Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Förbättrade metoder för beredning av tvärsnitt och rullade hela fästen av majsbladsprimordia för fluorescens och konfokal avbildning

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65239
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Department of Biology, School of Science and Engineering, Ateneo de Manila University, 2Division of Biological Sciences, Interdisciplinary Plant Group, and Missouri Maize Center, University of Missouri

Summary

Majsblad primordia är djupt mantlade och rullade, vilket gör dem svåra att studera. Här presenterar vi metoder för att förbereda tvärsnitt och rullade ut hela fästen av majsbladprimordia för fluorescens och konfokal avbildning.

Abstract

I majs (Zea mays) och andra gräs (Poaceae) är bladprimordia djupt mantlade och rullade inuti bladvirveln, vilket gör det svårt att studera tidig bladutveckling. Här beskriver vi metoder för beredning av tvärsnitt och rullade ut hela fästen av majsbladprimordia för fluorescens och konfokal avbildning. Den första metoden använder en trådstrippare för att ta bort de övre delarna av äldre löv, exponera spetsen på bladprimordium och möjliggöra mätning för mer exakt tvärsnittsprovtagning. Den andra metoden använder klar, dubbelsidig nanotejp för att rulla ut och montera helbladiga primordier för avbildning. Vi visar nyttan av de två metoderna för att visualisera och analysera fluorescerande proteinreportrar i majs. Dessa metoder ger en lösning på de utmaningar som den distinkta morfologin hos majsbladprimordia presenterar och kommer att vara användbara för att visualisera och kvantifiera bladanatomiska och utvecklingsegenskaper hos majs och andra gräsarter.

Introduction

Gräsgrödor är en viktig källa till mat och biobränsle för den globala befolkningen1, och förbättrad bladanatomi har potential att öka deras produktivitet 2,3. Vår nuvarande förståelse för hur bladanatomi regleras i gräs är dock begränsad4 och kräver analys av bladprimordia, eftersom många anatomiska och fysiologiska egenskaper hos bladet är förutbestämda tidigt i utvecklingen 5,6,7. Cellulära avbildningstekniker, såsom fluorescens och konfokal avbildning, är oumbärliga för att studera gräsbladanatomi och cellulära egenskaper, men dessa tekniker är svåra att tillämpa på gräsbladprimordia eftersom de är djupt mantlade och rullade inuti bladvirveln. Vi tog itu med denna fråga genom att utveckla metoder för att förbereda tvärsnitt och orullade helbladsfästen för fluorescens och konfokalanalys av majsbladprimordia, ett modellsystem för att studera gräsbladens anatomi och utveckling 2,8.

Majsbladet, som alla gräsblad, består av ett bandliknande blad med en mantel som sveper runt stammen och utvecklar skott 9,10,11,12,13. Bladen utvecklas från skottapikal meristem (SAM) i ett distichous mönster, där varje nytt blad initierar i motsatt position som föregående blad, vilket resulterar i två rader av löv längs den vertikala axeln (Figur 1A)14 . Utvecklingsstadiet för varje bladprimordium identifieras genom dess position i förhållande till SAM, med det närmaste primordium betecknat som plastokron1 (P1) och följande primordia betecknat som P2, P3 och så vidare (figur 1B, C)2. Under utvecklingen (figur 1D) framträder bladprimordium först som en halvmåneformad strävpelare runt basen av SAM (P1) och växer sedan till ett huvformat primordium som sträcker sig över meristem (P2) 9,10,11. Huvens basala marginaler expanderar sedan i sidled och överlappar varandra när spetsen växer uppåt och bildar ett konformat primordium (P3-P5)10. Primordium växer sedan snabbt i längd, och mantelbladsgränsen vid basen blir mer framträdande med bildandet av ligulen, den fransliknande projektionen på bladets adaxiella sida (P6 / P7). Slutligen rullar bladet ut när det kommer ut ur virveln under steady-state-tillväxt, där delningscellerna är begränsade inom bladets lilla basala region och bildar en gradient med expanderande och differentierande celler längs den proximala-distala axeln (P7 / P8)15. Skotttoppen på en majsplanta innehåller flera primordia i olika utvecklingsstadier, vilket gör den till en utmärkt modell för att studera bladutveckling8.

Noggrann analys av tidig bladutveckling kräver iscensättning eller användning av standardiserade kriterier för att definiera distinkta stadier av primordiumutveckling i förhållande till andra tillväxt- eller morfologiska parametrar. Eftersom bladprimordia är dolda i grässkottet använder utredare vanligtvis parametrar som växtens ålder eller storleken på de framväxande bladen som prediktorer för stadierna och storlekarna på bladprimordia 9,16. I majs bestäms växtens kronologiska ålder antingen av antalet dagar efter plantering eller groning (DAP/DAG)17,18. Det vegetativa stadiet (V-steget) bestäms av det översta bladet med en synlig krage, en blek linje på den abaxiella sidan mellan bladet och manteln som motsvarar ligulens och auriklarnas position, ett par kilformade regioner vid bladets bas (figur 1A,B)17,19 . Mellan 20 och 25 DAG övergår SAM till en blomställning meristem och upphör att producera nya blad20. Tillväxthastigheten för majsbladprimordia kan variera beroende på miljön och växtens genotyp. Av denna anledning kan växtåldern och storleken på de framväxande bladen inte exakt förutsäga storleken på bladprimordia; Att använda dessa parametrar kan dock hjälpa till att förutsäga intervallet för Primordia-stadier och storlekar för experimentella ändamål.

Tvärsnittsanalys är en populär metod för att undersöka bladanatomi och utveckling i majs och andra gräs eftersom det möjliggör provtagning av flera plastokroner i en enda sektion över skottet21,22,23. Denna metod är också lämplig för cellulär avbildning av färska prover, eftersom de omgivande bladen fungerar som en byggnadsställning som håller bladprimordia på plats under sektionering och montering24. En nackdel med denna metod är dock att det kan vara utmanande att exakt lokalisera målplastokranen och regionen inom primordium vid snittning från en intakt skott. Eftersom bladtillväxten varierar mellan plastokroner och längs den proximala-distala axeln 2,5 kan dessutom inexakt provtagning leda till en felaktig tolkning av primordiumets utvecklingsstadium och region i ett givet avsnitt. Därför är det viktigt att utveckla en metod för exakt tvärsnittsprovtagning för att säkerställa noggrannheten och reproducerbarheten av anatomiska och utvecklingsanalyser av gräsbladprimordia.

Helbladsmonteringsanalys möjliggör omfattande och integrativ undersökning av vävnads- och cellulära processer som uppträder på helorganskalan, såsom proliferativ tillväxt25 och venmönstring26,27,28. Metoden ger en paradermal översikt över bladet, vilket möjliggör upptäckt av distinkta processer och mönster som annars skulle vara svåra att upptäcka med hjälp av tvärsnittsanalys24,27. Till skillnad från Arabidopsis, där det redan finns etablerade metoder för avbildning av helbladsfästen29,30, finns det för närvarande ingen standardmetod för avbildning av orullade helbladsfästen i gräs. Ett tidigare protokoll för utrullning av isolerat majsbladprimordia involverade ovanliga material och var inte lämpligt för cellulär avbildning31. Avancerade avbildningstekniker, såsom datortomografi (CT) och magnetisk resonanstomografi (MRT), kan förvärva 3D-anatomisk information utan att isolera och rulla ut primordia 11,32,33, men de är dyra och kräver specialutrustning. Att utveckla en teknik för att övervinna de begränsningar som den rullade och koniska morfologin hos bladprimordia i majs och andra gräs skulle främja undersökningar av deras anatomiska och utvecklingsegenskaper.

Här presenterar vi metoder för att förbereda tvärsnitt och rullade ut hela fästen av majsbladprimordia för fluorescens och konfokal avbildning. Vi använde dessa metoder för att kvantifiera venantal och kartlägga fördelningen av rumsligt-temporalt hormon i majsbladprimordia med fluorescerande proteiner (FPs)24. Den första metoden innebär att man tar bort den övre delen av äldre löv från majsplantor med en trådstrippare (figur 1E). Genom att exponera primordiumspetsen (P5-P7) blir det möjligt att bestämma dess längd utan att helt behöva ta bort de äldre omgivande bladen, vilket möjliggör enkel och exakt sektionering. Den andra metoden innefattar avrullning och montering av helbladig primordia (P3-P7) med klar, dubbelsidig nanotejp (figur 1F). Dessa metoder är lämpliga för att visualisera olika FP24 men behöver optimering för att använda fluorescerande färgämnen och clearingreagens. Dessutom beskriver vi några procedurer för att platta z-stackar, sy bilder och slå samman kanaler i ImageJ / FIJI34, som gäller för bilderna som produceras med de två metoderna. Dessa metoder är användbara för rutinmässig fluorescens eller konfokal avbildning av majsblad, men de kan också anpassas för andra modellgräsarter, såsom ris, setaria och brachypodium.

Figure 1
Figur 1: Organisation och morfologi av majsbladprimordia och översikt över metoderna . a) Schematisk framställning av en majsplanta. Majs har en distichous phyllotaxy, med det nya bladet som initierar i motsatt position som föregående blad. Bladnumret anger den kronologiska ordning i vilken bladen uppstod från groning (dvs. första bladet, L1; andra bladet, L2; tredje bladet, L3; etc.). Varje blad har ett distalt blad och en basalmantel avgränsad av en krage som motsvarar ligulen och öronen. Det översta bladet med kragen synlig betecknar det vegetativa stadiet. Plantan i detta exempel är i V2-steget, med L2-kragen (pilspetsen) synlig. Saxikonen anger platsen vid mesocotyl (mig) där plantan måste skäras för att kunna samlas in. (B) Schematisk representation av den dissekerade skottet som visar isolerad L1 till L4, med bladprimordia L5 till L9 som en förstorad bild i (C). Plastokrantalet anger primordiumets position i förhållande till SAM, med det yngsta bladprimordium (P1) närmast SAM och det äldre bladprimordia (P2, P3, P4 och så vidare) successivt längre bort2. D) Schematisk framställning av morfologin hos majsbladprimordia från P1 till P5. E) Schematisk översikt över metoden för tvärsnittsanalys av primordia av majsblad. (1) Trimma de äldre bladen med en trådstrippare. (2) Mät primordium och sektionera skottet. (3) Montera sektionen på ett objektglas för bildbehandling och bearbetning (4, 5). F) Schematisk översikt över metoden för helmonteringsanalys av majsbladets primordia. (1) Ta bort de omgivande bladen för att extrahera primordium. (2) Klipp och rulla ut primordium platt på nanotejpen. (3) Montera provet för bildbehandling och bearbetning (4, 5). Förkortningar: L = blad; bl = blad; sh = mantel; co = krage; mig = mesocotyl; V = vegetativ; P = plastokron; SAM = skjut apikalt meristem. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

1. Iscensättning av majsbladutveckling och utformning av experimentet

  1. Växande växter och iscensättning av bladutveckling
    1. Bestäm ålder och utvecklingsstadium för de växter som ska användas för experimentet och utför en detaljerad iscensättning av bladutveckling.
      OBS: Det rekommenderas att iscensättningen utförs på växter med samma genetiska bakgrund som de muterade eller transgena linjer som kommer att användas i experimenten. SAM slutar producera nya blad mellan 20 och 25 DAG, beroende på den genetiska bakgrunden och tillväxtförhållandena. Av denna anledning är de metoder som beskrivs här idealiska för majsplantor i åldern 7-14 DAG.
    2. Odla majsplantorna i ett växthus eller en tillväxtkammare enligt ett lämpligt växtskyddsprotokoll35.
    3. Samla växterna i önskad ålder eller V-steg med en liten kniv eller sax genom att skära vid mesocotyl, som är stammen under markytan (figur 1A). Sätt försiktigt in skärverktyget i jorden bredvid plantan och skjut ner det till basen i 45 ° vinkel för att skära mesocotylen.
    4. Lyft plantan ur jorden och damma bort eventuell kvarvarande smuts eller jordpartiklar som kan klamra sig fast vid växten. Ta bort coleoptile, den skyddande manteln som täcker den framväxande skottet i unga plantor, för hand.
    5. För varje växt, registrera V-steget, antalet blad och längden på det sista bladet som kommer från virveln. Ta bilder av växterna för framtida referens.
    6. Ta bort de äldre bladen en efter en. För att göra detta, håll växten genom resterna av mesocotyl eller stammen och skära ut varje blad från mantelns botten och veckla försiktigt ut manteln på ett cirklande sätt med en tandsond (figur 1B).
      Se steg 2.1 för en snabb metod för att ta bort de omgivande bladen.
    7. Under ett stereomikroskop med cirka 2x förstoring, dissekera försiktigt resten av skottspetsen på fuktiga våtservetter för att förhindra att provet torkar ut. Punktbeskatta försiktigt och veckla ut varje bladprimordium med en tandsond med en böjd nål eller ett par fina pincett tills SAM, P1 och P2 är synliga (figur 1D). Registrera utseende och mätning av varje plastokron.
      OBS: Se ett exempel på bladutveckling i majsplantor i kompletterande fil 1.
  2. Planera experimentet
    OBS: Att planera experimentet noggrant kan förbättra effektiviteten. Till exempel, i tvärsnittsanalys, kan bestämning av den ungefärliga platsen som ska skäras vid avbildning av specifika plastokroner eller regioner minska dissektionstiden. Figur 2 visar ett exempel på standardiserad provtagning. Dessutom kan optimering av bildparametrarna baserat på egenskaperna hos FP eller fluorescerande sonder förbättra experimentens effektivitet.
    1. Använd iscensättningsinformationen som en guide för att fokusera experimentet på specifika plastokroner, primordiumregioner och vävnader. Använd FP eller andra fluorescerande sonder av intresse för att följa avsnitt 2 och / eller 3 nedan på några prover.
      Anmärkning: Se tillgängliga utsädeslager för majs FP linje 36-42 vid https://www.maizegdb.org/data_center/stock.
    2. Bestäm de optimala bildinsamlingsparametrarna för varje FP-reporter eller sond, inklusive lämplig detektor eller filter, excitations- och emissionsvåglängder, pinhålstorlek och andra inställningar. Spara inställningarna för att återskapa arbetsförhållandena för vart och ett av experimenten.
      OBS: Se Linh och Scarpella30 för några tekniska riktlinjer för konfokal laserskanningsmikroskopi av framväxande löv.
    3. Planera bildtagningstiden baserat på halveringstiden och andra egenskaper hos FP-reportern43.
      OBS: Tiden mellan dissektion och avbildning måste också beaktas vid planering av ett experiment, eftersom färska växtprover utsätts för uttorkning och cellförändringar under denna period.

Figure 2
Figur 2: Provtagningsschema för tvärsnittsanalys av primordia av majsblad. (A, vänster) Proximalt skott av en 7 DAG-majsplanta som visar ett exponerat fjärde blad (L4) vid P7. De brutna linjerna anger de sju provtagningspunkterna längs primordiet, från 0,5 mm till 10 mm. (A, höger) Schematisk representation av bladprimordia, med den projicerade storleken och positionen för varje plastokron: P7 (vit); P6 (magenta); P5 (blå); P4 (grön); och P3 tills SAM (gul). (B-H) Fluorescensbilder av tvärsnitt som representerar provtagningspunkterna i A från 10 mm (B) till 0,5 mm (H). Primordia är pseudofärgade enligt plastochronfärgschemat i (A). Sektionerna avbildades med ett epifluorescensmikroskop med hjälp av ett UV-filter för långpassemission för autofluorescens. Skalstång = 200 μm (B-H). Denna figur har modifierats och reproducerats med tillstånd från Robil och McSteen24. Förkortningar: DAG = dagar efter spiring; P = plastokron; SAM = skjuta apikal meristem; † = bladmantel eller egentlig förligula, * = skjut apikalt meristem; ** = stam. Klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Avbildning av tvärsnitt av majsblad primordia

  1. Strippa äldre omgivande löv och mäta bladprimordium
    1. Samla upp plantan genom att försiktigt klippa den vid mesocotylen under markytan med en liten kniv eller sax, enligt beskrivningen i steg 1.1.3-1.1.4 (figur 1A).
    2. Bestäm rätt trådborttagningshålstorlek som ska användas och var snittet ska göras längs skottet. Se till att hålet är tillräckligt stort för att passa målet primordium.
    3. Börja klippa vid den mer distala delen av skottet och arbeta gradvis mot basen tills primordiumets spets exponeras.
    4. För att göra snittet, håll trådstripparen med käftarna mot skottet. Placera skottet mot det valda hålet och pressa ihop stripparhandtagen för att skära igenom bladvirveln.
      OBS: För att undvika att oavsiktligt skära målprimordiet, rikta försiktigt in skottets mitt med hålet i trådstripparen. För större växter rekommenderas att manuellt ta bort några av de omgivande bladen för hand innan du använder stripparen.
      VARNING: Trådstrippare har vassa käkar som kan orsaka skärsår eller andra skador om de inte används försiktigt.
    5. Medan du fortsätter att pressa ihop handtagen, skjut stripparen bort från skottet för att trimma den övre delen av bladen. Se till att målområdet i primordium förblir täckt av de omgivande bladen (kompletterande figur S1C, D).
      OBS: Efter trimning av de övre bladen lämnas skottet med en exponerad primordiumspets (P5, P6 eller P7, beroende på snittets position och storleken på det trådstripphål som används; Figur 1E). Detta primordium kommer att fungera som referens för att uppskatta storleken och stadiet av yngre primordia. P6 är den mest praktiska referensen att använda i majsplantor på grund av dess storleksintervall och stiftliknande morfologi.
    6. Använd en linjal för att mäta längden från primordiumets spets till skottets botten. Registrera mätningen.
      OBS: Längden på primordium kommer att överskattas något eftersom det finns några millimeter stam vid basen av primordia (figur 2A).
  2. Frihandssnittning och avbildning av bladprimordium
    1. Under ett stereomikroskop med cirka 0,8x förstoring, håll skottet stadigt på en slät yta, till exempel en skärbräda av glas eller annat reptåligt material. Använd ett rakblad eller skalpell för att skära tunna sektioner (0,25-0,8 mm) av skottet vid önskade punkter längs primordiumets längd.
    2. Gör ett första snitt något ovanför målområdet för att kasta den distala delen av skottet och få sedan tunna sektioner runt målområdet. För att göra rena snitt, håll bladet vinkelrätt mot skottet och skjut det inåt med en jämn, jämn rörelse.
      OBS: Det kan finnas några millimeter sektionsutrymme för större primordia (P6 eller P7). För mindre primordia (P5 och tidigare) kan dock 1 mm göra en signifikant skillnad i provtagningen, eftersom dessa primordier staplas upp inom de första millimeterna från skottets bas (se figur 2A, F-H). Det rekommenderas att använda ett tveeggat rakblad för finare sektionering.
      VARNING: Var försiktig när du använder rakblad och skalpeller för att undvika oavsiktliga skärsår eller skador.
    3. Byt ut rakbladet regelbundet, eftersom bladmantlarna lätt kan slöa bladet. Täck skottet med fuktiga våtservetter efter varje sektionsomgång för att förhindra att provet torkar ut.
    4. Montera bladsektionen på en ren glasskiva (75 mm x 25 mm), använd en pipett för att applicera en droppe vatten (eller 50% glycerol) direkt på sektionen och placera en täckglas (22 mm x 22 mm) ovanpå.
    5. Om du använder ett fluorescerande färgämne, applicera färglösningen på sektionen, placera en täckglas ovanpå och inkubera den efter behov.
      OBS: Beroende på typen av färgämne kan ytterligare steg för bearbetning av bladsektionerna vara nödvändiga innan du fortsätter till nästa steg. Dessa referenser44,45,46,47 ger allmänna detaljer och användningar av fluorescerande färgämnen vid avbildning av växtceller. Ett kärnfärgande fluorescerande färgämne, 5-etynyl-2′-deoxiuridin (EdU), har använts effektivt på tvärsnitt av majsblad primordia48. Däremot ger plasmamembranfärgningsfärgämnen, såsom Fei Mao 4-64 (FM 4-64) och propidiumjodid, inte tillfredsställande resultat (figur 3A-D).
    6. Placera bilden på scenen i ett epifluorescens- eller konfokallaserskanningsmikroskop och justera fokus och inställningar efter behov för att visualisera fluoroforen30. Se tabell 1 för de belysnings- och bildinsamlingsinställningar som används för utvalda FP-reporterlinjer för majs.
      OBS: Tjocka sektioner kan ge höga nivåer av bakgrundsautofluorescens. Överväg några strategier för bildbehandling och provberedning som kan hjälpa till att mildra detta problem30,49 (se tabell 2).
      VARNING: Var försiktig och använd skyddsglasögon när du arbetar med kraftfulla ljuskällor och lasrar för att minska risken för ögonskador.
    7. Bild genom bladsektionen vid olika förstoringar och detekteringskanaler (inklusive ljusfältsbelysning)30. Använd 4x förstoring för att avbilda hela tvärsnittet och 20x eller 40x förstoring för att avbilda specifika vävnader. Minska exponeringstiden vid högre förstoringar för epifluorescensavbildning för att skydda proverna från snabb fotoblekning (se tabell 1).
    8. Ta bilder av hela avsnittet eller specifika intressanta regioner (ROI). Om det behövs, skaffa en z-stack, som är en serie bilder som tagits med olika brännvidder30.
    9. För att få en z-stack, bestäm först de övre och nedre positionerna i provet, sedan antalet optiska sektioner som måste fångas mellan dessa positioner. Färre optiska sektioner resulterar i en större z-stegstorlek, vilket är avståndet mellan varje sektion. Beroende på FP: s egenskaper och den förstoring som används, fånga tre till 25 optiska sektioner med z-stegstorlekar mellan 1 och 12 μm för avbildning av tvärsnitt av majsbladprimordia.
      OBS: För att platta z-stacken, använd en lämplig volymåtergivningsteknik50 som kan åstadkommas genom mikroskopprogramvaran eller genom att använda ImageJ / FIJI34 (se steg 4.1 och 4.2).
    10. Spara alla bildfiler och tillhörande metadata, om sådana finns.

Tabell 1: Inställningar för belysning och bildinsamling som används för fluorescens och konfokal avbildning av utvalda rapportörer för majs. Förkortningar: FP = fluorescerande protein; TRITC = tetrametylrodamin; FITC = fluoresceinisotiocyanat, WLL = laser med vitt ljus; Ar-jon = argonjonlaser; HyD = hybriddetektor; AU = Luftig enhet; Hz = Hertz, skanningslinje per sekund. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

3. Avbildning rullade ut hela fästen av majsblad primordia

  1. Dissekera primordia och förbereda glasskivan med nanotejp
    1. Samla upp plantan genom att försiktigt klippa den vid mesocotylen under markytan med en liten kniv eller en sax, enligt beskrivningen i steg 1.1.3-1.1.4 (figur 1A).
    2. Förbered glasskivan (75 mm x 25 mm) med den klara, dubbelhäftande nanotejpen (kompletterande figur S1H) innan du dissekerar växten. Klipp en rektangulär bit nanotejp och fäst den i mitten av en ren glasskiva. Ta inte bort den skyddande plastfilmen på tejpens ovansida.
      OBS: Bestäm storleken på tejpen som ska användas enligt storleken på proverna som ska avbildas (se exempel på överdimensionerade prover i kompletterande figur S1I, J). Nanotejpen finns i antingen akryl- eller polyuretangelmaterial. Båda typerna är effektiva för fluorescens och konfokal avbildning24. För att förhindra missfärgning av tejpen, skydda den från långvarig exponering för ljus genom att förvara den i en mörk behållare.
    3. Börja dissekera skottet genom att ta bort den övre delen av de äldre bladen med en trådstrippare, som beskrivs i steg 2.1.
    4. Håll skottet vid mesocotylen och ta försiktigt bort de omgivande bladen med en tandsond för att extrahera primordia. För att göra detta, ta bort bladen från skottets botten och veckla ut dem en i taget tills primordium av intresse exponeras.
    5. Alternativt kan du använda trådstripparen för att direkt extrahera bladprimordia genom att göra ett snitt vid skottets basala region (kompletterande figur S1E-G).
      OBS: Denna metod medför en högre risk att knäppa primordia.
  2. Montering och avbildning av primordium.
    1. Ta bort skyddsfilmen från tejpen. Lägg det exponerade primordium på tejpen. Använd ett rakblad för att skära primordium vid basen, kassera basalstammen och hypokotylen (figur 1F).
    2. Rulla ut primordium med en tandsond med en böjd nål (spetsdiameter på 0,25-0,6 mm). Använd en mikrosond (spetsdiameter på 0,15-0,2 mm) för primordia mindre än 3 mm (P3 till tidig P4).
    3. Placera nålspetsen parallellt med ytan och veckla ut den yttre basalmarginalen, tryck den försiktigt mot tejpen.
    4. För mjukare utrullning, smörj bladets inre yta (adaxial) genom att doppa nålspetsen i 100% glycerol.
    5. Med den yttre marginalen fäst vid tejpen, rikta in nålspetsen parallellt med bladets långa axel. Skjut försiktigt nålen i sidled för att rulla ut och platta bladet på tejpen (figur 1F).
      OBS: Att bryta eller skada bladet under rullning är vanligt, särskilt i större primordia med en robust midrib (se figur 3E-G). Att rulla ut bladet kraftigt kan blåsa ytan och producera artefakter under avbildning (figur 3H). Se tabell 2 och diskussionen för rekommenderade lösningar på dessa problem.
    6. Applicera en droppe vatten på det orullade primordiumet. Lägg omedelbart ett täckglas ovanpå vattendroppen och primordiumet. Tryck försiktigt ner kanterna på täckglaset så att de fäster vid tejpen.
      OBS: Det rekommenderas att använda stora rektangulära täckglas (50 mm x 24 mm eller 60 mm x 24 mm) med extra områden för att fästa på tejpen. Minimera bildandet av luftbubblor, vilket kan förvränga bladet och orsaka ojämn ljusbrytning (se figur 3I-K). Se till att täckglaset fäster helt på tejpen, eftersom marginalerna på det monterade primordium kan rulla tillbaka in under ett löst vidhäftat täckglas (se figur 3L).
    7. Placera bilden på scenen av en epifluorescens (se kompletterande figur S1K) eller konfokalt laserskanningsmikroskop och justera fokus och inställningar efter behov för att visualisera fluoroforen30. Se tabell 1 för de belysnings- och bildinsamlingsinställningar som används för de valda rapportlinjerna för majs.
    8. Avbilda hela bladet eller en specifik ROI genom olika detekteringskanaler30. För att avbilda hela bladet, antingen manuellt fånga mosaikbilder av bladet eller använd mikroskopets kakeloperation vid låg förstoring (4x eller 10x).
      OBS: Även vid den lägsta förstoringen kan majsbladprimordia vara för stor för att avbildas med ett epifluorescens- eller konfokallaserskanningsmikroskop, vilket resulterar i längre bildtider som kan resultera i fotoblekning (se figur 3M) eller ökad bakgrundsautofluorescens. Därför rekommenderas att man använder ett fluorescensstereomikroskop för avbildning av helbladsprover större än 5 mm.
    9. För konfokal avbildning är det nödvändigt att erhålla z-staplar som omfattar bladets tjocklek (se steg 2.2.9).
    10. Spara alla bildfiler och tillhörande metadata, om sådana finns.

Tabell 2: Felsökning av vanliga problem vid avbildning av tvärsnitt och hela fästen av majsbladprimordia. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Figure 3
Figur 3: Suboptimal tvärsnitt och helmonterad beredning av majsbladprimordia. (A-D) Representativa konfokala bilder av tvärsnitt av bladprimordia med en plasmamembranmarkör, PIP2-1-CFP (A), och ett plasmamembranbindande fluorescerande färgämne, FM 4-64 (B), med motsvarande ljusfältsbilder (C,D). Jämfört med PIP2-1-CFP visar FM 4-64 suboptimal visualisering av cellkonturer. (E-M) Representativa fluorescensbilder av hela fästen av bladprimordia som visar förekomst av rivning (E-G), blåslagna ytor† (H), luftbubblor* (I–K), bakåtrullade marginaler (L) och fotoblekta områden‡ (M). Bladprimordia uttrycker DII-Venus (E-G), GAR2-YFP (H-J), mDII-Venus (K), PIN1a-YFP (L) och DR5-RFP (M). Skalstapel = 200 μm (AD); 500 μm (E-M). Figur 3A har modifierats och reproducerats med tillstånd från Robil och McSteen24, medan figur 5B-M är opublicerade data från författarna. Förkortningar: P = plastokron; YFP = gult fluorescerande protein; RFP = rött fluorescerande protein; CFP = fluorescerande cyanprotein, PIP2-1-CFP = pZmPIP2-1::ZmPIP2-1:CFP; DII-Venus = pZmUbi:DII:YFP-NLS; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; BF = ljusfält. Klicka här för att se en större version av denna figur.

4. Bearbetar bilderna med ImageJ/FIJI

  1. Platta z-staplar med maximal intensitetsprojektion (MIP)
    1. Starta ImageJ/FIJI och öppna stapeln med bilder, eller skapa en ny stapel från flera separata avbildningar genom att välja Image | Travar | Bilder att stapla från menyn.
    2. Välj bildstapeln. På menyn väljer du Bild | Travar | Z-projektet.... I dialogrutan Z-Project väljer du Max intensitet i listrutan Projektionstyp . Klicka på OK för att skapa maximal intensitet z-projektion.
      OBS: Den platta bilden är en 2D-projektion av pixlarna med den högsta intensiteten över z-stacks50. Denna metod är lämplig för att visualisera fluoroforen men inte de anatomiska egenskaperna i ljusfältsbilder av tjocka tvärsnitt och helbladsfästen.
    3. Spara bilden som TIFF (Tagged Image File Format) genom att välja Arkiv | Spara som | Tiff. Ange ett namn för filen och klicka på Spara.
      OBS: Det rekommenderas att använda TIFF för att lagra fluorescens och konfokala bilder, eftersom det behåller kvaliteten och detaljerna när bilden sparas.
  2. Platta z-staplar med hjälp av EDF-plugin (Extended Depth of Field)51
    1. Installera EDF-plugin52. Ladda ner Extended_Depth_Field.jar-filen (version 17.05.2021) från http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ och placera den i mappen "plugins" i ImageJ/FIJI.
    2. Starta ImageJ/FIJI och öppna stapeln med bilder, eller skapa en ny stapel från flera separata avbildningar genom att välja Image | Travar | Bilder att stapla från menyn.
    3. Välj bildstapeln. På menyn väljer du Plugins | Utökat skärpedjup | EDF Enkelt läge. I dialogrutan Utökat skärpedjup använder du skjutreglagen under Hastighet/ kvalitet för att ställa in önskad kvalitet och bearbetningshastighet och reg för höjdkarta för att ange jämnhetsnivå för topografin. Klicka på Kör för att skapa den rekonstruerade avbildningen.
      EDF kombinerar stacken till en skarp, sammansatt 2D-bild genom att projicera bästa fokus51. Denna teknik är användbar för att övervinna det begränsade fokusdjupet och är lämplig för att rekonstruera ljusfältsbilder av tjocka tvärsnitt eller helbladsfästen. Var försiktig när du använder det här filtret för att visualisera fluoroforen eftersom EDF, till skillnad från MIP, justerar bildens kontrast, vilket påverkar pixelintensiteten.
    4. Spara bilden som en TIFF-fil genom att välja Arkiv | Spara som | Tiff. Ange ett namn för filen och klicka på Spara.
  3. Sammanfoga bilder med plugin-programmet Grid/Collection Stitching53
    1. Spara samlingen av bilder eller bildstaplar som ska sys ihop i en enda katalog.
    2. Starta ImageJ/FIJI och välj Plugins | Sömmar | Rutnät/samling sömmar från menyn. I dialogrutan Sammanfogning av rutnät/samling väljer du Okänd position i listrutan Typ och sedan Alla filer i katalogen från Ordning. Klicka på OK.
    3. I dialogrutan Rutnätssömmar: Okänd position, Alla filer i katalogen anger du platsen för bilderna genom att skriva eller klistra in katalogsökvägen i textfältet Katalog eller genom att klicka på Bläddra... för att hitta katalogen. Klicka på OK för att starta sömnadsprocessen.
      Alternativet Okänd position i plugin-programmet Grid/Collection Stitching rekonstruerar en sammansatt bild från en uppsättning sammanhängande bilder genom att analysera deras överlappande regioner. Därför är det här alternativet användbart för att sy mosaik av bilder av tvärsnitt eller helbladsfästen som inte erhålls med hjälp av en kakelskanning.
    4. När sömnaden är klar visas ett nytt fönster med den sydda bilden. Spara bilden som en TIFF-fil genom att välja Arkiv | Spara som | Tiff. Ange ett namn för filen och klicka på Spara.
      OBS: Sammanfogning av stora montage av 2D- och 3D-bilder kan också åstadkommas med hjälp av kommandon för bildrekonstruktion i mikroskopprogramvaran eller genom importalternativen för bioformat i ImageJ/FIJI.
  4. Kombinera flera kanaler med kommandot Sammanfoga kanaler
    1. Starta ImageJ / FIJI och öppna bilderna eller bildstaplarna som ska slås samman.
      Bildstaplar kan först plattas ut med steg 4.1 eller 4.2. MIP rekommenderas generellt för att platta ut fluoroforkanaler, medan EDF är bättre lämpad för att platta ut ljusfältskanaler eller andra kanaler med varierande skärpedjup.
    2. Justera ljusstyrkan och kontrasten på bilderna med Bild | Justera | Ljusstyrka/kontrast. Använd skjutreglagen eller inmatningsfälten för att justera parametrarna och klicka sedan på Använd. Du kan också använda en sträckningsmetod för linjärt histogram genom att välja Process | Förbättra kontrasten .... Ange procentandelen mättade pixlar, välj Normalisera och klicka sedan på OK.
      OBS: När du kvantifierar eller jämför fluoroforsignalintensiteten mellan bilder är det i allmänhet bäst att inte justera ljusstyrkan eller kontrasten eftersom detta kan ändra de relativa pixelintensiteterna i bilden, vilket kan påverka mätningarna och jämförelserna.
    3. Om du vill skilja mellan kanaler använder du pseudofärger på specifika bilder med hjälp av en uppslagstabell (LUT). Det gör du genom att markera bilden och sedan välja Bild på menyn ImageJ/FIJI, klicka på Slå upp tabeller och välja lämplig LUT i listrutan.
    4. På menyn väljer du Bild | Färg | Slå samman kanaler. För varje kanal (C1, C2, C3...) använder du listrutan för att välja den bild som ska tilldelas den kanalen. Klicka på OK för att slå samman kanalerna.
    5. Spara den nya bilden som TIFF genom att välja Arkiv | Spara som | Tiff. Ange ett namn för filen och klicka på Spara.

Representative Results

Tvärsnittsanalys av majsbladprimordia
Vi använde protokollavsnitt 2 för att kvantifiera venantal och karakterisera hormonresponsmönster i tvärsnitt av majsbladprimordia med FP (figur 4)24. För att bedöma rollen av växthormonet auxin i bladtillväxt och venbildning kvantifierade vi antalet vener i bladprimordia hos en auxinbrist majsmutant, försvinnande tofs254. I tidiga plastokroner uppvisar utvecklande vener distinkt cellularisering i mediancellskiktet i majsbladets primordium21,22. Att identifiera och räkna vener med konventionella histologiska tekniker22 kan dock vara arbetskrävande och tidskrävande. Således, för att kvantifiera venerna, använde vi majs auxin efflux proteinmarkör p Zm PIN1a ::ZmPIN1a: YFP41 (PIN1a-YFP nedan), som markerar utvecklande vener och procambialsträngar (PCS; Figur 4A). Med hjälp av protokollavsnitt 2 kunde vi standardisera tvärsnittsprovtagningen genom att mäta primordia före sektionering (figur 4B, C). Vi upptäckte en trend där vt2 har ett bredare primordium och fler vener än normalt (Figur 4D,E)24, vilket överensstämmer med data från fullt expanderade blad55, vilket indikerar att defekten i vt2 började tidigt i bladutvecklingen. Med hjälp av protokollavsnitt 2 kunde vi också systematiskt undersöka uttrycksmönstren för hormonrespons FP-reportrar i bladprimordia (se exempel på bilderna i figur 4F-I). Genom ett standardiserat tvärsnittsprovtagningsschema kartlade vi fördelningen av auxin-, cytokinin- (CK) och gibberellinsyrasvar (GA) över olika plastokroner och regioner av bladprimordia och upptäckte nya svarsmönster som vi antar har konsekvenser för bladtillväxt och venbildning24. Därför visar dessa representativa resultat användbarheten av protokoll avsnitt 2 för tvärsnittsanalys av majsbladprimordia.

Figure 4
Figur 4: Representativa resultat för tvärsnittsanalys av primordia av majsblad. (A–E) Kvantifiering av venantal och primordiumbredd i bladprimordia hos normal och försvinnande tofs2 med auxineffluxproteinmarkören PIN1a-YFP. (A) Representativa fluorescensbilder av tvärsnitt av P5 till P7 som uttrycker PIN1a-YFP i utvecklande vener och prokambialsträngar. De tvärgående sektionerna avbildades med ett epifluorescensmikroskop med hjälp av ett FITC-filter (495-519 nm excitation). Antalet vener och primordiumbredden kvantifierades med hjälp av flerpunkts- respektive frihandslinjeverktygen i FIJI/ImageJ. B) En majsplanta med de övre bladvirvlarna avlägsnade med en trådstrippare för att exponera spetsen på det fjärde bladet (L4). Fästet sträcker sig över den projicerade primordiumlängden, med den streckade linjen som indikerar mellanlängden. (C) Schematiskt diagram över olika primordiumformer från P5 till P7, som illustrerar hur venantal och primordiumbredd vid mitten av längden (horisontell streckad linje) kan variera beroende på primordiumets utvecklingsstadium. (D,E) Mätning av primordiumbredd (D) och venantal (E) vid mittlängdssektionen av L4 av normal och vt2. Trendlinjen representerar 10 mm rullande medelvärden av mätningar ± standardfel av medelvärdet (SEM). (F-I) Representativa konfokala bilder av tvärsnitt av bladprimordia som uttrycker kombinationer av PIN1a-YFP, auxin response reporter, DR5-RFP, cytokinin response reporter, TCS-Tomato, gibberellinsyra-responsiv markör, GAR2-YFP och mDII-Venus, en muterad version av auxinsignalingångsreportern DII-Venus. FP-kanalerna läggs ovanpå ljusfältskanalen i varje bild. Skalstapel = 200 μm (A); 10 mm (B), 100 μm (F-I). Denna figur har modifierats och reproducerats med tillstånd från Robil och McSteen24. Förkortningar: DAG = dagar efter spiring; P = plastokron; vt2 = försvinnande tofs2; PCS = prokambial sträng; YFP = gult fluorescerande protein; FITC = fluoresceinisotiocyanat, RFP = rött fluorescerande protein; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-tomat = TCSv2::NLS-tdTomat; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Helmonteringsanalys av majsbladprimordia
Vi följde protokollavsnitt 3 för att visualisera och analysera FP-uttryck i helbladsfästen av majsbladprimordia (figur 5). Genom att visualisera venmönster med PIN1a-YFP fann vi att bildandet av vener sker i hela primordium under tidiga plastokroner, men denna process blir begränsad i de proximala regionerna senare i utvecklingen (Figur 5A)24. Som komplement till de tvärsnittsanalyser har helbladsmonteringsanalyserna avslöjat vävnads- och stadiespecifika mönster för hormonrespons under venbildning24. Ett exempel är uttrycksmönstret för CK-svarsreportern TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato), i förhållande till PIN1a-YFP-uttrycket (figur 5B)24. Genom att följa protokollavsnitt 3 kunde vi utföra både kvalitativa och kvantitativa analyser av FP-uttryck i bladprimordia (Figur 5D-F; opublicerade data). Vi undersökte uttrycksmönstren för en auxin-svarsreporter, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), och en GA-responsiv markör, p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), i helbladsfästen av enkla och dubbla mutanter av vt2 och dvärgväxt3 (d3), en GA-bristfällig mutant56 (figur 5D). Vi jämförde också de relativa nivåerna av cellproliferation mellan normal och vt2 bladprimordia med p Zm Cyclin-D2B :: ZmCyclin-D2B: YFP42 (Cyclin-D2B-YFP), vilket är en markör för G1 / S-övergången i cellcykeln 57 (figur 5E, F). Även om det inte fanns någon signifikant skillnad mellan normal och vt2, överensstämde Cyclin-D2B-YFP-uttrycket med den kända cellproliferationsprofilen för tidiga plastokroner31. Vi drar slutsatsen att protokollavsnitt 3 är en effektiv metod för att analysera hela fästen av majsbladprimordia, som är svåra att avbilda på grund av deras rullade morfologi.

Figure 5
Figur 5: Representativa resultat för helmonteringsanalys av primordia av majsblad. a) Representativa fluorescensbilder av bladprimordier från 7 DAG-majsplantor som visar framväxande vener och prokbiala strängar, markerade med auxineffluxproteinmarkören PIN1a-YFP. P3-P6 primordia skars ut från basen, rullades ut och plattades med den adaxiella sidan uppåt. Infällningar visar närbilder av P3 och P4. I P5 och P6 avgränsar streckade linjer den distala änden av de proliferativa zonerna, där majoriteten av procambialsträngarna fortfarande utvecklas och sträcker sig. (B,C) Representativa konfokala bilder som visar uttrycket av PIN1a-YFP och cytokinin responsreporter, TCS-Tomato, i den proximala marginalregionen av ett P5-primordium. (D) Representativa fluorescensbilder av P4 primordia som visar uttrycket av auxin response reporter, DR5-RFP och gibberellinsyra-responsiv markör, GAR2-YFP i normala och enkla och dubbla mutanter av försvinnande tofs2 och dvärgplanta3. E) Representativa konfokala bilder av P3 och/eller P4 som visar uttrycket av Cyclin-D2B-YFP, en rapportör för G1/S-övergången i cellcykeln. (F) Relativa mängder cellproliferation i P3/P4-bladprimordia av normal och vt2, kvantifierad genom mätning av den integrerade densiteten hos Cyclin-D2B-YFP-signalen över primordiumområdet med användning av ImageJ/FIJI. Staplarna representerar medelvärdet ± medelfelet för medelvärdet. Skalstapel = 500 μm (A,D,E); 200 μm (B). 100 μm (C). Figur 4A-C har modifierats och reproducerats med tillstånd från Robil och McSteen24, medan figur 4D-F är opublicerade data från författarna. Förkortningar: DAG = dagar efter spiring; P = plastokron; vt2 = försvinnande tofs2; d3 = dvärgväxt3; YFP = gult fluorescerande protein; RFP = rött fluorescerande protein; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-tomat = TCSv2::NLS-tdTomat; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Cyklin-D2B-YFP = pZmCyklin-D2B::ZmCyklin-D2B:YFP; ns = ingen signifikant skillnad; au = godtycklig enhet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande fil 1: Exempel på bladutveckling i majsplantor. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S1: Växtprover och material som används i protokollen. (A,B) En majsplanta 7-8 DAG med den övre bladvirveln borttagen med hjälp av en trådstripper. (B) Infällningen visar en närbild av skottet med det exponerade P6-primortoriet. (C-G) Skott av majsplantor med de övre virvlarna borttagna för tvärsnittsanalys (C,D) och omgivande blad helt borttagna för helmonteringsanalys (E-G). (H) En rulle polyuretangelklar dubbelhäftande nanotejp. (I,J) P6-bladprimordium (I) och proximal region av P8-blad (J) rullas ut och monteras på glasskivor med nanotejpen. K) En glasskiva med ett orullat bladprimordium monterat på scenen i ett epifluorescensmikroskop. Förkortning: DAG = dagar efter spiring. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Vi presenterar två metoder för beredning av majsbladprimordia för cellulär avbildning. Den första metoden (protokollavsnitt 2) möjliggör mätning av primordium för tvärsnittsanalys, medan den andra metoden (protokollavsnitt 3) möjliggör avrullning och utplattning av primordium för helmonteringsanalys. Dessa metoder underlättar cellulär avbildning av ramprogram i majsblad primordia24 (som visas i figur 4 och figur 5) och ger enkla lösningar på utmaningarna med att avbilda utveckling av majsblad. Protokoll avsnitt 2 minskar dissektionstiden och förbättrar provtagningsnoggrannheten genom att mäta primordia före sektionering snarare än att enbart förlita sig på mellanlagringsparametrarna 9,16. Med kommersiellt tillgänglig nanotejp löser protokollavsnitt 3 det långvariga problemet med att avbilda helbladiga primordier i majs. Detta protokoll förbättrar den tidigare metoden, som använde dialysslang 31, och är ett mycket billigare alternativ till CT och MR11,32,33. Men när det gäller att visualisera bladanatomiska egenskaper och producera optimala resultat har båda protokollen vissa begränsningar, som beskrivs i tabell 2 och diskuteras mer detaljerat nedan.

I protokollavsnitt 2 stötte vi på svårigheter att visualisera cellkonturer i tjocka tvärsnitt av bladprimordia, och motfärgning med cellväggs- eller plasmamembranbindande fluorescerande färgämnen gav inte tillfredsställande resultat. Till exempel gav FM 4-64 suboptimala resultat jämfört med plasmamembranets FP-markör, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Figur 3A-D). För att övervinna denna begränsning rekommenderar vi att du använder ett vibratom för att producera tunnare vävnadssnitt (~ 0,1 mm)58 vilket möjliggör en levande ljusfältsavbildning av cellkonturer eller optimering av motfärgningsprotokollet 47,59.

I protokollavsnitt 3 är huvudbegränsningen svårigheten att montera bladet utan att riva, skada eller luftbubblor, vilket beskrivs i protokollstegen 3.2.5-3.2.6 (figur 3E-K). Eftersom majsbladet är bilateralt symmetriskt kan ett halvbladsfäste snarare än ett helbladsfäste vara tillräckligt för visualisering9. För att göra detta kan primordium skäras med ett rakblad längs längdaxeln efter att ha rullat upp det till mittribben, så att endast hälften av bladet kan monteras. En annan begränsning i protokollavsnitt 3 är att bladets tjocklek kan begränsa fluoroforsignalens optiska upplösning under djupavbildning. För att lösa detta problem är det möjligt att använda en vävnadsrensningsteknik60. Vi fann dock att ClearSee61, ett vanligt clearingreagens för avbildning av växtvävnader, inte är kompatibelt med protokollet eftersom det gör att provet och täckglaset lossnar från nanotejpen. En potentiell lösning på detta problem kan vara att applicera ett semipermeabelt membran31 över bladprovet, så att det kan behandlas med clearinglösningen medan det hålls på plats av nanotejpen. En sådan metod som gör det möjligt att applicera flytande lösningar på det orullade bladet kan också användas för helmonterade RNA in situ-hybridiserings- och immunlokaliseringstekniker, som tidigare har optimerats för att utveckla majsblomställningar men inte för helbladiga primordia62,63.

Vi beskrev protokoll för majs, som har stora bladprimordia även vid plantstadiet. Andra gräsarter med mycket mindre bladprimordia, såsom ris, korn, vete, setaria och Brachypodium 16,23,64,65,66, kan kräva användning av ytterligare precisionsverktyg för att effektivt tillämpa dessa protokoll. Dessutom var dessa protokoll inte avsedda för levande cellavbildning, som fångar dynamiska processer i realtid för vävnadsbildning och cellulära svar. Men eftersom fluorescerande sonder, bildteknik och datorkapacitet fortsätter att utvecklas inom levande cellavbildning för växter67, kan framtida forskning bygga på dessa protokoll för att utveckla levande cellavbildningsstrategier skräddarsydda för de unika egenskaperna hos gräsbladprimordia.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Maize Genetics Cooperation, Maize Cell Genomics Project, Dave Jackson (Cold Spring Harbor Laboratory, NY), Anne W. Sylvester (Marine Biological Laboratory, University of Chicago, IL), Andrea Gallavotti (Rutgers University, NJ) och Carolyn G. Rasmussen (University of California, Riverside) för att tillhandahålla mutanta och transgena bestånd, liksom Robert F. Baker och Alexander Jurkevich från Advanced Light Microscopy Core vid University of Missouri-Columbia för deras hjälp med konfokalmikroskopi. JMR stöddes av J. William Fulbright Fellowship, Diane P. och Robert E. Sharp Fund och National Science Foundation's Plant Genome Research Program (IOS-1546873) till PM. CDTC, CMRV, EDCDP och RJRR stöds av Ateneo College Scholarship Program. CDTC, EDCDP och RJRR stöds av DOST-SEI S&T Undergraduate Scholarship. DODL stöds av Fr. Thomas Steinbugler SJ Academic Scholarship. RJRR stöds av Aiducation International – Pathways to Higher Education Scholarship. Detta arbete stöddes av School of Science and Engineering och Rizal Library, Ateneo de Manila University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick EZlifego Store (Amazon) B07YB1ZXG6 1 roll
Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in Bausch & Lomb N1692 9 1 pc
Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in Storz Opthalmic Instruments E0542 1 pc
Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in) Ted Pella 13553 1 pc
DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper Dowell Store (Amazon) 10-22 AWG 1 pc
Feather Double Edge Carbon Steel Blades Ted Pella 121-9 pkg/10; for fine sectioning
Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm Ted Pella 260442 pkg/144
GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades Ted Pella 121-1 box/200; for general cutting/sectioning
Glycerol Thermo Scientific PI17904 1 liter
ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin National Institutes of Health (NIH) USA version 2.9.0/1.54s The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).
Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm Kimtech Science 34155 box/280 ply
Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260140 1 ounce
PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick Yecaye Store (Amazon) L354 W1.18 2 rolls
Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260166 1 ounce
Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260168 1 ounce
Tempered Glass Cutting Board Hacaroa (Amazon) B09XMXBT5S 4 pc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McSteen, P., Kellogg, E. A. Molecular, cellular, and developmental foundations of grass diversity. Science. 377 (6606), 599-602 (2022).
  2. Wang, P., Vlad, D., Langdale, J. A. Finding the genes to build C4 rice. Current Opinion in Plant Biology. 31, 44-50 (2016).
  3. Wang, P., et al. Candidate regulators of early leaf development in maize perturb hormone signalling and secondary cell wall formation when constitutively expressed in rice. Scientific Reports. 7 (1), 4535 (2017).
  4. Perico, C., Tan, S., Langdale, J. A. Developmental regulation of leaf venation patterns: Monocot versus eudicots and the role of auxin. New Phytologist. 234 (3), 783-803 (2022).
  5. Wang, P., Kelly, S., Fouracre, J. P., Langdale, J. A. Genome-wide transcript analysis of early maize leaf development reveals gene cohorts associated with the differentiation of C4 Kranz anatomy. The Plant Journal. 75 (4), 656-670 (2013).
  6. Liu, W. Y., et al. Regulators of early maize leaf development inferred from transcriptomes of laser capture microdissection (LCM)-isolated embryonic leaf cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (35), e2208795119 (2022).
  7. Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (10), 3979-3984 (2013).
  8. Strable, J., Nelissen, H. The dynamics of maize leaf development: Patterned to grow while growing a pattern. Current Opinion in Plant Biology. 63, 102038 (2021).
  9. Reynolds, J. O., Eisses, J. F., Sylvester, A. W. Balancing division and expansion during maize leaf morphogenesis: Analysis of the mutant, warty-1. Development. 125 (2), 259-268 (1998).
  10. Richardson, A. E., et al. Evolution of the grass leaf by primordium extension and petiole-lamina remodeling. Science. 374 (6573), 1377-1381 (2021).
  11. Johnston, R., Leiboff, S., Scanlon, M. J. Ontogeny of the sheathing leaf base in maize (Zea mays). New Phytologist. 205 (1), 306-315 (2015).
  12. Sharman, B. C. Developmental anatomy of the shoot of Zea mays L. Annals of Botany. 6 (22), 245-282 (1942).
  13. Johnston, R., et al. Transcriptomic analyses indicate that maize ligule development recapitulates gene expression patterns that occur during lateral organ initiation. The Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
  14. Sharman, B. C. Leaf and bud initiation in the Gramineae. Botanical Gazette. 106 (3), 269-289 (1945).
  15. Nelissen, H., et al. A local maximum in gibberellin levels regulates maize leaf growth by spatial control of cell division. Current Biology. 22 (13), 1183-1187 (2012).
  16. Itoh, J., et al. Rice plant development: From zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
  17. Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Iowa State University of Science and Technology. , (1986).
  18. Freeling, M., Walbot, V. The Maize Handbook. , Springer Science & Business Media. (2013).
  19. Freeling, M., Hake, S. Developmental genetics of mutants that specify knotted leaves in maize. Genetics. 111 (3), 617-634 (1985).
  20. Durbak, A. R., et al. Transport of boron by the tassel-less1 aquaporin is critical for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 26 (7), 2978-2995 (2014).
  21. Langdale, J. A., Lane, B., Freeling, M., Nelson, T. Cell lineage analysis of maize bundle sheath and mesophyll cells. Developmental Biology. 133 (1), 128-139 (1989).
  22. Bosabalidis, A. M., Evert, R. F., Russin, W. A. Ontogeny of the vascular bundles and contiguous tissues in the maize leaf blade. American Journal of Botany. 81 (6), 745-752 (1994).
  23. Junqueira, N. E. G., et al. Anatomy and ultrastructure of embryonic leaves of the C4 species Setaria viridis. Annals of Botany. 121 (6), 1163-1172 (2018).
  24. Robil, J. M., McSteen, P. Hormonal control of medial-lateral growth and vein formation in the maize leaf. New Phytologist. 238 (1), 125-141 (2023).
  25. Donnelly, P. M., Bonetta, D., Tsukaya, H., Dengler, R. E., Dengler, N. G. Cell cycling and cell enlargement in developing leaves of Arabidopsis. Developmental Biology. 215 (2), 407-419 (1999).
  26. Govindaraju, P., Verna, C., Zhu, T., Scarpella, E. Vein patterning by tissue-specific auxin transport. Development. 147 (13), (2020).
  27. Linh, N. M., Scarpella, E. Leaf vein patterning is regulated by the aperture of plasmodesmata intercellular channels. PLoS Biology. 20 (9), e3001781 (2022).
  28. Verna, C., Ravichandran, S. J., Sawchuk, M. G., Linh, N. M., Scarpella, E. Coordination of tissue cell polarity by auxin transport and signaling. eLife. 8, e51061 (2019).
  29. Sawchuk, M. G., Head, P., Donner, T. J., Scarpella, E. Time-lapse imaging of Arabidopsis leaf development shows dynamic patterns of procambium formation. New Phytologist. 176 (3), 560-571 (2007).
  30. Linh, N. M., Scarpella, E. Confocal imaging of developing leaves. Current Protocols. 2 (1), e349 (2022).
  31. Poethig, R. S., Szymkowiak, E. J. Clonal analysis of leaf development in maize. Maydica. 40, 67-76 (1995).
  32. Sprangers, K., Thys, S., van Dusschoten, D., Beemster, G. T. S. Gibberellin enhances the anisotropy of cell expansion in the growth zone of the maize leaf. Frontiers in Plant Science. 11, 1163 (2020).
  33. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 cofactors, BLH12 and BLH14, regulate internode patterning and vein anastomosis in maize. The Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  34. Schindelin, J., et al. FIJI: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Plant Care Protocols - Maize. The Donald Danforth Plant Science Center's Plant Growth Facility. , Available from: https://www.danforthcenter.org/our-work/core-facilities/plant-growth/ (2019).
  36. Mir, R., et al. A DII domain-based auxin reporter uncovers low auxin signaling during telophase and early G1. Plant Physiology. 173 (1), 863-871 (2017).
  37. DeBlasio, S. L., Sylvester, A. W., Jackson, D. Illuminating plant biology: Using fluorescent proteins for high-throughput analysis of protein localization and function in plants. Briefings in Functional Genomics. 9 (2), 129-138 (2010).
  38. Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: Generation and applications. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 535-543 (2013).
  39. Mohanty, A., et al. Advancing cell biology and functional genomics in maize using fluorescent protein-tagged lines. Plant Physiology. 149 (2), 601-605 (2009).
  40. Baker, R. F., et al. Sucrose transporter ZmSut1 expression and localization uncover new insights into sucrose phloem loading. Plant Physiology. 172 (3), 1876-1898 (2016).
  41. Gallavotti, A., Yang, Y., Schmidt, R. J., Jackson, D. The relationship between auxin transport and maize branching. Plant Physiology. 147 (4), 1913-1923 (2008).
  42. Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), 12 (2015).
  43. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: A cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  44. Geng, Y., Zhou, Y. Confocal live imaging of shoot apical meristems from different plant species. Journal of Visualized Experiments. (145), e59369 (2019).
  45. Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell Biology. 139, Elsevier. 203-223 (2017).
  46. Fodor, E., Ayaydin, F. Fluorescent probes and live imaging of plant cells. Advances in Plant Ecophysiology Techniques. , Springer. 241-251 (2018).
  47. Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. The Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
  48. Conklin, P. A., Johnston, R., Conlon, B. R., Shimizu, R., Scanlon, M. J. Plant homeodomain proteins provide a mechanism for how leaves grow wide. Development. 147 (20), (2020).
  49. Shaw, S. L. Imaging the live plant cell. The Plant Journal. 45 (4), 573-598 (2006).
  50. Klaus, A. V., Schawaroch, V., Frischmann, K. J. Confocal imaging and three-dimensional visualization of thick autofluorescent specimens. Methods in Molecular Biology. 1075, 213-225 (2014).
  51. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Extended depth-of-focus for multi-channel microscopy images: a complex wavelet approach. 2004 2nd IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: Nano to Macro (IEEE Cat No. 04EX821). IEEE. , 660-663 (2004).
  52. Extended Depth of Field. EPFL Biomedical Imaging Group. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2022).
  53. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  54. Phillips, K. A., et al. vanishing tassel2 encodes a grass-specific tryptophan aminotransferase required for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 23 (2), 550-566 (2011).
  55. Robil, J. M., et al. GrasVIQ: An image analysis framework for automatically quantifying vein number and morphology in grass leaves. The Plant Journal. 107 (2), 629-648 (2021).
  56. Helliwell, C. A., Chandler, P. M., Poole, A., Dennis, E. S., Peacock, W. J. The CYP88A cytochrome P450, ent-kaurenoic acid oxidase, catalyzes three steps of the gibberellin biosynthesis pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 2065-2070 (2001).
  57. Gutierrez, R., Quiroz-Figueroa, F., Vazquez-Ramos, J. M. Maize cyclin D2 expression, associated kinase activity and effect of phytohormones during germination. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 166-173 (2005).
  58. Atkinson, J. A., Wells, D. M. An updated protocol for high throughput plant tissue sectioning. Frontiers in Plant Science. 8, 1721 (2017).
  59. Lux, A., Morita, S., Abe, J., Ito, K. An improved method for clearing and staining free-hand sections and whole-mount samples. Annals of Botany. 96 (6), 989-996 (2005).
  60. Heriche, M., Arnould, C., Wipf, D., Courty, P. E. Imaging plant tissues: Advances and promising clearing practices. Trends in Plant Science. 27 (6), 601-615 (2022).
  61. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  62. Chuck, G., Muszynski, M., Kellogg, E., Hake, S., Schmidt, R. J. The control of spikelet meristem identity by the branched silkless1 gene in maize. Science. 298 (5596), 1238-1241 (2002).
  63. Tran, T. M., et al. An optimized whole-mount immunofluorescence method for shoot apices. Current Protocols. 1 (4), e101 (2021).
  64. O'Connor, D. L. PINs Lost and PINs Gained: Auxin-Transport Mediated Patterning in the Grasses. University of California, Berkeley. , Doctoral Dissertation (2012).
  65. Sharman, B. C., Hitch, P. A. Initiation of procambial strands in leaf primordia of bread wheat, Triticum aestivum L. Annals of Botany. 31 (2), 229-243 (1967).
  66. Serra, L., Tan, S., Robinson, S., Langdale, J. A. Flip-flap: A simple dual-view imaging method for 3D reconstruction of thick plant samples. Plants. 11 (4), 506 (2022).
  67. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 199 majs (Zea mays) gräsbladprimordia bladanatomi och utveckling fluorescens och konfokal avbildning tvärsnitt helfäste ImageJ / FIJI cellulär avbildning
Förbättrade metoder för beredning av tvärsnitt och rullade hela fästen av majsbladsprimordia för fluorescens och konfokal avbildning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robil, J. M., Cortez, C. D. T.,… More

Robil, J. M., Cortez, C. D. T., Villafuerte, C. M. R., Dela Peña, E. D. C., De Leon, D. O., Rioja, R. J. R., McSteen, P. Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (199), e65239, doi:10.3791/65239 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter