Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Forbedrede metoder for fremstilling av tverrsnitt og utrullede hele fester av maisbladprimordia for fluorescens og konfokal avbildning

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65239
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Department of Biology, School of Science and Engineering, Ateneo de Manila University, 2Division of Biological Sciences, Interdisciplinary Plant Group, and Missouri Maize Center, University of Missouri

Summary

Maisbladprimordia er dypt innhyllet og rullet, noe som gjør dem vanskelige å studere. Her presenterer vi metoder for å forberede tverrsnitt og utrullede hele fester av maisbladprimordia for fluorescens og konfokal avbildning.

Abstract

I mais (Zea mays) og andre gress (Poaceae) er bladprimordiene dypt innhyllet og rullet i bladhvirvelen, noe som gjør det vanskelig å studere tidlig bladutvikling. Her beskriver vi metoder for fremstilling av tverrsnitt og utrullede hele fester av maisbladprimordia for fluorescens og konfokal avbildning. Den første metoden bruker en trådstripper for å fjerne de øvre delene av eldre blader, utsette spissen av bladprimordium og tillate måling for mer nøyaktig tverrsnittprøvetaking. Den andre metoden bruker klar, dobbeltsidig nanotape for å rulle ut og montere helbladprimordia for avbildning. Vi viser nytten av de to metodene for å visualisere og analysere fluorescerende proteinreportere i mais. Disse metodene gir en løsning på utfordringene som den særegne morfologien til maisbladprimordia gir, og vil være nyttige for å visualisere og kvantifisere bladets anatomiske og utviklingsmessige egenskaper hos mais og andre gressarter.

Introduction

Gressavlinger er en viktig kilde til mat og biodrivstoff for den globale befolkningen1, og forbedring av bladanatomi har potensial til å øke produktiviteten 2,3. Vår nåværende forståelse av hvordan bladanatomi reguleres i gress er imidlertid begrenset4 og krever analyse av bladprimordia, da mange anatomiske og fysiologiske egenskaper ved bladet er forhåndsbestemt tidlig i utviklingen 5,6,7. Cellulære bildebehandlingsteknikker, som fluorescens og konfokal avbildning, er uunnværlige for å studere gressbladanatomi og cellulære egenskaper, men disse teknikkene er vanskelige å bruke på gressbladprimordia fordi de er dypt omsluttet og rullet i bladhvirvelen. Vi løste dette problemet ved å utvikle metoder for å forberede tverrsnitt og utrullede helbladfester for fluorescens og konfokal analyse av maisbladprimordia, et modellsystem for å studere gressbladanatomi og utvikling 2,8.

Maisbladet, som alle gressblader, består av et stroppelignende blad med en kappe som vikler seg rundt stilken og utvikler skudd 9,10,11,12,13. Bladene utvikler seg fra skuddet apikale meristem (SAM) i et distichous mønster, hvor hvert nytt blad starter i motsatt posisjon av det forrige bladet, noe som resulterer i to rekker av blader langs den vertikale aksen (figur 1A) 14 . Utviklingsstadiet til hvert bladprimordium identifiseres ved dets posisjon i forhold til SAM, med nærmeste primordium betegnet som plastochron1 (P1) og følgende primordia betegnet som P2, P3 og så videre (figur 1B, C) 2. Under utviklingen (figur 1D) vises bladprimordiet først som en halvmåneformet støtte rundt bunnen av SAM (P1), og vokser deretter til et hetteformet primordium som strekker seg over meristem (P2)9,10,11. De basale kantene av hetten ekspanderer deretter sideveis og overlapper hverandre når spissen vokser oppover og danner et kjegleformet primordium (P3-P5)10. Primordium vokser da raskt i lengde, og slirebladgrensen ved basen blir mer fremtredende med dannelsen av ligulen, den frynselignende projeksjonen på bladets adaksiale side (P6/P7). Til slutt ruller bladet ut når det kommer ut av hvirvelen under steady-state vekst, hvor de delende cellene er begrenset innenfor den lille basale regionen av bladet, og danner en gradient med ekspanderende og differensierende celler langs den proksimal-distale aksen (P7 / P8) 15. Skuddspissen til en maisplante inneholder flere primordier på forskjellige utviklingsstadier, noe som gjør den til en utmerket modell for å studere bladutvikling8.

Nøyaktig analyse av tidlig bladutvikling krever staging eller bruk av standardiserte kriterier for å definere forskjellige stadier av primordiumutvikling i forhold til andre vekst- eller morfologiske parametere. Fordi bladprimordiene er skjult i gressskuddet, bruker forskere vanligvis parametere som plantens alder eller størrelsen på de fremvoksende bladene som prediktorer for stadiene og størrelsene på bladprimordia 9,16. I mais bestemmes plantens kronologiske alder enten av antall dager etter planting eller spiring (DAP/DAG)17,18. Det vegetative stadiet (V-trinnet) bestemmes av det øverste bladet med en synlig krage, en blek linje på den abaksiale siden mellom bladet og skjeden som tilsvarer posisjonen til ligule og auriklene, et par kileformede områder ved bunnen av bladet (figur 1A,B)17,19 . Mellom 20 og 25 DAG går SAM over i en blomsterstandsmeristem og slutter å produsere nye blader20. Vekstratene for maisbladprimordia kan variere avhengig av miljøet og genotypen til planten. Av denne grunn kan plantealder og størrelsen på de fremvoksende bladene ikke nøyaktig forutsi størrelsene på bladprimordia; Imidlertid kan bruk av disse parametrene bidra til å forutsi rekkevidden av Primordia-stadier og størrelser for eksperimentelle formål.

Tverrsnittsanalyse er en populær metode for å undersøke bladanatomi og utvikling i mais og andre gress fordi det muliggjør prøvetaking av flere plastokroner i en enkelt seksjon over skuddet21,22,23. Denne metoden er også praktisk for cellulær avbildning av ferske prøver, da de omkringliggende bladene fungerer som et stillas som holder bladprimordia på plass under seksjonering og montering24. En ulempe med denne metoden er imidlertid at det kan være utfordrende å nøyaktig lokalisere målplastokronen og regionen innenfor primordiet ved snitting fra et intakt skudd. Videre, fordi bladveksten varierer mellom plastokroner og langs den proksimal-distale aksen2,5, kan upresis prøvetaking resultere i en feil tolkning av utviklingsstadiet og regionen av primordium i et gitt avsnitt. Derfor er utvikling av en metode for presis tverrsnittsprøvetaking avgjørende for å sikre nøyaktigheten og reproduserbarheten av anatomiske og utviklingsmessige analyser av gressbladprimordia.

Helbladmonteringsanalyse muliggjør omfattende og integrativ undersøkelse av vev og cellulære prosesser som forekommer på hele organskalaen, for eksempel proliferativ vekst25 og venemønster26,27,28. Metoden gir en paradermal oversikt over bladet, slik at det oppdages forskjellige prosesser og mønstre som ellers ville være vanskelig å oppdage ved hjelp av tverrsnittanalyse24,27. I motsetning til i Arabidopsis, hvor det allerede er etablerte metoder for avbildning av helbladfester29,30, er det for tiden ingen standardmetode for avbildning av utrullede helbladfester i gress. En tidligere protokoll for utrulling av isolert maisbladprimordia involverte uvanlige materialer og var ikke egnet for cellulær avbildning31. Avanserte bildebehandlingsteknikker, som computertomografi (CT) og magnetisk resonansavbildning (MRI), kan skaffe 3D-anatomisk informasjon uten å isolere og rulle ut primordia 11,32,33, men de er dyre og krever spesialutstyr. Å utvikle en teknikk for å overvinne begrensningene pålagt av den rullede og koniske morfologien til bladprimordia i mais og andre gress, ville fremme undersøkelser av deres anatomiske og utviklingsmessige egenskaper.

Her presenterer vi metoder for å forberede tverrsnitt og utrullede hele fester av maisbladprimordia for fluorescens og konfokal avbildning. Vi brukte disse metodene til å kvantifisere veneantall og kartlegge den romlige-temporale hormonfordelingen i maisbladprimordia med fluorescerende proteiner (FPs)24. Den første metoden innebærer å fjerne den øvre delen av eldre blader fra maisplanter med en trådstripper (figur 1E). Ved å eksponere spissen av primordium (P5-P7), blir det mulig å bestemme lengden uten å måtte fjerne de eldre omkringliggende bladene helt, og dermed muliggjøre enkel og nøyaktig seksjonering. Den andre metoden innebærer å rulle ut og montere helbladprimordia (P3-P7) med klar, dobbeltsidig nanotape (figur 1F). Disse metodene er egnet for å visualisere forskjellige FPs24, men trenger optimalisering for bruk av fluorescerende fargestoffer og rydding av reagenser. I tillegg skisserer vi noen prosedyrer for sammenslåing av z-stabler, sammenslåing av bilder og sammenslåing av kanaler i ImageJ/FIJI34, som gjelder for bildene produsert av de to metodene. Disse metodene er nyttige for rutinemessig fluorescens eller konfokal avbildning av maisblader, men de kan også tilpasses for andre modellgressarter, som ris, Setaria og Brachypodium.

Figure 1
Figur 1: Organisering og morfologi av maisbladprimordier og oversikt over metodene . (A) Skjematisk fremstilling av en maisplante. Mais har en distichous phyllotaxy, med det nye bladet initiere på motsatt posisjon av forrige blad. Bladnummeret angir den kronologiske rekkefølgen som bladene kom fra spiring (dvs. første blad, L1; andre blad, L2; tredje blad, L3; etc.). Hvert blad har et distalt blad og en basal kappe avgrenset av en krage som tilsvarer ligule og auricle. Det øverste bladet med kragen synlig angir vegetativt stadium. Frøplanten i dette eksemplet er på V2-trinnet, med L2-kragen (pilspissen) synlig. Saksikonet indikerer stedet ved mesocotyl (me) der frøplanten må kuttes for å bli samlet. (B) Skjematisk fremstilling av dissekert opptak som viser isolert L1 til L4, med bladet primordia L5 til L9 vist som et forstørret bilde i (C). Gitokrontallet indikerer primordiums posisjon i forhold til SAM, med det yngste bladprimordium (P1) nærmest SAM og det eldre bladprimordiet (P2, P3, P4 og så videre) suksessivt lenger unna2. (D) Skjematisk fremstilling av morfologien til maisbladprimordia fra P1 til P5. (E) Skjematisk oversikt over metoden for tverrsnittsanalyse av maisbladet primordia. (1) Trim de eldre bladene med en trådstripper. (2) Mål primordium og seksjon skytingen. (3) Monter seksjonen på et lysbilde for avbildning og behandling (4, 5). (F) Skjematisk oversikt over metoden for helmontert analyse av maisbladet primordia. (1) Fjern de omkringliggende bladene for å trekke ut primordium. (2) Klipp ut og rull ut primordiumflaten på nanobåndet. (3) Monter prøven for avbildning og behandling (4, 5). Forkortelser: L = blad; bl = blad; sh = skjede; co = krage; meg = mesocotyl; V = vegetativ; P = plastokron; SAM = skyte apikal meristem. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

1. Iscenesettelse av maisbladutvikling og utforming av eksperimentet

  1. Dyrking av plantene og iscenesettelse av bladutvikling
    1. Bestem alder og utviklingsstadium av plantene som skal brukes til forsøket, og utfør en detaljert iscenesettelse av bladutvikling.
      MERK: Det anbefales at staging utføres på planter med samme genetiske bakgrunn som de mutante eller transgene linjene som skal brukes i forsøkene. SAM slutter å produsere nye blader mellom 20 og 25 DAG, avhengig av genetisk bakgrunn og vekstforhold. Av denne grunn er metodene beskrevet her ideelle for maisplanter i alderen 7-14 DAG.
    2. Dyrk maisplantene i et drivhus eller vekstkammer etter en egnet plantepleieprotokoll35.
    3. Samle plantene i ønsket alder eller V-stadium med en liten kniv eller saks ved å kutte på mesocotyl, som er stammen under jordoverflaten (figur 1A). Sett skjæreverktøyet forsiktig i jorden ved siden av frøplanten og skyv det ned til basen i en 45 ° vinkel for å kutte mesokotylen.
    4. Løft frøplanten ut av jorden og støv bort gjenværende smuss eller jordpartikler som kan klamre seg til planten. Fjern coleoptile, beskyttelseskjeden som dekker det fremvoksende skuddet i unge frøplanter, for hånd.
    5. For hver plante registrerer du V-trinnet, antall blader og lengden på det siste bladet som kommer fra hvirvelen. Ta bilder av plantene for fremtidig referanse.
    6. Fjern de eldre bladene en etter en. For å gjøre dette, hold planten ved restene av mesocotyl eller stammen, og punkter hvert blad fra bunnen av skjeden og forsiktig unfurl skjeden på en sirklende måte med en tannsonde (figur 1B).
      MERK: Se trinn 2.1 for en rask metode for å fjerne de omkringliggende bladene.
    7. Under et stereomikroskop ved rundt 2x forstørrelse, dissekerer du forsiktig resten av skuddet på fuktige kluter for å forhindre at prøven tørker ut. Stikk forsiktig ut og brett ut hvert blad primordium med en tannsonde med en bøyd nål eller et par fine tang til SAM, P1 og P2 er synlige (figur 1D). Registrer utseendet og måling av hver plastokron.
      MERK: Se et eksempel på bladutviklingsstaging hos maisplanter i tilleggsfil 1.
  2. Planlegging av eksperimentet
    MERK: Å planlegge eksperimentet nøye kan forbedre effektiviteten. For eksempel, i tverrsnittanalyse, kan bestemmelse av omtrentlig plassering som skal kuttes ved avbildning av spesifikke plastokroner eller regioner, redusere disseksjonstiden. Figur 2 viser et eksempel på standardisert prøvetaking. Videre kan optimalisering av avbildningsparametrene basert på egenskapene til FPs eller fluorescerende sonder forbedre effektiviteten av eksperimentene.
    1. Bruk iscenesettelsesinformasjonen som en veiledning for å fokusere eksperimentet på spesifikke plastokroner, primordiumregioner og vev. Bruk FPs eller andre fluorescerende sonder av interesse for å følge avsnitt 2 og / eller 3 nedenfor på noen få prøver.
      MERK: Se tilgjengelige mais FP markør line36-42 frø aksjer på https://www.maizegdb.org/data_center/stock.
    2. Bestem de optimale parameterne for bildeopptak for hver FP-reporter eller sonde, inkludert passende detektor eller filter, eksitasjons- og utslippsbølgelengder, pinhole-størrelse og andre innstillinger. Lagre innstillingene for å gjengi arbeidsforholdene for hvert av eksperimentene.
      MERK: Se Linh og Scarpella30 for noen tekniske retningslinjer for konfokal laserskanningsmikroskopi av utviklende blader.
    3. Planlegg bildetiden basert på halveringstiden og andre egenskaper til FP reporter43.
      MERK: Tiden mellom disseksjon og avbildning må også vurderes når du planlegger et eksperiment, da ferske planteprøver blir utsatt for uttørking og cellulære endringer i denne perioden.

Figure 2
Figur 2: Prøvetakingsskjema for tverrsnittsanalyse av maisbladprimordia. (A, venstre) Proksimalt skudd av en 7 DAG maisplante, som viser et eksponert fjerde blad (L4) på P7. De brutte linjene indikerer de syv prøvetakingspunktene langs primordium, fra 0, 5 mm til 10 mm. (A, høyre) Skjematisk fremstilling av bladprimordia, med den projiserte størrelsen og posisjonen til hver plastokron: P7 (hvit); P6 (magenta); P5 (blå); P4 (grønn); og P3 til SAM (gul). (VG Nett) Fluorescensbilder av tverrsnitt som representerer prøvetakingspunktene vist i A fra 10 mm (B) til 0,5 mm (H). Primordiene er pseudofarget i henhold til plastokronfargeskjemaet i (A). Snittene ble avbildet med et epifluorescensmikroskop ved hjelp av et UV-filter med longpass-emisjon for autofluorescens. Skala bar = 200 μm (B-H). Denne figuren er modifisert og gjengitt med tillatelse fra Robil og McSteen24. Forkortelser: DAG = dager etter spiring; P = plastokron; SAM = skyte apikal meristem; † = bladkappe eller pre-ligule riktig; * = skyte apikal meristem; ** = stamme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Avbildning av tverrsnitt av maisblad primordia

  1. Stripping eldre omkringliggende blader og måling av bladet primordium
    1. Samle frøplanten ved å kutte den forsiktig ved mesokotylen under jordoverflaten med en liten kniv eller saks, som beskrevet i trinn 1.1.3-1.1.4 (figur 1A).
    2. Bestem riktig wire stripper hullstørrelse som skal brukes og hvor kuttet skal gjøres langs skytingen. Forsikre deg om at hullet er stort nok til å passe til målprimordiumet.
    3. Begynn å kutte på den mer distale delen av skuddet og arbeid gradvis mot basen til spissen av primordiet er eksponert.
    4. For å gjøre kuttet, hold trådstripperen med kjevene mot skuddet. Plasser skuddet til det valgte hullet og klem stripperhåndtakene sammen for å skjære gjennom bladhvirvelen.
      MERK: For å unngå å kutte målprimordiet ved et uhell, juster midten av skuddet forsiktig med hullet i trådstripperen. For større planter anbefales det å manuelt fjerne noen av de omkringliggende bladene for hånd før du bruker stripperen.
      FORSIKTIG: Wire strippers har skarpe kjever som kan forårsake kutt eller andre skader hvis de ikke brukes forsiktig.
    5. Mens du fortsetter å klemme håndtakene sammen, skyver du stripperen bort fra skuddet for å trimme den øvre delen av bladene. Sørg for at målområdet i primordium forblir omsluttet av de omkringliggende bladene (tilleggsfigur S1C,D).
      MERK: Etter å ha trimmet de øvre bladene, sitter skuddet igjen med en eksponert primordiumspiss (P5, P6 eller P7, avhengig av kuttets posisjon og størrelsen på trådstripperhullet som brukes; Figur 1E). Dette primordium vil tjene som referanse for å estimere størrelsen og stadiet av yngre primordia. P6 er den mest praktiske referansen å bruke i maisplanter på grunn av størrelsesområdet og pin-lignende morfologi.
    6. Bruk en linjal til å måle lengden fra spissen av primordium til bunnen av skuddet. Registrer målingen.
      MERK: Lengden på primordium vil bli litt overestimert da det er noen få millimeter stamme ved foten av primordia (figur 2A).
  2. Frihåndssnitt og avbildning av bladprimordium
    1. Under et stereomikroskop med rundt 0,8x forstørrelse, hold skuddet stødig på en jevn overflate, for eksempel et skjærebrett i glass eller annet ripebestandig materiale. Bruk et barberblad eller skalpell til å kutte tynne seksjoner (0,25-0,8 mm) av skuddet på de ønskede punktene langs primordiumets lengde.
    2. Gjør et første kutt litt over målområdet for å forkaste den distale delen av skytingen, og få deretter tynne seksjoner rundt målområdet. For å gjøre rene kutt, hold bladet vinkelrett på skuddet og skyv det innover med en jevn, jevn bevegelse.
      MERK: Det kan være noen millimeter seksjoneringsrom for større primordia (P6 eller P7). For mindre primordia (P5 og tidligere) kan imidlertid 1 mm utgjøre en betydelig forskjell i prøvetakingen, da disse primordiene er stablet opp innenfor de første millimeterne av skuddets base (se figur 2A, F-H). Det anbefales å bruke et dobbeltkantet barberblad for finere seksjonering.
      FORSIKTIG: Vær forsiktig når du bruker barberblader og skalpeller for å unngå utilsiktede kutt eller skader.
    3. Bytt ut barberbladet regelmessig, siden bladkappene lett kan sløve bladet. Dekk skuddet med fuktige kluter etter hver seksjonsrunde for å forhindre at prøven tørker ut.
    4. Monter bladseksjonen på en ren glassglass (75 mm x 25 mm), bruk en pipette til å påføre en dråpe vann (eller 50% glyserol) direkte på seksjonen, og legg en deksel (22 mm x 22 mm) på toppen.
    5. Hvis du bruker et fluorescerende fargestoff, må du bruke fargestoffløsningen på seksjonen, plassere en dekselslip på toppen og inkubere den etter behov.
      MERK: Avhengig av fargestofftypen kan det være nødvendig med ytterligere trinn for behandling av bladseksjonene før du går videre til neste trinn. Disse referansene44,45,46,47 gir generelle detaljer og bruk av fluorescerende fargestoffer i plantecelleavbildning. Et kjernefargende fluorescerende fargestoff, 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU), har blitt brukt effektivt på tverrsnitt av maisbladprimordia 48. Derimot gir plasmamembranfargestoffer, som Fei Mao 4-64 (FM 4-64) og propidiumjodid, ikke tilfredsstillende resultater (figur 3A-D).
    6. Plasser lysbildet på scenen av et epifluorescens eller konfokal laserskanningsmikroskop og juster fokus og innstillinger etter behov for å visualisere fluoroforen30. Se tabell 1 for innstillinger for belysning og bildeopptak som brukes for utvalgte mais FP reporter linjer.
      MERK: Tykke seksjoner kan produsere høye nivåer av bakgrunnsautofluorescens. Vurder noen bildebehandlings- og prøveprepareringsstrategier som kan bidra til å redusere dette problemet 30,49 (se tabell 2).
      FORSIKTIG: Vær forsiktig og bruk vernebriller når du arbeider med kraftige lyskilder og lasere for å redusere risikoen for øyeskader.
    7. Bilde gjennom bladsnittet ved forskjellige forstørrelser og deteksjonskanaler (inkludert belysningen i det lyse feltet)30. Bruk 4x forstørrelse til å avbilde hele tverrsnittet og 20x eller 40x forstørrelse for å avbilde spesifikke vev. Reduser eksponeringstiden ved høyere forstørrelser for epifluorescensavbildning for å beskytte prøvene mot rask fotobleking (se tabell 1).
    8. Ta bilder av hele delen eller bestemte interesseområder (ROI). Skaff deg om nødvendig en z-stack, som er en serie bilder tatt med forskjellige brennvidder30.
    9. For å skaffe deg en z-stack, bestem først de øvre og nedre posisjonene i prøven, deretter antall optiske seksjoner som må fanges mellom disse posisjonene. Færre optiske seksjoner resulterer i en større z-trinnstørrelse, som er avstanden mellom hver seksjon. Avhengig av egenskapene til FP og forstørrelsen som brukes, fang tre til 25 optiske seksjoner med z-trinnstørrelser mellom 1 og 12 μm for avbildning av tverrsnitt av maisbladprimordia.
      MERK: Hvis du vil flate ut z-stakken, bruker du en passende volumgjengivelsesteknikk50 som kan oppnås gjennom mikroskopprogramvaren eller ved å bruke ImageJ/FIJI34 (se trinn 4.1 og 4.2).
    10. Lagre alle bildefilene og de tilknyttede metadataene, hvis tilgjengelig.

Tabell 1: Innstillinger for belysning og bildeopptak brukt til fluorescens og konfokal avbildning av utvalgte mais-FP-reportere. Forkortelser: FP = fluorescerende protein; TRITC = tetrametylrhodamin; FITC = fluoresceinisotiocyanat; WLL = hvitt lys laser; Ar-ion = argonionlaser; HyD = hybrid detektor; AU = Luftig enhet; Hz = Hertz, skannelinje per sekund. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

3. Avbildning av utrullede hele fester av maisblad primordia

  1. Dissekere primordia og forberede glassglasset med nanotape
    1. Samle frøplanten ved å kutte den forsiktig på mesocotyl under jordoverflaten med en liten kniv eller en saks, som beskrevet i trinn 1.1.3-1.1.4 (figur 1A).
    2. Forbered glasssliden (75 mm x 25 mm) med den klare, dobbeltsidige nanotapen (tilleggsfigur S1H) før du dissekerer planten. Klipp et rektangulært stykke nanotape og fest det til midten av et rent glassglass. Ikke fjern den beskyttende plastfilmen på oversiden av båndet.
      MERK: Bestem størrelsen på båndet som skal brukes i henhold til størrelsen på prøvene til bildet (se eksempler på store prøver i tilleggsfigur S1I, J). Nanobåndet er tilgjengelig i enten akryl eller polyuretan gel materiale. Begge typer er effektive for fluorescens og konfokal avbildning24. For å forhindre misfarging av båndet, beskytt det mot langvarig eksponering for lys ved å lagre det i en mørk beholder.
    3. Begynn å dissekere skuddet ved å fjerne den øvre delen av de eldre bladene med en trådstripper, som beskrevet i trinn 2.1.
    4. Hold skuddet ved mesocotyl og fjern forsiktig de omkringliggende bladene med en tannsonde for å trekke ut primordia. For å gjøre dette, fjern bladene fra bunnen av skuddet og utfold dem en om gangen til primordium av interesse er utsatt.
    5. Alternativt kan du bruke trådstripperen til å trekke ut bladprimordiene direkte ved å lage et kutt i basalområdet av skuddet (tilleggsfigur S1E-G).
      MERK: Denne metoden har en høyere risiko for å snappe primordia.
  2. Montering og avbildning av primordium.
    1. Fjern beskyttelsesfilmen fra båndet. Legg det eksponerte primordium på båndet. Bruk et barberblad til å skjære primordium ved basen, og kast basalstammen og hypocotyl (figur 1F).
    2. Rull ut primordium ved hjelp av en tannsonde med en bøyd nål (spissdiameter på 0,25-0,6 mm). Bruk en mikrosonde (spissdiameter på 0,15-0,2 mm) for primordia mindre enn 3 mm (P3 til tidlig P4).
    3. Plasser nålespissen parallelt med overflaten og brett ut den ytre basalmargen og press den forsiktig mot tapen.
    4. For jevnere utrulling, smør den indre overflaten (adaxial) av bladet ved å dyppe spissen av nålen i 100% glyserol.
    5. Med den ytre margen festet til båndet, juster nålespissen parallelt med bladets lange akse. Skyv kanylen forsiktig sidelengs for å rulle ut og flate bladet på tapen (figur 1F).
      MERK: Å bryte eller skade bladet mens du ruller ut er vanlig, spesielt i større primordia med en robust midrib (se figur 3E-G). Hvis du ruller bladet kraftig ut, kan det få blåmerker på overflaten og produsere artefakter under avbildning (figur 3H). Se tabell 2 og diskusjonen for anbefalte løsninger på disse problemene.
    6. Påfør en dråpe vann på det utrullede primordium. Legg umiddelbart en dekkslipp på toppen av vanndråpen og primordiumet. Trykk forsiktig ned kantene på dekselet slik at de fester seg til båndet.
      MERK: Det anbefales å bruke store rektangulære deksler (50 mm x 24 mm eller 60 mm x 24 mm) med ekstra områder for å feste båndet. Minimer dannelsen av luftbobler, som kan forvrenge bladet og forårsake ujevn lysbrytning (se figur 3I-K). Forsikre deg om at dekselet fester seg helt til båndet, da kantene på det monterte primordiumet kan rulle inn igjen under en løst festet dekselslip (se figur 3L).
    7. Plasser lysbildet på scenen av en epifluorescens (se tilleggsfigur S1K) eller konfokal laserskanningsmikroskop og juster fokus og innstillinger etter behov for å visualisere fluoroforen30. Se tabell 1 for innstillingene for belysning og bildeopptak som brukes for de valgte maisrapportlinjene.
    8. Avbilde hele bladet eller en bestemt avkastning gjennom ulike deteksjonskanaler30. For å avbilde hele bladet, må du enten manuelt ta mosaikkbilder av bladet eller bruke flisleggingen av mikroskopet ved lav forstørrelse (4x eller 10x).
      MERK: Selv ved den laveste forstørrelsen kan maisbladprimordia være for stor til å avbildes med et epifluorescens eller konfokal laserskanningsmikroskop, noe som resulterer i lengre bildebehandlingstider som kan føre til fotobleking (se figur 3M) eller økt bakgrunnsautofluorescens. Derfor anbefales det å bruke et fluorescensstereomikroskop for avbildning av helbladprøver større enn 5 mm.
    9. For konfokal avbildning vil det være nødvendig å oppnå z-stabler som omfatter tykkelsen på bladet (se trinn 2.2.9).
    10. Lagre alle bildefilene og de tilknyttede metadataene, hvis tilgjengelig.

Tabell 2: Feilsøking av vanlige problemer ved avbildning av tverrsnitt og hele fester av maisbladprimordia. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Figure 3
Figur 3: Suboptimalt tverrsnitt og helmontert preparering av maisbladprimordia. (A-D) Representative konfokale bilder av tverrsnitt av bladprimordia med en plasmamembranmarkør, PIP2-1-CFP (A), og et plasmamembranbindende fluorescerende fargestoff, FM 4-64 (B), med tilsvarende lysfeltbilder (C,D). Sammenlignet med PIP2-1-CFP, viser FM 4-64 suboptimal visualisering av cellekonturer. (E-M) Representative fluorescensbilder av hele fester av bladprimordier som viser tilstedeværelse av rifter (E-G), blåste overflater† (H), luftbobler* (I-K), tilbakerullede marger (L) og fotoblekede regioner‡ (M). Bladprimordia uttrykker DII-Venus (E-G), GAR2-YFP (H-J), mDII-Venus (K), PIN1a-YFP (L) og DR5-RFP (M). Skala bar = 200 μm (A-D); 500 μm (E-M). Figur 3A er modifisert og gjengitt med tillatelse fra Robil og McSteen24, mens figur 5B-M er upubliserte data fra forfatterne. Forkortelser: P = plastokron; YFP = gult fluorescerende protein; RFP = rødt fluorescerende protein; CFP = cyan fluorescerende protein; PIP2-1-CFP = pZmPIP2-1::ZmPIP2-1:CFP; DII-Venus = pzmubi:DII:YFP-NLS; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2: YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a: YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; BF = lyst felt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Behandle bildene ved hjelp av ImageJ / FIJI

  1. Slå sammen z-stakker ved hjelp av maksimal intensitetsprojeksjon (MIP)
    1. Start ImageJ/FIJI og åpne bunken med bilder, eller opprett en ny stabel fra flere separate bilder ved å velge Image | Stabler | Bilder som skal stables fra menyen.
    2. Velg bildestakken. Fra menyen velger du Bilde | Stabler | Z-prosjekt .... I dialogboksen Z-Project velger du Maksimal intensitet fra rullegardinmenyen Projeksjonstype . Klikk OK for å opprette z-projeksjon med maksimal intensitet.
      MERK: Det sammenslåtte bildet er en 2D-projeksjon av pikslene med høyest intensitet over z-stakkene50. Denne metoden er egnet for å visualisere fluoroforen, men ikke de anatomiske egenskapene i lyse feltbilder av tykke tverrsnitt og helbladfester.
    3. Lagre bildet som TIFF (Tagged Image File Format) ved å velge File | Lagre som | Tiff. Skriv inn et navn på filen, og klikk Lagre.
      MERK: Det anbefales å bruke TIFF for lagring av fluorescens og konfokale bilder, da det beholder kvaliteten og detaljene når bildet lagres.
  2. Slå sammen z-stabler ved hjelp av Extended Depth of Field (EDF) plugin51
    1. Installer EDF-plugin52. Last ned Extended_Depth_Field.jar filen (versjon 17.05.2021) fra http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ og legg den i "plugins"-mappen til ImageJ/FIJI.
    2. Start ImageJ/FIJI og åpne bunken med bilder, eller opprett en ny stabel fra flere separate bilder ved å velge Image | Stabler | Bilder som skal stables fra menyen.
    3. Velg bildestakken. Fra menyen velger du Plugins | Utvidet dybdeskarphet | EDF enkel modus. I dialogboksen Utvidet dybdeskarphet bruker du glidebryterne under Hastighet/ kvalitet til å angi ønsket kvalitet og behandlingshastighet, og høydekartregeringen til å angi jevnhetsnivået for topografien. Klikk Kjør for å opprette det rekonstruerte bildet.
      MERK: EDF kombinerer stakken til et skarpt, sammensatt 2D-bilde ved å projisere det beste fokuset51. Denne teknikken er nyttig for å overvinne den begrensede fokusdybden og er egnet for å rekonstruere bilder av lyse felt av tykke tverrsnitt eller helbladfester. Vær forsiktig når du bruker dette filteret til å visualisere fluoroforen fordi EDF, i motsetning til MIP, justerer kontrasten i bildet, noe som påvirker pikselintensiteten.
    4. Lagre bildet som en TIFF-fil ved å velge Fil | Lagre som | Tiff. Skriv inn et navn på filen, og klikk Lagre.
  3. Sy bilder sammen ved hjelp av Grid / Collection Stitching plugin53
    1. Lagre samlingen av bilder eller bildestakker som skal sys sammen i en enkelt katalog.
    2. Start ImageJ/FIJI og velg Plugins | Søm | Rutenett/samlingssøm fra menyen. I dialogboksen Sammensetting av rutenett / samling velger du Ukjent plassering fra rullegardinmenyen Type og deretter Alle filer i katalogen fra Rekkefølge. Klikk OK.
    3. I dialogboksen Rutenettsammensetting: Ukjent plassering, Alle filer i katalog , angir du plasseringen av bildene ved å skrive eller lime inn katalogbanen i Katalogtekst-feltet eller ved å klikke Bla gjennom... for å finne katalogen. Klikk OK for å starte sammensyingsprosessen.
      MERK: Alternativet Ukjent posisjon i plugin-modulen Grid/Collection Stitching rekonstruerer et sammensatt bilde fra et sett med sammenhengende bilder ved å analysere overlappende regioner. Derfor er dette alternativet nyttig for å sy mosaikker av bilder av tverrsnitt eller helbladfester som ikke oppnås ved hjelp av en flisskanningsoperasjon.
    4. Når sømmen er ferdig, vises et nytt vindu med det sydde bildet. Lagre bildet som en TIFF-fil ved å velge Fil | Lagre som | Tiff. Skriv inn et navn på filen, og klikk Lagre.
      MERK: Sammensetting av store montasjer av 2D- og 3D-bilder kan også oppnås ved hjelp av bilderekonstruksjonskommandoer i mikroskopprogramvaren eller gjennom Bio-Formats Import Options i ImageJ / FIJI.
  4. Kombinere flere kanaler ved hjelp av kommandoen Slå sammen kanaler
    1. Start ImageJ/FIJI og åpne bildene eller bildestakkene som skal slås sammen.
      MERK: Bildestakker kan slås sammen først ved hjelp av trinn 4.1 eller 4.2. MIP anbefales generelt for å flate ut fluoroforkanaler, mens EDF er bedre egnet for å flate ut lysfeltkanaler eller andre kanaler med varierende dybdefokus.
    2. Juster lysstyrken og kontrasten til bildene med Image | Justere | Lysstyrke/kontrast. Bruk glidebryterne eller inndatafeltene til å justere parameterne, og klikk deretter på Bruk. Du kan også bruke en lineær histogramstrekkemetode ved å velge Prosess | Forbedre kontrasten .... Angi prosentandelen av mettede piksler, velg Normaliser, og klikk deretter OK.
      MERK: Når du kvantifiserer eller sammenligner fluoroforsignalintensiteten mellom bilder, er det vanligvis best å ikke justere lysstyrken eller kontrasten, fordi dette kan endre den relative pikselintensiteten i bildet, noe som kan påvirke målingene og sammenligningene.
    3. Hvis du vil skille mellom kanaler, bruker du pseudofarger på bestemte bilder ved hjelp av en oppslagstabell (LUT). For å gjøre dette, velg bildet, velg deretter Bilde fra ImageJ / FIJI-menyen, klikk Slå opp tabeller og velg riktig LUT fra rullegardinlisten.
    4. Fra menyen velger du Bilde | Farge | Slå sammen kanaler. For hver kanal (C1, C2, C3 ...) bruker du rullegardinlisten til å velge bildet som skal tilordnes den kanalen. Klikk OK for å slå sammen kanalene.
    5. Lagre det nye bildet som TIFF ved å velge Fil | Lagre som | Tiff. Skriv inn et navn på filen, og klikk Lagre.

Representative Results

Tverrsnittsanalyse av maisblad primordia
Vi brukte protokolldel 2 til å kvantifisere veneantall og karakterisere hormonresponsmønstre i tverrsnitt av maisbladprimordia med FPs (figur 4)24. For å vurdere rollen til plantehormonet auxin i bladvekst og venedannelse, kvantifiserte vi antall vener i bladprimordiene til en auxinmangelfull maismutant, forsvinnende dusk254. I tidlige plastokroner viser utviklingsårene tydelig cellularisering i mediancellelaget av maisbladet primordium21,22. Identifisering og telling av vener ved hjelp av konvensjonelle histologiske teknikker22 kan imidlertid være arbeidskrevende og tidkrevende. For å kvantifisere venene benyttet vi derfor maisauxin-effluksproteinmarkøren p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP heretter), som markerer utvikling av vener og prokambiale tråder (PCS; Figur 4A). Ved hjelp av protokolldel 2 kunne vi standardisere tverrsnittprøvetakingen ved å måle primordiene før snitting (figur 4B,C). Vi oppdaget en trend der vt2 har et bredere primordium og flere vener enn normalt (figur 4D,E)24, noe som stemmer overens med data fra fullt utvidede blad55, noe som indikerer at defekten i vt2 begynte tidlig i bladutviklingen. Ved hjelp av protokollseksjon 2 kunne vi også systematisk undersøke uttrykksmønstrene til hormonrespons FP-reportere i bladprimordia (se eksempler på bildene i figur 4F-I). Gjennom et standardisert tverrsnittsprøveskjema kartla vi fordelingen av auxin-, cytokinin- (CK) og gibberellsyre (GA) responser på tvers av forskjellige plastochroner og regioner av bladprimordia, og oppdaget nye responsmønstre som vi hypoteser har implikasjoner for bladvekst og venedannelse24. Derfor viser disse representative resultatene nytten av protokollseksjon 2 for tverrsnittsanalyse av maisbladprimordia.

Figure 4
Figur 4: Representative resultater for tverrsnittsanalyse av maisbladprimordia. (A-E) Kvantifisering av veneantall og primordiumbredde i bladprimordia av normal og forsvinnende dusk2 med auxin efflux proteinmarkør PIN1a-YFP. (A) Representative fluorescensbilder av tverrsnitt av P5 til P7 som uttrykker PIN1a-YFP i utviklingsårer og prokambiale tråder. De tverrgående seksjonene ble avbildet med et epifluorescensmikroskop ved hjelp av et FITC-filter (495-519 nm eksitasjon). Antall vener og primordiumbredden ble kvantifisert ved hjelp av flerpunkts- og frihåndslinjeverktøyene i henholdsvis FIJI/ImageJ. (B) En maisplante med de øvre bladhvirvlene fjernet med en trådstripper for å avsløre spissen av det fjerde bladet (L4). Braketten spenner over den projiserte primordiumlengden, med den stiplede linjen som indikerer midtlengden. (C) Skjematisk diagram av varierende primordiumformer fra P5 til P7, som illustrerer hvordan venenummer og primordiumbredde i midtlengden (horisontal stiplet linje) kan variere avhengig av utviklingsstadiet til primordium. (D,E) Måling av primordiumbredde (D) og venenummer (E) i midtlengdeseksjonen av L4 av normal og vt2. Trendlinjen representerer 10 mm rullerende gjennomsnitt av målinger ± standardfeil av gjennomsnittet (SEM). (F-I) Representative konfokale bilder av tverrsnitt av bladprimordia som uttrykker kombinasjoner av PIN1a-YFP, auxin response reporter, DR5-RFP, cytokinin response reporter, TCS-Tomato, gibberellic acid-responsive markør, GAR2-YFP, og mDII-Venus, en mutert versjon av auxin signaling input reporter DII-Venus. FP-kanalene legges oppå lysfeltkanalen i hvert bilde. Skala bar = 200 μm (A); 10 mm (B); 100 μm (F-I). Denne figuren er modifisert og gjengitt med tillatelse fra Robil og McSteen24. Forkortelser: DAG = dager etter spiring; P = plastokron; vt2 = forsvinnende dusk2; PCS = procambial streng; YFP = gult fluorescerende protein; FITC = fluoresceinisotiocyanat; RFP = rødt fluorescerende protein; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a: YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-tomat = TCSv2::NLS-tdTomat; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2: YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Helmonteringsanalyse av maisblad primordia
Vi fulgte protokollseksjon 3 for å visualisere og analysere FP-uttrykk i helbladfester av maisbladprimordia (figur 5). Ved å visualisere venemønstre med PIN1a-YFP fant vi at dannelsen av vener forekommer i hele primordium under tidlige plastokroner, men denne prosessen blir begrenset i de proksimale regionene senere i utviklingen (figur 5A)24. Komplementært til tverrsnittanalysene har helbladsanalysene avdekket vevs- og stadiespesifikke mønstre av hormonrespons under venedannelse24. Et eksempel er uttrykksmønsteret til CK-responsreporteren TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato), i forhold til PIN1a-YFP-uttrykk (figur 5B)24. Ved å følge protokolldel 3 kunne vi utføre både kvalitative og kvantitative analyser av FP-uttrykk i bladprimordiene (figur 5D-F; upubliserte data). Vi undersøkte uttrykksmønstrene til en auxin-responsreporter, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), og en GA-responsiv markør, pZmGAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), i helbladfester av enkle og doble mutanter av vt2 og dvergplante3 (d3), en GA-mangelfull mutant56 (figur 5D). Vi sammenlignet også de relative nivåene av celleproliferasjon mellom normal og vt2 bladprimordia ved hjelp av p Zm Cyclin-D2B :: ZmCyclin-D2B: YFP42 (Cyclin-D2B-YFP), som er en markør for G1 / S-overgangen i cellesyklusen57 (figur 5E, F). Selv om det ikke var noen signifikant forskjell mellom normal og vt2, var Cyclin-D2B-YFP-ekspresjon konsistent med den kjente celleproliferasjonsprofilen til tidlige plastokroner31. Vi konkluderer med at protokollseksjon 3 er en effektiv metode for å analysere hele fester av maisbladprimordia, som er vanskelige å avbilde på grunn av deres valsede morfologi.

Figure 5
Figur 5: Representative resultater for helmonteringsanalyse av maisbladprimordia. (A) Representative fluorescensbilder av bladprimordia av 7 DAG maisplanter som viser utviklende vener og kambiale tråder, som markert med auxin efflux proteinmarkør PIN1a-YFP. P3-P6 primordia ble skåret ut fra basen, rullet ut og flattrykt med adaksialsiden opp. Innfelte viser nærbilder av P3 og P4. I P5 og P6 avgrenser stiplede linjer den distale enden av de proliferative sonene, hvor flertallet av kambiale tråder fortsatt utvikler seg og strekker seg. (B,C) Representative konfokale bilder som viser uttrykket av PIN1a-YFP og cytokininresponsreporter, TCS-Tomato, i den proksimale marginale regionen av et P5 primordium. (D) Representative fluorescensbilder av P4 primordia som viser uttrykket av auxinresponsreporter, DR5-RFP, og gibberellsyre-responsiv markør, GAR2-YFP i normale og enkle og doble mutanter av forsvinnende dusk2 og dvergplante3. (E) Representative konfokale bilder av P3 og/eller P4 som viser uttrykket av Cyclin-D2B-YFP, en reporter for G1/S-overgangen i cellesyklusen. (F) Relative mengder celleproliferasjon i P3/P4 bladprimordia av normal og vt2, kvantifisert ved å måle den integrerte tettheten av Cyclin-D2B-YFP-signalet over arealet av primordium ved hjelp av ImageJ/FIJI. Stolpene representerer gjennomsnittsmålingene ± standardfeilen til gjennomsnittet. Skala bar = 500 μm (A,D,E); 200 μm (B); 100 μm (C). Figur 4A-C er modifisert og gjengitt med tillatelse fra Robil og McSteen24, mens figur 4D-F er upubliserte data fra forfatterne. Forkortelser: DAG = dager etter spiring; P = plastokron; vt2 = forsvinnende dusk2; d3 = dvergplante3; YFP = gult fluorescerende protein; RFP = rødt fluorescerende protein; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a: YFP; TCS-tomat = TCSv2::NLS-tdTomat; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2: YFP; Syklin-D2B-YFP = pZmSyklin-D2B::ZmSyklin-D2B:YFP; NS = ingen signifikant forskjell; au = vilkårlig enhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: Eksempler på bladutviklingsstaging i maisplanter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur S1: Planteprøver og materialer brukt i protokollene. (A,B) En maisplante 7-8 DAG med den øvre bladhvirvelen fjernet ved hjelp av en trådstripper. (B) Innfellingen viser et nærbilde av opptaket med det eksponerte P6 primordium. (VG Nett) Skudd av maisplanter med de øvre hvirvlene fjernet for tverrsnittanalyse (C,D) og omkringliggende blader helt fjernet for helmonteringsanalyse (E-G). (H) En rull med polyuretan gel klar dobbeltsidig nano tape. (I,J) P6 blad primordium (I) og proksimale regionen av P8 blad (J) rullet ut og montert på glass lysbilder med nano tape. (K) Et glassglass med et utrullet bladprimordium montert på scenen i et epifluorescensmikroskop. Forkortelse: DAG = dager etter spiring. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Vi presenterer to metoder for å forberede maisbladprimordia for cellulær avbildning. Den første metoden (protokolldel 2) tillater måling av primordium for tverrsnittanalyse, mens den andre metoden (protokolldel 3) muliggjør utrulling og utflating av primordium for helmonteringsanalyse. Disse metodene letter cellulær avbildning av FPs i maisbladprimordia 24 (som vist i figur 4 og figur 5) og gir enkle løsninger på utfordringene med å avbilde utvikling av maisblader. Protokollseksjon 2 reduserer disseksjonstiden og forbedrer prøvetakingsnøyaktigheten ved å måle primordiene før seksjonering i stedet for å stole utelukkende på stagingparametere 9,16. Med kommersielt tilgjengelig nanotape løser protokollseksjon 3 det langvarige problemet med avbildning av helbladprimordia i mais. Denne protokollen forbedrer den forrige metoden, som brukte dialyserør 31, og er et mye billigere alternativ til CT og MR11,32,33. Men når det gjelder å visualisere bladanatomiske egenskaper og produsere optimale resultater, har begge protokollene noen begrensninger, som er skissert i tabell 2 og diskuteres mer detaljert nedenfor.

I protokolldel 2 opplevde vi problemer med å visualisere cellekonturer i tykke tverrsnitt av bladprimordiene, og motfarging med cellevegg- eller plasmamembranbindende fluorescerende fargestoffer ga ikke tilfredsstillende resultat. For eksempel ga FM 4-64 suboptimale resultater sammenlignet med plasmamembranen FP-markøren, pZmPIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Figur 3A-D). For å overvinne denne begrensningen anbefaler vi å bruke en vibratome for å produsere tynnere vevsseksjoner (~0,1 mm)58 som vil muliggjøre en levende lysfeltavbildning av cellekonturer eller optimalisere motfargingsprotokollen47,59.

I protokollseksjon 3 er hovedbegrensningen vanskeligheten med å montere bladet uten å rive, skade eller luftbobler, som beskrevet i protokolltrinn 3.2.5-3.2.6 (figur 3E-K). Fordi maisbladet er bilateralt symmetrisk, kan et halvbladfeste i stedet for et helbladfeste være tilstrekkelig for visualisering9. For å gjøre dette kan primordiumet kuttes med et barberblad langs lengdeaksen etter å ha rullet det opp til midribben, slik at bare halvparten av bladet kan monteres. En annen begrensning ved protokollseksjon 3 er at tykkelsen på bladet kan begrense den optiske oppløsningen av fluoroforsignalet under dyp avbildning. For å løse dette problemet er det mulig å bruke en vevsryddingsteknikk60. Vi fant imidlertid ut at ClearSee61, et vanlig brukt clearingreagens for avbildning av plantevev, ikke er kompatibelt med protokollen fordi det får prøven og dekselet til å løsne fra nanobåndet. En potensiell løsning på dette problemet kan være å påføre en semipermeabel membran31 over bladprøven, slik at den kan behandles med ryddeløsningen mens den holdes på plass av nanobåndet. En slik metode som gjør det mulig å bruke flytende løsninger på det utrullede bladet, kan også brukes til helmontert RNA in situ-hybridisering og immunlokaliseringsteknikker, som tidligere har blitt optimalisert for å utvikle maisblomstrer, men ikke for helbladet primordia62,63.

Vi beskrev protokoller for mais, som har store bladprimordier selv på plantestadiet. Andre gressarter med mye mindre bladprimordia, som ris, bygg, hvete, Setaria og Brachypodium 16,23,64,65,66, kan kreve bruk av ekstra presisjonsverktøy for effektivt å anvende disse protokollene. Videre var disse protokollene ikke ment for levende celleavbildning, som fanger sanntids dynamiske prosesser for vevsdannelse og cellulære responser. Men som fluorescerende prober, bildebehandlingsteknologier og databehandlingsevner fortsetter å utvikle seg i levende celleavbildning for planter67, kan fremtidig forskning bygge på disse protokollene for å utvikle levende celleavbildningsstrategier skreddersydd for de unike egenskapene til gressbladprimordia.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Maize Genetics Cooperation, Maize Cell Genomics Project, Dave Jackson (Cold Spring Harbor Laboratory, NY), Anne W. Sylvester (Marine Biological Laboratory, University of Chicago, IL), Andrea Gallavotti (Rutgers University, NJ), og Carolyn G. Rasmussen (University of California, Riverside) for å gi mutante og transgene aksjer, samt Robert F. Baker og Alexander Jurkevich fra Advanced Light Microscopy Core ved University of Missouri-Columbia for deres hjelp med konfokal mikroskopi. JMR ble støttet av J. William Fulbright Fellowship, The Diane P. og Robert E. Sharp Fund, og National Science Foundation's Plant Genome Research Program (IOS-1546873) til PM. CDTC, CMRV, EDCDP og RJRR støttes av Ateneo College Scholarship Program. CDTC, EDCDP og RJRR støttes av DOST-SEI S&T Undergraduate Scholarship. DODL støttes av Fr. Thomas Steinbugler SJ Academic Scholarship. RJRR støttes av Aiducation International-Pathways to Higher Education Scholarship. Dette arbeidet ble støttet av School of Science and Engineering og Rizal Library, Ateneo de Manila University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick EZlifego Store (Amazon) B07YB1ZXG6 1 roll
Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in Bausch & Lomb N1692 9 1 pc
Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in Storz Opthalmic Instruments E0542 1 pc
Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in) Ted Pella 13553 1 pc
DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper Dowell Store (Amazon) 10-22 AWG 1 pc
Feather Double Edge Carbon Steel Blades Ted Pella 121-9 pkg/10; for fine sectioning
Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm Ted Pella 260442 pkg/144
GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades Ted Pella 121-1 box/200; for general cutting/sectioning
Glycerol Thermo Scientific PI17904 1 liter
ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin National Institutes of Health (NIH) USA version 2.9.0/1.54s The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).
Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm Kimtech Science 34155 box/280 ply
Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260140 1 ounce
PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick Yecaye Store (Amazon) L354 W1.18 2 rolls
Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260166 1 ounce
Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260168 1 ounce
Tempered Glass Cutting Board Hacaroa (Amazon) B09XMXBT5S 4 pc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McSteen, P., Kellogg, E. A. Molecular, cellular, and developmental foundations of grass diversity. Science. 377 (6606), 599-602 (2022).
  2. Wang, P., Vlad, D., Langdale, J. A. Finding the genes to build C4 rice. Current Opinion in Plant Biology. 31, 44-50 (2016).
  3. Wang, P., et al. Candidate regulators of early leaf development in maize perturb hormone signalling and secondary cell wall formation when constitutively expressed in rice. Scientific Reports. 7 (1), 4535 (2017).
  4. Perico, C., Tan, S., Langdale, J. A. Developmental regulation of leaf venation patterns: Monocot versus eudicots and the role of auxin. New Phytologist. 234 (3), 783-803 (2022).
  5. Wang, P., Kelly, S., Fouracre, J. P., Langdale, J. A. Genome-wide transcript analysis of early maize leaf development reveals gene cohorts associated with the differentiation of C4 Kranz anatomy. The Plant Journal. 75 (4), 656-670 (2013).
  6. Liu, W. Y., et al. Regulators of early maize leaf development inferred from transcriptomes of laser capture microdissection (LCM)-isolated embryonic leaf cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (35), e2208795119 (2022).
  7. Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (10), 3979-3984 (2013).
  8. Strable, J., Nelissen, H. The dynamics of maize leaf development: Patterned to grow while growing a pattern. Current Opinion in Plant Biology. 63, 102038 (2021).
  9. Reynolds, J. O., Eisses, J. F., Sylvester, A. W. Balancing division and expansion during maize leaf morphogenesis: Analysis of the mutant, warty-1. Development. 125 (2), 259-268 (1998).
  10. Richardson, A. E., et al. Evolution of the grass leaf by primordium extension and petiole-lamina remodeling. Science. 374 (6573), 1377-1381 (2021).
  11. Johnston, R., Leiboff, S., Scanlon, M. J. Ontogeny of the sheathing leaf base in maize (Zea mays). New Phytologist. 205 (1), 306-315 (2015).
  12. Sharman, B. C. Developmental anatomy of the shoot of Zea mays L. Annals of Botany. 6 (22), 245-282 (1942).
  13. Johnston, R., et al. Transcriptomic analyses indicate that maize ligule development recapitulates gene expression patterns that occur during lateral organ initiation. The Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
  14. Sharman, B. C. Leaf and bud initiation in the Gramineae. Botanical Gazette. 106 (3), 269-289 (1945).
  15. Nelissen, H., et al. A local maximum in gibberellin levels regulates maize leaf growth by spatial control of cell division. Current Biology. 22 (13), 1183-1187 (2012).
  16. Itoh, J., et al. Rice plant development: From zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
  17. Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Iowa State University of Science and Technology. , (1986).
  18. Freeling, M., Walbot, V. The Maize Handbook. , Springer Science & Business Media. (2013).
  19. Freeling, M., Hake, S. Developmental genetics of mutants that specify knotted leaves in maize. Genetics. 111 (3), 617-634 (1985).
  20. Durbak, A. R., et al. Transport of boron by the tassel-less1 aquaporin is critical for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 26 (7), 2978-2995 (2014).
  21. Langdale, J. A., Lane, B., Freeling, M., Nelson, T. Cell lineage analysis of maize bundle sheath and mesophyll cells. Developmental Biology. 133 (1), 128-139 (1989).
  22. Bosabalidis, A. M., Evert, R. F., Russin, W. A. Ontogeny of the vascular bundles and contiguous tissues in the maize leaf blade. American Journal of Botany. 81 (6), 745-752 (1994).
  23. Junqueira, N. E. G., et al. Anatomy and ultrastructure of embryonic leaves of the C4 species Setaria viridis. Annals of Botany. 121 (6), 1163-1172 (2018).
  24. Robil, J. M., McSteen, P. Hormonal control of medial-lateral growth and vein formation in the maize leaf. New Phytologist. 238 (1), 125-141 (2023).
  25. Donnelly, P. M., Bonetta, D., Tsukaya, H., Dengler, R. E., Dengler, N. G. Cell cycling and cell enlargement in developing leaves of Arabidopsis. Developmental Biology. 215 (2), 407-419 (1999).
  26. Govindaraju, P., Verna, C., Zhu, T., Scarpella, E. Vein patterning by tissue-specific auxin transport. Development. 147 (13), (2020).
  27. Linh, N. M., Scarpella, E. Leaf vein patterning is regulated by the aperture of plasmodesmata intercellular channels. PLoS Biology. 20 (9), e3001781 (2022).
  28. Verna, C., Ravichandran, S. J., Sawchuk, M. G., Linh, N. M., Scarpella, E. Coordination of tissue cell polarity by auxin transport and signaling. eLife. 8, e51061 (2019).
  29. Sawchuk, M. G., Head, P., Donner, T. J., Scarpella, E. Time-lapse imaging of Arabidopsis leaf development shows dynamic patterns of procambium formation. New Phytologist. 176 (3), 560-571 (2007).
  30. Linh, N. M., Scarpella, E. Confocal imaging of developing leaves. Current Protocols. 2 (1), e349 (2022).
  31. Poethig, R. S., Szymkowiak, E. J. Clonal analysis of leaf development in maize. Maydica. 40, 67-76 (1995).
  32. Sprangers, K., Thys, S., van Dusschoten, D., Beemster, G. T. S. Gibberellin enhances the anisotropy of cell expansion in the growth zone of the maize leaf. Frontiers in Plant Science. 11, 1163 (2020).
  33. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 cofactors, BLH12 and BLH14, regulate internode patterning and vein anastomosis in maize. The Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  34. Schindelin, J., et al. FIJI: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Plant Care Protocols - Maize. The Donald Danforth Plant Science Center's Plant Growth Facility. , Available from: https://www.danforthcenter.org/our-work/core-facilities/plant-growth/ (2019).
  36. Mir, R., et al. A DII domain-based auxin reporter uncovers low auxin signaling during telophase and early G1. Plant Physiology. 173 (1), 863-871 (2017).
  37. DeBlasio, S. L., Sylvester, A. W., Jackson, D. Illuminating plant biology: Using fluorescent proteins for high-throughput analysis of protein localization and function in plants. Briefings in Functional Genomics. 9 (2), 129-138 (2010).
  38. Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: Generation and applications. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 535-543 (2013).
  39. Mohanty, A., et al. Advancing cell biology and functional genomics in maize using fluorescent protein-tagged lines. Plant Physiology. 149 (2), 601-605 (2009).
  40. Baker, R. F., et al. Sucrose transporter ZmSut1 expression and localization uncover new insights into sucrose phloem loading. Plant Physiology. 172 (3), 1876-1898 (2016).
  41. Gallavotti, A., Yang, Y., Schmidt, R. J., Jackson, D. The relationship between auxin transport and maize branching. Plant Physiology. 147 (4), 1913-1923 (2008).
  42. Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), 12 (2015).
  43. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: A cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  44. Geng, Y., Zhou, Y. Confocal live imaging of shoot apical meristems from different plant species. Journal of Visualized Experiments. (145), e59369 (2019).
  45. Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell Biology. 139, Elsevier. 203-223 (2017).
  46. Fodor, E., Ayaydin, F. Fluorescent probes and live imaging of plant cells. Advances in Plant Ecophysiology Techniques. , Springer. 241-251 (2018).
  47. Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. The Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
  48. Conklin, P. A., Johnston, R., Conlon, B. R., Shimizu, R., Scanlon, M. J. Plant homeodomain proteins provide a mechanism for how leaves grow wide. Development. 147 (20), (2020).
  49. Shaw, S. L. Imaging the live plant cell. The Plant Journal. 45 (4), 573-598 (2006).
  50. Klaus, A. V., Schawaroch, V., Frischmann, K. J. Confocal imaging and three-dimensional visualization of thick autofluorescent specimens. Methods in Molecular Biology. 1075, 213-225 (2014).
  51. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Extended depth-of-focus for multi-channel microscopy images: a complex wavelet approach. 2004 2nd IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: Nano to Macro (IEEE Cat No. 04EX821). IEEE. , 660-663 (2004).
  52. Extended Depth of Field. EPFL Biomedical Imaging Group. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2022).
  53. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  54. Phillips, K. A., et al. vanishing tassel2 encodes a grass-specific tryptophan aminotransferase required for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 23 (2), 550-566 (2011).
  55. Robil, J. M., et al. GrasVIQ: An image analysis framework for automatically quantifying vein number and morphology in grass leaves. The Plant Journal. 107 (2), 629-648 (2021).
  56. Helliwell, C. A., Chandler, P. M., Poole, A., Dennis, E. S., Peacock, W. J. The CYP88A cytochrome P450, ent-kaurenoic acid oxidase, catalyzes three steps of the gibberellin biosynthesis pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 2065-2070 (2001).
  57. Gutierrez, R., Quiroz-Figueroa, F., Vazquez-Ramos, J. M. Maize cyclin D2 expression, associated kinase activity and effect of phytohormones during germination. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 166-173 (2005).
  58. Atkinson, J. A., Wells, D. M. An updated protocol for high throughput plant tissue sectioning. Frontiers in Plant Science. 8, 1721 (2017).
  59. Lux, A., Morita, S., Abe, J., Ito, K. An improved method for clearing and staining free-hand sections and whole-mount samples. Annals of Botany. 96 (6), 989-996 (2005).
  60. Heriche, M., Arnould, C., Wipf, D., Courty, P. E. Imaging plant tissues: Advances and promising clearing practices. Trends in Plant Science. 27 (6), 601-615 (2022).
  61. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  62. Chuck, G., Muszynski, M., Kellogg, E., Hake, S., Schmidt, R. J. The control of spikelet meristem identity by the branched silkless1 gene in maize. Science. 298 (5596), 1238-1241 (2002).
  63. Tran, T. M., et al. An optimized whole-mount immunofluorescence method for shoot apices. Current Protocols. 1 (4), e101 (2021).
  64. O'Connor, D. L. PINs Lost and PINs Gained: Auxin-Transport Mediated Patterning in the Grasses. University of California, Berkeley. , Doctoral Dissertation (2012).
  65. Sharman, B. C., Hitch, P. A. Initiation of procambial strands in leaf primordia of bread wheat, Triticum aestivum L. Annals of Botany. 31 (2), 229-243 (1967).
  66. Serra, L., Tan, S., Robinson, S., Langdale, J. A. Flip-flap: A simple dual-view imaging method for 3D reconstruction of thick plant samples. Plants. 11 (4), 506 (2022).
  67. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 199 mais (Zea mays) gressblad primordia bladanatomi og utvikling fluorescens og konfokal avbildning tverrsnitt hele mount ImageJ / FIJI cellulær bildebehandling
Forbedrede metoder for fremstilling av tverrsnitt og utrullede hele fester av maisbladprimordia for fluorescens og konfokal avbildning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robil, J. M., Cortez, C. D. T.,… More

Robil, J. M., Cortez, C. D. T., Villafuerte, C. M. R., Dela Peña, E. D. C., De Leon, D. O., Rioja, R. J. R., McSteen, P. Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (199), e65239, doi:10.3791/65239 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter