Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שיטות משופרות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות לא מגולגלות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65239
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Department of Biology, School of Science and Engineering, Ateneo de Manila University, 2Division of Biological Sciences, Interdisciplinary Plant Group, and Missouri Maize Center, University of Missouri

Summary

פרימורדיה של עלי תירס עטופה ומגולגלת עמוק, מה שמקשה על מחקרם. כאן, אנו מציגים שיטות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית.

Abstract

בתירס (Zea mays) ובעשבים אחרים (Poaceae), פרימורדיה העלים סגורה עמוק ומגולגלת בתוך זונת העלים, מה שמקשה על חקר התפתחות העלים המוקדמת. במאמר זה אנו מתארים שיטות להכנת חתכים רוחביים ופרושים שלמים של פרימורדיה של עלי תירס לצורך הדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית. השיטה הראשונה משתמשת בחשפנית תיל כדי להסיר את החלקים העליונים של עלים ישנים, לחשוף את קצה פרימורדיום העלה ולאפשר את מדידתו לדגימת חתך רוחבי מדויקת יותר. השיטה השנייה משתמשת בננו-טייפ דו-צדדי שקוף כדי לפתוח ולהרכיב פרימורדיה של עלה שלם לצורך הדמיה. אנו מראים את התועלת של שתי השיטות בהדמיה וניתוח של כתבי חלבון פלואורסצנטי בתירס. שיטות אלה מספקות פתרון לאתגרים שמציבה המורפולוגיה הייחודית של פרימורדיה של עלי תירס ויהיו שימושיות להדמיה וכימות של תכונות אנטומיות והתפתחותיות של עלים בתירס ובמיני עשב אחרים.

Introduction

גידולי דשא הם מקור עיקרי של מזון ודלק ביולוגי לאוכלוסיית העולם1, ולשיפור האנטומיה של העלים יש פוטנציאל להגדיל את התפוקה שלהם 2,3. עם זאת, ההבנה הנוכחית שלנו לגבי האופן שבו אנטומיה של עלים מווסתת בעשבים מוגבלת4 ודורשת ניתוח של פרימורדיה של עלה, שכן תכונות אנטומיות ופיזיולוגיות רבות של העלה נקבעות מראש בשלב מוקדם בהתפתחות 5,6,7. טכניקות הדמיה תאית, כגון פלואורסצנטיות ודימות קונפוקלי, הן הכרחיות לחקר אנטומיה של עלי דשא ותכונות תאיות, אך קשה ליישם טכניקות אלה על פרימורדיה של עלי דשא מכיוון שהן עטופות עמוק ומגולגלות בתוך זונת העלים. טיפלנו בבעיה זו על ידי פיתוח שיטות להכנת חתכים רוחביים ותושבות עלים שלמים לא מגולגלים לניתוח פלואורסצנטי וקונפוקלי של פרימורדיה של עלי תירס, מערכת מודל לחקר אנטומיה והתפתחות של עלי דשא 2,8.

עלה התירס, כמו כל עלי העשב, מורכב מלהב דמוי רצועה עם נדן העוטף את הגבעול ומתפתח נבט 9,10,11,12,13. העלים מתפתחים מה-shoot apical meristem (SAM) בתבנית דיסטיכוסית, שבה כל עלה חדש מתחיל במיקום הפוך מהעלה הקודם, והתוצאה היא שתי שורות של עלים לאורך הציר האנכי (איור 1A)14. השלב ההתפתחותי של כל פרימורדיום עלים מזוהה על פי מיקומו ביחס ל-SAM, כאשר הפרימורדיום הקרוב ביותר מסומן כפלסטוכרון1 (P1) והפרימורדיה הבאה אחריו מסומנת כ-P2, P3 וכן הלאה (איור 1B,C)2. במהלך ההתפתחות (איור 1D), פרימורדיום העלים מופיע תחילה כתומך בצורת חצי סהר סביב בסיס ה-SAM (P1), ולאחר מכן גדל לפרימורדיום בצורת ברדס המשתרע מעל המריסטם (P2)9,10,11. השוליים הבסיסיים של מכסה המנוע מתרחבים לרוחב וחופפים זה את זה כאשר הקצה גדל כלפי מעלה, ויוצר פרימורדיום בצורת חרוט (P3-P5)10. לאחר מכן הפרימורדיום גדל במהירות באורכו, וגבול להב הנדן בבסיסו הופך בולט יותר עם היווצרות הליגולה, ההיטל דמוי השוליים בצד האדקסיאלי של העלה (P6/P7). לבסוף, העלה מתגלגל כשהוא יוצא מהזונה במהלך צמיחה במצב יציב, שבו התאים המתחלקים מוגבלים בתוך האזור הבסיסי הקטן של הלהב, ויוצרים שיפוע עם תאים מתרחבים ומתמיינים לאורך הציר הפרוקסימלי-דיסטלי (P7/P8)15. קודקוד הנבטה של שתיל תירס מכיל מספר פרימורדיה בשלבי התפתחות שונים, מה שהופך אותו למודל מצוין לחקר התפתחות עלים8.

ניתוח מדויק של התפתחות עלים מוקדמת דורש היערכות או שימוש בקריטריונים סטנדרטיים כדי להגדיר שלבים מובחנים של התפתחות ראשונית ביחס לצמיחה אחרת או פרמטרים מורפולוגיים. מכיוון שפרימורדיה של העלים מוסתרת בתוך נבט העשב, החוקרים בדרך כלל משתמשים בפרמטרים כגון גיל הצמח או גודל העלים המתעוררים כמנבאים לשלבים ולגדלים של פרימורדיה 9,16. בתירס, הגיל הכרונולוגי של הצמח נקבע על ידי מספר הימים לאחר השתילה או הנביטה (DAP/DAG)17,18. השלב הווגטטיבי (שלב V) נקבע על ידי העלה העליון עם צווארון גלוי, קו חיוור בצד האבקסי בין הלהב לנדן המתאים למיקום הליגול והאוריקלס, זוג אזורים בצורת טריז בבסיס הלהב (איור 1A,B)17,19. בין 20 ל 25 DAG, SAM הופך meristem תפרחת ומפסיק לייצר עלים חדשים20. שיעורי הצמיחה של פרימורדיה של עלי תירס יכולים להשתנות בהתאם לסביבה ולגנוטיפ של הצמח. מסיבה זו, גיל הצמח וגודל העלים המתעוררים אינם יכולים לחזות במדויק את גודל פרימורדיה העלים; עם זאת, שימוש בפרמטרים אלה יכול לעזור לחזות את טווח השלבים והגדלים של פרימורדיה למטרות ניסוי.

ניתוח חתך רוחבי הוא שיטה פופולרית לבחינת אנטומיה והתפתחות של עלים בתירס ועשבים אחרים מכיוון שהוא מאפשר דגימה של פלסטוכרונים מרובים בחתך אחד לאורך הנבטה21,22,23. שיטה זו נוחה גם להדמיה תאית של דגימות טריות, שכן העלים שמסביב משמשים כפיגום השומר על פרימורדיה העלה במקומה במהלך חתך והרכבה24. עם זאת, החיסרון של שיטה זו הוא שזה יכול להיות מאתגר לאתר במדויק את פלסטוסטרון המטרה ואת האזור בתוך הפרימורדיום בעת חתך מתוך יורה שלם. יתר על כן, מכיוון שצמיחת העלים משתנה בין פלסטוכרונים ולאורך הציר הפרוקסימלי-דיסטלי2,5, דגימה לא מדויקת עלולה לגרום לפרשנות שגויה של השלב ההתפתחותי והאזור של הפרימורדיום בקטע נתון. לכן, פיתוח שיטה לדיגום חתך רוחבי מדויק הוא קריטי להבטחת הדיוק והשחזור של ניתוחים אנטומיים והתפתחותיים של פרימורדיה של עלי דשא.

אנליזה של תושבות עלים שלמים מאפשרת חקירה מקיפה ואינטגרטיבית של תהליכים רקמתיים ותאיים המתרחשים בקנה מידה של איברים שלמים, כגון גדילה מתפשטת25 ותבנית ורידים26,27,28. השיטה מספקת סקירה פרדרמלית של העלה, ומאפשרת גילוי של תהליכים ודפוסים מובחנים שאחרת היה קשה לזהות באמצעות ניתוח חתך רוחבי24,27. שלא כמו בארבידופסיס, שם כבר קיימות שיטות מבוססות להדמיית תושבות עלים שלמים29,30, אין כיום שיטה סטנדרטית להדמיית תושבות עלים שלמים לא מגולגלים בעשבים. פרוטוקול קודם לגילוי פרימורדיה של עלי תירס מבודדים כלל חומרים נדירים ולא התאים להדמיה תאית31. טכניקות הדמיה מתקדמות, כגון טומוגרפיה ממוחשבת (CT) והדמיית תהודה מגנטית (MRI), יכולות לרכוש מידע אנטומי תלת ממדי מבלי לבודד ולפתוח את הפרימורדיה 11,32,33, אך הן יקרות ודורשות ציוד מיוחד. פיתוח טכניקה להתגבר על האילוצים שנכפו על ידי המורפולוגיה המגולגלת והחרוטית של פרימורדיה של עלים בתירס ועשבים אחרים יקדם חקירות של התכונות האנטומיות וההתפתחותיות שלהם.

כאן, אנו מציגים שיטות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית. השתמשנו בשיטות אלה כדי לכמת את מספר הוורידים ולמפות את התפלגות ההורמונים המרחבית-טמפורלית בפרימורדיה של עלי תירס עם חלבונים פלואורסצנטיים (FPs)24. השיטה הראשונה כוללת הסרת החלק העליון של עלים ישנים משתילי תירס באמצעות חשפנית תיל (איור 1E). על ידי חשיפת קצה הפרימורדיום (P5-P7), ניתן לקבוע את אורכו ללא צורך להסיר לחלוטין את העלים הישנים יותר, ובכך לאפשר חתך קל ומדויק. השיטה השנייה כוללת גלגול והרכבה של פרימורדיה שלמה (P3-P7) עם ננו-טייפ דו-צדדי שקוף (איור 1F). שיטות אלה מתאימות להדמיה של FPs24 שונים, אך זקוקות לאופטימיזציה לשימוש בצבעים פלואורסצנטיים וריאגנטים לניקוי. בנוסף, אנו מתארים כמה הליכים לשיטוח ערימות z, תפירת תמונות ומיזוג ערוצים ב- ImageJ/FIJI34, החלים על התמונות המופקות בשתי השיטות. שיטות אלה שימושיות עבור פלואורסצנטיות שגרתית או הדמיה קונפוקלית של עלי תירס, אך ניתן להתאים אותן גם למיני עשב מודל אחרים, כגון אורז, סטריה וברהיפודיום.

Figure 1
איור 1: ארגון ומורפולוגיה של פרימורדיה של עלי תירס וסקירה כללית של השיטות . (A) ייצוג סכמטי של שתיל תירס. לתירס יש פילוטקסיה דיסטיכוסית, כאשר העלה החדש מתחיל במיקום הפוך מהעלה הקודם. מספר העלה מציין את הסדר הכרונולוגי שבו יצאו העלים מנביטה (כלומר, עלה ראשון, L1; עלה שני, L2; עלה שלישי, L3; וכו'). לכל עלה יש להב דיסטלי ונדן בזאלי התחום על ידי קולר המתאים לליגולה ולאוריקל. העלה העליון עם הצווארון הנראה לעין מציין את השלב הווגטטיבי. השתיל בדוגמה זו נמצא בשלב V2, כאשר צווארון L2 (ראש החץ) גלוי. סמל המספריים מציין את המיקום במזוקוטיל (me) שבו יש לחתוך את השתיל על מנת להיאסף. (B) ייצוג סכמטי של הירייה המנותחת המראה L1 עד L4 מבודדים, כאשר קדימות העלה L5 עד L9 מוצגות כתמונה מוגדלת ב-(C). מספר הפלסטוכרון מציין את מיקומו של הפרימורדיום ביחס ל-SAM, כאשר פרימורדיום העלה הצעיר ביותר (P1) הקרוב ביותר ל-SAM והעלה המבוגר יותר פרימורדיה (P2, P3, P4 וכן הלאה) רחוקים יותר ברצף2. (D) ייצוג סכמטי של המורפולוגיה של פרימורדיה של עלי תירס מ-P1 עד P5. (E) סקירה סכמטית של השיטה לניתוח חתך רוחבי של פרימורדיה עלה תירס. (1) גזור את העלים הישנים יותר עם חשפנית תיל. (2) למדוד את הפרימורדיום ולחתוך את היורה. (3) להרכיב את הקטע על שקופית לצורך הדמיה ועיבוד (4, 5). (F) סקירה סכמטית של השיטה לאנליזה מלאה של פרימורדיה של עלי תירס. (1) הסר את העלים שמסביב כדי לחלץ את הפרימורדיום. (2) גזור ופתח את הפרימורדיום שטוח על סרט הנאנו. (3) להרכיב את הדגימה לצורך הדמיה ועיבוד (4, 5). קיצורים: L = עלה; bl = להב; sh = נדן; co = צווארון; me = mesocotyl; V = צומח; P = פלסטוכרון; SAM = לירות meristem אפי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

1. בימוי פיתוח עלי תירס ועיצוב הניסוי

  1. גידול הצמחים והיערכות פיתוח העלים
    1. לקבוע את הגיל ואת השלב ההתפתחותי של הצמחים שישמשו לניסוי ולבצע היערכות מפורטת של התפתחות עלים.
      הערה: מומלץ לבצע את הבימוי על צמחים בעלי רקע גנטי זהה לזה של הקווים המוטנטיים או הטרנסגניים שישמשו בניסויים. ה-SAM מפסיק לייצר עלים חדשים בין 20 ל-25 DAG, בהתאם לרקע הגנטי ולתנאי הגדילה. מסיבה זו, השיטות המתוארות כאן אידיאליות עבור שתילי תירס בגילאי 7-14 DAG.
    2. לגדל את צמחי התירס בחממה או בתא גידול בהתאם לפרוטוקול מתאים לטיפול בצמחים35.
    3. אספו את הצמחים בגיל הרצוי או בשלב V בעזרת סכין קטנה או זוג מספריים על-ידי חיתוך במזוקוטיל שהוא הגבעול שמתחת לפני הקרקע (איור 1A). הכניסו בזהירות את כלי החיתוך לאדמה שליד השתיל והחליקו אותו מטה לבסיס בזווית של 45 מעלות כדי לחתוך את המזוקוטיל.
    4. הרימו את השתיל מהאדמה והסירו אבק מכל לכלוך או חלקיקי אדמה שנותרו שעלולים להיצמד לצמח. הסר את coleoptile, נדן מגן מכסה את יורה עולה שתילים צעירים, ביד.
    5. עבור כל צמח, רשמו את שלב V, את מספר העלים, ואת אורך העלה האחרון היוצא מהזונה. צלמו את הצמחים לעיון עתידי.
    6. מוציאים את העלים הישנים בזה אחר זה. כדי לעשות זאת, החזיקו את הצמח ליד שאריות המזוקוטיל או הגבעול, והוציאו כל עלה מבסיס הנדן ופרשו בעדינות את הנדן בצורה מעגלית בעזרת בדיקה דנטלית (איור 1B).
      הערה: ראה שלב 2.1 לקבלת שיטה מהירה להסרת העלים שמסביב.
    7. תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של בערך פי 2, נתחו בזהירות את שאר קודקוד הצילום על מגבונים לחים כדי למנוע מהדגימה להתייבש. הוציאו בעדינות את הבלו ופרשו כל פרימורדיום עלה בעזרת בדיקה דנטלית עם מחט כפופה או זוג מלקחיים עדינים עד שה-SAM, P1 ו-P2 נראים לעין (איור 1D). רשום את המראה והמדידה של כל פלסטוכרון.
      הערה: ראו דוגמה להתפתחות עלים בשתילי תירס בקובץ משלים 1.
  2. תכנון הניסוי
    הערה: תכנון קפדני של הניסוי יכול לשפר את היעילות. לדוגמה, בניתוח חתך רוחבי, קביעת המיקום המשוער שיש לחתוך בעת הדמיה של פלסטוכרונים או אזורים ספציפיים יכולה להפחית את זמן הדיסקציה. איור 2 מציג דוגמה לדגימה מתוקננת. יתר על כן, אופטימיזציה של פרמטרי ההדמיה בהתבסס על התכונות של FPs או גשושיות פלואורסצנטיות יכול לשפר את היעילות של הניסויים.
    1. השתמש במידע הבימוי כמדריך כדי למקד את הניסוי בפלסטוכרונים ספציפיים, אזורי פרימורדיום ורקמות. השתמש ב- FPs או בבדיקות פלואורסצנטיות אחרות המעניינות כדי לעקוב אחר סעיפים 2 ו / או 3 להלן בכמה דגימות.
      הערה: ראה מניות סמן FP זמינות של תירס קו 36-42 זרעים ב- https://www.maizegdb.org/data_center/stock.
    2. קבע את הפרמטרים האופטימליים לרכישת תמונה עבור כל כתב FP או גשושית, כולל הגלאי או המסנן המתאימים, אורכי גל עירור ופליטה, גודל חור סיכה והגדרות אחרות. שמור את ההגדרות כדי לשחזר את תנאי העבודה עבור כל אחד מהניסויים.
      הערה: ראה Linh and Scarpella30 לקבלת הנחיות טכניות עבור מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי של עלים מתפתחים.
    3. תכנן את זמן ההדמיה בהתבסס על זמן מחצית החיים ומאפיינים אחרים של כתב FP43.
      הערה: הזמן בין דיסקציה להדמיה חייב להילקח בחשבון גם בעת תכנון ניסוי, מכיוון שדגימות צמחים טריים חשופות להתייבשות ולשינויים תאיים במהלך תקופה זו.

Figure 2
איור 2: סכימת דגימה לניתוח חתך רוחבי של פרימורדיה של עלי תירס. (A, משמאל) שוט פרוקסימלי של שתיל תירס 7 DAG, מראה עלה רביעי חשוף (L4) ב-P7. הקווים השבורים מציינים את שבע נקודות הדגימה לאורך הפרימורדיום, מ-0.5 מ"מ עד 10 מ"מ. (A, מימין) ייצוג סכמטי של פרימורדיית העלה, עם הגודל והמיקום הצפויים של כל פלסטוכרון: P7 (לבן); P6 (מגנטה); P5 (כחול); P4 (ירוק); ו-P3 עד ה-SAM (צהוב). (ב-ח) תמונות פלואורסצנטיות של חתכים רוחביים המייצגים את נקודות הדגימה המוצגות ב-A מ-10 מ"מ (B) עד 0.5 מ"מ (H). הפרימורדיה היא פסאודו-צבעונית בהתאם לסכמת הצבעים הפלסטוכרון ב-(A). המקטעים צולמו במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי באמצעות מסנן UV בעל פליטה ארוכה לאוטופלואורסצנטיות. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (B-H). נתון זה שונה ושוכפל באישור רוביל ומקסטין24. קיצורים: DAG = ימים לאחר הנביטה; P = פלסטוכרון; SAM = לירות meristem אפי; † = נדן עלה או pre-ligule תקין; * = לירות מריסטם אפי; ** = גזע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. הדמיה של חתכים רוחביים של פרימורדיה של עלי תירס

  1. הפשטת עלים ישנים יותר ומדידת פרימורדיום העלים
    1. אספו את השתיל על-ידי חיתוך זהיר שלו במזוקוטיל שמתחת לפני הקרקע בעזרת סכין קטנה או זוג מספריים, כמתואר בשלבים 1.1.3-1.1.4 (איור 1A).
    2. קבע את גודל חור חשפנית החוט הנכון לשימוש והיכן יבוצע החיתוך לאורך הצילום. ודא שהחור גדול מספיק כדי להתאים לפרימורדיום המטרה.
    3. מתחילים לחתוך בחלק הדיסטלי יותר של הנבטה ועובדים בהדרגה לכיוון הבסיס עד לחשיפת קצה הפרימורדיום.
    4. כדי לבצע את החיתוך, החזיקו את חשפנית החוט כשהלסתות פונות לצילומים. מקמו את הנבטה לחור שנבחר ודחסו את ידיות החשפנית זו לזו כדי לחתוך דרך זונת העלים.
      הערה: כדי להימנע מחיתוך בטעות של פרימורדיום המטרה, יישר בזהירות את מרכז הצילום עם החור בחשפנית התיל. עבור צמחים גדולים יותר, מומלץ להסיר ידנית חלק מהעלים שמסביב ביד לפני השימוש בחשפנית.
      זהירות: לחשפניות חוט יש לסתות חדות שעלולות לגרום לחתכים או פציעות אחרות אם לא משתמשים בהן בזהירות.
    5. תוך כדי המשך הידיות יחד, החליקו את החשפנית הרחק מהנבטה כדי לקצץ את החלק העליון של העלים. ודאו שאזור המטרה בקדמון נשאר עטוף על-ידי העלים שמסביב (איור משלים S1C,D).
      הערה: לאחר חיתוך העלים העליונים, משאירים את הנצר עם קצה פרימורדיום חשוף (P5, P6 או P7, תלוי במיקום החתך ובגודל חור חשפנית התיל בו נעשה שימוש; איור 1E). פרימורדיום זה ישמש כנקודת ייחוס להערכת הגודל והשלב של הפרימורדיה הצעירה. P6 הוא ההתייחסות המעשית ביותר לשימוש בשתילי תירס בשל טווח הגדלים שלו והמורפולוגיה דמוית הסיכה שלו.
    6. השתמש בסרגל כדי למדוד את האורך מקצה הפרימורדיום לבסיס הנבט. הקלט את המדידה.
      הערה: אורך הפרימורדיום יוערך מעט יתר על המידה מאחר שיש כמה מילימטרים של גבעול בבסיס הפרימורדיה (איור 2A).
  2. חתך והדמיה ביד חופשית של פרימורדיום העלה
    1. תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה של כ-0.8x, החזק את הנבטה יציבה על משטח חלק, כגון קרש חיתוך זכוכית או חומר עמיד בפני שריטות. השתמש בסכין גילוח או אזמל כדי לחתוך חלקים דקים (0.25-0.8 מ"מ) של הירייה בנקודות הרצויות לאורך הפרימורדיום.
    2. בצע חיתוך ראשוני מעט מעל אזור המטרה כדי להשליך את החלק הדיסטלי של הצילום, ולאחר מכן קבל חלקים דקים סביב אזור המטרה. כדי לבצע חתכים נקיים, החזק את הלהב בניצב לצילום והחלק אותו פנימה בתנועה חלקה ואחידה.
      הערה: ייתכנו כמה מילימטרים של מרחב תמרון חתך עבור פרימורדיה גדולה יותר (P6 או P7). אולם עבור פרימורדיה קטנה יותר (P5 ומוקדם יותר), 1 מ"מ יכול לעשות הבדל משמעותי בדגימה, מאחר שהפרימורדיה הזו נערמת בתוך המילימטרים הראשונים של בסיס הנבטה (ראו איור 2A,F-H). מומלץ להשתמש בסכין גילוח פיפיות לחתך עדין יותר.
      התראה: יש לנקוט משנה זהירות בעת השימוש בסכיני גילוח ובאזמלים כדי למנוע חתכים או פציעות בשוגג.
    3. החלף את סכין הגילוח באופן קבוע, מכיוון שנדן העלה יכול בקלות להקהות את הלהב. כסו את הנבטה במגבונים לחים לאחר כל סבב חתך כדי למנוע מהדגימה להתייבש.
    4. הרכיבו את קטע העלה על מגלשת זכוכית נקייה (75 מ"מ x 25 מ"מ), השתמשו בפיפטה כדי למרוח טיפת מים (או 50% גליצרול) ישירות על המקטע, והניחו על החלק כיסוי (22 מ"מ x 22 מ"מ).
    5. אם אתם משתמשים בצבע פלואורסצנטי, מרחו את תמיסת הצבע על הקטע, הניחו עליו כיסוי ודגרו עליו לפי הצורך.
      הערה: בהתאם לסוג הצבע, ייתכן שיהיה צורך בשלבים נוספים לעיבוד חלקי העלה לפני שתמשיך לשלב הבא. הפניות אלה44,45,46,47 מספקות פרטים כלליים ושימושים בצבעים פלואורסצנטיים בדימות תאי צמחים. צבע פלואורסצנטי מכתים גרעין, 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU), שימש ביעילות על חתכים רוחביים של פרימורדיה48 עלה תירס. לעומת זאת, צבעים שמכתימים את קרום הפלזמה, כמו פיי מאו 4-64 (FM 4-64) ופרופידיום יודיד, אינם מפיקים תוצאות משביעות רצון (איור 3A-D).
    6. הניחו את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ סריקת לייזר אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי וכווננו את המיקוד וההגדרות לפי הצורך כדי להמחיש את הפלואורופור30. ראו טבלה 1 להגדרות התאורה ורכישת התמונה המשמשות לקווי כתב FP נבחרים של תירס.
      הערה: מקטעים עבים עשויים להפיק רמות גבוהות של אוטופלואורסצנטיות ברקע. שקול כמה אסטרטגיות הדמיה והכנת דגימות שיכולות לעזור להקל על בעיה זו30,49 (ראה טבלה 2).
      התראה: יש לנקוט משנה זהירות ולהרכיב משקפי מגן בעת עבודה עם מקורות אור רבי עוצמה ולייזרים כדי להפחית את הסיכון לנזק לעיניים.
    7. צלמו דרך קטע הדף בהגדלות ובערוצי זיהוי שונים (כולל תאורת השדה הבהיר)30. השתמש בהגדלה של 4x כדי לצלם את כל החלק הרוחבי ובהגדלה של 20x או 40x כדי לצלם רקמות ספציפיות. צמצם את זמן החשיפה בהגדלות גבוהות יותר לצורך דימות אפיפלואורסצנטי כדי להגן על הדגימות מפני הלבנה מהירה (ראה טבלה 1).
    8. צלם תמונות של המקטע כולו או של אזורי עניין ספציפיים (ROI). במידת הצורך, לרכוש z-stack, שהיא סדרה של תמונות שנלכדו בעומקי מוקד שונים30.
    9. כדי לרכוש ערימת z, תחילה לקבוע את המיקומים העליונים והתחתונים בדגימה, ולאחר מכן את מספר החלקים האופטיים שיש ללכוד בין מיקומים אלה. פחות מקטעים אופטיים יוצרים גודל גדול יותר של צעד z, שהוא המרחק בין כל מקטע. בהתאם לתכונות ה-FP וההגדלה שבה נעשה שימוש, לכוד שלושה עד 25 מקטעים אופטיים בגדלים של Z-step בין 1 ל-12 מיקרומטר לצורך הדמיה של מקטעים רוחביים של פרימורדיה של עלי תירס.
      הערה: כדי לשטח את ערימת z, השתמש בטכניקת עיבוד נפחמתאימה 50 שניתן לבצע באמצעות תוכנת המיקרוסקופ או באמצעות ImageJ/FIJI34 (ראה שלבים 4.1 ו- 4.2).
    10. שמור את כל קובצי התמונה ואת המטא-נתונים המשויכים אליהם, אם הם זמינים.

טבלה 1: הגדרות תאורה ורכישת תמונה המשמשות להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית של מדווחי FP נבחרים של תירס. קיצורים: FP = חלבון פלואורסצנטי; TRITC = tetramethylrhodamine; FITC = isothiocyanate fluorescein; WLL = לייזר אור לבן; Ar-ion = לייזר יון ארגון; HyD = גלאי היברידי; AU = יחידה אוורירית; Hz = הרץ, קו סריקה לשנייה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

3. הדמיה של תושבות שלמות מגולגלות של פרימורדיה של עלי תירס

  1. ניתוח הפרימורדיה והכנת שקופית הזכוכית עם ננו טייפ
    1. אספו את השתיל על-ידי חיתוך זהיר שלו במזוקוטיל שמתחת לפני הקרקע בעזרת סכין קטנה או זוג מספריים, כמתואר בשלבים 1.1.3-1.1.4 (איור 1A).
    2. הכינו את מגלשת הזכוכית (75 מ"מ x 25 מ"מ) עם סרט ננו דו-צדדי שקוף (איור משלים S1H) לפני שאתם מנתחים את הצמח. חתכו פיסת ננו טייפ מלבנית והדביקו אותה למרכז מגלשת זכוכית נקייה. אין להסיר את סרט הפלסטיק המגן בצד העליון של הקלטת.
      הערה: קבע את גודל הקלטת לשימוש בהתאם לגודל הדגימות לתמונה (ראה דוגמאות של דגימות גדולות מדי באיור משלים S1I,J). הננו טייפ זמין בחומר ג'ל אקרילי או פוליאוריתן. שני הסוגים יעילים להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית24. כדי למנוע שינוי צבע של הקלטת, להגן עליו מפני חשיפה ממושכת לאור על ידי אחסון אותו במיכל כהה.
    3. התחל לנתח את הצילומים על ידי הסרת החלק העליון של העלים הישנים עם חשפנית תיל, כמתואר בשלב 2.1.
    4. החזק את הנבטה על ידי mesocotyl בזהירות להסיר את העלים שמסביב עם בדיקה שיניים כדי לחלץ את primordia. כדי לעשות זאת, להסיר את העלים מבסיס הנבטה ולפרוש אותם אחד בכל פעם עד הראשוניות של עניין נחשף.
    5. לחלופין, השתמשו בחשפנית התיל כדי לחלץ ישירות את פרימורדיה העלה על-ידי ביצוע חתך באזור הבסיס של הנבטה (איור משלים S1E-G).
      הערה: שיטה זו נושאת סיכון גבוה יותר להצמדת הפרימורדיה.
  2. הרכבה והדמיה של הפרימורדיום.
    1. הסר את סרט המגן מהקלטת. הניחו את הפרימורדיום החשוף על הקלטת. השתמשו בסכין גילוח כדי לחתוך את הפרימורדיום בבסיס, והשליכו את גזע הבסיס ואת ההיפוקוטיל (איור 1F).
    2. פתח את הפרימורדיום באמצעות בדיקה דנטלית עם מחט כפופה (קוטר קצה של 0.25-0.6 מ"מ). השתמש במיקרו-פרוב (קוטר קצה של 0.15-0.2 מ"מ) עבור פרימורדיה קטנה מ-3 מ"מ (P3 עד P4 מוקדם).
    3. מקם את קצה המחט במקביל למשטח ופרוש את השוליים הבסיסיים החיצוניים, תוך הצמדה עדינה לקלטת.
    4. לפתיחה חלקה יותר, יש לשמן את המשטח הפנימי (אדקסיאלי) של העלה על ידי טבילת קצה המחט ב-100% גליצרול.
    5. כאשר השוליים החיצוניים נצמדים לסרט הדבקה, יישרו את קצה המחט במקביל לציר הארוך של העלה. החליקו בעדינות את המחט הצידה כדי לפתוח ולשטח את העלה על סרט הדבק (איור 1F).
      הערה: שבירה או גרימת נזק לעלה בזמן הגלגול היא נפוצה, במיוחד בפרימורדיה גדולה יותר עם צלע אמצעית חזקה (ראו איור 3E-G). גלגול נמרץ של העלה עלול לגרום לחבלות בפני השטח שלו ולייצר ממצאים במהלך ההדמיה (איור 3H). ראה טבלה 2 והדיון לפתרונות מומלצים לבעיות אלה.
    6. יש למרוח טיפת מים על הפרימורדיום הלא מגולגל. הניחו מיד מכסה על גבי טיפת המים והפרימורדיום. לחץ בעדינות על שולי הכיסוי כך שהם נצמדים לקלטת.
      הערה: מומלץ להשתמש בכיסויים מלבניים גדולים (50 מ"מ x 24 מ"מ או 60 מ"מ x 24 מ"מ) עם אזורים נוספים להדבקת סרט הדבקה. מזערו את היווצרותן של בועות אוויר, שיכולות לעוות את העלה ולגרום לשבירת אור לא אחידה (ראו איור 3I-K). ודאו שהחלקת הכיסוי נצמדת לחלוטין לסרט הדבקה, שכן השוליים של הפרימורדיום המותקן עשויים להתגלגל חזרה פנימה מתחת למכסה מודבק באופן רופף (ראו איור 3L).
    7. מקם את השקופית על במה של אפיפלואורסצנטיות (ראה איור משלים S1K) או מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי וכוונן את המיקוד וההגדרות לפי הצורך כדי להמחיש את פלואורופור30. ראו טבלה 1 להגדרות התאורה ורכישת התמונה המשמשות לקווי הכתבים שנבחרו של תירס FP.
    8. דמיינו את כל העלה או החזר השקעה ספציפי דרך ערוצי איתור שונים30. כדי לצלם את העלה כולו, צלם ידנית תמונות פסיפס של העלה או השתמש בפעולת הריצוף של המיקרוסקופ בהגדלה נמוכה (4x או 10x).
      הערה: אפילו בהגדלה הנמוכה ביותר, פרימורדיה של עלי תירס עשויה להיות גדולה מדי לצילום עם מיקרוסקופ סריקת לייזר אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי, וכתוצאה מכך זמני הדמיה ארוכים יותר שעלולים לגרום להלבנה (ראו איור 3M) או לעלייה באוטופלואורסצנטיות ברקע. לכן, מומלץ להשתמש במיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי להדמיית דגימות עלים שלמים הגדולים מ-5 מ"מ.
    9. עבור הדמיה קונפוקלית, השגת ערימות z המקיפות את עובי העלה יהיה צורך (ראה שלב 2.2.9).
    10. שמור את כל קובצי התמונה ואת המטא-נתונים המשויכים אליהם, אם הם זמינים.

טבלה 2: פתרון בעיות נפוצות בהדמיה של חתכים רוחביים ותושבות שלמות של פרימורדיה של עלי תירס. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Figure 3
איור 3: חתך רוחבי תת-אופטימלי והכנה מלאה של פרימורדיה של עלי תירס. (A-D) תמונות קונפוקליות מייצגות של חתכים רוחביים של פרימורדיה של עלים עם סמן קרום פלזמה, PIP2-1-CFP (A), וצבע פלואורסצנטי קושר קרום פלזמה, FM 4-64 (B), עם תמונות תואמות של שדה בהיר (C,D). בהשוואה ל- PIP2-1-CFP, FM 4-64 מציג תצוגה חזותית לא אופטימלית של קווי מתאר של תאים. (אי-אם) תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של תושבות שלמות של פרימורדיה של עלים המראות נוכחות של קריעה (E-G), משטחים חבולים† (H), בועות אוויר* (I-K), שוליים מגולגלים לאחור (L) ואזורים מולבנים‡ (M). פרימורדיה העלה מבטאת DII-Venus (E-G), GAR2-YFP (H-J), mDII-Venus (K), PIN1a-YFP (L) ו-DR5-RFP (M). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (A-D); 500 מיקרומטר (E-M). איור 3A שונה ושוכפל באישור Robil ו-McSteen24, ואילו איור 5B-M הם נתונים שלא פורסמו מהמחברים. קיצורים: P = plastochron; YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב; RFP = חלבון פלואורסצנטי אדום; CFP = חלבון פלואורסצנטי ציאן; PIP2-1-CFP = p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP; DII-Venus = pZmUbi:DII:YFP-NLS; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; BF = שדה בהיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. עיבוד התמונות באמצעות ImageJ/FIJI

  1. שיטוח ערימות z באמצעות הקרנה בעוצמה מרבית (MIP)
    1. הפעל את ImageJ/FIJI ופתח את ערימת התמונות, או צור ערימה חדשה ממספר תמונות נפרדות על ידי בחירה באפשרות תמונה | ערימות | תמונות לערימה מהתפריט.
    2. בחרו באוסף התמונות. מהתפריט, בחר תמונה | ערימות | פרויקט Z.... בתיבת הדו-שיח Z-Project , בחר עוצמה מרבית מהתפריט הנפתח סוג הקרנה . לחצו על ' אשר' ליצירת הקרנת z בעוצמה מרבית.
      הערה: התמונה המשוטחת היא הקרנה דו-ממדית של הפיקסלים בעוצמה הגבוהה ביותר על-פני ערימות z50. שיטה זו מתאימה להמחשת הפלואורופור, אך לא לתכונות האנטומיות בתמונות שדה בהיר של חתכים רוחביים עבים ותושבות עלים שלמים.
    3. שמור את התמונה כ- TIFF (Tagged Image File Format) על-ידי בחירה באפשרות File | שמירה בשם | טיף. הזן שם לקובץ ולחץ על Save.
      הערה: מומלץ להשתמש ב- TIFF לאחסון תמונות פלואורסצנטיות וקונפוקליות, מכיוון שהוא שומר על האיכות והפרטים בעת שמירת התמונה.
  2. שיטוח ערימות z באמצעות תוסף עומק שדה מורחב (EDF)51
    1. התקן את תוסף EDF52. הורד את קובץ Extended_Depth_Field.jar (גרסה 17.05.2021) מ- http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ ומקם אותו בתיקיית "תוספים" של ImageJ/FIJI.
    2. הפעל את ImageJ/FIJI ופתח את ערימת התמונות, או צור ערימה חדשה ממספר תמונות נפרדות על ידי בחירה באפשרות תמונה | ערימות | תמונות לערימה מהתפריט.
    3. בחרו באוסף התמונות. מהתפריט, בחר תוספים | עומק שדה מורחב | מצב קל של EDF. בתיבת הדו-שיח Extended Depth of Field , השתמש במחוונים תחת Speed/Quality כדי להגדיר את האיכות ומהירות העיבוד הרצויות, וב - Height-map reg כדי להגדיר את רמת החלקות של הטופוגרפיה. לחץ על Run כדי ליצור את התמונה המשוחזרת.
      הערה: EDF משלב את הערימה לתמונה דו-ממדית חדה ומורכבת על-ידי הקרנת המיקוד הטוב ביותר51. טכניקה זו שימושית להתגברות על עומק המיקוד המוגבל ומתאימה לשחזור תמונות שדה בהיר של חתכים רוחביים עבים או תושבות של עלים שלמים. יש לנקוט משנה זהירות בשעת החלת מסנן זה כדי להציג את הפלואורופור, מכיוון שבניגוד ל-MIP, EDF מתאים את הניגודיות של התמונה ומשפיע על עוצמת הפיקסלים.
    4. שמור את התמונה כקובץ TIFF על-ידי בחירה באפשרות קובץ | שמירה בשם | טיף. הזן שם לקובץ ולחץ על Save.
  3. תפירת תמונות יחד באמצעות תוסף Grid/Collection Stitching53
    1. שמור את אוסף התמונות או אוספי התמונות לתפירה משותפת בספרייה אחת.
    2. הפעל את ImageJ/FIJI ובחר תוספים | תפירה | תפירת רשת/אוסף מהתפריט. בתיבת הדו-שיח ' תפירת רשת/אוסף ', בחר 'מיקום לא ידוע ' מהתפריט הנפתח ' סוג ', ולאחר מכן ' כל הקבצים בספרייה ' מ'סדר'. לחץ על אישור.
    3. בתיבת הדו-שיח Grid Stitching: Unknown position, All files in directory , ציין את מיקום התמונות על-ידי הקלדה או הדבקה של נתיב הספרייה בשדה הטקסט Directory או על-ידי לחיצה על Browse... כדי לאתר את הספרייה. לחץ על אישור כדי להתחיל בתהליך התפירה.
      הערה: האפשרות ' מיקום לא ידוע ' בתוסף ' תפירת רשת/אוסף' בונה מחדש תמונה ללא הפרדות צבע מתוך קבוצה של תמונות רציפות על-ידי ניתוח האזורים החופפים שלהן. לכן, אפשרות זו שימושית לתפירת פסיפסים של תמונות של חתכים רוחביים או תושבות של עלים שלמים שאינן מתקבלות בפעולת סריקת אריחים.
    4. בסיום התפירה, יופיע חלון חדש עם התמונה התפורה. שמור את התמונה כקובץ TIFF על-ידי בחירה באפשרות קובץ | שמירה בשם | טיף. הזן שם לקובץ ולחץ על Save.
      הערה: ניתן לתפור מונטאז'ים גדולים של תמונות דו-ממדיות ותלת-ממדיות גם באמצעות פקודות שחזור תמונה בתוכנת המיקרוסקופ או באמצעות אפשרויות ייבוא של תבניות ביולוגיות ב-ImageJ/FIJI.
  4. שילוב ערוצים מרובים באמצעות הפקודה 'מזג ערוצים'
    1. הפעל את ImageJ/FIJI ופתח את התמונות או אוספי התמונות למיזוג.
      הערה: תחילה ניתן לשטח ערימות תמונות באמצעות שלבים 4.1 או 4.2. MIP מומלץ בדרך כלל להשטחת תעלות פלואורופור, ואילו EDF מתאים יותר לשיטוח ערוצי שדה בהיר או ערוצים אחרים עם עומק מיקוד משתנה.
    2. התאם את הבהירות והניגודיות של התמונות באמצעות תמונה | התאמה | בהירות/ניגודיות. השתמש/י במחוונים או בשדות הקלט כדי להתאים את הפרמטרים, ואז לחץ/י על ״החל״. לחלופין, השתמש בשיטת מתיחה של היסטוגרמה ליניארית על-ידי בחירה באפשרות תהליך | שפר את הניגודיות.... הגדר/י את אחוז הפיקסלים הרוויים, בחר/י ״ נרמל״ ולאחר מכן לחץ/י על ״ אישור״.
      הערה: בעת כימות או השוואה של עוצמת אות פלואורופור בין תמונות, בדרך כלל עדיף לא להתאים את הבהירות או הניגודיות מכיוון שהדבר יכול לשנות את עוצמות הפיקסלים היחסיות בתמונה, דבר שיכול להשפיע על המדידות וההשוואות.
    3. כדי להבדיל בין ערוצים, החילו פסאודו-צבעים על תמונות ספציפיות באמצעות טבלת בדיקת מידע (LUT). לשם כך, בחר את התמונה ולאחר מכן בתפריט ImageJ/FIJI, בחר תמונה, לחץ על טבלאות בדיקת מידע ובחר את ה- LUT המתאים מהרשימה הנפתחת.
    4. מהתפריט, בחר תמונה | צבע | מיזוג ערוצים. עבור כל ערוץ (C1, C2, C3...), השתמש ברשימה הנפתחת כדי לבחור את התמונה שתוקצה לערוץ זה. לחץ על אישור כדי למזג את הערוצים.
    5. שמור את התמונה החדשה כ- TIFF על-ידי בחירה באפשרות קובץ | שמירה בשם | טיף. הזן שם לקובץ ולחץ על Save.

Representative Results

ניתוח חתך רוחבי של פרימורדיה עלי תירס
השתמשנו בסעיף 2 של פרוטוקול כדי לכמת את מספר הוורידים ולאפיין דפוסי תגובה הורמונליים במקטעים רוחביים של פרימורדיה של עלי תירס עם FPs (איור 4)24. כדי להעריך את תפקידו של ההורמון הצמחי אוקסין בצמיחת עלים ובהיווצרות ורידים, כימתנו את מספר הוורידים בפרימורדיה של מוטציה של תירס חסר אוקסין, ציצית נעלמת254. בפלסטוכרונים מוקדמים, ורידים מתפתחים מפגינים צלולריזציה ברורה בשכבת התא החציונית של פרימורדיום עלה התירס21,22. עם זאת, זיהוי וספירת ורידים באמצעות טכניקות היסטולוגיות קונבנציונליות22 יכול להיות עבודה אינטנסיבית זמן רב. לכן, כדי לכמת את הוורידים, השתמשנו בסמן חלבון התירס אוקסין אפלוקס pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP להלן), המסמן ורידים מתפתחים וגדילים פרוקמביאליים (PCSs; איור 4A). באמצעות פרוטוקול סעיף 2 הצלחנו לתקנן את דגימת החתך הרוחבי על-ידי מדידת הפרימורדיה לפני החתך (איור 4B,C). גילינו מגמה שבה ל-vt2 יש פרימורדיום רחב יותר ויותר ורידים מהרגיל (איור 4D,E)24, אשר עולה בקנה אחד עם נתונים מעלים55 מורחבים במלואם, מה שמצביע על כך שהפגם ב-vt2 החל בשלב מוקדם של התפתחות העלים. באמצעות פרוטוקול סעיף 2 יכולנו גם לבחון באופן שיטתי את דפוסי הביטוי של כתבי FP של תגובת הורמונים בפרימורדיה של העלה (ראו דוגמאות לתמונות באיור 4F-I). באמצעות סכמת דגימה מתוקננת של חתך רוחבי, מיפינו את ההתפלגות של תגובות אוקסין, ציטוקינין (CK) וחומצה ג'יברלית (GA) על פני פלסטוכרונים ואזורים שונים של פרימורדיית עלים, וגילינו דפוסי תגובה חדשים שאנו משערים שיש להם השלכות על צמיחת עלים והיווצרות ורידים24. לכן, תוצאות מייצגות אלה מדגימות את התועלת של פרוטוקול סעיף 2 לניתוח חתך רוחבי של פרימורדיה של עלי תירס.

Figure 4
איור 4: תוצאות מייצגות לניתוח חתך רוחבי של פרימורדיה של עלי תירס. (A-E) כימות מספר הוורידים ורוחב הפרימורדיום בפרימורדיה של ציצית רגילה ונעלמת2 באמצעות סמן חלבון האוקסין EFFLUX PIN1a-YFP. (A) תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של חתכים רוחביים של P5 עד P7 המבטאים PIN1a-YFP בהתפתחות ורידים וגדילים פרוקמביאליים. החתכים הרוחביים צולמו במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי באמצעות מסנן FITC (עירור 495-519 ננומטר). מספר הוורידים ורוחב הפרימורדיום כומתו באמצעות כלי הקו הרב-נקודתי והקו החופשי ב-FIJI/ImageJ, בהתאמה. (B) שתיל תירס שאת העלה העליון מוציאים בעזרת חשפנית תיל כדי לחשוף את קצה העלה הרביעי (L4). הסוגר המרובע משתרע על פני אורך הפרימורדיום הצפוי, כאשר הקו המקווקו מציין את אורך האמצע. (C) דיאגרמה סכמטית של צורות פרימורדיום משתנות מ-P5 עד P7, הממחישה כיצד מספר הוורידים ורוחב הפרימורדיום באורך האמצעי (קו מקווקו אופקי) יכולים להשתנות בהתאם לשלב ההתפתחותי של הפרימורדיום. (ד,ה) מדידת רוחב פרימורדיום (D) ומספר ורידים (E) בחלק הבינוני של L4 של נורמלי ו vt2. קו המגמה מייצג ממוצעים מתגלגלים של 10 מ"מ של מדידות ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). (פ-י) תמונות קונפוקליות מייצגות של חתכים רוחביים של פרימורדיה של עלים המבטאים שילובים של PIN1a-YFP, כתב תגובת אוקסין, DR5-RFP, כתב תגובת ציטוקינין, TCS-Tomato, סמן מגיב לחומצה ג'יברלית, GAR2-YFP ו- mDII-Venus, גרסה מוטנטית של כתב קלט האיתות אוקסין DII-Venus. ערוצי FP מונחים על ערוץ השדה הבהיר בכל תמונה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (A); 10 מ"מ (B); 100 מיקרומטר (F-I). נתון זה שונה ושוכפל באישור רוביל ומקסטין24. קיצורים: DAG = ימים לאחר הנביטה; P = פלסטוכרון; VT2 = ציצית נעלמת2; PCS = גדיל פרוקמביאלי; YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב; FITC = isothiocyanate fluorescein; RFP = חלבון פלואורסצנטי אדום; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

אנליזה מלאה של פרימורדיה של עלי תירס
עקבנו אחר סעיף 3 של פרוטוקול כדי להמחיש ולנתח ביטוי FP בתושבות של עלים שלמים של פרימורדיה של עלי תירס (איור 5). על-ידי הדמיה של דפוסי ורידים עם PIN1a-YFP, מצאנו שהיווצרות ורידים מתרחשת בכל הפרימורדיום במהלך הפלסטוכרונים המוקדמים, אולם תהליך זה נעשה מוגבל באזורים הפרוקסימליים בשלב מאוחר יותר בהתפתחות (איור 5A)24. הניתוחים המשלימים את ניתוחי החתך הרוחבי, חשפו דפוסים ספציפיים לרקמות ולשלבים של תגובת הורמונים במהלך היווצרות ורידים24. דוגמה אחת היא תבנית הביטוי של כתב התגובה של CK TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato), ביחס לביטוי PIN1a-YFP (איור 5B)24. על ידי ביצוע סעיף 3 של הפרוטוקול, הצלחנו לבצע ניתוחים איכותיים וכמותיים של ביטוי FP בפרימורדיה של העלה (איור 5D-F; נתונים שלא פורסמו). בחנו את דפוסי הביטוי של כתב תגובת אוקסין, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), וסמן מגיב GA, pZmGAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), בתושבות עלים שלמים של מוטנטים בודדים וכפולים של vt2 וצמח ננסי3 (d3), מוטנט חסר GA56 (איור 5D). השווינו גם את הרמות היחסיות של התפשטות תאים בין פרימורדיה נורמלית לפרימורדיה של עלה vt2 באמצעות p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 (Cyclin-D2B-YFP), שהוא סמן למעבר G1/S במחזור התא 57 (איור 5E,F). בעוד שלא היה הבדל משמעותי בין נורמלי לבין vt2, ביטוי Cyclin-D2B-YFP היה עקבי עם פרופיל התפשטות התאים הידוע של פלסטוכרונים מוקדמים31. אנו מסיקים כי פרוטוקול סעיף 3 הוא שיטה יעילה לניתוח תושבות שלמות של פרימורדיה של עלי תירס, שקשה לדמיין אותן בשל המורפולוגיה המגולגלת שלהן.

Figure 5
איור 5: תוצאות מייצגות לניתוח כולל של פרימורדיה של עלי תירס. (A) תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של פרימורדיה של 7 שתילי תירס DAG המראים ורידים מתפתחים וגדילים פרוקמביאליים, כפי שמסומן על ידי סמן חלבון האוקסין EFFLUX PIN1a-YFP. פרימורדיה P3-P6 הוצאו מהבסיס, לא גולגלו ושוטחו עם הצד האדקסיאלי כלפי מעלה. כניסות מציגות צילומי תקריב של P3 ו-P4. ב-P5 וב-P6, קווים מקווקווים תוחמים את הקצה הדיסטלי של אזורי השגשוג, שבהם רוב הגדילים הפרוצמביאליים עדיין מתפתחים ומתרחבים. (ב,ג) תמונות קונפוקליות מייצגות המציגות את הביטוי של PIN1a-YFP וכתב תגובת ציטוקינין, TCS-Tomato, באזור השוליים הפרוקסימלי של פרימורדיום P5. (D) תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של P4 primordia המראות את הביטוי של כתב תגובת אוקסין, DR5-RFP, וסמן מגיב לחומצה ג'יברלית, GAR2-YFP במוטציות רגילות ובודדות וכפולות של ציצית נעלמת2 וצמח ננסי3. (E) תמונות קונפוקליות מייצגות של P3 ו/או P4 המראות את הביטוי של Cyclin-D2B-YFP, כתב למעבר G1/S במחזור התא. (F) כמויות יחסיות של התפשטות תאים בפרימורדיה של עלה P3/P4 של נורמלי ו-vt2, מכומתות על ידי מדידת הצפיפות המשולבת של אות Cyclin-D2B-YFP על פני שטח הפרימורדיום באמצעות ImageJ/FIJI. העמודות מייצגות את ממוצע המידות ± שגיאת התקן של הממוצע. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר (A,D,E); 200 מיקרומטר (B); 100 מיקרומטר (C). איור 4A-C שונה ושוכפל באישור Robil ו-McSteen24, ואילו איור 4D-F הוא נתונים שלא פורסמו על ידי המחברים. קיצורים: DAG = ימים לאחר הנביטה; P = פלסטוכרון; VT2 = ציצית נעלמת2; D3 = צמח ננסי3; YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב; RFP = חלבון פלואורסצנטי אדום; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Cyclin-D2B-YFP = pZmCyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP; ns = אין הבדל משמעותי; au = יחידה שרירותית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: דוגמאות להתפתחות עלים בשתילי תירס. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S1: דגימות צמחים וחומרים המשמשים בפרוטוקולים. (א,ב) שתיל תירס 7-8 DAG עם זונת העלה העליון הוסר באמצעות חשפנית תיל. (B) השיבוץ מראה תקריב של הצילום עם הפרימורדיום P6 החשוף. (ג-ג) נבטים של שתילי תירס כאשר הזונות העליונות הוסרו לצורך ניתוח חתך רוחבי (C,D) והעלים שמסביב הוסרו במלואם לצורך ניתוח הרכבה שלמה (E-G). (H) גליל ננו-טייפ דו-צדדי שקוף מג'ל פוליאוריתן. (ט,י) פרימורדיום עלה P6 (I) ואזור פרוקסימלי של עלה P8 (J) נפרש והורכב על שקופיות זכוכית עם סרט ננו. (K) מגלשת זכוכית עם פרימורדיום עלים לא מגולגל המותקן על במה של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. קיצור: DAG = ימים לאחר הנביטה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

אנו מציגים שתי שיטות להכנת פרימורדיה של עלי תירס לדימות תאי. השיטה הראשונה (פרוטוקול סעיף 2) מאפשרת מדידה של הפרימורדיום לצורך ניתוח חתך רוחבי, ואילו השיטה השנייה (פרוטוקול סעיף 3) מאפשרת גלגול והשטחה של הפרימורדיום לצורך אנליזה של הרכבה שלמה. שיטות אלה מקלות על הדמיה תאית של FPs בפרימורדיה24 של עלי תירס (כפי שמוצג באיור 4 ובאיור 5) ומספקות פתרונות פשוטים לאתגרי הדמיה של עלי תירס מתפתחים. פרוטוקול סעיף 2 מקצר את זמן הדיסקציה ומשפר את דיוק הדגימה על ידי מדידת הפרימורדיה לפני החתך במקום להסתמך רק על פרמטרים 9,16. עם ננו טייפ זמין מסחרית, פרוטוקול סעיף 3 פותר את הבעיה ארוכת השנים של הדמיה של פרימורדיה של עלה שלם בתירס. פרוטוקול זה משפר את השיטה הקודמת, שהשתמשה בצינורות דיאליזה 31, והוא חלופה זולה בהרבה ל- CT ו- MRI11,32,33. עם זאת, כשמדובר בהדמיה של תכונות אנטומיות של עלים והפקת תוצאות אופטימליות, לשני הפרוטוקולים יש כמה מגבלות, המתוארות בטבלה 2 ונידונות ביתר פירוט להלן.

בפרוטוקול סעיף 2 נתקלנו בקושי לדמיין קווי מתאר של תאים בחתכים רוחביים עבים של פרימורדיה העלה, וצביעת נגד בצבעים פלואורסצנטיים קושרי דופן התא או פלסמה לא סיפקה תוצאות משביעות רצון. לדוגמה, FM 4-64 הפיק תוצאות תת-אופטימליות בהשוואה לסמן FP של קרום הפלזמה, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; איור 3A-D). כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו ממליצים להשתמש בויברטום כדי לייצר קטעי רקמה דקים יותר (~0.1 מ"מ)58 אשר יאפשרו הדמיה חיה של שדה בהיר של קווי מתאר התא או אופטימיזציה של פרוטוקול הצביעה הנגדית 47,59.

בסעיף 3 של פרוטוקול, המגבלה העיקרית היא הקושי להרכיב את העלה ללא קרע, נזק או בועות אוויר, כמפורט בשלבי פרוטוקול 3.2.5-3.2.6 (איור 3E-K). מכיוון שעלה התירס סימטרי דו-צדדית, תושבת של חצי עלה ולא תושבת של עלה שלם עשויה להספיק להדמיה9. כדי לעשות זאת, פרימורדיום ניתן לחתוך עם סכין גילוח לאורך ציר האורך לאחר גלגול אותו עד אמצע הצלע, המאפשר רק מחצית העלה להיות רכוב. מגבלה נוספת של פרוטוקול סעיף 3 היא שעובי העלה יכול להגביל את הרזולוציה האופטית של אות הפלואורופור במהלך הדמיה עמוקה. כדי לטפל בבעיה זו, ניתן להשתמש בטכניקת ניקוי רקמות60. עם זאת, מצאנו כי ClearSee61, מגיב ניקוי נפוץ להדמיית רקמות צמחים, אינו תואם לפרוטוקול מכיוון שהוא גורם לדגימה ולכיסוי להתנתק מננו-קלטת. פתרון אפשרי לבעיה זו יכול להיות מריחת קרוםחדיר למחצה 31 על דגימת העלה, המאפשר לטפל בה בתמיסת הניקוי תוך החזקתה במקומה על ידי סרט הננו. שיטה כזו המאפשרת ליישם תמיסות נוזליות על העלה הלא מגולגל יכולה לשמש גם להכלאה של RNA באתרו שלם ולטכניקות אימונולוקליזציה, אשר הותאמו בעבר לפיתוח תפרחות תירס אך לא לפרימורדיה 62,63 של עלה שלם.

תיארנו פרוטוקולים לתירס, שיש לו פרימורדיה גדולה של עלים אפילו בשלב השתילה. מיני עשב אחרים עם פרימורדיה עלים קטנה בהרבה, כגון אורז, שעורה, חיטה, סטריה וברהיפודיום 16,23,64,65,66, עשויים לדרוש שימוש בכלים מדויקים נוספים כדי ליישם ביעילות פרוטוקולים אלה. יתר על כן, פרוטוקולים אלה לא נועדו לדימות תאים חיים, אשר לוכד בזמן אמת תהליכים דינמיים של היווצרות רקמות ותגובות תאיות. עם זאת, ככל שגשושיות פלואורסצנטיות, טכנולוגיות הדמיה ויכולות מחשוב ממשיכות להתקדם בדימות תאים חיים עבור צמחים67, מחקר עתידי יכול להתבסס על פרוטוקולים אלה כדי לפתח אסטרטגיות דימות תאים חיים המותאמות לתכונות הייחודיות של פרימורדיה של עלי דשא.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לשיתוף הפעולה בגנטיקה של תירס, פרויקט הגנומיקה של תאי תירס, דייב ג'קסון (מעבדת קולד ספרינג הארבור, ניו יורק), אן סילבסטר (מעבדה ביולוגית ימית, אוניברסיטת שיקגו, אילינוי), אנדראה גלאבוטי (אוניברסיטת ראטגרס, ניו ג'רזי) וקרולין ג. רסמוסן (אוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד) על אספקת המניות המוטנטיות והטרנסגניות, כמו גם רוברט פ. בייקר ואלכסנדר יורקביץ' מליבת מיקרוסקופ האור המתקדם באוניברסיטת מיזורי-קולומביה על עזרתם במיקרוסקופ קונפוקלי. JMR נתמך על ידי מלגת ג'יי ויליאם פולברייט, קרן דיאן פ. ורוברט א. שארפ, והתוכנית לחקר גנום הצמח של הקרן הלאומית למדע (IOS-1546873) ל- PM. CDTC, CMRV, EDCDP ו- RJRR נתמכים על ידי תוכנית המלגות של מכללת אטנאו. CDTC, EDCDP ו- RJRR נתמכים על ידי מלגת DOST-SEI S&T לתואר ראשון. DODL נתמך על ידי Fr. Thomas Steinbugler SJ Academic Scholarship. RJRR נתמך על ידי Aiducation International-Pathways to Higher Education Scholarship. עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר למדעים והנדסה וספריית ריזאל, אוניברסיטת אטנאו דה מנילה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick EZlifego Store (Amazon) B07YB1ZXG6 1 roll
Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in Bausch & Lomb N1692 9 1 pc
Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in Storz Opthalmic Instruments E0542 1 pc
Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in) Ted Pella 13553 1 pc
DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper Dowell Store (Amazon) 10-22 AWG 1 pc
Feather Double Edge Carbon Steel Blades Ted Pella 121-9 pkg/10; for fine sectioning
Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm Ted Pella 260442 pkg/144
GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades Ted Pella 121-1 box/200; for general cutting/sectioning
Glycerol Thermo Scientific PI17904 1 liter
ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin National Institutes of Health (NIH) USA version 2.9.0/1.54s The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).
Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm Kimtech Science 34155 box/280 ply
Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260140 1 ounce
PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick Yecaye Store (Amazon) L354 W1.18 2 rolls
Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260166 1 ounce
Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260168 1 ounce
Tempered Glass Cutting Board Hacaroa (Amazon) B09XMXBT5S 4 pc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McSteen, P., Kellogg, E. A. Molecular, cellular, and developmental foundations of grass diversity. Science. 377 (6606), 599-602 (2022).
  2. Wang, P., Vlad, D., Langdale, J. A. Finding the genes to build C4 rice. Current Opinion in Plant Biology. 31, 44-50 (2016).
  3. Wang, P., et al. Candidate regulators of early leaf development in maize perturb hormone signalling and secondary cell wall formation when constitutively expressed in rice. Scientific Reports. 7 (1), 4535 (2017).
  4. Perico, C., Tan, S., Langdale, J. A. Developmental regulation of leaf venation patterns: Monocot versus eudicots and the role of auxin. New Phytologist. 234 (3), 783-803 (2022).
  5. Wang, P., Kelly, S., Fouracre, J. P., Langdale, J. A. Genome-wide transcript analysis of early maize leaf development reveals gene cohorts associated with the differentiation of C4 Kranz anatomy. The Plant Journal. 75 (4), 656-670 (2013).
  6. Liu, W. Y., et al. Regulators of early maize leaf development inferred from transcriptomes of laser capture microdissection (LCM)-isolated embryonic leaf cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (35), e2208795119 (2022).
  7. Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (10), 3979-3984 (2013).
  8. Strable, J., Nelissen, H. The dynamics of maize leaf development: Patterned to grow while growing a pattern. Current Opinion in Plant Biology. 63, 102038 (2021).
  9. Reynolds, J. O., Eisses, J. F., Sylvester, A. W. Balancing division and expansion during maize leaf morphogenesis: Analysis of the mutant, warty-1. Development. 125 (2), 259-268 (1998).
  10. Richardson, A. E., et al. Evolution of the grass leaf by primordium extension and petiole-lamina remodeling. Science. 374 (6573), 1377-1381 (2021).
  11. Johnston, R., Leiboff, S., Scanlon, M. J. Ontogeny of the sheathing leaf base in maize (Zea mays). New Phytologist. 205 (1), 306-315 (2015).
  12. Sharman, B. C. Developmental anatomy of the shoot of Zea mays L. Annals of Botany. 6 (22), 245-282 (1942).
  13. Johnston, R., et al. Transcriptomic analyses indicate that maize ligule development recapitulates gene expression patterns that occur during lateral organ initiation. The Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
  14. Sharman, B. C. Leaf and bud initiation in the Gramineae. Botanical Gazette. 106 (3), 269-289 (1945).
  15. Nelissen, H., et al. A local maximum in gibberellin levels regulates maize leaf growth by spatial control of cell division. Current Biology. 22 (13), 1183-1187 (2012).
  16. Itoh, J., et al. Rice plant development: From zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
  17. Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Iowa State University of Science and Technology. , (1986).
  18. Freeling, M., Walbot, V. The Maize Handbook. , Springer Science & Business Media. (2013).
  19. Freeling, M., Hake, S. Developmental genetics of mutants that specify knotted leaves in maize. Genetics. 111 (3), 617-634 (1985).
  20. Durbak, A. R., et al. Transport of boron by the tassel-less1 aquaporin is critical for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 26 (7), 2978-2995 (2014).
  21. Langdale, J. A., Lane, B., Freeling, M., Nelson, T. Cell lineage analysis of maize bundle sheath and mesophyll cells. Developmental Biology. 133 (1), 128-139 (1989).
  22. Bosabalidis, A. M., Evert, R. F., Russin, W. A. Ontogeny of the vascular bundles and contiguous tissues in the maize leaf blade. American Journal of Botany. 81 (6), 745-752 (1994).
  23. Junqueira, N. E. G., et al. Anatomy and ultrastructure of embryonic leaves of the C4 species Setaria viridis. Annals of Botany. 121 (6), 1163-1172 (2018).
  24. Robil, J. M., McSteen, P. Hormonal control of medial-lateral growth and vein formation in the maize leaf. New Phytologist. 238 (1), 125-141 (2023).
  25. Donnelly, P. M., Bonetta, D., Tsukaya, H., Dengler, R. E., Dengler, N. G. Cell cycling and cell enlargement in developing leaves of Arabidopsis. Developmental Biology. 215 (2), 407-419 (1999).
  26. Govindaraju, P., Verna, C., Zhu, T., Scarpella, E. Vein patterning by tissue-specific auxin transport. Development. 147 (13), (2020).
  27. Linh, N. M., Scarpella, E. Leaf vein patterning is regulated by the aperture of plasmodesmata intercellular channels. PLoS Biology. 20 (9), e3001781 (2022).
  28. Verna, C., Ravichandran, S. J., Sawchuk, M. G., Linh, N. M., Scarpella, E. Coordination of tissue cell polarity by auxin transport and signaling. eLife. 8, e51061 (2019).
  29. Sawchuk, M. G., Head, P., Donner, T. J., Scarpella, E. Time-lapse imaging of Arabidopsis leaf development shows dynamic patterns of procambium formation. New Phytologist. 176 (3), 560-571 (2007).
  30. Linh, N. M., Scarpella, E. Confocal imaging of developing leaves. Current Protocols. 2 (1), e349 (2022).
  31. Poethig, R. S., Szymkowiak, E. J. Clonal analysis of leaf development in maize. Maydica. 40, 67-76 (1995).
  32. Sprangers, K., Thys, S., van Dusschoten, D., Beemster, G. T. S. Gibberellin enhances the anisotropy of cell expansion in the growth zone of the maize leaf. Frontiers in Plant Science. 11, 1163 (2020).
  33. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 cofactors, BLH12 and BLH14, regulate internode patterning and vein anastomosis in maize. The Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  34. Schindelin, J., et al. FIJI: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Plant Care Protocols - Maize. The Donald Danforth Plant Science Center's Plant Growth Facility. , Available from: https://www.danforthcenter.org/our-work/core-facilities/plant-growth/ (2019).
  36. Mir, R., et al. A DII domain-based auxin reporter uncovers low auxin signaling during telophase and early G1. Plant Physiology. 173 (1), 863-871 (2017).
  37. DeBlasio, S. L., Sylvester, A. W., Jackson, D. Illuminating plant biology: Using fluorescent proteins for high-throughput analysis of protein localization and function in plants. Briefings in Functional Genomics. 9 (2), 129-138 (2010).
  38. Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: Generation and applications. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 535-543 (2013).
  39. Mohanty, A., et al. Advancing cell biology and functional genomics in maize using fluorescent protein-tagged lines. Plant Physiology. 149 (2), 601-605 (2009).
  40. Baker, R. F., et al. Sucrose transporter ZmSut1 expression and localization uncover new insights into sucrose phloem loading. Plant Physiology. 172 (3), 1876-1898 (2016).
  41. Gallavotti, A., Yang, Y., Schmidt, R. J., Jackson, D. The relationship between auxin transport and maize branching. Plant Physiology. 147 (4), 1913-1923 (2008).
  42. Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), 12 (2015).
  43. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: A cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  44. Geng, Y., Zhou, Y. Confocal live imaging of shoot apical meristems from different plant species. Journal of Visualized Experiments. (145), e59369 (2019).
  45. Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell Biology. 139, Elsevier. 203-223 (2017).
  46. Fodor, E., Ayaydin, F. Fluorescent probes and live imaging of plant cells. Advances in Plant Ecophysiology Techniques. , Springer. 241-251 (2018).
  47. Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. The Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
  48. Conklin, P. A., Johnston, R., Conlon, B. R., Shimizu, R., Scanlon, M. J. Plant homeodomain proteins provide a mechanism for how leaves grow wide. Development. 147 (20), (2020).
  49. Shaw, S. L. Imaging the live plant cell. The Plant Journal. 45 (4), 573-598 (2006).
  50. Klaus, A. V., Schawaroch, V., Frischmann, K. J. Confocal imaging and three-dimensional visualization of thick autofluorescent specimens. Methods in Molecular Biology. 1075, 213-225 (2014).
  51. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Extended depth-of-focus for multi-channel microscopy images: a complex wavelet approach. 2004 2nd IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: Nano to Macro (IEEE Cat No. 04EX821). IEEE. , 660-663 (2004).
  52. Extended Depth of Field. EPFL Biomedical Imaging Group. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2022).
  53. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  54. Phillips, K. A., et al. vanishing tassel2 encodes a grass-specific tryptophan aminotransferase required for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 23 (2), 550-566 (2011).
  55. Robil, J. M., et al. GrasVIQ: An image analysis framework for automatically quantifying vein number and morphology in grass leaves. The Plant Journal. 107 (2), 629-648 (2021).
  56. Helliwell, C. A., Chandler, P. M., Poole, A., Dennis, E. S., Peacock, W. J. The CYP88A cytochrome P450, ent-kaurenoic acid oxidase, catalyzes three steps of the gibberellin biosynthesis pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 2065-2070 (2001).
  57. Gutierrez, R., Quiroz-Figueroa, F., Vazquez-Ramos, J. M. Maize cyclin D2 expression, associated kinase activity and effect of phytohormones during germination. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 166-173 (2005).
  58. Atkinson, J. A., Wells, D. M. An updated protocol for high throughput plant tissue sectioning. Frontiers in Plant Science. 8, 1721 (2017).
  59. Lux, A., Morita, S., Abe, J., Ito, K. An improved method for clearing and staining free-hand sections and whole-mount samples. Annals of Botany. 96 (6), 989-996 (2005).
  60. Heriche, M., Arnould, C., Wipf, D., Courty, P. E. Imaging plant tissues: Advances and promising clearing practices. Trends in Plant Science. 27 (6), 601-615 (2022).
  61. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  62. Chuck, G., Muszynski, M., Kellogg, E., Hake, S., Schmidt, R. J. The control of spikelet meristem identity by the branched silkless1 gene in maize. Science. 298 (5596), 1238-1241 (2002).
  63. Tran, T. M., et al. An optimized whole-mount immunofluorescence method for shoot apices. Current Protocols. 1 (4), e101 (2021).
  64. O'Connor, D. L. PINs Lost and PINs Gained: Auxin-Transport Mediated Patterning in the Grasses. University of California, Berkeley. , Doctoral Dissertation (2012).
  65. Sharman, B. C., Hitch, P. A. Initiation of procambial strands in leaf primordia of bread wheat, Triticum aestivum L. Annals of Botany. 31 (2), 229-243 (1967).
  66. Serra, L., Tan, S., Robinson, S., Langdale, J. A. Flip-flap: A simple dual-view imaging method for 3D reconstruction of thick plant samples. Plants. 11 (4), 506 (2022).
  67. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 199 תירס (Zea mays) פרימורדיה של עלי דשא אנטומיה והתפתחות עלים דימות פלואורסצנטי וקונפוקלי חתך רוחבי הר שלם ImageJ/FIJI הדמיה תאית
שיטות משופרות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות לא מגולגלות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robil, J. M., Cortez, C. D. T.,… More

Robil, J. M., Cortez, C. D. T., Villafuerte, C. M. R., Dela Peña, E. D. C., De Leon, D. O., Rioja, R. J. R., McSteen, P. Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (199), e65239, doi:10.3791/65239 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter