Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Métodos aprimorados para preparar seções transversais e montagens inteiras não enroladas de primordia de folhas de milho para fluorescência e imagens confocais

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65239
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Department of Biology, School of Science and Engineering, Ateneo de Manila University, 2Division of Biological Sciences, Interdisciplinary Plant Group, and Missouri Maize Center, University of Missouri

Summary

Os primórdios das folhas de milho são profundamente embainhados e enrolados, tornando-os difíceis de estudar. Aqui, apresentamos métodos para preparar cortes transversais e montagens inteiras de primórdios foliares de milho para fluorescência e imagens confocais.

Abstract

No milho (Zea mays) e em outras gramíneas (Poaceae), os primórdios foliares são profundamente embainhados e enrolados dentro da espiral foliar, dificultando o estudo do desenvolvimento foliar inicial. Aqui, descrevemos métodos para preparar cortes transversais e montagens inteiras não enroladas de primórdios foliares de milho para fluorescência e imagens confocais. O primeiro método utiliza um decapador de arame para remover as porções superiores das folhas mais velhas, expondo a ponta do primórdio foliar e permitindo sua medição para uma amostragem mais precisa da seção transversal. O segundo método usa fita nano transparente de dupla face para desenrolar e montar primórdios de folhas inteiras para geração de imagens. Mostramos a utilidade dos dois métodos na visualização e análise de repórteres de proteínas fluorescentes em milho. Estes métodos fornecem uma solução para os desafios apresentados pela morfologia distinta dos primórdios foliares do milho e serão úteis para visualizar e quantificar características anatômicas e de desenvolvimento foliar em milho e outras espécies de gramíneas.

Introduction

As culturas de gramíneas são uma importante fonte de alimento e biocombustível para a população mundial1, e a melhoria da anatomia foliar tem o potencial de aumentar sua produtividade 2,3. No entanto, nosso entendimento atual de como a anatomia foliar é regulada em gramíneas é limitado4 e requer a análise dos primórdios foliares, uma vez que muitas características anatômicas e fisiológicas da folha são predeterminadas no início do desenvolvimento 5,6,7. Técnicas de imagem celular, como fluorescência e imagem confocal, são indispensáveis para o estudo da anatomia foliar e características celulares de gramíneas, mas essas técnicas são difíceis de aplicar aos primórdios foliares de gramíneas porque eles são profundamente embainhados e enrolados dentro da espiral foliar. Abordamos essa questão desenvolvendo métodos de preparação de cortes transversais e montagens foliares inteiras não enroladas para fluorescência e análise confocal de primórdios foliares de milho, um sistema modelo para o estudo da anatomia e desenvolvimento foliar de gramíneas 2,8.

A folha de milho, como todas as folhas de capim, consiste de uma lâmina em forma de alça com uma bainha que envolve o caule e a parte aérea em desenvolvimento 9,10,11,12,13. As folhas desenvolvem-se a partir do meristema apical da parte aérea (SAM) em um padrão distichoso, onde cada nova folha se inicia na posição oposta à folha anterior, resultando em duas fileiras de folhas ao longo do eixo vertical (Figura 1A)14 . O estágio de desenvolvimento de cada primórdio foliar é identificado pela sua posição em relação ao SAM, sendo o primórdio mais próximo designado como plastochron1 (P1) e os primórdios seguintes designados como P2, P3 e assim por diante (Figura 1B,C)2. Durante o desenvolvimento (Figura 1D), o primórdio foliar aparece primeiramente como um contraforte em forma de crescente ao redor da base do SAM (P1), e depois cresce em um primórdio em forma de capuz que se estende sobre o meristema (P2)9,10,11. As margens basais do capuz então se expandem lateralmente e se sobrepõem à medida que a ponta cresce para cima, formando um primórdio em forma de cone (P3-P5)10. O primórdio então cresce rapidamente em comprimento, e o limite bainha-lâmina na base torna-se mais proeminente com a formação da lígula, a projeção em forma de franja no lado adaxial da folha (P6/P7). Finalmente, a folha se desenrola ao emergir da espiral durante o crescimento em estado estacionário, no qual as células em divisão ficam restritas dentro da pequena região basal da lâmina, formando um gradiente com células em expansão e diferenciação ao longo do eixo proximal-distal (P7/P8)15. O ápice da parte aérea de uma plântula de milho contém múltiplos primórdios em diferentes estádios de desenvolvimento, tornando-se um excelente modelo para o estudo do desenvolvimento foliar8.

A análise acurada do desenvolvimento foliar inicial requer estadiamento ou o uso de critérios padronizados para definir estágios distintos de desenvolvimento do primórdio em relação a outros parâmetros de crescimento ou morfológicos. Como os primórdios foliares estão ocultos dentro da parte aérea da gramínea, os pesquisadores normalmente utilizam parâmetros como a idade da planta ou o tamanho das folhas emergentes como preditores para os estágios e tamanhos dos primórdios foliares 9,16. No milho, a idade cronológica da planta é determinada pelo número de dias após o plantio ou pela germinação (DAP/DAG)17,18. O estágio vegetativo (estágio V) é determinado pela folha mais superior com colar visível, uma linha pálida no lado abaxial entre a lâmina e a bainha que corresponde à posição da lígula e aurículas, um par de regiões em forma de cunha na base da lâmina (Figura 1A,B)17,19 . Entre 20 e 25 DAG, o SAM transita para um meristema de inflorescência e deixa de produzir novas folhas20. As taxas de crescimento dos primórdios foliares do milho podem variar dependendo do ambiente e do genótipo da planta. Por esta razão, a idade da planta e o tamanho das folhas emergentes não podem prever com precisão os tamanhos dos primórdios foliares; no entanto, o uso desses parâmetros pode ajudar a prever a faixa de estágios e tamanhos dos primórdios para fins experimentais.

A análise de cortes transversais é um método popular para examinar a anatomia foliar e o desenvolvimento em milho e outras gramíneas, pois permite a amostragem de múltiplos plastócronos em uma única seção ao longo da parte aérea21,22,23. Este método também é conveniente para imagens celulares de amostras frescas, pois as folhas circundantes servem como um andaime que mantém os primórdios foliares no lugar durante a seccionagem e montagem24. No entanto, uma desvantagem deste método é que pode ser difícil localizar precisamente o plastocrono alvo e a região dentro do primórdio ao seccionar a partir de um broto intacto. Além disso, como o crescimento foliar varia entre os plastócronos e ao longo do eixo proximal-distal2,5, uma amostragem imprecisa poderia resultar em uma interpretação incorreta do estágio de desenvolvimento e da região do primórdio em uma determinada seção. Portanto, o desenvolvimento de um método para amostragem precisa de cortes transversais é fundamental para garantir a exatidão e a reprodutibilidade das análises anatômicas e de desenvolvimento dos primórdios foliares das gramíneas.

A análise da montagem foliar inteira permite a investigação abrangente e integrativa de processos teciduais e celulares que ocorrem em escala de órgãos inteiros, como crescimentoproliferativo25 e padronização venosa26,27,28. O método fornece uma visão paradérmica da folha, permitindo a descoberta de processos e padrões distintos que, de outra forma, seriam difíceis de detectar usando a análise de cortes transversais24,27. Ao contrário de Arabidopsis, onde já existem métodos estabelecidos para obtenção de imagens de montagens de folhas inteiras29,30, atualmente não há um método padrão para obtenção de imagens de montagens de folhas inteiras não enroladas em gramíneas. Um protocolo prévio para desenrolar primórdios isolados de folhas de milho envolveu materiais incomuns e não foi adequado para imagens celulares31. Técnicas avançadas de imagem, como a tomografia computadorizada (TC) e a ressonância magnética (RM), podem adquirir informações anatômicas 3D sem isolar e desenrolar os primórdios 11,32,33, mas são caras e requerem equipamentos especializados. O desenvolvimento de uma técnica para superar as restrições impostas pela morfologia laminada e cônica dos primórdios foliares em milho e outras gramíneas avançaria nas investigações sobre suas características anatômicas e de desenvolvimento.

Aqui, apresentamos métodos para preparar cortes transversais e montagens inteiras de primórdios foliares de milho para fluorescência e imagens confocais. Utilizamos esses métodos para quantificar o número de nervuras e mapear a distribuição hormonal espaço-temporal nos primórdios foliares do milho com proteínas fluorescentes (FPs)24. O primeiro método envolve a remoção da porção superior de folhas mais velhas de mudas de milho com um decapador de arame (Figura 1E). Ao expor a ponta do primórdio (P5-P7), torna-se possível determinar seu comprimento sem ter que remover completamente as folhas mais antigas ao redor, permitindo assim um corte fácil e preciso. O segundo método envolve o desenrolar e montar primórdios de folhas inteiras (P3-P7) com nanofita transparente de dupla face (Figura 1F). Esses métodos são adequados para visualizar vários FPs24, mas precisam de otimização para o uso de corantes fluorescentes e reagentes de limpeza. Além disso, descrevemos alguns procedimentos para achatar z-stacks, costurar imagens e mesclar canais no ImageJ/FIJI34, que se aplicam às imagens produzidas pelos dois métodos. Esses métodos são úteis para fluorescência de rotina ou imagens confocais de folhas de milho, mas também podem ser adaptados para outras espécies de gramíneas modelo, como arroz, Setaria e Brachypodium.

Figure 1
Figura 1: Organização e morfologia dos primórdios foliares do milho e visão geral dos métodos . (A) Representação esquemática de uma plântula de milho. O milho tem uma filotaxia distichosa, com a nova folha iniciando na posição oposta à folha anterior. O número de folhas indica a ordem cronológica em que as folhas emergiram da germinação (i.e., primeira folha, L1; segunda folha, L2; terceira folha, L3; etc.). Cada folha possui uma lâmina distal e uma bainha basal delineada por um colar que corresponde à lígula e aurícula. A folha mais superior com o colar visível denota o estágio vegetativo. A muda neste exemplo está no estágio V2, com o colar L2 (ponta de seta) visível. O ícone da tesoura indica o local no mesocótilo (me) onde a muda deve ser cortada para ser coletada. (B) Representação esquemática da parte aérea dissecada mostrando L1 a L4 isolados, com os primórdios foliares L5 a L9 mostrados como imagem ampliada em (C). O número de plastocrono indica a posição do primórdio em relação ao SAM, com o primórdio foliar mais jovem (P1) mais próximo do SAM e o primórdio foliar mais velho (P2, P3, P4 e assim por diante) sucessivamente mais distante2. (D) Representação esquemática da morfologia dos primórdios foliares do milho de P1 a P5. (E) Visão geral esquemática do método de análise de secção transversal dos primórdios foliares do milho. (1) Corte as folhas mais velhas com um decapante de arame. (2) Meça o primórdio e corte a parte aérea. (3) Monte a seção em uma lâmina para aquisição de imagens e processamento (4, 5). (F) Visão geral esquemática do método de análise de montagem total dos primórdios foliares do milho. (1) Retire as folhas circundantes para extrair o primórdio. (2) Corte e desenrole o primórdio na nanofita. (3) Montar a amostra para aquisição de imagens e processamento (4, 5). Abreviações: L = folha; bl = lâmina; sh = bainha; co = colarinho; me = mesocótilo; V = vegetativo; P = plastocrono; SAM = meristema apical da parte aérea. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. Estadiamento do desenvolvimento foliar do milho e delineamento do experimento

  1. Cultivo das plantas e estadiamento do desenvolvimento foliar
    1. Determinar a idade e o estádio de desenvolvimento das plantas a serem utilizadas no experimento e realizar um estadiamento detalhado do desenvolvimento foliar.
      OBS: Recomenda-se que o estadiamento seja realizado em plantas com o mesmo background genético das linhagens mutantes ou transgênicas que serão utilizadas nos experimentos. O SAM deixa de produzir novas folhas entre 20 e 25 DAG, dependendo do background genético e das condições de crescimento. Por esta razão, os métodos aqui descritos são ideais para mudas de milho com idade entre 7 e 14 DAG.
    2. Cultivar as plantas de milho em casa de vegetação ou câmara de crescimento seguindo um protocolo adequado de cuidados com a planta35.
    3. Coletar as plantas na idade desejada ou no estágio V com uma pequena faca ou tesoura, cortando o mesocótilo, que é o caule abaixo da superfície do solo (Figura 1A). Insira cuidadosamente a ferramenta de corte no solo ao lado da muda e deslize-a até a base em um ângulo de 45° para cortar o mesocótilo.
    4. Retire a muda do solo e remova a poeira de qualquer sujeira remanescente ou partículas de solo que possam estar agarradas à planta. Retire manualmente o coleóptilo, bainha protetora que cobre o broto emergente em mudas jovens.
    5. Para cada planta, registre o estágio V, o número de folhas e o comprimento da última folha que emerge da espiral. Tire fotos das plantas para referência futura.
    6. Retire as folhas mais antigas, uma a uma. Para isso, segure a planta pelos restos do mesocótilo ou caule, retire cada folha da base da bainha e desfralde suavemente a bainha de forma circular com uma sonda dentária (Figura 1B).
      Observação : consulte a etapa 2.1 para obter um método rápido para remover as folhas circundantes.
    7. Sob um microscópio estéreo com cerca de 2x de aumento, disseque cuidadosamente o resto do ápice da parte aérea em lenços umedecidos para evitar que a amostra seque. Excisar suavemente e desenrolar cada primórdio foliar com uma sonda dentária com uma agulha dobrada ou um par de pinças finas até que o SAM, P1 e P2 estejam visíveis (Figura 1D). Registre a aparência e a medição de cada plastocrono.
      NOTA: Veja um exemplo de estadiamento do desenvolvimento foliar em mudas de milho no Arquivo Suplementar 1.
  2. Planejando o experimento
    NOTA: Planejar o experimento cuidadosamente pode melhorar a eficiência. Por exemplo, na análise de cortes transversais, determinar o local aproximado de corte ao obter imagens de plastochrons ou regiões específicas pode reduzir o tempo de dissecção. A Figura 2 mostra um exemplo de amostragem padronizada. Além disso, a otimização dos parâmetros de imagem com base nas propriedades dos PFs ou sondas fluorescentes pode melhorar a eficiência dos experimentos.
    1. Utilize as informações de estadiamento como um guia para focar o experimento em plastochrons específicos, regiões do primórdio e tecidos. Use as PFs ou outras sondas fluorescentes de interesse para seguir as seções 2 e/ou 3 abaixo em algumas amostras.
      NOTA: Ver as existências de sementes disponíveis no marcador FP de milho36-42 em https://www.maizegdb.org/data_center/stock.
    2. Determine os parâmetros ideais de aquisição de imagem para cada repórter ou sonda FP, incluindo o detector ou filtro apropriado, comprimentos de onda de excitação e emissão, tamanho do orifício e outras configurações. Salve as configurações para reproduzir as condições de trabalho de cada um dos experimentos.
      NOTA: Veja Linh e Scarpella30 para algumas diretrizes técnicas para microscopia confocal de varredura a laser de folhas em desenvolvimento.
    3. Planeje o tempo de imagem com base na meia-vida e outras propriedades do repórter FP43.
      NOTA: O tempo entre a dissecção e a imagem também deve ser considerado no planejamento de um experimento, pois amostras de plantas frescas são submetidas à dessecação e alterações celulares durante esse período.

Figure 2
Figura 2: Esquema amostral para análise de secção transversal de primórdios foliares de milho. (A, esquerda) Parte aérea proximal de uma plântula de milho aos 7 DAG, mostrando uma quarta folha exposta (L4) em P7. As linhas quebradas indicam os sete pontos de amostragem ao longo do primórdio, de 0,5 mm a 10 mm. (A, à direita) Representação esquemática dos primórdios foliares, com o tamanho e a posição projetados de cada plastocrono: P7 (branco); P6 (magenta); P5 (azul); P4 (verde); e P3 até o SAM (amarelo). (B-H) Imagens de fluorescência de cortes transversais representando os pontos de amostragem mostrados em A de 10 mm (B) a 0,5 mm (H). Os primórdios são pseudocoloridos de acordo com o esquema de cores do plastocrono em (A). Os cortes foram fotografados com um microscópio de epifluorescência usando um filtro UV de emissão passa-longa para autofluorescência. Barra de escala = 200 μm (B-H). Esta figura foi modificada e reproduzida com permissão de Robil e McSteen24. Abreviações: DAG = dias após a germinação; P = plastocrono; SAM = meristema apical da parte aérea; † = bainha foliar ou pré-lígula propriamente dita; * = meristema apical da parte aérea; ** = caule. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Imagem de cortes transversais de primórdios foliares de milho

  1. Descascar folhas mais velhas ao redor e medir o primórdio foliar
    1. Recolher a plântula cortando-a cuidadosamente no mesocótilo abaixo da superfície do solo com uma pequena faca ou tesoura, conforme descrito nos passos 1.1.3-1.1.4 (figura 1A).
    2. Determine o tamanho correto do furo do decapador de arame a ser usado e onde o corte será feito ao longo do broto. Certifique-se de que o orifício é grande o suficiente para caber no primórdio alvo.
    3. Comece a cortar na parte mais distal do broto e trabalhe gradualmente em direção à base até que a ponta do primórdio fique exposta.
    4. Para fazer o corte, segure o decapante de arame com as mandíbulas voltadas para o rebento. Posicione o broto no orifício selecionado e aperte as alças do stripper juntas para cortar a espiral da folha.
      NOTA: Para evitar cortar acidentalmente o primórdio alvo, alinhe cuidadosamente o centro do rebento com o orifício no decapante de arame. Para plantas maiores, recomenda-se remover manualmente algumas das folhas circundantes à mão antes de usar o stripper.
      CUIDADO: Os decapantes de arame têm mandíbulas afiadas que podem causar cortes ou outros ferimentos se não forem usados com cuidado.
    5. Enquanto continua a apertar as alças juntas, deslize o stripper para longe do broto para aparar a parte superior das folhas. Certifique-se de que a região alvo no primórdio permaneça revestida pelas folhas circundantes (Figura suplementar S1C,D).
      NOTA: Após o corte das folhas superiores, a parte aérea é deixada com uma ponta de primórdio exposta (P5, P6 ou P7, dependendo da posição do corte e do tamanho do orifício do decapante utilizado; Figura 1E). Este primórdio servirá de referência para estimar o tamanho e o estágio dos primórdios mais jovens. O P6 é a referência mais prática para uso em mudas de milho devido à sua faixa de tamanho e morfologia em forma de alfinete.
    6. Use uma régua para medir o comprimento da ponta do primórdio até a base do broto. Registre a medição.
      NOTA: O comprimento do primórdio será ligeiramente superestimado, pois existem alguns milímetros de haste na base dos primórdios (Figura 2A).
  2. Secção à mão livre e obtenção de imagens do primórdio foliar
    1. Sob um microscópio estéreo com cerca de 0,8x de ampliação, mantenha a parte aérea estável em uma superfície lisa, como uma placa de corte de vidro ou outro material resistente a riscos. Use uma lâmina de barbear ou bisturi para cortar seções finas (0,25-0,8 mm) do broto nos pontos desejados ao longo do comprimento do primórdio.
    2. Faça um corte inicial ligeiramente acima da região alvo para descartar a porção distal da parte aérea e, em seguida, obtenha seções finas ao redor da região alvo. Para fazer cortes limpos, segure a lâmina perpendicularmente ao broto e deslize-a para dentro com um movimento suave e uniforme.
      NOTA: Pode haver alguns milímetros de margem de secção para primórdios maiores (P6 ou P7). No entanto, para primórdios menores (P5 e anteriores), 1 mm pode fazer uma diferença significativa na amostragem, pois esses primórdios são empilhados dentro dos primeiros milímetros da base da parte aérea (ver Figura 2A, F-H). Recomenda-se o uso de uma lâmina de barbear de dois gumes para seccionamento mais fino.
      CUIDADO: Tenha cuidado ao usar lâminas de barbear e bisturis para evitar cortes acidentais ou ferimentos.
    3. Substitua a lâmina de barbear regularmente, uma vez que as bainhas das folhas podem facilmente entorpecer a lâmina. Cubra a parte aérea com lenços umedecidos após cada rodada de seccionamento para evitar que a amostra seque.
    4. Monte a seção da folha em uma lâmina de vidro limpa (75 mm x 25 mm), use uma pipeta para aplicar uma gota de água (ou 50% de glicerol) diretamente na seção e coloque uma lamínula (22 mm x 22 mm) por cima.
    5. Se estiver usando um corante fluorescente, aplique a solução de corante na seção, coloque uma lamínula por cima e incube-a conforme necessário.
      NOTA: Dependendo do tipo de corante, etapas adicionais para processar as seções da folha podem ser necessárias antes de prosseguir para a próxima etapa. Essas referências44,45,46,47 fornecem detalhes gerais e usos de corantes fluorescentes em imagens de células vegetais. Um corante fluorescente corante corante de núcleo, 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU), tem sido usado efetivamente em seções transversais de primórdios foliares de milho48. Por outro lado, corantes corantes de membrana plasmática, como Fei Mao 4-64 (FM 4-64) e iodeto de propídio, não produzem resultados satisfatórios (Figura 3A-D).
    6. Coloque a lâmina no palco de um microscópio confocal de varredura a laser de epifluorescência ou confocal e ajuste o foco e as configurações conforme necessário para visualizar o fluoróforo30. Consulte a Tabela 1 para as configurações de iluminação e aquisição de imagens usadas para linhas de repórter FP de milho selecionadas.
      Observação : seções grossas podem produzir altos níveis de autofluorescência de fundo. Considere algumas estratégias de imagem e preparação de espécimes que podem ajudar a mitigar esse problema30,49 (ver Tabela 2).
      CUIDADO: Tenha cuidado e use óculos de proteção ao trabalhar com fontes de luz e lasers poderosos para reduzir o risco de danos oculares.
    7. Imagem através da seção foliar em diferentes ampliações e canais de detecção (incluindo a iluminação de campo brilhante)30. Use aumento de 4x para obter imagens de todo o corte transversal e aumento de 20x ou 40x para obter imagens de tecidos específicos. Reduzir o tempo de exposição em aumentos mais altos para imagens de epifluorescência para proteger as amostras do fotoclareamento rápido (ver Tabela 1).
    8. Capture imagens de toda a seção ou regiões específicas de interesse (ROIs). Se necessário, adquira uma pilha z, que é uma série de imagens capturadas em diferentes profundidades focais30.
    9. Para adquirir uma pilha z, primeiro determine as posições superior e inferior no espécime e, em seguida, o número de seções ópticas que devem ser capturadas entre essas posições. Menos seções ópticas resultam em um tamanho z-step maior, que é a distância entre cada seção. Dependendo das propriedades do PF e da ampliação utilizada, capture de três a 25 seções ópticas com tamanhos z-step entre 1 e 12 μm para obter imagens de cortes transversais de primórdios foliares de milho.
      NOTA: Para achatar a pilha z, use uma técnica de renderização de volume apropriada50 que pode ser realizada através do software do microscópio ou usando o ImageJ/FIJI34 (consulte as etapas 4.1 e 4.2).
    10. Salve todos os arquivos de imagem e seus metadados associados, se disponíveis.

Tabela 1: Configurações de iluminação e aquisição de imagens usadas para fluorescência e imagens confocais de repórteres selecionados de FP de milho. Abreviações: FP = proteína fluorescente; TRITC = tetrametilrodamina; FITC = isotiocianato de fluoresceína; WLL = laser de luz branca; Íon ar = laser de íons argônio; HyD = detector híbrido; AU = Unidade arejada; Hz = Hertz, linha de varredura por segundo. Clique aqui para baixar esta tabela.

3. Imagem de montagens inteiras não enroladas de primórdios de folhas de milho

  1. Dissecar os primórdios e preparar a lâmina de vidro com nanofita adesiva
    1. Recolher a plântula cortando-a cuidadosamente no mesocótilo abaixo da superfície do solo com uma pequena faca ou uma tesoura, conforme descrito nos passos 1.1.3-1.1.4 (Figura 1A).
    2. Prepare a lâmina de vidro (75 mm x 25 mm) com a nanofita transparente de dupla face (Figura Suplementar S1H) antes de dissecar a planta. Corte um pedaço retangular de nano fita e cole-o no centro de uma lâmina de vidro limpa. Não remova a película plástica protetora na parte superior da fita.
      NOTA: Determine o tamanho da fita a ser usada de acordo com o tamanho das amostras a serem obtidas (consulte exemplos de amostras superdimensionadas na Figura Suplementar S1I,J). A nanofita está disponível em acrílico ou poliuretano em gel. Ambos os tipos são efetivos para fluorescência e imagem confocal24. Para evitar a descoloração da fita, proteja-a da exposição prolongada à luz, armazenando-a em um recipiente escuro.
    3. Comece a dissecar a parte aérea removendo a porção superior das folhas mais velhas com um decapante de arame, conforme descrito na etapa 2.1.
    4. Segure o broto pelo mesocótilo e remova cuidadosamente as folhas circundantes com uma sonda dentária para extrair os primórdios. Para fazer isso, retire as folhas da base do broto e desfralde-as uma de cada vez até que o primórdio de interesse seja exposto.
    5. Alternativamente, use o decapante de arame para extrair diretamente os primórdios foliares, fazendo um corte na região basal da parte aérea (Figura Suplementar S1E-G).
      NOTA: Este método acarreta um risco maior de encaixe dos primórdios.
  2. Montagem e geração de imagens do primórdio.
    1. Remova a película protetora da fita. Coloque o primórdio exposto na fita. Utilizar lâmina de barbear para cortar o primórdio na base, descartando-se a haste basal e o hipocótilo (Figura 1F).
    2. Desenrolar o primórdio usando uma sonda dentária com uma agulha dobrada (diâmetro da ponta de 0,25-0,6 mm). Use uma microssonda (diâmetro da ponta de 0,15-0,2 mm) para primórdios menores que 3 mm (P3 a P4 inicial).
    3. Posicione a ponta da agulha paralela à superfície e desfralde a margem basal externa, pressionando-a suavemente contra a fita.
    4. Para um desenrolar mais suave, lubrifique a superfície interna (adaxial) da folha mergulhando a ponta da agulha em glicerol a 100%.
    5. Com a margem externa aderida à fita, alinhe a ponta da agulha paralelamente ao longo eixo da folha. Deslize suavemente a agulha para os lados para desenrolar e achatar a folha sobre a fita (Figura 1F).
      NOTA: Quebrar ou danificar a folha durante o desenrolar é comum, especialmente em primórdios maiores com uma nervura central robusta (ver Figura 3E-G). Desenrolar vigorosamente a folha pode machucar sua superfície e produzir artefatos durante a aquisição de imagens (Figura 3H). Consulte a Tabela 2 e a discussão para soluções recomendadas para esses problemas.
    6. Aplique uma gota de água no primórdio não enrolado. Coloque imediatamente uma tampa em cima da gota de água e do primórdio. Pressione suavemente as bordas da tampa para que elas grudem na fita.
      OBS: Recomenda-se o uso de lamínulas retangulares grandes (50 mm x 24 mm ou 60 mm x 24 mm) com áreas extras para aderência à fita. Minimizar a formação de bolhas de ar, que podem distorcer a folha e causar refração irregular da luz (ver Figura 3I-K). Certifique-se de que a lamínula adere completamente à fita, pois as margens do primórdio montado podem voltar a rolar sob uma lamínula frouxamente aderida (ver Figura 3L).
    7. Coloque a lâmina no palco de uma epifluorescência (ver Figura Suplementar S1K) ou microscópio confocal de varredura a laser e ajuste o foco e as configurações conforme necessário para visualizar o fluoróforo30. Consulte a Tabela 1 para as configurações de iluminação e aquisição de imagens usadas para as linhas de repórter FP de milho selecionadas.
    8. Fotografe a folha inteira ou uma ROI específica através de vários canais de detecção30. Para obter imagens de toda a folha, capture manualmente imagens em mosaico da folha ou use a operação de mosaico do microscópio em baixa magnificação (4x ou 10x).
      NOTA: Mesmo na menor ampliação, os primórdios das folhas de milho podem ser muito grandes para obter imagens com um microscópio de varredura a laser confocal ou epifluorescência, resultando em tempos de imagem mais longos que podem resultar em fotobranqueamento (ver Figura 3M) ou aumento da autofluorescência de fundo. Portanto, recomenda-se o uso de um microscópio estéreo de fluorescência para obter imagens de amostras de folhas inteiras maiores que 5 mm.
    9. Para imagens confocais, será necessária a obtenção de pilhas z que abranjam a espessura da folha (ver passo 2.2.9).
    10. Salve todos os arquivos de imagem e seus metadados associados, se disponíveis.

Tabela 2: Solução de problemas comuns em cortes transversais de imagem e montagens inteiras de primórdios foliares de milho. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figure 3
Figura 3: Secção transversal subóptima e preparação de montagem total dos primórdios foliares do milho. (A-D) Imagens confocais representativas de seções transversais de primórdios foliares com um marcador de membrana plasmática, PIP2-1-CFP (A), e um corante fluorescente ligante à membrana plasmática, FM 4-64 (B), com imagens de campo claro correspondentes (C,D). Quando comparado ao PIP2-1-CFP, o FM 4-64 exibe visualização subótima dos contornos celulares. (E-M) Imagens representativas de fluorescência de montagens inteiras de primórdios foliares mostrando a presença de rasgos (E-G), superfícies machucadas† (H), bolhas de ar* (I-K), margens revertidas (L) e regiões fotobranqueadas‡ (M). Os primórdios foliares expressam DII-Vênus (E-G), GAR2-YFP (H-J), mDII-Vênus (K), PIN1a-YFP (L) e DR5-RFP (M). Barra de escala = 200 μm (A-D); 500 μm (E-M). A Figura 3A foi modificada e reproduzida com permissão de Robil e McSteen24, enquanto a Figura 5B-M são dados não publicados dos autores. Abreviações: P = plastochron; YFP = proteína fluorescente amarela; RFP = proteína fluorescente vermelha; CFP = proteína fluorescente ciano; PIP2-1-CFP = p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP; DII-Vênus = pZmUbi:DII:YFP-NLS; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Vênus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; BF = campo claro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Processamento das imagens usando ImageJ/FIJI

  1. Achatamento de z-stacks usando projeção de intensidade máxima (MIP)
    1. Inicie o ImageJ/FIJI e abra a pilha de imagens ou crie uma nova pilha a partir de várias imagens separadas selecionando Imagem | Pilhas | Imagens para empilhar no menu.
    2. Selecione a pilha de imagens. No menu, selecione Imagem | Pilhas | Projeto Z.... Na caixa de diálogo Projeto Z, escolha Intensidade máxima no menu suspenso Tipo de projeção . Clique em OK para criar a projeção z de intensidade máxima.
      NOTA: A imagem achatada é uma projeção 2D dos pixels com a maior intensidade nas pilhas z50. Este método é adequado para visualizar o fluoróforo, mas não as características anatômicas em imagens de campo claro de cortes transversais espessos e montagens de folhas inteiras.
    3. Salve a imagem como TIFF (Tagged Image File Format) selecionando Arquivo | Salvar como | Tiff. Insira um nome para o arquivo e clique em Salvar.
      NOTA: Recomenda-se usar TIFF para armazenar imagens de fluorescência e confocais, pois ele mantém a qualidade e os detalhes quando a imagem é salva.
  2. Achatando z-stacks usando o plugin Extended Depth of Field (EDF)51
    1. Instale o plugin EDF52. Baixe o arquivo Extended_Depth_Field.jar (versão 17.05.2021) do http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ e coloque-o na pasta "plugins" do ImageJ/FIJI.
    2. Inicie o ImageJ/FIJI e abra a pilha de imagens ou crie uma nova pilha a partir de várias imagens separadas selecionando Imagem | Pilhas | Imagens para empilhar no menu.
    3. Selecione a pilha de imagens. No menu, selecione Plugins | Profundidade de campo estendida | Modo Fácil EDF. Na caixa de diálogo Profundidade de Campo Estendida , use os controles deslizantes em Velocidade/Qualidade para definir a qualidade e a velocidade de processamento desejadas e o reg Mapa de altura para definir o nível de suavidade da topografia. Clique em Executar para criar a imagem reconstruída.
      NOTA: EDF combina a pilha em uma imagem 2D nítida e composta, projetando o melhor foco51. Essa técnica é útil para superar a profundidade limitada de foco e é adequada para reconstruir imagens de campo brilhante de seções transversais espessas ou montagens de folhas inteiras. Tenha cuidado ao aplicar este filtro para visualizar o fluoróforo porque, ao contrário do MIP, o EDF ajusta o contraste da imagem, afetando a intensidade do pixel.
    4. Salve a imagem como um arquivo TIFF selecionando Arquivo | Salvar como | Tiff. Insira um nome para o arquivo e clique em Salvar.
  3. Costurando imagens usando o plugin Grid/Collection Stitching53
    1. Salve a coleção de imagens ou pilhas de imagens a serem costuradas em um único diretório.
    2. Inicie o ImageJ/FIJI e selecione Plugins | Costura | Costura de grade/coleção no menu. Na caixa de diálogo Costura de Grade/Coleção, escolha Posição desconhecida no menu suspenso Tipo e, em seguida, Todos os arquivos no diretório na Ordem. Clique em OK.
    3. Na caixa de diálogo Costura de grade: posição desconhecida, Todos os arquivos no diretório, especifique o local das imagens digitando ou colando o caminho do diretório no campo de texto Diretório ou clicando em Procurar... para localizar o diretório. Clique em OK para iniciar o processo de costura.
      NOTA: A opção Posição desconhecida no plug-in Grid/Collection Stitching reconstrói uma imagem composta a partir de um conjunto de imagens contíguas analisando suas regiões sobrepostas. Portanto, essa opção é útil para costurar mosaicos de imagens de seções transversais ou montagens de folhas inteiras que não são obtidas usando uma operação de varredura de azulejos.
    4. Quando a costura terminar, uma nova janela aparecerá com a imagem costurada. Salve a imagem como um arquivo TIFF selecionando Arquivo | Salvar como | Tiff. Insira um nome para o arquivo e clique em Salvar.
      NOTA: A costura de grandes montagens de imagens 2D e 3D também pode ser realizada usando comandos de reconstrução de imagem no software do microscópio ou através das Opções de Importação de Bioformatos no ImageJ/FIJI.
  4. Combinando vários canais usando o comando Mesclar canais
    1. Inicie o ImageJ/FIJI e abra as imagens ou pilhas de imagens a serem mescladas.
      Observação : pilhas de imagem podem ser niveladas primeiro usando as etapas 4.1 ou 4.2. A MIP é geralmente recomendada para achatar canais de fluoróforos, enquanto a EDF é mais adequada para achatar canais de campo claro ou outros canais com profundidade de foco variável.
    2. Ajuste o brilho e o contraste das imagens com Imagem | Ajustar | Brilho/Contraste. Use os controles deslizantes ou campos de entrada para ajustar os parâmetros e clique em Aplicar. Como alternativa, use um método de alongamento de histograma linear selecionando Processo | Melhorar o contraste.... Defina a porcentagem de pixels saturados, selecione Normalizar e clique em OK.
      NOTA: Ao quantificar ou comparar a intensidade do sinal de fluoróforo entre imagens, geralmente é melhor não ajustar o brilho ou contraste, pois isso pode alterar as intensidades relativas de pixels na imagem, o que pode afetar as medições e comparações.
    3. Para diferenciar entre canais, aplique pseudocores a imagens específicas usando uma tabela de pesquisa (LUT). Para fazer isso, selecione a imagem e, no menu ImageJ/FIJI, selecione Imagem, clique em Tabelas de Pesquisa e escolha a LUT apropriada na lista suspensa.
    4. No menu, selecione Imagem | Cor | Mesclar canais. Para cada canal (C1, C2, C3...), use a lista suspensa para selecionar a imagem a ser atribuída a esse canal. Clique em OK para mesclar os canais.
    5. Salve a nova imagem como TIFF selecionando Arquivo | Salvar como | Tiff. Insira um nome para o arquivo e clique em Salvar.

Representative Results

Análise de secção transversal de primórdios foliares de milho
Utilizou-se o protocolo seção 2 para quantificar o número de nervuras e caracterizar os padrões de resposta hormonal em cortes transversais de primórdios foliares de milho com FPs (Figura 4)24. Para avaliar o papel do hormônio vegetal auxina no crescimento foliar e na formação de nervuras, quantificamos o número de nervuras nos primórdios foliares de um mutante de milho deficiente em auxina, desaparecendo borlas254. Nos plastócronos iniciais, as nervuras em desenvolvimento exibem celularização distinta na camada celular mediana do primórdio foliar do milho21,22. No entanto, a identificação e contagem de veias utilizando técnicas histológicas convencionais22 pode ser trabalhosa e demorada. Assim, para quantificar as veias, utilizou-se o marcador da proteína de efluxo de auxina de milho p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (doravante PIN1a-YFP), que marca veias em desenvolvimento e fitas procambiais (PCSs; Figura 4A). Utilizando o protocolo seção 2, foi possível padronizar a amostragem do corte transversal medindo os primórdios antes do corte (Figura 4B,C). Descobrimos uma tendência em que vt2 tem um primórdio mais largo e mais nervuras do que o normal (Figura 4D,E)24, o que é consistente com dados de folhas totalmente expandidas55, indicando que o defeito em vt2 começou cedo no desenvolvimento foliar. Usando a seção 2 do protocolo, também pudemos examinar sistematicamente os padrões de expressão dos repórteres de resposta hormonal FP nos primórdios foliares (ver exemplos das imagens na Figura 4F-I). Através de um esquema padronizado de amostragem de seção transversal, mapeamos a distribuição das respostas de auxina, citocinina (CK) e ácido giberélico (GA) em diferentes plastochrons e regiões dos primórdios foliares, e descobrimos novos padrões de resposta que hipotetizamos ter implicações para o crescimento foliar e formação de nervuras24. Portanto, estes resultados representativos demonstram a utilidade do protocolo seção 2 para a análise de cortes transversais de primórdios foliares de milho.

Figure 4
Figura 4: Resultados representativos da análise de secção transversal dos primórdios foliares do milho. (A-E) Quantificação do número de nervuras e largura do primórdio em primórdios foliares de borlas normais e desaparecidas2 com o marcador proteico de efluxo de auxina PIN1a-YFP. (A) Imagens representativas de fluorescência de cortes transversais de P5 a P7 expressando PIN1a-YFP em veias em desenvolvimento e fitas procambiais. Os cortes transversais foram fotografados com microscópio de epifluorescência usando filtro FITC (excitação de 495-519 nm). O número de veias e a largura do primórdio foram quantificados usando as ferramentas multiponto e linha livre em FIJI/ImageJ, respectivamente. (B) Uma plântula de milho com as espirais da folha superior removidas com um decapador de arame para expor a ponta da quarta folha (L4). O suporte abrange o comprimento do primórdio projetado, com a linha tracejada indicando o comprimento médio. (C) Diagrama esquemático de formas variadas de primórdio de P5 a P7, ilustrando como o número de veias e a largura do primórdio no comprimento médio (linha tracejada horizontal) podem variar dependendo do estágio de desenvolvimento do primórdio. (D,E) Medida da largura do primórdio (D) e do número de veias (E) na seção de comprimento médio da L4 normal e vt2. A linha de tendência representa médias contínuas de 10 mm das medidas ± erro padrão da média (EPM). (F-I) Imagens confocais representativas de seções transversais de primórdios foliares expressando combinações de PIN1a-YFP, auxin response reporter, DR5-RFP, cytokinin response reporter, TCS-Tomato, gibberellic acid-responsive marker, GAR2-YFP, e mDII-Venus, uma versão mutada do auxin signaling input reporter DII-Venus. Os canais FP são sobrepostos ao canal de campo brilhante em cada imagem. Barra de escala = 200 μm (A); 10 mm (B); 100 μm (F-I). Esta figura foi modificada e reproduzida com permissão de Robil e McSteen24. Abreviações: DAG = dias após a germinação; P = plastocrono; vt2 = borla de desaparecimento2; PCS = fita procambial; YFP = proteína fluorescente amarela; FITC = isotiocianato de fluoresceína; RFP = proteína fluorescente vermelha; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Tomate = TCSv2::NLS-tdTomate; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Vênus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise de montagem integral de primórdios foliares de milho
Seguimos o protocolo seção 3 para visualizar e analisar a expressão de PF em montagens de folhas inteiras de primórdios foliares de milho (Figura 5). Visualizando os padrões venosos com PIN1a-YFP, observamos que a formação de veias ocorre em todo o primórdio durante os plastócronos iniciais, mas esse processo torna-se restrito nas regiões proximais mais tarde no desenvolvimento (Figura 5A)24. Complementar às análises de secção transversal, as análises de montagem de folhas inteiras revelaram padrões de resposta hormonal tecidual e estádio-específica durante a formação da veia24. Um exemplo é o padrão de expressão do repórter de resposta CK TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato), relativo à expressão de PIN1a-YFP (Figura 5B)24. Seguindo o protocolo seção 3, pudemos realizar análises qualitativas e quantitativas da expressão de PF nos primórdios foliares (Figura 5D-F; dados não publicados). Examinamos os padrões de expressão de um repórter de resposta à auxina, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), e de um marcador responsivo a GA, p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), em montagens de folhas inteiras de mutantes simples e duplos de vt2 e planta anã3 (d3), um mutante56 deficiente em GA (Figura 5D). Também comparamos os níveis relativos de proliferação celular entre primórdios foliares normais e vt2 usando p Zm Ciclina-D2B::ZmCiclina-D2B:YFP42 (Ciclina-D2B-YFP), que é um marcador para a transição G1/S no ciclo celular57 (Figura 5E,F). Embora não tenha havido diferença significativa entre normal e vt2, a expressão de ciclina-D2B-YFP foi consistente com o conhecido perfil de proliferação celular dos plastochrons precoces31. Concluímos que o protocolo seção 3 é um método eficaz para analisar montagens inteiras de primórdios foliares de milho, que são difíceis de obter imagens devido à sua morfologia laminada.

Figure 5
Figura 5: Resultados representativos da análise de montagem total dos primórdios foliares do milho. (A) Imagens representativas de fluorescência dos primórdios foliares de plântulas de milho 7 DAG mostrando nervuras em desenvolvimento e fitas procambiais, marcadas pelo marcador de proteína de efluxo de auxina PIN1a-YFP. Os primórdios P3-P6 foram retirados da base, desenrolados e achatados com o lado adaxial para cima. Insets mostram close-ups de P3 e P4. Em P5 e P6, linhas tracejadas demarcam a extremidade distal das zonas proliferativas, onde a maioria dos fios procambiais ainda está se desenvolvendo e se estendendo. (B,C) Imagens confocais representativas mostrando a expressão de PIN1a-YFP e do repórter de resposta de citocinina, TCS-Tomato, na região marginal proximal de um primórdio P5. (D) Imagens representativas de fluorescência de primórdios de P4 mostrando a expressão de repórter de resposta à auxina, DR5-RFP, e marcador responsivo ao ácido giberélico, GAR2-YFP em mutantes normais e simples e duplos de borlas em extinção2 e planta anã3. (E) Imagens confocais representativas de P3 e/ou P4 mostrando a expressão de Ciclina-D2B-YFP, um repórter para a transição G1/S no ciclo celular. (F) Quantidades relativas de proliferação celular nos primórdios foliares P3/P4 normal e vt2, quantificadas medindo-se a densidade integrada do sinal Cyclin-D2B-YFP sobre a área do primórdio usando ImageJ/FIJI. As barras representam as medidas médias ± erro padrão da média. Barra de escala = 500 μm (A,D,E); 200 μm (B); 100 μm (C). A Figura 4A-C foi modificada e reproduzida com permissão de Robil e McSteen24, enquanto a Figura 4D-F é um dado não publicado dos autores. Abreviações: DAG = dias após a germinação; P = plastocrono; vt2 = borla em desaparecimento2; d3 = planta anã3; YFP = proteína fluorescente amarela; RFP = proteína fluorescente vermelha; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Tomate = TCSv2::NLS-tdTomate; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Ciclina-D2B-YFP = p Zm Ciclina-D2B::ZmCiclina-D2B:YFP; ns = sem diferença significativa; au = unidade arbitrária. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Exemplos de estadiamento do desenvolvimento foliar em mudas de milho. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S1: Amostras de plantas e materiais utilizados nos protocolos. (A,B) Uma plântula de milho 7-8 DAG com a folha superior removida usando um stripper de arame. (B) O inset mostra um close-up do broto com o perrodio P6 exposto. (C-G) Brotos de plântulas de milho com as espirais superiores removidas para análise de seção transversal (C,D) e folhas adjacentes totalmente removidas para análise de montagem total (E-G). (H) Um rolo de nanofita dupla face transparente de gel de poliuretano. (I,J) P6 primórdio da folha (I) e região proximal da folha P8 (J) desenroladas e montadas em lâminas de vidro com a nanofita. (K) Uma lâmina de vidro com um primórdio foliar não enrolado montada no palco de um microscópio de epifluorescência. Abreviação: DAG = dias após a germinação. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Apresentamos dois métodos de preparação de primórdios foliares de milho para aquisição de imagens celulares. O primeiro método (protocolo seção 2) permite a medição do primórdio para análise de secção transversal, enquanto o segundo método (protocolo seção 3) permite desenrolar e achatar o primórdio para análise de montagem inteira. Esses métodos facilitam a obtenção de imagens celulares de PFs em primórdiosfoliares de milho 24 (como mostrado na Figura 4 e Figura 5) e fornecem soluções simples para os desafios de obtenção de imagens de folhas de milho em desenvolvimento. A seção 2 do protocolo reduz o tempo de dissecção e melhora a precisão da amostragem medindo os primórdios antes da secção, em vez de depender apenas dos parâmetros de estadiamento 9,16. Com a nanofita disponível comercialmente, a seção 3 do protocolo resolve o problema de longa data da obtenção de imagens de primórdios de folhas inteiras em milho. Esse protocolo melhora o método anterior, que utilizava tubos de diálise 31, sendo uma alternativa muito mais barata à TC e RM11,32,33. No entanto, quando se trata de visualizar as características anatômicas foliares e produzir resultados ótimos, ambos os protocolos apresentam algumas limitações, que são descritas na Tabela 2 e discutidas mais detalhadamente a seguir.

Na seção 2 do protocolo, encontramos dificuldade em visualizar contornos celulares em cortes transversais espessos dos primórdios foliares, e a contramarcação com corantes fluorescentes ligantes à parede celular ou à membrana plasmática não forneceu resultados satisfatórios. Por exemplo, FM 4-64 produziu resultados subótimos em comparação com o marcador FP da membrana plasmática, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Figura 3A-D). Para superar essa limitação, recomendamos o uso de um vibratomo para produzir cortes teciduais mais finos (~0,1 mm)58, o que permitirá uma imagem vívida de campo claro dos contornos celulares ou otimizando o protocolo de contramarcação 47,59.

Na seção 3 do protocolo, a principal limitação é a dificuldade de montagem da folha sem rasgar, danificar ou formar bolhas de ar, conforme detalhado nas etapas do protocolo 3.2.5-3.2.6 (Figura 3E-K). Como a folha de milho é bilateralmente simétrica, uma montagem de meia folha em vez de uma montagem de folha inteira pode ser suficiente para visualização9. Para fazer isso, o primórdio pode ser cortado com uma lâmina de barbear ao longo do eixo longitudinal depois de desenrolá-lo até a nervura central, permitindo que apenas metade da folha seja montada. Outra limitação da seção 3 do protocolo é que a espessura da folha pode limitar a resolução óptica do sinal do fluoróforo durante imagens profundas. Para resolver essa questão, é possível empregar uma técnica de limpeza de tecidos60. No entanto, descobrimos que o ClearSee61, um reagente de limpeza comumente usado para imagens de tecidos vegetais, não é compatível com o protocolo porque faz com que a amostra e a lamínula se desprenda da fita nano. Uma solução potencial para este problema poderia ser a aplicação de uma membrana semipermeável31 sobre a amostra foliar, permitindo que ela seja tratada com a solução de limpeza enquanto é mantida no lugar pela nanofita. Este método, que permite a aplicação de soluções líquidas na folha não enrolada, também pode ser utilizado para técnicas de hibridização in situ e imunolocalização de RNA montado, previamente otimizadas para o desenvolvimento de inflorescências de milho, mas não para primórdios de folhasinteiras 62,63.

Descrevemos protocolos para o milho, que apresenta primórdios foliares grandes mesmo na fase de plântula. Outras espécies de gramíneas com primórdios foliares muito menores, como arroz, cevada, trigo, Setaria e Brachypodium 16,23,64,65,66, podem requerer o uso de ferramentas adicionais de precisão para a aplicação efetiva desses protocolos. Além disso, esses protocolos não foram destinados a imagens de células vivas, que capturam processos dinâmicos em tempo real de formação de tecidos e respostas celulares. No entanto, à medida que sondas fluorescentes, tecnologias de imagem e recursos de computação continuam a avançar em imagens de células vivas para plantas67, pesquisas futuras poderiam se basear nesses protocolos para desenvolver estratégias de imagem de células vivas adaptadas às características únicas dos primórdios das folhas de gramínea.

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer à Cooperação em Genética de Milho, ao Projeto de Genômica de Células de Milho, a Dave Jackson (Laboratório Cold Spring Harbor, NY), a Anne W. Sylvester (Laboratório Biológico Marinho, Universidade de Chicago, IL), a Andrea Gallavotti (Universidade Rutgers, NJ) e a Carolyn G. Rasmussen (Universidade da Califórnia, Riverside) por fornecerem os estoques mutantes e transgênicos, bem como a Robert F. Baker e Alexander Jurkevich do Núcleo de Microscopia de Luz Avançada da Universidade de Missouri-Columbia por sua assistência com microscopia confocal. A JMR foi apoiada pela J. William Fulbright Fellowship, The Diane P. and Robert E. Sharp Fund, e pelo Programa de Pesquisa do Genoma Vegetal da National Science Foundation (IOS-1546873) para PM. CDTC, CMRV, EDCDP e RJRR são apoiados pelo Programa de Bolsas de Estudo da Faculdade Ateneo. CDTC, EDCDP e RJRR são apoiados pela Bolsa de Graduação DOST-SEI S&T. O DODL é apoiado pelo P. Thomas Steinbugler SJ Academic Scholarship. O RJRR é apoiado pela Aiducation International–Pathways to Higher Education Scholarship. Este trabalho foi apoiado pela Escola de Ciências e Engenharia e pela Biblioteca Rizal, Universidade Ateneo de Manila.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick EZlifego Store (Amazon) B07YB1ZXG6 1 roll
Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in Bausch & Lomb N1692 9 1 pc
Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in Storz Opthalmic Instruments E0542 1 pc
Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in) Ted Pella 13553 1 pc
DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper Dowell Store (Amazon) 10-22 AWG 1 pc
Feather Double Edge Carbon Steel Blades Ted Pella 121-9 pkg/10; for fine sectioning
Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm Ted Pella 260442 pkg/144
GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades Ted Pella 121-1 box/200; for general cutting/sectioning
Glycerol Thermo Scientific PI17904 1 liter
ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin National Institutes of Health (NIH) USA version 2.9.0/1.54s The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).
Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm Kimtech Science 34155 box/280 ply
Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260140 1 ounce
PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick Yecaye Store (Amazon) L354 W1.18 2 rolls
Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260166 1 ounce
Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260168 1 ounce
Tempered Glass Cutting Board Hacaroa (Amazon) B09XMXBT5S 4 pc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McSteen, P., Kellogg, E. A. Molecular, cellular, and developmental foundations of grass diversity. Science. 377 (6606), 599-602 (2022).
  2. Wang, P., Vlad, D., Langdale, J. A. Finding the genes to build C4 rice. Current Opinion in Plant Biology. 31, 44-50 (2016).
  3. Wang, P., et al. Candidate regulators of early leaf development in maize perturb hormone signalling and secondary cell wall formation when constitutively expressed in rice. Scientific Reports. 7 (1), 4535 (2017).
  4. Perico, C., Tan, S., Langdale, J. A. Developmental regulation of leaf venation patterns: Monocot versus eudicots and the role of auxin. New Phytologist. 234 (3), 783-803 (2022).
  5. Wang, P., Kelly, S., Fouracre, J. P., Langdale, J. A. Genome-wide transcript analysis of early maize leaf development reveals gene cohorts associated with the differentiation of C4 Kranz anatomy. The Plant Journal. 75 (4), 656-670 (2013).
  6. Liu, W. Y., et al. Regulators of early maize leaf development inferred from transcriptomes of laser capture microdissection (LCM)-isolated embryonic leaf cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (35), e2208795119 (2022).
  7. Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (10), 3979-3984 (2013).
  8. Strable, J., Nelissen, H. The dynamics of maize leaf development: Patterned to grow while growing a pattern. Current Opinion in Plant Biology. 63, 102038 (2021).
  9. Reynolds, J. O., Eisses, J. F., Sylvester, A. W. Balancing division and expansion during maize leaf morphogenesis: Analysis of the mutant, warty-1. Development. 125 (2), 259-268 (1998).
  10. Richardson, A. E., et al. Evolution of the grass leaf by primordium extension and petiole-lamina remodeling. Science. 374 (6573), 1377-1381 (2021).
  11. Johnston, R., Leiboff, S., Scanlon, M. J. Ontogeny of the sheathing leaf base in maize (Zea mays). New Phytologist. 205 (1), 306-315 (2015).
  12. Sharman, B. C. Developmental anatomy of the shoot of Zea mays L. Annals of Botany. 6 (22), 245-282 (1942).
  13. Johnston, R., et al. Transcriptomic analyses indicate that maize ligule development recapitulates gene expression patterns that occur during lateral organ initiation. The Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
  14. Sharman, B. C. Leaf and bud initiation in the Gramineae. Botanical Gazette. 106 (3), 269-289 (1945).
  15. Nelissen, H., et al. A local maximum in gibberellin levels regulates maize leaf growth by spatial control of cell division. Current Biology. 22 (13), 1183-1187 (2012).
  16. Itoh, J., et al. Rice plant development: From zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
  17. Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Iowa State University of Science and Technology. , (1986).
  18. Freeling, M., Walbot, V. The Maize Handbook. , Springer Science & Business Media. (2013).
  19. Freeling, M., Hake, S. Developmental genetics of mutants that specify knotted leaves in maize. Genetics. 111 (3), 617-634 (1985).
  20. Durbak, A. R., et al. Transport of boron by the tassel-less1 aquaporin is critical for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 26 (7), 2978-2995 (2014).
  21. Langdale, J. A., Lane, B., Freeling, M., Nelson, T. Cell lineage analysis of maize bundle sheath and mesophyll cells. Developmental Biology. 133 (1), 128-139 (1989).
  22. Bosabalidis, A. M., Evert, R. F., Russin, W. A. Ontogeny of the vascular bundles and contiguous tissues in the maize leaf blade. American Journal of Botany. 81 (6), 745-752 (1994).
  23. Junqueira, N. E. G., et al. Anatomy and ultrastructure of embryonic leaves of the C4 species Setaria viridis. Annals of Botany. 121 (6), 1163-1172 (2018).
  24. Robil, J. M., McSteen, P. Hormonal control of medial-lateral growth and vein formation in the maize leaf. New Phytologist. 238 (1), 125-141 (2023).
  25. Donnelly, P. M., Bonetta, D., Tsukaya, H., Dengler, R. E., Dengler, N. G. Cell cycling and cell enlargement in developing leaves of Arabidopsis. Developmental Biology. 215 (2), 407-419 (1999).
  26. Govindaraju, P., Verna, C., Zhu, T., Scarpella, E. Vein patterning by tissue-specific auxin transport. Development. 147 (13), (2020).
  27. Linh, N. M., Scarpella, E. Leaf vein patterning is regulated by the aperture of plasmodesmata intercellular channels. PLoS Biology. 20 (9), e3001781 (2022).
  28. Verna, C., Ravichandran, S. J., Sawchuk, M. G., Linh, N. M., Scarpella, E. Coordination of tissue cell polarity by auxin transport and signaling. eLife. 8, e51061 (2019).
  29. Sawchuk, M. G., Head, P., Donner, T. J., Scarpella, E. Time-lapse imaging of Arabidopsis leaf development shows dynamic patterns of procambium formation. New Phytologist. 176 (3), 560-571 (2007).
  30. Linh, N. M., Scarpella, E. Confocal imaging of developing leaves. Current Protocols. 2 (1), e349 (2022).
  31. Poethig, R. S., Szymkowiak, E. J. Clonal analysis of leaf development in maize. Maydica. 40, 67-76 (1995).
  32. Sprangers, K., Thys, S., van Dusschoten, D., Beemster, G. T. S. Gibberellin enhances the anisotropy of cell expansion in the growth zone of the maize leaf. Frontiers in Plant Science. 11, 1163 (2020).
  33. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 cofactors, BLH12 and BLH14, regulate internode patterning and vein anastomosis in maize. The Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  34. Schindelin, J., et al. FIJI: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Plant Care Protocols - Maize. The Donald Danforth Plant Science Center's Plant Growth Facility. , Available from: https://www.danforthcenter.org/our-work/core-facilities/plant-growth/ (2019).
  36. Mir, R., et al. A DII domain-based auxin reporter uncovers low auxin signaling during telophase and early G1. Plant Physiology. 173 (1), 863-871 (2017).
  37. DeBlasio, S. L., Sylvester, A. W., Jackson, D. Illuminating plant biology: Using fluorescent proteins for high-throughput analysis of protein localization and function in plants. Briefings in Functional Genomics. 9 (2), 129-138 (2010).
  38. Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: Generation and applications. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 535-543 (2013).
  39. Mohanty, A., et al. Advancing cell biology and functional genomics in maize using fluorescent protein-tagged lines. Plant Physiology. 149 (2), 601-605 (2009).
  40. Baker, R. F., et al. Sucrose transporter ZmSut1 expression and localization uncover new insights into sucrose phloem loading. Plant Physiology. 172 (3), 1876-1898 (2016).
  41. Gallavotti, A., Yang, Y., Schmidt, R. J., Jackson, D. The relationship between auxin transport and maize branching. Plant Physiology. 147 (4), 1913-1923 (2008).
  42. Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), 12 (2015).
  43. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: A cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  44. Geng, Y., Zhou, Y. Confocal live imaging of shoot apical meristems from different plant species. Journal of Visualized Experiments. (145), e59369 (2019).
  45. Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell Biology. 139, Elsevier. 203-223 (2017).
  46. Fodor, E., Ayaydin, F. Fluorescent probes and live imaging of plant cells. Advances in Plant Ecophysiology Techniques. , Springer. 241-251 (2018).
  47. Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. The Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
  48. Conklin, P. A., Johnston, R., Conlon, B. R., Shimizu, R., Scanlon, M. J. Plant homeodomain proteins provide a mechanism for how leaves grow wide. Development. 147 (20), (2020).
  49. Shaw, S. L. Imaging the live plant cell. The Plant Journal. 45 (4), 573-598 (2006).
  50. Klaus, A. V., Schawaroch, V., Frischmann, K. J. Confocal imaging and three-dimensional visualization of thick autofluorescent specimens. Methods in Molecular Biology. 1075, 213-225 (2014).
  51. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Extended depth-of-focus for multi-channel microscopy images: a complex wavelet approach. 2004 2nd IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: Nano to Macro (IEEE Cat No. 04EX821). IEEE. , 660-663 (2004).
  52. Extended Depth of Field. EPFL Biomedical Imaging Group. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2022).
  53. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  54. Phillips, K. A., et al. vanishing tassel2 encodes a grass-specific tryptophan aminotransferase required for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 23 (2), 550-566 (2011).
  55. Robil, J. M., et al. GrasVIQ: An image analysis framework for automatically quantifying vein number and morphology in grass leaves. The Plant Journal. 107 (2), 629-648 (2021).
  56. Helliwell, C. A., Chandler, P. M., Poole, A., Dennis, E. S., Peacock, W. J. The CYP88A cytochrome P450, ent-kaurenoic acid oxidase, catalyzes three steps of the gibberellin biosynthesis pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 2065-2070 (2001).
  57. Gutierrez, R., Quiroz-Figueroa, F., Vazquez-Ramos, J. M. Maize cyclin D2 expression, associated kinase activity and effect of phytohormones during germination. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 166-173 (2005).
  58. Atkinson, J. A., Wells, D. M. An updated protocol for high throughput plant tissue sectioning. Frontiers in Plant Science. 8, 1721 (2017).
  59. Lux, A., Morita, S., Abe, J., Ito, K. An improved method for clearing and staining free-hand sections and whole-mount samples. Annals of Botany. 96 (6), 989-996 (2005).
  60. Heriche, M., Arnould, C., Wipf, D., Courty, P. E. Imaging plant tissues: Advances and promising clearing practices. Trends in Plant Science. 27 (6), 601-615 (2022).
  61. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  62. Chuck, G., Muszynski, M., Kellogg, E., Hake, S., Schmidt, R. J. The control of spikelet meristem identity by the branched silkless1 gene in maize. Science. 298 (5596), 1238-1241 (2002).
  63. Tran, T. M., et al. An optimized whole-mount immunofluorescence method for shoot apices. Current Protocols. 1 (4), e101 (2021).
  64. O'Connor, D. L. PINs Lost and PINs Gained: Auxin-Transport Mediated Patterning in the Grasses. University of California, Berkeley. , Doctoral Dissertation (2012).
  65. Sharman, B. C., Hitch, P. A. Initiation of procambial strands in leaf primordia of bread wheat, Triticum aestivum L. Annals of Botany. 31 (2), 229-243 (1967).
  66. Serra, L., Tan, S., Robinson, S., Langdale, J. A. Flip-flap: A simple dual-view imaging method for 3D reconstruction of thick plant samples. Plants. 11 (4), 506 (2022).
  67. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).

Tags

Este mês em JoVE Edição 199 milho (Zea mays) primórdios de folhas de gramíneas anatomia e desenvolvimento foliar fluorescência e imagens confocais seção transversal montagem inteira ImageJ/FIJI imagem celular
Métodos aprimorados para preparar seções transversais e montagens inteiras não enroladas de primordia de folhas de milho para fluorescência e imagens confocais
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robil, J. M., Cortez, C. D. T.,… More

Robil, J. M., Cortez, C. D. T., Villafuerte, C. M. R., Dela Peña, E. D. C., De Leon, D. O., Rioja, R. J. R., McSteen, P. Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (199), e65239, doi:10.3791/65239 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter