焦成像都有效24。为防止胶带变色，请将其存放在黑暗的容器中，防止胶带长时间暴露在光线下。 - 通过用剥线钳去除老叶的上部来开始解剖芽，如步骤 2.1 中所述。
- 用中胚叶握住枝条，用牙探针小心地去除周围的叶子以提取原木。为此，从芽的底部取出叶子并一次展开一个，直到感兴趣的原基暴露出来。
- 或者，使用剥线钳通过在芽的基部区域进行切割来直接提取叶原基（补充图S1E-G）。
注意：此方法具有更高的折断原基的风险。
- 安装和成像原基。
- 从胶带上取下保护膜。将暴露的原基放在胶带上。使用剃须刀片切割基部的原基，丢弃基茎和下胚轴（图1F）。
- 使用带有弯曲针的牙科探针展开原基（尖端直径为0.25-0.6毫米）。使用微探针（尖端直径为0.15-0.2毫米）小于3毫米（P3至早期P4）的原基。
- 将针尖平行于表面放置并展开外基缘，轻轻将其按压在胶带上。
- 为了更顺利地展开，通过将针尖浸入 100% 甘油中来润滑叶子的内表面（近轴）。
- 将外边缘粘附在胶带上，将针尖平行于叶片的长轴对齐。轻轻地将针向侧面滑动以展开并将叶子压平到胶带上（图1F）。
注意：展开时折断或损坏叶子很常见，特别是在具有强壮中脉的较大原基中（见图3E-G）。用力展开叶子会在成像过程中擦伤其表面并产生伪影（图 3H）。有关这些问题的建议解决方案，请参阅表 2 和讨论。 - 在展开的原木上滴一滴水。立即将盖玻片放在水滴和原基物的顶部。轻轻按下盖玻片的边缘，使其粘附在胶带上。
注意：建议使用大的矩形盖玻片（50 mm x 24 mm或60 mm x 24 mm），并带有额外的区域以粘附在胶带上。尽量减少气泡的形成，气泡会扭曲叶片并导致光折射不均匀（见图3I-K）。确保盖玻片完全粘附在胶带上，因为安装的原基的边缘可能会在松散粘附的盖玻片下回滚（见图3L）。 - 将载玻片放在落射荧光（参见 补充图S1K）或共聚焦激光扫描显微镜的载物台上，并根据需要调整焦点和设置以可视化荧光团30。有关用于所选玉米FP报告株系的照明和图像采集设置，请参见 表1 。
- 通过各种检测通道对整个叶子或特定ROI进行成像30。要对整个叶片进行成像，请手动捕获叶片的马赛克图像，或使用显微镜在低放大倍率（4x或10x）下的平铺操作。
注意：即使在最低放大倍率下，玉米叶原基也可能太大而无法用落射荧光或共聚焦激光扫描显微镜成像，导致成像时间更长，可能导致光漂白（见 图3M）或背景自发荧光增加。因此，建议使用荧光体视显微镜对大于5毫米的全叶样品进行成像。 - 对于共聚焦成像，需要获得包含叶片厚度的z堆栈（参见步骤2.2.9）。
- 保存所有图像文件及其关联的元数据（如果可用）。
表 2：对玉米叶原基的横向切片和整个支架进行成像的常见问题故障排除。请按此下载此表格。
图3：玉米叶原基的次优横截面和全安装制备。 （A-D）具有质膜标记PIP2-1-CFP（A）和质膜结合荧光染料FM 4-64（B）的叶原基横向切片的代表性共聚焦图像，以及相应的明场图像（C，D）。与PIP2-1-CFP相比，FM 4-64显示细胞轮廓的次优可视化。（E-M）整个叶原基的代表性荧光图像显示存在撕裂（E-G），瘀伤表面†（H），气泡*（I-K），回滚边缘（L）和光漂白区域‡（M）。叶原基表达DII-Venus（E-G），GAR2-YFP（H-J），mDII-Venus（K），PIN1a-YFP（L）和DR5-RFP（M）。比例尺 = 200 μm （A-D）;500微米（E-M）。图3A经Robil和McSteen24许可修改和复制，而图5B-M是作者未发表的数据。缩写：P = 塑体;YFP = 黄色荧光蛋白;RFP = 红色荧光蛋白;CFP = 青色荧光蛋白;PIP2-1-CFP = p Zm PIP2-1：：ZmPIP2-1：CFP;DII-Venus = pZmUbi：DII：YFP-NLS;GAR2-YFP = p Zm GAR2：：ZmGAR2：YFP;mDII-Venus = pZmUbi：mDII：YFP-NLS;PIN1a-YFP = p Zm PIN1a：：ZmPIN1a：YFP;DR5-RFP = DR5rev：：mRFPer;BF = 明场。请点击此处查看此图的大图。
4. 使用图像J/斐济处理图像
- 使用最大强度投影 （MIP） 展平 z 堆栈
- 启动 ImageJ/FIJI 并打开图像堆栈，或通过选择 图像 |堆栈 | 从菜单中堆叠图像。
- 选择映像堆栈。从菜单中，选择“图像 |堆栈 |Z项目....在 Z 投影对话框中，从投影类型下拉菜单中选择最大强度。单击确定创建最大强度 z 投影。
注意：展平图像是 z 堆栈50 上强度最高的像素的 2D 投影。该方法适用于可视化荧光基团，但不适用于厚横截面和全叶支架的明场图像中的解剖特征。 - 通过选择 “文件”|“ 将图像另存为 TIFF（标记图像文件格式）另存为 |蒂夫。输入文件的名称，然后单击 保存。
注意：建议使用TIFF存储荧光和共聚焦图像，因为它在保存图像时保留质量和细节。
- 使用扩展景深 （EDF） 插件展平 z 轴堆栈51
- 安装 EDF 插件52。从 http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ 下载 Extended_Depth_Field.jar 文件（版本 17.05.2021），并将其放在 ImageJ/FIJI 的“插件”文件夹中。
- 启动 ImageJ/FIJI 并打开图像堆栈，或通过选择 图像 |堆栈 | 从菜单中堆叠图像。
- 选择映像堆栈。从菜单中，选择 插件 |扩展景深 |法国电力公司简易模式。在“ 扩展景深 ”对话框中，使用“速度 /质量” 下的滑块设置所需的质量和处理速度，并使用 “高度贴图”reg 设置地形的平滑度级别。单击 “运行 ”以创建重建的映像。
注意：EDF通过投影最佳焦点将堆栈组合成清晰的复合2D图像51。该技术可用于克服有限的焦深，适用于重建厚横截面或全叶安装的明场图像。应用此滤光片可视化荧光团时要小心，因为与MIP不同，EDF会调整图像的对比度，从而影响像素强度。 - 通过选择“ 文件”|”另存为 |蒂夫。输入文件的名称，然后单击 保存。
- 使用网格/集合拼接插件将图像拼接在一起53
- 将要拼接在一起的图像或图像堆栈的集合保存在单个目录中。
- 启动 ImageJ/FIJI 并选择插件 |拼接 |菜单中的网格/集合拼接。在“网格/集合拼接”对话框中，从“类型”下拉菜单中选择“未知位置”，然后从“顺序”中选择“目录中的所有文件”。单击“确定”。
- 在“网格拼接： 未知位置，目录中的所有文件”对话框中，通过在“目录”文本字段中键入或粘贴目录路径或单击“浏览...”来查找目录来指定图像的位置。单击“确定”开始拼接过程。
注意：网格/集合拼接插件中的未知位置选项通过分析一组连续图像的重叠区域从一组连续图像重建合成图像。因此，此选项对于拼接未使用切片扫描操作获得的横向截面或全叶安装的图像的马赛克非常有用。 - 拼接完成后，将出现一个新窗口，其中包含拼接后的图像。通过选择“ 文件”|”另存为 |蒂夫。输入文件的名称，然后单击 保存。
注意：也可以使用显微镜软件中的图像重建命令或通过ImageJ/FIJI中的 生物格式导入选项 拼接2D和3D图像的大型蒙太奇。
- 使用“合并通道”命令组合多个通道
- 启动 ImageJ/FIJI 并打开要合并的图像或图像堆栈。
注意：可以先使用步骤 4.1 或 4.2 拼合映像堆栈。MIP通常推荐用于扁平化荧光基团通道，而EDF更适合于平坦的明场通道或其他具有不同焦深的通道。 - 使用图像调整图像的亮度和对比度 |调整 |亮度/对比度。使用滑块或输入字段调整参数，然后单击应用。或者，通过选择“处理”|”增强对比度....设置饱和像素的百分比，选择归一化，然后单击确定。
注意：在量化或比较图像之间的荧光基团信号强度时，通常最好不要调整亮度或对比度，因为这会改变图像中的相对像素强度，从而影响测量和比较。 - 要区分通道，请使用查找表 （LUT） 将伪彩色应用于特定图像。为此，请选择图像，然后从 ImageJ/FIJI 菜单中选择 图像，单击查找 表，然后从下拉列表中选择适当的 LUT。
- 从菜单中，选择 “图像 |颜色 |合并频道。对于每个通道（C1、 C2、 C3...），使用下拉列表选择要分配给该通道的图像。单击“ 确定” 合并通道。
- 通过选择“ 文件”|”另存为 |蒂夫。输入文件的名称，然后单击 保存。
- 启动 ImageJ/FIJI 并打开要合并的图像或图像堆栈。
Representative Results
玉米叶原基横断面分析
我们使用协议第 2 节来量化静脉数量，并使用 FPs 表征玉米叶原基横向切片中的激素反应模式（图 4）24。为了评估植物激素生长素在叶片生长和叶脉形成中的作用，我们量化了生长素缺乏型玉米突变体消失流苏的叶原叶脉数2 54。在早期塑体中，发育中的脉在玉米叶原基21,22的中间细胞层中表现出明显的细胞化。然而，使用传统的组织学技术22识别和计数静脉可能是劳动密集型和耗时的。因此，为了量化静脉，我们利用玉米生长素外排蛋白标记物p Zm PIN1a：：ZmPIN1a：YFP41（以下简称PIN1a-YFP），它标记发育中的静脉和丙氨酸链（PCS;图 4A）。使用协议部分2，我们能够通过在切片前测量原基来标准化横向切片采样（图4B，C）。我们发现vt2比正常具有更宽的原基和更多的脉络的趋势（图4D，E）24，这与完全展开的叶子55的数据一致，表明vt2的缺陷始于叶片发育的早期。使用协议第2部分，我们还能够系统地检查叶原基中激素反应FP报告基因的表达模式（参见图4F-I中的图像示例）。通过标准化的横截面采样方案，我们绘制了生长素、细胞分裂素（CK）和赤霉酸（GA）响应在不同质体和叶原基区域中的分布，并发现了我们假设对叶片生长和叶脉形成有影响的新响应模式24。因此，这些具有代表性的结果证明了协议第2节在玉米叶原初横截面分析中的实用性。
图4：玉米叶原基横截面分析的代表性结果。 （A-E）用生长素外排蛋白标记PIN1a-YFP量化正常和消失流苏2叶片原基中的脉数和原基宽度。（A）在发育中的静脉和丙链中表达PIN1a-YFP的P5至P7横截面的代表性荧光图像。使用FITC滤光片（495-519nm激发）用落射荧光显微镜对横截面进行成像。静脉数量和原基宽度分别使用FIJI/ImageJ中的多点和手绘线工具进行量化。（B）用剥线钳去除上部叶涡的玉米幼苗，露出第四片叶子（L4）的尖端。括号跨越投影的原基长度，虚线表示中间长度。（C）从P5到P7的不同原基形状的示意图，说明了中长处的脉数和原基宽度（水平虚线）如何根据原基的发育阶段而变化。（D，E）测量正常和vt2的L4中长部分的原基宽度（D）和静脉数（E）。趋势线表示测量值的 10 mm 滚动平均值±平均值的标准误差 （SEM）。（F-I）表达PIN1a-YFP，生长素反应报告基因，DR5-RFP，细胞分裂素反应报告基因，TCS-番茄，赤霉酸响应标记物GAR2-YFP和mDII-Venus（生长素信号输入报告基因DII-Venus的突变版本）组合的叶原基横截面的代表性共聚焦图像。FP通道叠加在每个图像中的明场通道上。比例尺 = 200 μm （A）;10毫米（B）;100微米（F-I）。该图经Robil和McSteen24许可修改和复制。缩写：DAG = 发芽后几天;P = 塑体;VT2 = 消失的流苏2;PCS = 丙链;YFP = 黄色荧光蛋白;FITC = 异硫氰酸荧光素;RFP = 红色荧光蛋白;PIN1a-YFP = p Zm PIN1a：：ZmPIN1a：YFP;DR5-RFP = DR5rev：：mRFPer;TCS-Tomato = TCSv2：：NLS-tdTomato;GAR2-YFP = p Zm GAR2：：ZmGAR2：YFP;mDII-Venus = pZmUbi：mDII：YFP-NLS.请点击此处查看此图的大图。
玉米叶原基的全安装分析
我们按照协议第3节可视化和分析玉米叶原基全叶坐骑中的FP表达（图5）。通过使用PIN1a-YFP可视化静脉模式，我们发现在早期质体中，静脉的形成发生在整个原基中，但这一过程在发育后期的近端区域受到限制（图5A）24。作为横截面分析的补充，全叶安装分析揭示了静脉形成过程中激素反应的组织和阶段特异性模式24。一个例子是CK响应报告基因TCSv2：：NLS-tdTomato37（TCS-Tomato）相对于PIN1a-YFP表达的表达模式（图5B）24。通过遵循协议第3节，我们能够对叶原基中的FP表达进行定性和定量分析（图5D-F;未发表的数据）。我们检查了生长素反应报告基因DR5rev：：mRFPer41（DR5-RFP）和GA响应标记物p Zm GAR2：：ZmGAR2：YFP 39（GAR2-YFP）在vt2和矮植物3（d3）的单双突变体（GAR2-YFP）的全叶安装中的表达模式，矮植物3（d3）是GA缺陷突变体56（图5D）。我们还使用p Zm Cyclin-D2B：：ZmCyclin-D2B：YFP42（Cyclin-D2B-YFP）比较了正常和vt2叶原基之间的细胞增殖相对水平，这是细胞周期57中G1 / S转变的标志物（图5E，F）。虽然正常和vt2之间没有显着差异，但Cyclin-D2B-YFP表达与早期质体31的已知细胞增殖曲线一致。我们得出结论，协议第3节是分析玉米叶原基整体坐骑的有效方法，由于其滚动形态而难以成像。
图5：玉米叶原基全安装分析的代表性结果。 （A） 7 个 DAG 玉米幼苗的叶原基的代表性荧光图像，显示发育中的脉络和丙层链，由生长素外排蛋白标记物 PIN1a-YFP 标记。P3-P6原基从基部切除，展开，平整，轴面朝上。插图显示了 P3 和 P4 的特写镜头。在P5和P6中，虚线划定了增殖区的远端，大多数前部链仍在发育和延伸。（乙，丙）代表性共聚焦图像显示PIN1a-YFP和细胞分裂素反应报告基因TCS-Tomato在P5原基近端边缘区域的表达。（D）P4原基的代表性荧光图像，显示生长素反应报告基因DR5-RFP和赤霉酸反应标志物GAR2-YFP在消失的流苏2和矮植株3的正常和单双突变体中的表达。（E）P3和/或P4的代表性共聚焦图像，显示细胞周期蛋白-D2B-YFP的表达，细胞周期中G1 / S跃迁的报告基因。（F） 正常和 vt2 的 P3/P4 叶原基中细胞增殖的相对量，通过使用 ImageJ/FIJI 测量原基面积上细胞周期蛋白-D2B-YFP 信号的积分密度来量化。条形表示平均值测量值±平均值的标准误差。比例尺 = 500 μm （A、D、E）;200微米（B）;100微米（C）。图4A-C经Robil和McSteen24许可修改和复制，而图4D-F是作者未发表的数据。缩写：DAG = 发芽后几天;P = 塑体;VT2 = 消失的流苏2; d3 = 矮植物3; YFP = 黄色荧光蛋白;RFP = 红色荧光蛋白;PIN1a-YFP = p Zm PIN1a：：ZmPIN1a：YFP;TCS-Tomato = TCSv2：：NLS-tdTomato;DR5-RFP = DR5rev：：mRFPer;GAR2-YFP = p Zm GAR2：：ZmGAR2：YFP;Cyclin-D2B-YFP = p Zm Cyclin-D2B：：ZmCyclin-D2B：YFP;ns = 无显著差异;au = 任意单位。请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：玉米幼苗叶片发育分期实例。请点击此处下载此文件。
补充图S1：协议中使用的植物样品和材料。 （一，二）玉米幼苗7-8 DAG，使用剥线钳去除上部叶涡。（B） 插图显示了使用曝光的 P6 原基拍摄的特写。（C-G）去除上部螺旋进行横截面分析（C，D）和完全去除周围叶子以进行整体安装分析（E-G）的玉米幼苗芽。（H）一卷聚氨酯凝胶透明双面纳米胶带。（一，一）P6叶原基（I）和P8叶（J）的近端区域展开并用纳米胶带安装在载玻片上。（K）安装在落射荧光显微镜载物台上的带有展开的叶原基的载玻片。缩写：DAG = 发芽后的几天。请点击此处下载此文件。
Discussion
我们提出了两种制备玉米叶原基用于细胞成像的方法。第一种方法（协议部分 2）允许测量原基进行横向截面分析，而第二种方法（协议第 3 部分）允许展开和展平原基以进行整体安装分析。这些方法有助于玉米叶原基24中FPs的细胞成像（如图4和图5所示），并为玉米叶片成像的挑战提供了简单的解决方案。协议第 2 节通过在切片前测量原基而不是仅依靠分期参数 9,16 来减少解剖时间并提高采样精度。通过市售纳米胶带，方案第3部分解决了玉米全叶原基成像的长期问题。该协议改进了先前使用透析管31的方法，并且是CT和MRI11,32,33的更便宜的替代方案。然而，当涉及到可视化叶片解剖特征并产生最佳结果时，两种方案都有一些局限性，表2中概述了这些局限性，下面将更详细地讨论。
在方案第2部分中，我们在叶原基的厚横向切片中难以可视化细胞轮廓，并且用细胞壁或质膜结合荧光染料复染未提供令人满意的结果。例如，与质膜FP标志物p Zm PIP2-1：：ZmPIP2-1：CFP39（PIP2-1-CFP;图3A-D）。为了克服这一限制，我们建议使用振动切片机产生更薄的组织切片（~0.1 mm）58，这将允许对细胞轮廓进行生动的明场成像或优化复染方案47,59。
在协议部分3中，主要限制是难以在不撕裂，损坏或气泡的情况下安装叶片，如协议步骤3.2.5-3.2.6（图3E-K）中所述。由于玉米叶片是双边对称的，因此半叶安装而不是全叶安装可能足以进行可视化9。为此，可以在将原基展开到中脉后，用剃须刀片沿纵轴切割原基，只允许安装叶子的一半。协议第3节的另一个限制是叶片的厚度会限制深度成像过程中荧光团信号的光学分辨率。为了解决这个问题，可以采用组织清除技术60。然而，我们发现ClearSee61是一种用于植物组织成像的常用清除试剂，与该方案不兼容，因为它会导致样品和盖玻片从纳米胶带上分离。这个问题的一个潜在解决方案可能是在叶片样品上施加半透膜31，允许它用透明溶液处理，同时被纳米胶带固定到位。这种允许将液体溶液应用于展开的叶子的方法也可用于全安装RNA原位杂交和免疫定位技术，这些技术以前已针对玉米花序发育进行了优化，但不适用于全叶原基62,63。
我们描述了玉米的方案，即使在幼苗阶段，玉米也有大的叶原。其他具有更小叶原基的草种，如水稻、大麦、小麦、Setaria 和 Brachypodium16、23、64、65,66，可能需要使用额外的精密工具来有效地应用这些协议。此外，这些协议不适用于活细胞成像，活细胞成像捕获组织形成和细胞反应的实时动态过程。然而，随着荧光探针，成像技术和计算能力在植物67活细胞成像方面的不断进步，未来的研究可以建立在这些协议的基础上，开发适合草叶原初生物独特特征的活细胞成像策略。
Disclosures
作者没有任何利益冲突需要披露。
Acknowledgments
作者要感谢玉米遗传学合作组织，玉米细胞基因组学项目，Dave Jackson（纽约冷泉港实验室），Anne W. Sylvester（伊利诺伊州芝加哥大学海洋生物实验室），Andrea Gallavoti（罗格斯大学，新泽西州）和Carolyn G. Rasmussen（加州大学河滨分校）提供突变和转基因种群，以及大学先进光学显微镜核心的Robert F. Baker和Alexander Jurkevich。密苏里-哥伦比亚在共聚焦显微镜方面的协助。JMR得到了J. William Fulbright奖学金，Diane P.和Robert E. Sharp基金以及国家科学基金会的植物基因组研究计划（IOS-1546873）的支持。CDTC，EDCDP和RJRR由DOST-SEI S&T本科奖学金支持。DODL由Thomas Steinbugler SJ学术奖学金支持。RJRR 由国际教育——高等教育途径奖学金支持。这项工作得到了马尼拉雅典耀大学科学与工程学院和黎刹图书馆的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick | EZlifego Store (Amazon) | B07YB1ZXG6 | 1 roll |
| Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in | Bausch & Lomb | N1692 9 | 1 pc |
| Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in | Storz Opthalmic Instruments | E0542 | 1 pc |
| Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in) | Ted Pella | 13553 | 1 pc |
| DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper | Dowell Store (Amazon) | 10-22 AWG | 1 pc |
| Feather Double Edge Carbon Steel Blades | Ted Pella | 121-9 | pkg/10; for fine sectioning |
| Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm | Ted Pella | 260442 | pkg/144 |
| GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades | Ted Pella | 121-1 | box/200; for general cutting/sectioning |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 1 liter |
| ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin | National Institutes of Health (NIH) USA | version 2.9.0/1.54s | The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG). |
| Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm | Kimtech Science | 34155 | box/280 ply |
| Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick | Ted Pella | 260140 | 1 ounce |
| PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick | Yecaye Store (Amazon) | L354 W1.18 | 2 rolls |
| Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick | Ted Pella | 260166 | 1 ounce |
| Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick | Ted Pella | 260168 | 1 ounce |
| Tempered Glass Cutting Board | Hacaroa (Amazon) | B09XMXBT5S | 4 pc |
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