Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Forbedrede metoder til forberedelse af tværsnit og valsede hele monteringer af majsbladprimordia til fluorescens og konfokal billeddannelse

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65239
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Department of Biology, School of Science and Engineering, Ateneo de Manila University, 2Division of Biological Sciences, Interdisciplinary Plant Group, and Missouri Maize Center, University of Missouri

Summary

Majsbladprimordia er dybt beklædt og rullet, hvilket gør dem vanskelige at studere. Her præsenterer vi metoder til forberedelse af tværsnit og udrullede hele monteringer af majsbladprimordier til fluorescens og konfokal billeddannelse.

Abstract

I majs (Zea mays) og andre græsser (Poaceae) er bladprimordierne dybt beklædt og rullet i bladhvirvlen, hvilket gør det vanskeligt at studere tidlig bladudvikling. Her beskriver vi metoder til forberedelse af tværsnit og udrullede hele monteringer af majsbladprimordia til fluorescens og konfokal billeddannelse. Den første metode bruger en trådfjerner til at fjerne de øverste dele af ældre blade, udsætte spidsen af bladprimordium og tillade dens måling for mere nøjagtig tværsnitsprøveudtagning. Den anden metode bruger klar, dobbeltsidet nanotape til at rulle ud og montere helbladet primordia til billeddannelse. Vi viser nytten af de to metoder til at visualisere og analysere fluorescerende proteinreportere i majs. Disse metoder giver en løsning på udfordringerne ved den karakteristiske morfologi af majsbladprimordia og vil være nyttige til at visualisere og kvantificere bladanatomiske og udviklingsmæssige træk i majs og andre græsarter.

Introduction

Græsafgrøder er en vigtig kilde til mad og biobrændstof til den globale befolkning1, og forbedring af bladanatomi har potentialet til at øge deres produktivitet 2,3. Vores nuværende forståelse af, hvordan bladanatomi reguleres i græsser, er imidlertid begrænset4 og kræver analyse af bladprimordia, da mange anatomiske og fysiologiske træk ved bladet er forudbestemt tidligt i udviklingen 5,6,7. Cellulære billeddannelsesteknikker, såsom fluorescens og konfokal billeddannelse, er uundværlige for at studere græsbladanatomi og cellulære træk, men disse teknikker er vanskelige at anvende på græsbladprimordia, fordi de er dybt beklædt og rullet i bladhvirvlen. Vi løste dette problem ved at udvikle metoder til forberedelse af tværsnit og udrullede helbladsmonteringer til fluorescens og konfokal analyse af majsbladprimordia, et modelsystem til undersøgelse af græsbladanatomi og udvikling 2,8.

Majsbladet består som alle græsblade af et remlignende blad med en kappe, der vikles rundt om stilken og udvikler skud 9,10,11,12,13. Bladene udvikler sig fra skuddet apikale meristem (SAM) i et distichous mønster, hvor hvert nyt blad starter i den modsatte position af det foregående blad, hvilket resulterer i to rækker blade langs den lodrette akse (figur 1A)14 . Udviklingsstadiet for hvert bladprimordium identificeres ved dets position i forhold til SAM, med det nærmeste primordium betegnet som plastochron1 (P1) og de følgende primordier betegnet som P2, P3 osv. (figur 1B, C)2. Under udviklingen (figur 1D) fremstår bladprimordiet først som en halvmåneformet støttepille omkring bunden af SAM (P1) og vokser derefter til et hætteformet primordium, der strækker sig over meristemet (P2)9,10,11. Emhættens basale margener udvider sig derefter sideværts og overlapper hinanden, når spidsen vokser opad og danner et kegleformet primordium (P3-P5)10. Primordiet vokser derefter hurtigt i længden, og kappe-bladgrænsen ved bunden bliver mere fremtrædende med dannelsen af ligule, den frynselignende fremspring på bladets adaxiale side (P6/P7). Endelig ruller bladet ud, når det kommer ud af hvirvlen under steady-state vækst, hvor de delende celler er begrænset inden for bladets lille basale område og danner en gradient med ekspanderende og differentierende celler langs den proksimale-distale akse (P7 / P8)15. Skudspidsen af en majsplante indeholder flere primordia på forskellige udviklingsstadier, hvilket gør den til en fremragende model til at studere bladudvikling8.

Nøjagtig analyse af tidlig bladudvikling kræver iscenesættelse eller brug af standardiserede kriterier til at definere forskellige stadier af primordiumudvikling i forhold til andre vækst- eller morfologiske parametre. Fordi bladprimordierne er skjult i græsskuddet, bruger efterforskere typisk parametre som plantens alder eller størrelsen af de nye blade som forudsigere for stadierne og størrelserne af bladet primordia 9,16. I majs bestemmes plantens kronologiske alder enten af antallet af dage efter plantning eller spiring (DAP/DAG)17,18. Det vegetative stadium (V-trin) bestemmes af det øverste blad med en synlig krave, en lys linje på den abaxiale side mellem bladet og kappen, der svarer til positionen af ligule og aurikler, et par kileformede regioner ved bunden af bladet (figur 1A, B) 17,19 . Mellem 20 og 25 DAG overgår SAM til et blomsterstandmeristem og ophører med at producere nye blade20. Vækstraterne for majsbladprimordia kan variere afhængigt af miljøet og plantens genotype. Af denne grund kan plantens alder og størrelsen af de nye blade ikke nøjagtigt forudsige størrelsen af bladprimordia; Brug af disse parametre kan dog hjælpe med at forudsige rækkevidden af Primordia-stadier og -størrelser til eksperimentelle formål.

Tværsnitsanalyse er en populær metode til undersøgelse af bladanatomi og udvikling i majs og andre græsser, fordi det giver mulighed for prøveudtagning af flere plastokroner i en enkelt sektion på tværs af skuddet21,22,23. Denne metode er også praktisk til cellulær billeddannelse af friske prøver, da de omgivende blade fungerer som et stillads, der holder bladets primordia på plads under sektionering og montering24. En ulempe ved denne metode er imidlertid, at det kan være udfordrende præcist at lokalisere målplastochronen og regionen inden for primordium, når man sektionerer fra et intakt skud. Da bladvæksten varierer på tværs af plastokroner og langs den proksimale-distale akse2,5, kan upræcis prøveudtagning resultere i en forkert fortolkning af primordiumets udviklingsstadium og region i et givet afsnit. Derfor er udvikling af en metode til præcis tværsnitsprøvetagning afgørende for at sikre nøjagtigheden og reproducerbarheden af anatomiske og udviklingsmæssige analyser af græsbladprimordia.

Helbladsmonteringsanalyse muliggør omfattende og integrativ undersøgelse af vævs- og cellulære processer, der forekommer på helorganskala, såsom proliferativ vækst25 og venemønster26,27,28. Metoden giver et paradermalt overblik over bladet, hvilket gør det muligt at opdage forskellige processer og mønstre, der ellers ville være vanskelige at opdage ved hjælp af tværsnitsanalyse24,27. I modsætning til i Arabidopsis, hvor der allerede findes etablerede metoder til billeddannelse af helbladsmonteringer29,30, findes der i øjeblikket ingen standardmetode til billeddannelse af rullet helbladsmontering i græsser. En tidligere protokol for udrullning af isolerede majsblade primordia involverede usædvanlige materialer og var ikke egnet til cellulær billeddannelse31. Avancerede billeddannelsesteknikker, såsom computertomografi (CT) og magnetisk resonansbilleddannelse (MR), kan erhverve 3D anatomisk information uden at isolere og udrulle primordia 11,32,33, men de er dyre og kræver specialudstyr. Udvikling af en teknik til at overvinde de begrænsninger, der er pålagt af den valsede og koniske morfologi af bladprimordia i majs og andre græsser, ville fremme undersøgelser af deres anatomiske og udviklingsmæssige træk.

Her præsenterer vi metoder til forberedelse af tværsnit og udrullede hele monteringer af majsbladprimordier til fluorescens og konfokal billeddannelse. Vi brugte disse metoder til at kvantificere veneantal og kortlægge den rumlige-temporale hormonfordeling i majsbladprimordia med fluorescerende proteiner (FP'er)24. Den første metode går ud på at fjerne den øverste del af ældre blade fra majsplanter med en trådfjerner (figur 1E). Ved at eksponere spidsen af primordium (P5-P7) bliver det muligt at bestemme dens længde uden helt at skulle fjerne de ældre omgivende blade, hvilket muliggør nem og præcis sektionering. Den anden metode involverer udrulning og montering af helbladet primordia (P3-P7) med klar, dobbeltsidet nanotape (figur 1F). Disse metoder er egnede til visualisering af forskellige FP'er24, men har brug for optimering til brug af fluorescerende farvestoffer og rydningsreagenser. Derudover skitserer vi nogle procedurer for samkopiering af z-stakke, syning af billeder og sammenlægning af kanaler i ImageJ/FIJI34, som gælder for de billeder, der produceres ved hjælp af de to metoder. Disse metoder er nyttige til rutinemæssig fluorescens eller konfokal billeddannelse af majsblade, men de kan også tilpasses til andre modelgræsarter, såsom ris, Setaria og Brachypodium.

Figure 1
Figur 1: Organisation og morfologi af majsbladprimordia og oversigt over metoderne. A) Skematisk gengivelse af en majsplante. Majs har en distichous phyllotaxy, hvor det nye blad starter i den modsatte position af det forrige blad. Bladnummeret angiver den kronologiske rækkefølge, hvori bladene opstod ved spiring (dvs. første blad, L1; andet blad, L2; tredje blad, L3 osv.). Hvert blad har et distalt blad og en basalkappe afgrænset af en krave, der svarer til ligule og auricle. Det øverste blad med kraven synlig angiver det vegetative stadium. Frøplanten i dette eksempel er på V2-stadiet, med L2-kraven (pilespids) synlig. Saksikonet angiver placeringen ved mesocotyl (mig), hvor frøplanten skal skæres for at blive indsamlet. (B) Skematisk gengivelse af det dissekerede skud, der viser isoleret L1 til L4, med bladet primordia L5 til L9 vist som et forstørret billede i (C). Plastochrontallet angiver primordiumets position i forhold til SAM, med det yngste bladprimordium (P1) tættest på SAM og det ældre bladprimordia (P2, P3, P4 osv.) successivt længere væk2. D) Skematisk gengivelse af morfologien af majsbladprimordia fra P1 til P5. E) Skematisk oversigt over metoden til tværsnitsanalyse af majsbladets primordia. (1) Trim de ældre blade med en trådfjerner. (2) Mål primordium og snit skuddet. (3) Monter sektionen på et dias til billeddannelse og behandling (4, 5). F) Skematisk oversigt over metoden til helmonteringsanalyse af majsbladets primordia. (1) Fjern de omgivende blade for at ekstrahere primordium. (2) Klip og rul primordium fladt ud på nanobåndet. (3) Monter prøven til billeddannelse og behandling (4, 5). Forkortelser: L = blad; bl = blad; sh = kappe; co = krave; mig = mesocotyl; V = vegetativ; P = plastochron; SAM = skyd apikal meristem. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Iscenesættelse af majsbladudvikling og design af eksperimentet

  1. Dyrkning af planterne og iscenesættelse af bladudvikling
    1. Bestem alder og udviklingsstadium for de planter, der skal bruges til eksperimentet, og udfør en detaljeret iscenesættelse af bladudvikling.
      BEMÆRK: Det anbefales, at iscenesættelsen udføres på planter med samme genetiske baggrund som de mutante eller transgene linjer, der vil blive brugt i forsøgene. SAM stopper med at producere nye blade mellem 20 og 25 DAG, afhængigt af den genetiske baggrund og vækstbetingelser. Af denne grund er metoderne beskrevet her ideelle til majsplanter i alderen 7-14 DAG.
    2. Dyrk majsplanterne i et drivhus eller vækstkammer efter en passende planteplejeprotokol35.
    3. Saml planterne i den ønskede alder eller V-trin med en lille kniv eller saks ved at skære ved mesocotyl, som er stammen under jordoverfladen (figur 1A). Indsæt forsigtigt skæreværktøjet i jorden ved siden af frøplanten og skub det ned til bunden i en vinkel på 45 ° for at skære mesocotyl.
    4. Løft frøplanten ud af jorden og støv eventuelt resterende snavs eller jordpartikler væk, der kan klamre sig til planten. Fjern coleoptilen, den beskyttende kappe, der dækker det nye skud i unge frøplanter, manuelt.
    5. For hver plante skal du registrere V-trinnet, antallet af blade og længden af det sidste blad, der kommer ud af hvirvlen. Tag billeder af planterne til fremtidig reference.
    6. Fjern de ældre blade en efter en. For at gøre dette skal du holde planten ved resterne af mesocotyl eller stamme og skære hvert blad fra bunden af kappen og forsigtigt folde kappen ud på en cirklende måde med en tandsonde (figur 1B).
      BEMÆRK: Se trin 2.1 for en hurtig metode til fjernelse af de omgivende blade.
    7. Under et stereomikroskop ved ca. 2x forstørrelse dissekeres resten af skudspidsen forsigtigt på fugtige servietter for at forhindre, at prøven tørrer ud. Skær forsigtigt og fold forsigtigt hvert bladprimordium ud med en tandsonde med en bøjet nål eller et par fine pincet, indtil SAM, P1 og P2 er synlige (figur 1D). Optag udseendet og målingen af hver plastochron.
      BEMÆRK: Se et eksempel på bladudviklingsstadietrin i majsplanter i supplerende fil 1.
  2. Planlægning af eksperimentet
    BEMÆRK: Planlægning af eksperimentet omhyggeligt kan forbedre effektiviteten. For eksempel i tværgående sektionsanalyse kan bestemmelse af den omtrentlige placering, der skal skæres, når der afbildes specifikke plastokroner eller regioner, reducere dissektionstiden. Figur 2 viser et eksempel på standardiseret prøveudtagning. Desuden kan optimering af billeddannelsesparametrene baseret på egenskaberne af FP'erne eller fluorescerende sonder forbedre effektiviteten af eksperimenterne.
    1. Brug iscenesættelsesoplysningerne som en guide til at fokusere eksperimentet på specifikke plastokroner, primordiumregioner og væv. Brug FP'erne eller andre fluorescerende sonder af interesse til at følge afsnit 2 og/eller 3 nedenfor på nogle få prøver.
      BEMÆRK: Se tilgængelige majs FP markør linje 36-42 frøbestande på https://www.maizegdb.org/data_center/stock.
    2. Bestem de optimale billedoptagelsesparametre for hver FP-reporter eller sonde, herunder den passende detektor eller filter, excitations- og emissionsbølgelængder, pinhole-størrelse og andre indstillinger. Gem indstillingerne for at gengive arbejdsvilkårene for hvert af eksperimenterne.
      BEMÆRK: Se Linh og Scarpella30 for nogle tekniske retningslinjer for konfokal laserscanningsmikroskopi af udviklende blade.
    3. Planlæg billedbehandlingstiden baseret på halveringstiden og andre egenskaber for FP reporter43.
      BEMÆRK: Tiden mellem dissektion og billeddannelse skal også overvejes ved planlægning af et forsøg, da friske planteprøver udsættes for udtørring og cellulære ændringer i denne periode.

Figure 2
Figur 2: Prøveudtagningsplan til tværsnitsanalyse af majsbladprimordia. (A, venstre) Proksimalt skud af en 7 DAG majsplante, der viser et blotlagt fjerde blad (L4) ved P7. De brudte linjer angiver de syv prøveudtagningspunkter langs primordium, fra 0,5 mm til 10 mm. (A, højre) Skematisk gengivelse af bladets primordia med den projicerede størrelse og placering af hver plastochron: P7 (hvid); P6 (magenta); P5 (blå); P4 (grøn); og P3 indtil SAM (gul). (B-H) Fluorescensbilleder af tværsnit, der repræsenterer prøveudtagningsstederne vist i A fra 10 mm (B) til 0,5 mm (H). Primordierne er pseudofarvede i henhold til plastochronfarveskemaet i (A). Sektionerne blev afbildet med et epifluorescensmikroskop ved hjælp af et longpass-emission UV-filter til autofluorescens. Skalabjælke = 200 μm (B-H). Denne figur er blevet ændret og gengivet med tilladelse fra Robil og McSteen24. Forkortelser: DAG = dage efter spiring; P = plastochron; SAM = skyde apikal meristem; † = bladskede eller egentlig præ-ligul; * = skyde apikal meristem; ** = stilk. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Billeddannelse af tværsnit af majsbladprimordia

  1. Stripping af ældre omgivende blade og måling af bladets primordium
    1. Frøplanten opsamles ved omhyggeligt at skære den ved mesocotylen under jordoverfladen med en lille kniv eller saks som beskrevet i trin 1.1.3-1.1.4 (figur 1A).
    2. Bestem den korrekte trådstripperhulstørrelse, der skal bruges, og hvor snittet skal foretages langs skuddet. Sørg for, at hullet er stort nok til at passe til målprimordium.
    3. Begynd at skære i den mere distale del af skuddet og arbejd gradvist mod basen, indtil spidsen af primordium er blottet.
    4. For at klippe skal du holde trådstripperen med kæberne vendt mod skuddet. Placer skuddet til det valgte hul, og klem stripperhåndtagene sammen for at skære gennem bladhvirvlen.
      BEMÆRK: For at undgå utilsigtet at skære målprimordium skal du forsigtigt justere midten af skuddet med hullet i trådstripperen. For større planter anbefales det manuelt at fjerne nogle af de omgivende blade manuelt, før du bruger stripperen.
      FORSIGTIG: Trådstrippere har skarpe kæber, der kan forårsage snit eller andre skader, hvis de ikke bruges forsigtigt.
    5. Mens du fortsætter med at klemme håndtagene sammen, skal du skubbe stripperen væk fra skuddet for at trimme den øverste del af bladene. Sørg for, at målområdet i primordium forbliver indhyllet af de omgivende blade (supplerende figur S1C, D).
      BEMÆRK: Efter trimning af de øverste blade efterlades skuddet med en udsat primordiumspids (P5, P6 eller P7, afhængigt af snittets position og størrelsen på det anvendte trådstripperhul; Figur 1E). Dette primordium vil tjene som reference for estimering af størrelsen og stadiet af yngre primordia. P6 er den mest praktiske reference til brug i majsplanter på grund af dets størrelsesområde og pinlignende morfologi.
    6. Brug en lineal til at måle længden fra spidsen af primordium til bunden af skuddet. Optag målingen.
      BEMÆRK: Primordiets længde vil blive lidt overvurderet, da der er et par millimeter stængel i bunden af primordien (figur 2A).
  2. Frihåndssnit og billeddannelse af bladprimordium
    1. Under et stereomikroskop med ca. 0,8x forstørrelse skal du holde optagelsen stabil på en glat overflade, såsom et glasskærebræt eller andet ridsefast materiale. Brug et barberblad eller skalpel til at skære tynde sektioner (0,25-0,8 mm) af skuddet på de ønskede punkter langs primordiumets længde.
    2. Lav et indledende snit lidt over målområdet for at kassere den distale del af skuddet, og få derefter tynde sektioner omkring målområdet. For at lave rene snit skal du holde bladet vinkelret på skuddet og skubbe det indad med en jævn, jævn bevægelse.
      BEMÆRK: Der kan være et par millimeter snitsrum for større primordia (P6 eller P7). For mindre primordier (P5 og tidligere) kan 1 mm dog gøre en betydelig forskel i prøveudtagningen, da disse primordia stables inden for de første par millimeter af skuddets bund (se figur 2A, F-H). Det anbefales at bruge et dobbeltkantet barberblad til finere sektionering.
      FORSIGTIG: Vær forsigtig, når du bruger barberblade og skalpeller for at undgå utilsigtede snit eller skader.
    3. Udskift barberbladet regelmæssigt, da bladskederne let kan sløve bladet. Dæk skuddet med fugtige klude efter hver sektionsrunde for at forhindre, at prøven tørrer ud.
    4. Monter bladsektionen på et rent glasglas (75 mm x 25 mm), brug en pipette til at påføre en dråbe vand (eller 50% glycerol) direkte på sektionen, og læg en dæksel (22 mm x 22 mm) ovenpå.
    5. Hvis du bruger et fluorescerende farvestof, skal du anvende farvestofopløsningen på sektionen, placere et dæksel ovenpå og inkubere det efter behov.
      BEMÆRK: Afhængigt af farvestoftypen kan yderligere trin til behandling af bladsektionerne være nødvendige, før du fortsætter til næste trin. Disse referencer44,45,46,47 giver generelle detaljer og anvendelser af fluorescerende farvestoffer i plantecellebilleddannelse. Et kernefarvningsfluorescerende farvestof, 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU), er blevet anvendt effektivt på tværsnit af majsbladprimordia48. I modsætning hertil giver plasmamembranfarvningsfarvestoffer, såsom Fei Mao 4-64 (FM 4-64) og propidiumiodid, ikke tilfredsstillende resultater (figur 3A-D).
    6. Placer diaset på scenen i et epifluorescens- eller konfokal laserscanningsmikroskop, og juster fokus og indstillinger efter behov for at visualisere fluoroforen30. Se tabel 1 for de belysnings- og billedoptagelsesindstillinger, der bruges til udvalgte FP-reporterlinjer for majs.
      BEMÆRK: Tykke sektioner kan producere høje niveauer af baggrundsautofluorescens. Overvej nogle billeddannelses- og prøveforberedelsesstrategier, der kan hjælpe med at afbøde dette problem30,49 (se tabel 2).
      FORSIGTIG: Vær forsigtig og brug beskyttelsesbriller, når du arbejder med kraftige lyskilder og lasere for at reducere risikoen for øjenskader.
    7. Billede gennem bladsektionen ved forskellige forstørrelser og detekteringskanaler (herunder lysstyrken)30. Brug 4x forstørrelse til at afbilde hele tværsnittet og 20x eller 40x forstørrelse til at afbilde specifikke væv. Reducer eksponeringstiden ved højere forstørrelser for epifluorescensbilleddannelse for at beskytte prøverne mod hurtig fotoblegning (se tabel 1).
    8. Tag billeder af hele sektionen eller bestemte interesseområder (ROI'er). Hvis det er nødvendigt, erhverve en z-stack, som er en række billeder taget på forskellige brændvidder30.
    9. For at erhverve en z-stak skal du først bestemme de øvre og nedre positioner i prøven og derefter antallet af optiske sektioner, der skal fanges mellem disse positioner. Færre optiske sektioner resulterer i en større z-trinstørrelse, som er afstanden mellem hver sektion. Afhængigt af FP'ens egenskaber og den anvendte forstørrelse optages tre til 25 optiske sektioner med z-trinstørrelser mellem 1 og 12 μm til billeddannelse af tværsnit af majsbladprimordia.
      BEMÆRK: For at samkopiere z-stakken skal du bruge en passende volumengengivelsesteknik50 , der kan udføres via mikroskopsoftwaren eller ved hjælp af ImageJ/FIJI34 (se trin 4.1 og 4.2).
    10. Gem alle billedfilerne og deres tilknyttede metadata, hvis de er tilgængelige.

Tabel 1: Indstillinger for belysning og billedoptagelse, der anvendes til fluorescens og konfokal billeddannelse af udvalgte FP-rapportører for majs. Forkortelser: FP = fluorescerende protein; TRITC = tetramethylrhodamin FITC = fluoresceinisothiocyanat; WLL = laser med hvidt lys; Ar-ion = argonionlaser; HyD = hybrid detektor; AU = Luftig enhed; Hz = Hertz, scanningslinje pr. Sekund. Klik her for at downloade denne tabel.

3. Billeddannelse af valsede hele monteringer af majsbladprimordia

  1. Dissekering af primordia og klargøring af glasobjektglasset med nanotape
    1. Frøplanten samles ved omhyggeligt at skære den ved mesocotylen under jordoverfladen med en lille kniv eller en saks som beskrevet i trin 1.1.3-1.1.4 (figur 1A).
    2. Forbered glasglasset (75 mm x 25 mm) med det klare, dobbeltsidede nanobånd (supplerende figur S1H), før du dissekerer planten. Skær et rektangulært stykke nanotape og sæt det fast i midten af et rent glasglas. Fjern ikke den beskyttende plastfilm på oversiden af båndet.
      BEMÆRK: Bestem størrelsen på båndet, der skal bruges, i henhold til størrelsen af prøverne til billedet (se eksempler på overdimensionerede prøver i supplerende figur S1I, J). Nanobåndet fås i enten akryl- eller polyurethangelmateriale. Begge typer er effektive til fluorescens og konfokal billeddannelse24. For at forhindre misfarvning af båndet skal du beskytte det mod langvarig udsættelse for lys ved at opbevare det i en mørk beholder.
    3. Begynd at dissekere skuddet ved at fjerne den øverste del af de ældre blade med en trådfjerner, som beskrevet i trin 2.1.
    4. Hold skuddet ved mesocotyl og fjern forsigtigt de omgivende blade med en tandsonde for at udtrække primordia. For at gøre dette skal du fjerne bladene fra bunden af skuddet og folde dem ud en ad gangen, indtil primordium af interesse er udsat.
    5. Alternativt kan du bruge trådstripperen til direkte at trække bladets primordia ud ved at lave et snit i skuddets basale område (supplerende figur S1E-G).
      BEMÆRK: Denne metode medfører en højere risiko for at snappe primordia.
  2. Montering og billeddannelse af primordium.
    1. Fjern beskyttelsesfilmen fra båndet. Læg det udsatte primordium på båndet. Brug et barberblad til at skære primordium i bunden, kassér basalstammen og hypocotyl (figur 1F).
    2. Rul primordium ud ved hjælp af en tandsonde med en bøjet nål (spidsdiameter på 0,25-0,6 mm). Brug en mikrosonde (spidsdiameter på 0,15-0,2 mm) til primordia mindre end 3 mm (P3 til tidlig P4).
    3. Placer nålespidsen parallelt med overfladen, fold den ydre basalmargen ud, og tryk den forsigtigt mod tapen.
    4. For en glattere udrulning smøres bladets indre overflade (adaxial) ved at dyppe nålens spids i 100% glycerol.
    5. Med den ydre margen klæbende til tapen justeres nålespidsen parallelt med bladets lange akse. Skub forsigtigt kanylen sidelæns for at rulle den ud, og flad bladet på tapen (figur 1F).
      BEMÆRK: Det er almindeligt at knække eller beskadige bladet under rullning, især i større primordia med en robust midrib (se figur 3E-G). Udrullning af bladet kraftigt kan blå mærke overfladen og producere artefakter under billeddannelse (figur 3H). Se tabel 2 og diskussionen for anbefalede løsninger på disse problemer.
    6. Påfør en dråbe vand på det urullede primordium. Placer straks en dæksel oven på vanddråben og primordium. Tryk forsigtigt kanterne af dækslet ned, så de klæber til båndet.
      BEMÆRK: Det anbefales at bruge store rektangulære dæksler (50 mm x 24 mm eller 60 mm x 24 mm) med ekstra områder til fastgørelse af tapen. Minimer dannelsen af luftbobler, som kan forvrænge bladet og forårsage ujævn lysbrydning (se figur 3I-K). Sørg for, at dæksedlen klæber helt til tapen, da kanterne på det monterede primordium kan rulle tilbage under et løst klæbet dæksel (se figur 3L).
    7. Placer objektglasset på scenen for et epifluorescens (se supplerende figur S1K) eller konfokal laserscanningsmikroskop, og juster fokus og indstillinger efter behov for at visualisere fluoroforen30. Se tabel 1 for de belysnings- og billedoptagelsesindstillinger, der bruges til de valgte rammerapportlinjer for majs.
    8. Afbild hele bladet eller et specifikt investeringsafkast gennem forskellige detektionskanaler30. For at afbilde hele bladet skal du enten manuelt tage mosaikbilleder af bladet eller bruge mikroskopets flisefunktion ved lav forstørrelse (4x eller 10x).
      BEMÆRK: Selv ved den laveste forstørrelse kan majsbladprimordia være for stor til at blive afbildet med et epifluorescens- eller konfokal laserscanningsmikroskop, hvilket resulterer i længere billedbehandlingstider, der kan resultere i fotoblegning (se figur 3M) eller øget baggrundsautofluorescens. Derfor anbefales det at bruge et fluorescensstereomikroskop til billeddannelse af helbladsprøver større end 5 mm.
    9. Til konfokal billeddannelse er det nødvendigt at opnå z-stakke, der omfatter bladets tykkelse (se trin 2.2.9).
    10. Gem alle billedfilerne og deres tilknyttede metadata, hvis de er tilgængelige.

Tabel 2: Fejlfinding af almindelige problemer i billeddannelse af tværsnit og hele monteringer af majsbladprimordia. Klik her for at downloade denne tabel.

Figure 3
Figur 3: Suboptimal tværsnit og helmonteret forberedelse af majsbladprimordia. (A-D) Repræsentative konfokale billeder af tværsnit af bladprimordia med en plasmamembranmarkør, PIP2-1-CFP (A), og et plasmamembranbindende fluorescerende farvestof, FM 4-64 (B), med tilsvarende lysfeltbilleder (C,D). Sammenlignet med PIP2-1-CFP viser FM 4-64 suboptimal visualisering af cellekonturer. (E-M) Repræsentative fluorescensbilleder af hele monteringer af bladprimordier, der viser tilstedeværelsen af rivning (E-G), forslåede overflader† (H), luftbobler* (I-K), tilbagerullede margener (L) og fotoblegede områder‡ (M). Bladets primordia udtrykker DII-Venus (E-G), GAR2-YFP (H-J), mDII-Venus (K), PIN1a-YFP (L) og DR5-RFP (M). Skalabjælke = 200 μm (A-D); 500 μm (E-M). Figur 3A er blevet ændret og gengivet med tilladelse fra Robil og McSteen24, mens figur 5B-M er upublicerede data fra forfatterne. Forkortelser: P = plastochron; YFP = gult fluorescerende protein; RFP = rødt fluorescerende protein; CFP = cyanfluorescerende protein PIP2-1-CFP = p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP; DII-Venus = pZmUbi:DII:YFP-NLS; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; BF = lysfelt. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Behandling af billederne ved hjælp af ImageJ / FIJI

  1. Samkopiering af z-stakke ved hjælp af maksimal intensitetsprojektion (MIP)
    1. Start ImageJ/FIJI , og åbn stakken med billeder, eller opret en ny stak ud fra flere separate billeder ved at vælge Billede | Stakke | Billeder, der skal stables i menuen.
    2. Vælg billedstakken. Vælg Billede | i menuen Stakke | Z-projekt.... I dialogboksen Z-projekt skal du vælge Maks. intensitet i rullemenuen Projektionstype . Klik på OK for at oprette z-projektionen med maksimal intensitet.
      BEMÆRK: Det samkopierede billede er en 2D-projektion af pixel med den højeste intensitet på tværs af z-stakkene50. Denne metode er egnet til visualisering af fluoroforen, men ikke de anatomiske træk i lyse feltbilleder af tykke tværgående sektioner og helbladsmonteringer.
    3. Gem billedet som TIFF (Tagged Image File Format) ved at vælge Filer | Gem som | Tiff. Indtast et navn til filen, og klik på Gem.
      BEMÆRK: Det anbefales at bruge TIFF til lagring af fluorescens og konfokale billeder, da det bevarer kvaliteten og detaljerne, når billedet gemmes.
  2. Samkopiering af z-stakke ved hjælp af EDF-plugin (Extended Depth of Field)51
    1. Installer EDF-plugin52. Download Extended_Depth_Field.jar filen (version 17.05.2021) fra http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/, og placer den i mappen "plugins" i ImageJ/FIJI.
    2. Start ImageJ/FIJI , og åbn stakken med billeder, eller opret en ny stak ud fra flere separate billeder ved at vælge Billede | Stakke | Billeder, der skal stables i menuen.
    3. Vælg billedstakken. I menuen skal du vælge Plugins | Udvidet dybdeskarphed | EDF nem tilstand. I dialogboksen Udvidet dybdeskarphed skal du bruge skyderne under Hastighed/ kvalitet til at indstille den ønskede kvalitet og behandlingshastighed og Højdekortreg til at indstille udjævningsniveauet for topografien. Klik på Kør for at oprette det rekonstruerede billede.
      BEMÆRK: EDF kombinerer stakken til et skarpt, sammensat 2D-billede ved at projicere det bedste fokus51. Denne teknik er nyttig til at overvinde den begrænsede dybdeskarphed og er velegnet til rekonstruktion af lysfeltsbilleder af tykke tværgående sektioner eller helbladsmonteringer. Vær forsigtig, når du anvender dette filter til at visualisere fluoroforen, fordi EDF i modsætning til MIP justerer billedets kontrast og påvirker pixelintensiteten.
    4. Gem billedet som en TIFF-fil ved at vælge Filer | Gem som | Tiff. Indtast et navn til filen, og klik på Gem.
  3. Syning af billeder sammen ved hjælp af Grid / Collection Stitching-plugin53
    1. Gem samlingen af billeder eller billedstakke, der skal sys sammen i en enkelt mappe.
    2. Start ImageJ / FIJI, og vælg Plugins | Syning | Gitter-/samlingssyning fra menuen. I dialogboksen Gitter-/samlingssømning skal du vælge Ukendt position i rullemenuen Type og derefter Alle filer i mappen fra Rækkefølge. Klik på OK.
    3. I dialogboksen Gittersyning: Ukendt placering, Alle filer i mappen skal du angive placeringen af billederne ved at skrive eller indsætte mappestien i tekstfeltet Mappe eller ved at klikke på Gennemse... for at finde mappen. Klik på OK for at starte syningsprocessen.
      BEMÆRK: Indstillingen Ukendt position i plugin'et Grid/Collection Stitching rekonstruerer et sammensat billede ud fra et sæt sammenhængende billeder ved at analysere deres overlappende områder. Derfor er denne mulighed nyttig til syning af mosaikker af billeder af tværgående sektioner eller helbladsmonteringer, der ikke opnås ved hjælp af en flisescanning.
    4. Når syningen er færdig, vises et nyt vindue med det syede billede. Gem billedet som en TIFF-fil ved at vælge Filer | Gem som | Tiff. Indtast et navn til filen, og klik på Gem.
      BEMÆRK: Syning af store montager af 2D- og 3D-billeder kan også udføres ved hjælp af billedrekonstruktionskommandoer i mikroskopsoftwaren eller via Bio-Formats Import Options i ImageJ / FIJI.
  4. Kombinere flere kanaler ved hjælp af kommandoen Flet kanaler
    1. Start ImageJ / FIJI, og åbn de billeder eller billedstakke, der skal flettes.
      BEMÆRK: Billedstakke kan først samkopieres ved hjælp af trin 4.1 eller 4.2. MIP anbefales generelt til udfladning af fluoroforkanaler, mens EDF er bedre egnet til udfladning af lysfeltkanaler eller andre kanaler med varierende fokusdybde.
    2. Juster billedernes lysstyrke og kontrast med Image | Juster | Lysstyrke/kontrast. Brug skyderne eller indtastningsfelterne til at justere parametrene, og klik derefter på Anvend. Du kan også bruge en lineær histogramstrækningsmetode ved at vælge Proces | Forbedr kontrasten.... Indstil procentdelen af mættede pixel, vælg Normaliser, og klik derefter på OK.
      BEMÆRK: Når du kvantificerer eller sammenligner fluoroforsignalintensiteten mellem billeder, er det generelt bedst ikke at justere lysstyrken eller kontrasten, da dette kan ændre de relative pixelintensiteter i billedet, hvilket kan påvirke målingerne og sammenligningerne.
    3. Hvis du vil skelne mellem kanaler, skal du anvende pseudofarver på bestemte billeder ved hjælp af en opslagstabel (LUT). For at gøre dette skal du vælge billedet og derefter vælge Billede i menuen ImageJ/FIJI, klikke på Opslagstabeller og vælge den relevante LUT på rullelisten.
    4. Vælg Billede | i menuen Farve | Flet kanaler. For hver kanal (C1, C2, C3...) skal du bruge rullelisten til at vælge det billede, der skal tildeles den pågældende kanal. Klik på OK for at flette kanalerne.
    5. Gem det nye billede som TIFF ved at vælge Filer | Gem som | Tiff. Indtast et navn til filen, og klik på Gem.

Representative Results

Tværsnitsanalyse af majsbladprimordia
Vi brugte protokolafsnit 2 til at kvantificere veneantal og karakterisere hormonresponsmønstre i tværgående sektioner af majsbladprimordier med FP'er (figur 4)24. For at vurdere plantehormonet auxins rolle i bladvækst og venedannelse kvantificerede vi antallet af vener i bladprimordien hos en majsmutant med auxinmangel, forsvindende kvast254. I tidlige plastokroner udviser udviklende vener tydelig cellularisering i mediancellelaget i majsbladets primordium21,22. Imidlertid kan identifikation og tælling af vener ved hjælp af konventionelle histologiske teknikker22 være arbejdskrævende og tidskrævende. For at kvantificere venerne brugte vi således majsauxin-effluxproteinmarkøren p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP i det følgende), som markerer udvikling af vener og procambiale tråde (PCS'er; Figur 4A). Ved hjælp af protokolafsnit 2 var vi i stand til at standardisere tværsnitsprøvetagningen ved at måle primordia før sektionering (figur 4B, C). Vi opdagede en tendens, hvor vt2 har et bredere primordium og flere vener end normalt (figur 4D,E)24, hvilket er i overensstemmelse med data fra fuldt udvidede blade55, hvilket indikerer, at defekten i vt2 begyndte tidligt i bladudviklingen. Ved hjælp af protokolafsnit 2 var vi også i stand til systematisk at undersøge ekspressionsmønstrene for hormonrespons FP-reportere i bladprimordierne (se eksempler på billederne i figur 4F-I). Gennem et standardiseret prøveudtagningsskema med tværsnit kortlagde vi fordelingen af auxin-, cytokinin- (CK) og gibberellinsyreresponser (GA) på tværs af forskellige plastokroner og regioner i bladprimordia og opdagede nye responsmønstre, som vi antager har konsekvenser for bladvækst og venedannelse24. Disse repræsentative resultater viser derfor nytten af protokolafsnit 2 til tværsnitsanalyse af majsbladprimordia.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative resultater for tværsnitsanalyse af majsbladprimordia. (A-E) Kvantificering af veneantal og primordiumbredde i bladprimordia af normal og forsvindende kvast2 med auxineffluxproteinmarkøren PIN1a-YFP. (A) Repræsentative fluorescensbilleder af tværsnit af P5 til P7, der udtrykker PIN1a-YFP i udviklingsvener og procambiale tråde. De tværgående sektioner blev afbildet med et epifluorescensmikroskop ved hjælp af et FITC-filter (495-519 nm excitation). Antallet af vener og primordiumbredden blev kvantificeret ved hjælp af flerpunkts- og frihåndslinjeværktøjerne i henholdsvis FIJI/ImageJ. B) Majsplante med de øverste bladhvirvler fjernet med en trådstripper for at blotlægge spidsen af det fjerde blad (L4). Beslaget spænder over den projicerede primordiumlængde, hvor den stiplede linje angiver midterlængden. (C) Skematisk diagram over varierende primordiumformer fra P5 til P7, der illustrerer, hvordan veneantal og primordiumbredde i midten (vandret stiplet linje) kan variere afhængigt af primordiumets udviklingsstadium. (D,E) Måling af primordiumbredde (D) og venetal (E) i midtersektionen af L4 af normal og vt2. Trendlinjen repræsenterer 10 mm rullende gennemsnit af målinger ± standardfejl for middelværdien (SEM). (F-I) Repræsentative konfokale billeder af tværgående sektioner af bladprimordia, der udtrykker kombinationer af PIN1a-YFP, auxin response reporter, DR5-RFP, cytokinin response reporter, TCS-tomat, gibberellinsyre-responsiv markør, GAR2-YFP og mDII-Venus, en muteret version af auxinsignalindgangsreporteren DII-Venus. FP-kanalerne er overlejret på lysfeltkanalen i hvert billede. Skalabjælke = 200 μm (A); 10 mm (B); 100 μm (F-I). Denne figur er blevet ændret og gengivet med tilladelse fra Robil og McSteen24. Forkortelser: DAG = dage efter spiring; P = plastochron; VT2 = forsvindende kvast2; PCS = procambial streng; YFP = gult fluorescerende protein; FITC = fluoresceinisothiocyanat; RFP = rødt fluorescerende protein; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Tomat = TCSv2:: NLS-tdTomat; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. Klik her for at se en større version af denne figur.

Helmonteringsanalyse af majsbladprimordia
Vi fulgte protokollens afsnit 3 for at visualisere og analysere FP-ekspression i helbladsmonteringer af majsbladprimordia (figur 5). Ved at visualisere venemønstre med PIN1a-YFP fandt vi, at dannelsen af vener forekommer i hele primordium under tidlige plastokroner, men denne proces bliver begrænset i de proksimale regioner senere i udviklingen (figur 5A)24. Som supplement til tværsnitsanalyserne har helbladsmonteringsanalyserne afsløret vævs- og fasespecifikke mønstre for hormonrespons under venedannelse24. Et eksempel er udtryksmønsteret for CK-responsreporteren TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomat) i forhold til PIN1a-YFP-udtryk (figur 5B)24. Ved at følge protokolafsnit 3 var vi i stand til at udføre både kvalitative og kvantitative analyser af FP-ekspression i bladets primordia (figur 5D-F; upublicerede data). Vi undersøgte ekspressionsmønstrene for en auxin-responsreporter, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), og en GA-responsiv markør, p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), i helbladsmonteringer af enkelt- ogdobbeltmutanter af vt2 og dværgplante3 (d3), en GA-mangelfuld mutant56 (figur 5D). Vi sammenlignede også de relative niveauer af celleproliferation mellem normal og vt2 bladprimordia ved hjælp af p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 (Cyclin-D2B-YFP), som er en markør for G1/S-overgangen i cellecyklussen57 (figur 5E,F). Selvom der ikke var nogen signifikant forskel mellem normal og vt2, var Cyclin-D2B-YFP-ekspression i overensstemmelse med den kendte celleproliferationsprofil for tidlige plastochroner31. Vi konkluderer, at protokolafsnit 3 er en effektiv metode til analyse af hele monteringer af majsbladprimordia, som er vanskelige at afbilde på grund af deres rullede morfologi.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative resultater for helmonteret analyse af majsbladprimordia. (A) Repræsentative fluorescensbilleder af bladprimordia af 7 DAG-majsfrøplanter, der viser årer under udvikling og procambiale tråde, som markeret med auxin-effluxproteinmarkøren PIN1a-YFP. P3-P6 primordia blev udskåret fra basen, rullet ud og fladtrykt med den adaxiale side opad. Indsatser viser nærbilleder af P3 og P4. I P5 og P6 afgrænser stiplede linjer den distale ende af de proliferative zoner, hvor størstedelen af procambiale tråde stadig udvikler sig og strækker sig. (B,C) Repræsentative konfokale billeder, der viser ekspressionen af PIN1a-YFP og cytokininresponsreporter, TCS-tomat, i det proksimale marginalområde af et P5-primordium. (D) Repræsentative fluorescensbilleder af P4 primordia, der viser ekspressionen af auxin response reporter, DR5-RFP, og gibberellinsyre-responsiv markør, GAR2-YFP i normale og enkelt- og dobbeltmutanter af forsvindende kvast2 og dværgplante3. (E) Repræsentative konfokale billeder af P3 og/eller P4, der viser ekspressionen af Cyclin-D2B-YFP, en reporter for G1/S-overgangen i cellecyklussen. (F) Relative mængder af celleproliferation i P3/P4 bladprimordia af normal og vt2, kvantificeret ved at måle den integrerede tæthed af Cyclin-D2B-YFP-signalet over primordiumområdet ved hjælp af ImageJ/FIJI. Søjlerne repræsenterer middelværdierne ± standardfejlen i middelværdien. Skalabjælke = 500 μm (A, D, E); 200 μm (B); 100 μm (C). Figur 4A-C er blevet ændret og gengivet med tilladelse fra Robil og McSteen24, mens figur 4D-F er upublicerede data fra forfatterne. Forkortelser: DAG = dage efter spiring; P = plastochron; VT2 = forsvindende kvast2; d3 = dværgplante3; YFP = gult fluorescerende protein; RFP = rødt fluorescerende protein; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Tomat = TCSv2:: NLS-tdTomat; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Cyclin-D2B-YFP = p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B: YFP; ns = ingen signifikant forskel au = vilkårlig enhed. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Eksempler på iscenesættelse af bladudvikling i majsplanter. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S1: Planteprøver og materialer, der anvendes i protokollerne. (A,B) En majsplante 7-8 DAG med den øverste bladhvirvel fjernet ved hjælp af en trådstripper. (B) Indsatsen viser et nærbillede af optagelsen med det eksponerede P6 primordium. (C-G) Skud af majsplanter med de øverste hvirvler fjernet med henblik på tværsnitsanalyse (C,D) og omgivende blade helt fjernet med henblik på helmonteringsanalyse (E-G). (H) En rulle polyurethangel klar dobbeltsidet nanotape. (I,J) P6 bladprimordium (I) og proksimal region af P8 blad (J) rullet ud og monteret på glasglas med nanobåndet. K) Et glasglas med et urullet bladprimordium monteret på et epifluorescensmikroskop. Forkortelse: DAG = dage efter spiring. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Vi præsenterer to metoder til fremstilling af majsbladprimordia til cellulær billeddannelse. Den første metode (protokolafsnit 2) tillader måling af primordium til tværsnitsanalyse, mens den anden metode (protokolafsnit 3) muliggør udrullning og udfladning af primordium til helmonteret analyse. Disse metoder letter cellulær billeddannelse af FP'er i majsbladprimordia24 (som vist i figur 4 og figur 5) og giver enkle løsninger på udfordringerne ved billeddannelse af majsblade. Protokolafsnit 2 reducerer dissektionstiden og forbedrer prøveudtagningsnøjagtigheden ved at måle primordierne før sektionering i stedet for udelukkende at stole på iscenesættelsesparametre 9,16. Med kommercielt tilgængelig nanotape løser protokolafsnit 3 det mangeårige problem med billeddannelse af helbladet primordia i majs. Denne protokol forbedrer den tidligere metode, der brugte dialyserør 31, og er et meget billigere alternativ til CT og MR11,32,33. Men når det kommer til at visualisere bladanatomiske træk og producere optimale resultater, har begge protokoller nogle begrænsninger, som er skitseret i tabel 2 og diskuteres mere detaljeret nedenfor.

I protokolafsnit 2 stødte vi på vanskeligheder med at visualisere cellekonturer i tykke tværsnit af bladprimordia, og modfarvning med cellevægs- eller plasmamembranbindende fluorescerende farvestoffer gav ikke tilfredsstillende resultater. For eksempel gav FM 4-64 suboptimale resultater sammenlignet med plasmamembranens FP-markør, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Figur 3A-D). For at overvinde denne begrænsning anbefaler vi at bruge et vibratomt til at producere tyndere vævssektioner (~ 0,1 mm)58, hvilket giver mulighed for en levende lysfeltbilleddannelse af cellekonturer eller optimering af modfarvningsprotokollen 47,59.

I protokolafsnit 3 er hovedbegrænsningen vanskeligheden ved at montere bladet uden at rive, beskadige eller luftbobler, som beskrevet i protokoltrin 3.2.5-3.2.6 (figur 3E-K). Da majsbladet er bilateralt symmetrisk, kan et halvbladsbeslag snarere end et helbladsbeslag være tilstrækkeligt til visualisering9. For at gøre dette kan primordium skæres med et barberblad langs længdeaksen efter udrullning op til midrib, så kun halvdelen af bladet kan monteres. En anden begrænsning i protokolafsnit 3 er, at bladets tykkelse kan begrænse fluoroforsignalets optiske opløsning under dyb billeddannelse. For at løse dette problem er det muligt at anvende en vævsrensningsteknik60. Vi fandt imidlertid, at ClearSee61, et almindeligt anvendt clearingreagens til billeddannelse af plantevæv, ikke er kompatibelt med protokollen, fordi det får prøven og dækslet til at løsne sig fra nanobåndet. En mulig løsning på dette problem kunne være at påføre en semipermeabel membran31 over bladprøven, så den kan behandles med clearingopløsningen, mens den holdes på plads af nanobåndet. En sådan metode, der gør det muligt at anvende flydende opløsninger på det uvalsede blad, kunne også anvendes til helmonteret RNA in situ-hybridisering og immunlokaliseringsteknikker, som tidligere er optimeret til udvikling af majsblomsterstande, men ikke til helbladet primordia62,63.

Vi beskrev protokoller for majs, som har store blade primordia selv på frøplantestadiet. Andre græsarter med meget mindre blade primordia, såsom ris, byg, hvede, Setaria og Brachypodium 16,23,64,65,66, kan kræve brug af yderligere præcisionsværktøjer for effektivt at anvende disse protokoller. Desuden var disse protokoller ikke beregnet til levende cellebilleddannelse, som fanger dynamiske processer i realtid med vævsdannelse og cellulære reaktioner. Men efterhånden som fluorescerende sonder, billeddannelsesteknologier og computerkapacitet fortsætter med at udvikle sig inden for levende cellebilleddannelse til planter67, kan fremtidig forskning bygge videre på disse protokoller for at udvikle levende cellebilleddannelsesstrategier, der er skræddersyet til de unikke egenskaber ved græsbladprimordia.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Maize Genetics Cooperation, Maize Cell Genomics Project, Dave Jackson (Cold Spring Harbor Laboratory, NY), Anne W. Sylvester (Marine Biological Laboratory, University of Chicago, IL), Andrea Gallavotti (Rutgers University, NJ) og Carolyn G. Rasmussen (University of California, Riverside) for at levere de mutante og transgene bestande samt Robert F. Baker og Alexander Jurkevich fra Advanced Light Microscopy Core ved University of Missouri-Columbia for deres hjælp med konfokal mikroskopi. JMR blev støttet af J. William Fulbright Fellowship, Diane P. og Robert E. Sharp Fund og National Science Foundation's Plant Genome Research Program (IOS-1546873) til PM. CDTC, CMRV, EDCDP og RJRR støttes af Ateneo College Scholarship Program. CDTC, EDCDP og RJRR understøttes af DOST-SEI S&T Undergraduate Scholarship. DODL støttes af Fr. Thomas Steinbugler SJ Academic Scholarship. RJRR understøttes af Aiducation International - Pathways to Higher Education Scholarship. Dette arbejde blev støttet af School of Science and Engineering og Rizal Library, Ateneo de Manila University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick EZlifego Store (Amazon) B07YB1ZXG6 1 roll
Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in Bausch & Lomb N1692 9 1 pc
Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in Storz Opthalmic Instruments E0542 1 pc
Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in) Ted Pella 13553 1 pc
DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper Dowell Store (Amazon) 10-22 AWG 1 pc
Feather Double Edge Carbon Steel Blades Ted Pella 121-9 pkg/10; for fine sectioning
Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm Ted Pella 260442 pkg/144
GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades Ted Pella 121-1 box/200; for general cutting/sectioning
Glycerol Thermo Scientific PI17904 1 liter
ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin National Institutes of Health (NIH) USA version 2.9.0/1.54s The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).
Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm Kimtech Science 34155 box/280 ply
Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260140 1 ounce
PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick Yecaye Store (Amazon) L354 W1.18 2 rolls
Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260166 1 ounce
Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260168 1 ounce
Tempered Glass Cutting Board Hacaroa (Amazon) B09XMXBT5S 4 pc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McSteen, P., Kellogg, E. A. Molecular, cellular, and developmental foundations of grass diversity. Science. 377 (6606), 599-602 (2022).
  2. Wang, P., Vlad, D., Langdale, J. A. Finding the genes to build C4 rice. Current Opinion in Plant Biology. 31, 44-50 (2016).
  3. Wang, P., et al. Candidate regulators of early leaf development in maize perturb hormone signalling and secondary cell wall formation when constitutively expressed in rice. Scientific Reports. 7 (1), 4535 (2017).
  4. Perico, C., Tan, S., Langdale, J. A. Developmental regulation of leaf venation patterns: Monocot versus eudicots and the role of auxin. New Phytologist. 234 (3), 783-803 (2022).
  5. Wang, P., Kelly, S., Fouracre, J. P., Langdale, J. A. Genome-wide transcript analysis of early maize leaf development reveals gene cohorts associated with the differentiation of C4 Kranz anatomy. The Plant Journal. 75 (4), 656-670 (2013).
  6. Liu, W. Y., et al. Regulators of early maize leaf development inferred from transcriptomes of laser capture microdissection (LCM)-isolated embryonic leaf cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (35), e2208795119 (2022).
  7. Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (10), 3979-3984 (2013).
  8. Strable, J., Nelissen, H. The dynamics of maize leaf development: Patterned to grow while growing a pattern. Current Opinion in Plant Biology. 63, 102038 (2021).
  9. Reynolds, J. O., Eisses, J. F., Sylvester, A. W. Balancing division and expansion during maize leaf morphogenesis: Analysis of the mutant, warty-1. Development. 125 (2), 259-268 (1998).
  10. Richardson, A. E., et al. Evolution of the grass leaf by primordium extension and petiole-lamina remodeling. Science. 374 (6573), 1377-1381 (2021).
  11. Johnston, R., Leiboff, S., Scanlon, M. J. Ontogeny of the sheathing leaf base in maize (Zea mays). New Phytologist. 205 (1), 306-315 (2015).
  12. Sharman, B. C. Developmental anatomy of the shoot of Zea mays L. Annals of Botany. 6 (22), 245-282 (1942).
  13. Johnston, R., et al. Transcriptomic analyses indicate that maize ligule development recapitulates gene expression patterns that occur during lateral organ initiation. The Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
  14. Sharman, B. C. Leaf and bud initiation in the Gramineae. Botanical Gazette. 106 (3), 269-289 (1945).
  15. Nelissen, H., et al. A local maximum in gibberellin levels regulates maize leaf growth by spatial control of cell division. Current Biology. 22 (13), 1183-1187 (2012).
  16. Itoh, J., et al. Rice plant development: From zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
  17. Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Iowa State University of Science and Technology. , (1986).
  18. Freeling, M., Walbot, V. The Maize Handbook. , Springer Science & Business Media. (2013).
  19. Freeling, M., Hake, S. Developmental genetics of mutants that specify knotted leaves in maize. Genetics. 111 (3), 617-634 (1985).
  20. Durbak, A. R., et al. Transport of boron by the tassel-less1 aquaporin is critical for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 26 (7), 2978-2995 (2014).
  21. Langdale, J. A., Lane, B., Freeling, M., Nelson, T. Cell lineage analysis of maize bundle sheath and mesophyll cells. Developmental Biology. 133 (1), 128-139 (1989).
  22. Bosabalidis, A. M., Evert, R. F., Russin, W. A. Ontogeny of the vascular bundles and contiguous tissues in the maize leaf blade. American Journal of Botany. 81 (6), 745-752 (1994).
  23. Junqueira, N. E. G., et al. Anatomy and ultrastructure of embryonic leaves of the C4 species Setaria viridis. Annals of Botany. 121 (6), 1163-1172 (2018).
  24. Robil, J. M., McSteen, P. Hormonal control of medial-lateral growth and vein formation in the maize leaf. New Phytologist. 238 (1), 125-141 (2023).
  25. Donnelly, P. M., Bonetta, D., Tsukaya, H., Dengler, R. E., Dengler, N. G. Cell cycling and cell enlargement in developing leaves of Arabidopsis. Developmental Biology. 215 (2), 407-419 (1999).
  26. Govindaraju, P., Verna, C., Zhu, T., Scarpella, E. Vein patterning by tissue-specific auxin transport. Development. 147 (13), (2020).
  27. Linh, N. M., Scarpella, E. Leaf vein patterning is regulated by the aperture of plasmodesmata intercellular channels. PLoS Biology. 20 (9), e3001781 (2022).
  28. Verna, C., Ravichandran, S. J., Sawchuk, M. G., Linh, N. M., Scarpella, E. Coordination of tissue cell polarity by auxin transport and signaling. eLife. 8, e51061 (2019).
  29. Sawchuk, M. G., Head, P., Donner, T. J., Scarpella, E. Time-lapse imaging of Arabidopsis leaf development shows dynamic patterns of procambium formation. New Phytologist. 176 (3), 560-571 (2007).
  30. Linh, N. M., Scarpella, E. Confocal imaging of developing leaves. Current Protocols. 2 (1), e349 (2022).
  31. Poethig, R. S., Szymkowiak, E. J. Clonal analysis of leaf development in maize. Maydica. 40, 67-76 (1995).
  32. Sprangers, K., Thys, S., van Dusschoten, D., Beemster, G. T. S. Gibberellin enhances the anisotropy of cell expansion in the growth zone of the maize leaf. Frontiers in Plant Science. 11, 1163 (2020).
  33. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 cofactors, BLH12 and BLH14, regulate internode patterning and vein anastomosis in maize. The Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  34. Schindelin, J., et al. FIJI: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Plant Care Protocols - Maize. The Donald Danforth Plant Science Center's Plant Growth Facility. , Available from: https://www.danforthcenter.org/our-work/core-facilities/plant-growth/ (2019).
  36. Mir, R., et al. A DII domain-based auxin reporter uncovers low auxin signaling during telophase and early G1. Plant Physiology. 173 (1), 863-871 (2017).
  37. DeBlasio, S. L., Sylvester, A. W., Jackson, D. Illuminating plant biology: Using fluorescent proteins for high-throughput analysis of protein localization and function in plants. Briefings in Functional Genomics. 9 (2), 129-138 (2010).
  38. Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: Generation and applications. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 535-543 (2013).
  39. Mohanty, A., et al. Advancing cell biology and functional genomics in maize using fluorescent protein-tagged lines. Plant Physiology. 149 (2), 601-605 (2009).
  40. Baker, R. F., et al. Sucrose transporter ZmSut1 expression and localization uncover new insights into sucrose phloem loading. Plant Physiology. 172 (3), 1876-1898 (2016).
  41. Gallavotti, A., Yang, Y., Schmidt, R. J., Jackson, D. The relationship between auxin transport and maize branching. Plant Physiology. 147 (4), 1913-1923 (2008).
  42. Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), 12 (2015).
  43. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: A cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  44. Geng, Y., Zhou, Y. Confocal live imaging of shoot apical meristems from different plant species. Journal of Visualized Experiments. (145), e59369 (2019).
  45. Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell Biology. 139, Elsevier. 203-223 (2017).
  46. Fodor, E., Ayaydin, F. Fluorescent probes and live imaging of plant cells. Advances in Plant Ecophysiology Techniques. , Springer. 241-251 (2018).
  47. Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. The Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
  48. Conklin, P. A., Johnston, R., Conlon, B. R., Shimizu, R., Scanlon, M. J. Plant homeodomain proteins provide a mechanism for how leaves grow wide. Development. 147 (20), (2020).
  49. Shaw, S. L. Imaging the live plant cell. The Plant Journal. 45 (4), 573-598 (2006).
  50. Klaus, A. V., Schawaroch, V., Frischmann, K. J. Confocal imaging and three-dimensional visualization of thick autofluorescent specimens. Methods in Molecular Biology. 1075, 213-225 (2014).
  51. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Extended depth-of-focus for multi-channel microscopy images: a complex wavelet approach. 2004 2nd IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: Nano to Macro (IEEE Cat No. 04EX821). IEEE. , 660-663 (2004).
  52. Extended Depth of Field. EPFL Biomedical Imaging Group. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2022).
  53. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  54. Phillips, K. A., et al. vanishing tassel2 encodes a grass-specific tryptophan aminotransferase required for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 23 (2), 550-566 (2011).
  55. Robil, J. M., et al. GrasVIQ: An image analysis framework for automatically quantifying vein number and morphology in grass leaves. The Plant Journal. 107 (2), 629-648 (2021).
  56. Helliwell, C. A., Chandler, P. M., Poole, A., Dennis, E. S., Peacock, W. J. The CYP88A cytochrome P450, ent-kaurenoic acid oxidase, catalyzes three steps of the gibberellin biosynthesis pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 2065-2070 (2001).
  57. Gutierrez, R., Quiroz-Figueroa, F., Vazquez-Ramos, J. M. Maize cyclin D2 expression, associated kinase activity and effect of phytohormones during germination. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 166-173 (2005).
  58. Atkinson, J. A., Wells, D. M. An updated protocol for high throughput plant tissue sectioning. Frontiers in Plant Science. 8, 1721 (2017).
  59. Lux, A., Morita, S., Abe, J., Ito, K. An improved method for clearing and staining free-hand sections and whole-mount samples. Annals of Botany. 96 (6), 989-996 (2005).
  60. Heriche, M., Arnould, C., Wipf, D., Courty, P. E. Imaging plant tissues: Advances and promising clearing practices. Trends in Plant Science. 27 (6), 601-615 (2022).
  61. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  62. Chuck, G., Muszynski, M., Kellogg, E., Hake, S., Schmidt, R. J. The control of spikelet meristem identity by the branched silkless1 gene in maize. Science. 298 (5596), 1238-1241 (2002).
  63. Tran, T. M., et al. An optimized whole-mount immunofluorescence method for shoot apices. Current Protocols. 1 (4), e101 (2021).
  64. O'Connor, D. L. PINs Lost and PINs Gained: Auxin-Transport Mediated Patterning in the Grasses. University of California, Berkeley. , Doctoral Dissertation (2012).
  65. Sharman, B. C., Hitch, P. A. Initiation of procambial strands in leaf primordia of bread wheat, Triticum aestivum L. Annals of Botany. 31 (2), 229-243 (1967).
  66. Serra, L., Tan, S., Robinson, S., Langdale, J. A. Flip-flap: A simple dual-view imaging method for 3D reconstruction of thick plant samples. Plants. 11 (4), 506 (2022).
  67. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 199 majs (Zea mays) græsbladprimordia bladanatomi og udvikling fluorescens og konfokal billeddannelse tværsnit hele monteringen ImageJ / FIJI cellulær billeddannelse
Forbedrede metoder til forberedelse af tværsnit og valsede hele monteringer af majsbladprimordia til fluorescens og konfokal billeddannelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Robil, J. M., Cortez, C. D. T.,… More

Robil, J. M., Cortez, C. D. T., Villafuerte, C. M. R., Dela Peña, E. D. C., De Leon, D. O., Rioja, R. J. R., McSteen, P. Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (199), e65239, doi:10.3791/65239 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter