Summary
トウモロコシの葉の原基は深く覆われて転がされているため、研究が困難です。ここでは、蛍光および共焦点イメージングのために、トウモロコシの葉の原基の横断切片と展開されたマウント全体を準備するための方法を紹介します。
Abstract
トウモロコシ(Zea mays)や他のイネ科(イネ科)では、葉の原基が葉の渦巻きの中に深く覆われて転がっているため、初期の葉の発達を研究することは困難です。ここでは、蛍光および共焦点イメージングのためにトウモロコシの葉原基の横断切片および展開されたマウント全体を調製するための方法について説明します。最初の方法は、ワイヤーストリッパーを使用して古い葉の上部を取り除き、葉の原基の先端を露出させ、より正確な横断面サンプリングのための測定を可能にします。2番目の方法は、透明な両面ナノテープを使用して、イメージング用の全葉原基を広げて取り付けます。トウモロコシの蛍光タンパク質レポーターの可視化と分析における2つの方法の有用性を示します。これらの方法は、トウモロコシの葉の原基の特徴的な形態によって提示される課題に対する解決策を提供し、トウモロコシおよび他のイネ科植物の葉の解剖学的および発生的形質を視覚化および定量化するのに役立ちます。
Introduction
草作物は世界人口の食料とバイオ燃料の主要な供給源であり1、葉の解剖学的構造を改善することは生産性を向上させる可能性があります2,3。しかし、イネ科植物の葉の解剖学的構造がどのように調節されているかについての現在の理解は限られており4、葉の解剖学的および生理学的特性の多くは発生の初期に事前に決定されているため、葉の原基の分析が必要です5,6,7。蛍光や共焦点イメージングなどの細胞イメージング技術は、草の葉の解剖学や細胞形質を研究するために不可欠ですが、これらの技術は葉の渦巻きの中で深く覆われて転がっているため、草の葉原基に適用することは困難です。私たちは、草の葉の解剖学と発達を研究するためのモデルシステムであるトウモロコシの葉原基の蛍光および共焦点分析のために、横断切片と展開された全葉マウントを準備する方法を開発することによってこの問題に対処しました2,8。
トウモロコシの葉は、すべての草の葉と同様に、茎を包み込み、芽9,10,11,12,13を発達させる鞘を備えたストラップのような刃で構成されています。葉は苗条頂分裂組織(SAM)から異形パターンで発達し、新しい葉はそれぞれ前の葉の反対の位置から始まり、垂直軸に沿って2つのランクの葉が得られます(図1A)14。各葉原基の発達段階はSAMに対する相対的な位置によって識別され、最も近い原基はプラストクロン1(P1)と呼ばれ、次の原基はP2、P3などと呼ばれます(図1B、C)2。発達中(図1D)、葉の原基は最初にSAMの基部の周りに三日月形のバットレスとして現れ(P1)、次に分裂組織(P2)9,10,11に広がるフード型の原基に成長します。フードの基底縁は横方向に拡大し、先端が上向きに成長するにつれて互いに重なり合い、円錐形の原基(P3-P5)10を形成します。その後、原基の長さは急速に成長し、葉の軸方向側にフリンジ状の突起である結紮が形成されると、基部の鞘と刃の境界がより顕著になります(P6 / P7)。最後に、葉は定常状態の成長中に渦巻きから出てくるときに展開し、分裂細胞はブレードの小さな基底領域内で制限され、近位遠位軸に沿って細胞が拡大および分化する勾配を形成します(P7/P8)15。トウモロコシ苗の苗条の頂点には、発育のさまざまな段階で複数の原基が含まれているため、葉の発達を研究するための優れたモデルとなっています8。
初期の葉の発達を正確に分析するには、他の成長または形態学的パラメータに関連して原基発達の明確な段階を定義するための病期分類または標準化された基準の使用が必要です。葉の原基は草の芽の中に隠れているため、研究者は通常、植物の年齢や出現する葉のサイズなどのパラメーターを、葉の原基の段階とサイズの予測因子として使用します9,16。トウモロコシでは、植物の年代順の年齢は、植え付けまたは発芽後の日数のいずれかによって決定されます(DAP / DAG)17,18。栄養段階(V期)は、目に見える襟、結紮と耳介の位置に対応するブレードと鞘の間の軸側の淡い線、ブレードの基部にある一対のくさび形の領域(図1A、B)17,19。20〜25 DAGの間で、SAMは花序分裂組織に移行し、新しい葉の生成を停止します20。トウモロコシの葉の原基の成長速度は、環境や植物の遺伝子型によって異なります。このため、植物の年齢と出現する葉のサイズは、葉の原基のサイズを正確に予測することはできません。ただし、これらのパラメーターを使用すると、実験目的で原基のステージとサイズの範囲を予測するのに役立ちます。
横断面分析は、シュート全体の単一のセクションで複数のプラストクロンのサンプリングを可能にするため、トウモロコシおよび他の草の葉の解剖学的構造および発達を調べるための一般的な方法である21,22,23。この方法は、周囲の葉が切断および取り付け中に葉の原基を所定の位置に保つ足場として機能するため、新鮮なサンプルの細胞イメージングにも便利です24。ただし、この方法の欠点は、無傷のシュートから切断するときに、原基内のターゲットプラストクロンと領域を正確に特定することが困難な場合があることです。さらに、葉の成長はプラストクロン間および近位遠位軸2,5に沿って異なるため、不正確なサンプリングは、特定のセクションの原基の発達段階と領域の誤った解釈をもたらす可能性があります。したがって、正確な横断面サンプリングの方法を開発することは、イネ科植物の解剖学的および発生的分析の精度と再現性を確保するために重要です。
全葉マウント分析により、増殖増殖25や静脈パターニング26、27、28など、臓器全体で発生する組織および細胞プロセスの包括的かつ統合的な調査が可能になります。この方法は、葉の傍皮の概要を提供し、横断面分析を使用して検出することが他の方法では困難であろう明確なプロセスおよびパターンの発見を可能にする24、27。シロイヌナズナとは異なり、すでに全葉マウントをイメージングする方法が確立されています29,30、現在、草の展開された全葉マウントをイメージングするための標準的な方法はありません。単離されたトウモロコシの葉の原基を展開するための以前のプロトコルは、珍しい材料を含み、細胞イメージングには適していませんでした31。コンピュータ断層撮影(CT)や磁気共鳴画像法(MRI)などの高度な画像技術は、原基11,32,33を分離して展開することなく3D解剖学的情報を取得できますが、高価であり、特殊な機器が必要です。トウモロコシや他のイネ科植物の葉原基の丸く円錐形の形態によって課せられる制約を克服する技術を開発することは、それらの解剖学的および発達的形質の調査を進めるでしょう。
ここでは、蛍光および共焦点イメージングのために、トウモロコシの葉の原基の横断切片と展開されたマウント全体を準備するための方法を紹介します。これらの方法を用いて、トウモロコシの葉原基における静脈数を定量化し、蛍光タンパク質(FP)24による時空間的ホルモン分布をマッピングしました。最初の方法は、ワイヤーストリッパーでトウモロコシの苗から古い葉の上部を取り除くことです(図1E)。原基(P5-P7)の先端を露出させることで、周囲の古い葉を完全に取り除くことなく長さを決定することが可能になり、簡単で正確な切片作成が可能になります。2番目の方法は、透明な両面ナノテープで全葉原基(P3-P7)を展開および取り付けることです(図1F)。これらの方法は、様々なFPs24を可視化するのに適しているが、蛍光色素および透明化試薬を使用するための最適化が必要である。さらに、ImageJ/FIJI34 の Z スタックの平坦化、画像のステッチング、およびチャネルのマージに関するいくつかの手順について概説します。これらの方法は、トウモロコシの葉の日常的な蛍光または共焦点イメージングに役立ちますが、イネ、セタリア、ブラキポディウムなどの他のモデルイネ科植物にも適用できます。
図1:トウモロコシ葉原基の構成と形態、および方法の概要 。 (A)トウモロコシ苗の模式図。トウモロコシには葉状突起があり、新しい葉は前の葉の反対側の位置から始まります。葉番号は、葉が発芽から出てきた年代順を示します(すなわち、最初の葉、L1、2番目の葉、L2、3番目の葉、L3など)。各葉は遠位刃と、結紮と耳介に対応する襟で描かれた基底鞘を持っています。襟が見える一番上の葉は栄養段階を示します。この例の苗はV2ステージにあり、L2カラー(矢じり)が見えます。はさみアイコンは、収集するために苗を切る必要がある中胚軸(me)の場所を示します。(B)単離されたL1〜L4を示す解剖シュートの模式図、(C)に拡大画像として示した葉原基L5〜L9。プラストクロン数は、SAMに対する原基の位置を示し、最も若い葉の原基(P1)がSAMに最も近く、古い葉の原基(P2、P3、P4など)が連続して遠くなります2。(D)P1からP5までのトウモロコシ葉原基の形態の模式図。(E)トウモロコシ葉原基の横断面解析方法の概略概要。(1)ワイヤーストリッパーで古い葉を切り取ります。(2)原基を測定し、シュートを切片化します。(3)イメージングと処理のためにスライドにセクションを取り付けます(4、5)。(F)トウモロコシ葉原基のホールマウント分析方法の概略概要。(1)周囲の葉を取り除き、原基を抽出します。(2)原基をナノテープ上で平らに切断して広げます。(3)イメージングおよび処理用のサンプルをマウントします(4、5)。略語:L =葉;bl =ブレード;sh =シース;co =襟;私=中胚軸;V =栄養;P =プラストクロン;SAM =頂端分裂組織を撃ちます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
1.トウモロコシの葉の発達のステージングと実験の設計
- 植物の成長と葉の発達の段階
- 実験に使用する植物の年齢と発達段階を決定し、葉の発達の詳細な病期分類を実行します。
注:病期分類は、実験で使用される突然変異株またはトランスジェニック株と同じ遺伝的背景を持つ植物に対して実行することをお勧めします。SAMは、遺伝的背景と成長条件に応じて、20〜25 DAGの間に新しい葉の生産を停止します。このため、ここで説明する方法は、7〜14 DAGのトウモロコシ苗に最適です。 - 適切な植物ケアプロトコル35に従って、温室または成長チャンバーでトウモロコシ植物を育てます。
- 土壌表面の下の茎である中胚軸を切って、小さなナイフまたはハサミで目的の年齢またはV段階の植物を収集します(図1A)。苗の横にある土に切削工具を慎重に挿入し、45°の角度で根元までスライドさせて中胚軸を切ります。
- 苗を土から持ち上げ、植物にしがみついている可能性のある残りの汚れや土の粒子をほこりで取り除きます。子葉鞘、若い苗の新芽を覆っている保護鞘を手で取り除きます。
- 各植物について、Vステージ、葉の数、および渦巻きから出てくる最後の葉の長さを記録します。後で参照できるように植物の写真を撮ります。
- 古い葉を一枚ずつ取り除きます。これを行うには、中胚軸または茎の残骸で植物を保持し、鞘の基部から各葉を切り取り、歯科用プローブを使用して円を描くように鞘をそっと広げます(図1B)。
注意: 周囲の葉をすばやく削除する方法については、手順2.1を参照してください。 - 約2倍の倍率の実体顕微鏡下で、サンプルが乾燥しないように、湿ったワイプでシュートの頂点の残りの部分を注意深く解剖します。SAM、P1、およびP2が見えるまで、針を曲げた歯科用プローブまたは細い鉗子のペアを使用して、各葉の原基をそっと切除して広げます(図1D)。各プラストクロンの外観と測定値を記録します。
注: 補足ファイル1のトウモロコシ苗の葉発達病期分類の例を参照してください。
- 実験に使用する植物の年齢と発達段階を決定し、葉の発達の詳細な病期分類を実行します。
- 実験の計画
注:実験を慎重に計画すると、効率を向上させることができます。たとえば、横断面解析では、特定のプラストクロンまたは領域をイメージングするときに切断するおおよその位置を決定することで、解剖時間を短縮できます。 図2 は、標準化されたサンプリングの例を示しています。さらに、FPまたは蛍光プローブの特性に基づいてイメージングパラメータを最適化することで、実験の効率を向上させることができます。- ステージング情報をガイドとして利用して、特定のプラストクロン、原基領域、および組織に実験を集中させます。FPまたはその他の目的の蛍光プローブを使用して、いくつかのサンプルについて以下のセクション2および/または3に従ってください。
注:https://www.maizegdb.org/data_center/stock で利用可能なトウモロコシFPマーカーline36-42シードストックを参照してください。 - 適切な検出器またはフィルター、励起および発光波長、ピンホールサイズ、その他の設定など、各FPレポーターまたはプローブに最適な画像取得パラメーターを決定します。設定を保存して、各実験の動作条件を再現します。
注:発育中の葉の共焦点レーザー走査顕微鏡の技術ガイドラインについては、LinhおよびScarpella30 を参照してください。 - FPレポーター43の半減期やその他の特性に基づいて撮影時間を計画する。
注:実験を計画する際には、新鮮な植物サンプルがこの期間中に乾燥と細胞の変化を受けるため、解剖とイメージングの間の時間も考慮する必要があります。
- ステージング情報をガイドとして利用して、特定のプラストクロン、原基領域、および組織に実験を集中させます。FPまたはその他の目的の蛍光プローブを使用して、いくつかのサンプルについて以下のセクション2および/または3に従ってください。
図2:トウモロコシ葉原基の横断面分析のためのサンプリングスキーム。 (A、左)7 DAGトウモロコシ苗の近位シュート、P7で露出した4番目の葉(L4)を示す。破線は、原基に沿った0.5mmから10mmまでの7つのサンプリングポイントを示しています。 (A、右)葉の原基の概略図、および各プラストクロンの投影サイズと位置:P7(白);P6(マゼンタ);P5(青);P4(緑);そしてP3をSAM(黄色)まで。(B-H)Aに示すサンプリング点を表す横断面の蛍光画像で、10 mm(B)から0.5 mm(H)まで。原基は、(A)のプラストクロンの配色に従って擬似着色されています。切片は、自己蛍光用のロングパス発光UVフィルターを使用して落射蛍光顕微鏡で画像化されました。スケールバー = 200 μm (B-H)。この図は、RobilとMcSteen24の許可を得て変更および複製されています。略語:DAG =発芽後の日数。P =プラストクロン;SAM =頂端分裂組織を撃ちます。†=葉の鞘または適切な前結紮;* =頂端分裂組織を撃つ。** = ステム。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. トウモロコシ葉原基の横断面のイメージング
- 周囲の古い葉を取り除き、葉の原基を測定する
- 手順1.1.3-1.1.4(図1A)で説明されているように、土壌表面の下の中胚軸で小さなナイフまたはハサミで慎重に切断して苗を収集します。
- 使用する正しいワイヤーストリッパーの穴のサイズと、シュートに沿ってカットを行う場所を決定します。穴がターゲット原基に収まるのに十分な大きさであることを確認してください。
- シュートのより遠位の部分で切断を開始し、原基の先端が露出するまで徐々に基部に向かって作業します。
- カットするには、あごをシュートに向けてワイヤーストリッパーを持ちます。選択した穴にシュートを配置し、ストリッパーハンドルを一緒に絞って葉の渦巻きを切ります。
注意: ターゲット原基を誤って切断しないように、シュートの中心をワイヤーストリッパーの穴に注意深く合わせます。より大きな植物の場合は、ストリッパーを使用する前に、周囲の葉の一部を手で手動で取り除くことをお勧めします。
注意: ワイヤーストリッパーには鋭い顎があり、慎重に使用しないと切り傷やその他の怪我を引き起こす可能性があります。 - ハンドルを一緒に握り続けながら、ストリッパーをシュートからスライドさせて葉の上部を整えます。原基のターゲット領域が周囲の葉で覆われたままであることを確認します(補足図S1C、D)。
注意: 上部の葉をトリミングした後、シュートには原基の先端が露出したままになります(カットの位置と使用するワイヤーストリッパー穴のサイズに応じて、P5、P6、またはP7。 図1E)。この原基は、若い原基の大きさと段階を推定するための基準として役立ちます。P6は、そのサイズ範囲とピン状の形態により、トウモロコシの苗に使用するための最も実用的なリファレンスです。 - 定規を使用して、原基の先端からシュートの根元までの長さを測定します。測定値を記録します。
注:原基の基部に数ミリメートルの茎があるため、原基の長さはわずかに過大評価されます(図2A)。
- 葉の原基のフリーハンドセクショニングとイメージング
- 約0.8倍の倍率の実体顕微鏡下で、ガラスのまな板やその他の傷のつきにくい材料などの滑らかな表面にシュートをしっかりと保持します。かみそりの刃またはメスを使用して、原基の長さに沿った目的のポイントでシュートの薄い部分(0.25〜0.8 mm)を切断します。
- ターゲット領域の少し上に最初のカットを作成して、シュートの遠位部分を破棄し、次にターゲット領域の周りの薄い切片を取得します。きれいにカットするには、ブレードをシュートに対して垂直に持ち、滑らかで均一な動きで内側にスライドさせます。
注:より大きな原基(P6またはP7)には、数ミリメートルの断面化の余裕がある場合があります。ただし、より小さな原基(P5以前)の場合、これらの原基はシュートの基部の最初の数ミリメートル以内に積み重ねられるため、1 mmはサンプリングに大きな違いをもたらす可能性があります( 図2A、F-Hを参照)。より細かい断面化には、両刃のかみそりの刃を使用することをお勧めします。
注意: かみそりの刃やメスを使用するときは、偶発的な切り傷や怪我を防ぐために注意してください。 - 葉の鞘が刃を簡単に鈍らせる可能性があるため、かみそりの刃を定期的に交換してください。サンプルが乾くのを防ぐために、切片作成の各ラウンドの後に湿ったワイプでシュートを覆います。
- リーフセクションをきれいなスライドガラス(75 mm x 25 mm)に取り付け、ピペットを使用して水滴(または50%グリセロール)をセクションに直接塗布し、カバースリップ(22 mm x 22 mm)を上に置きます。
- 蛍光色素を使用する場合は、色素溶液を切片に塗布し、カバーガラスを上に置き、必要に応じてインキュベートします。
注意: 染料の種類によっては、次のステップに進む前に、リーフセクションを処理するための追加の手順が必要になる場合があります。これらの参考文献44、45、46、47は、植物細胞イメージングにおける蛍光色素の一般的な詳細および使用を提供する。核染色蛍光色素である5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)は、トウモロコシの葉の原基48の横断面に効果的に使用されています。対照的に、フェイマオ4-64(FM 4-64)やヨウ化プロピジウムなどの原形質膜染色色素は、満足のいく結果をもたらさない(図3A-D)。 - スライドを落射蛍光または共焦点レーザー走査型顕微鏡のステージに置き、必要に応じて焦点と設定を調整して蛍光色素30を視覚化します。選択したトウモロコシFPレポーターラインに使用される照明および画像取得設定については、 表1 を参照してください。
注:厚い切片は、高レベルのバックグラウンド自家蛍光を生成する可能性があります。この問題を軽減するのに役立ついくつかのイメージングおよび標本調製戦略を検討してください30,49(表2を参照)。
注意: 目の損傷のリスクを減らすために、強力な光源やレーザーを扱うときは注意を払い、保護眼鏡を着用してください。 - 異なる倍率および検出チャネル(明視野照明を含む)でのリーフセクションを介した画像30。4倍の倍率を使用して横断面全体を画像化し、20倍または40倍の倍率を使用して特定の組織を画像化します。落射蛍光イメージングの高倍率での露光時間を短縮して、サンプルを急速な光退色から保護します(表1を参照)。
- セクション全体または特定の関心領域(ROI)の画像をキャプチャします。必要に応じて、異なる焦点深度30で撮像された一連の画像であるzスタックを取得する。
- zスタックを取得するには、まず試験片の上下の位置を決定し、次にこれらの位置間でキャプチャする必要がある光学セクションの数を決定します。光学セクションが少ないほど、各セクション間の距離である Z ステップ サイズが大きくなります。FPの特性と使用する倍率に応じて、トウモロコシの葉の原基の横断面をイメージングするために、1〜12μmのzステップサイズで3〜25の光学セクションをキャプチャします。
注意: zスタックを平坦化するには、顕微鏡ソフトウェアまたはImageJ / FIJI34を使用して実行できる適切なボリュームレンダリング技術50を使用します(手順4.1および4.2を参照)。 - すべての画像ファイルとそれに関連するメタデータ (使用可能な場合) を保存します。
表1:選択したトウモロコシFPレポーターの蛍光および共焦点イメージングに使用される照明および画像取得設定。 略語:FP =蛍光タンパク質;TRITC = テトラメチルローダミン;FITC = フルオレセインイソチオシアネート;WLL = 白色光レーザー;Arイオン=アルゴンイオンレーザー;HyD = ハイブリッド検出器;AU = エアリーユニット;Hz =ヘルツ、毎秒のスキャンライン。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
3.トウモロコシの葉の原基の展開されたマウント全体のイメージング
- 原基を解剖し、ナノテープでスライドガラスを準備する
- 手順1.1.3-1.1.4(図1A)で説明されているように、土壌表面の下の中胚軸で小さなナイフまたはハサミで慎重に切断して苗を収集します。
- 植物を解剖する前に、透明な両面ナノテープ(補足図S1H)でスライドガラス(75 mm x 25 mm)を準備します。長方形のナノテープを切り取り、きれいなスライドガラスの中央に貼り付けます。テープの上面にある保護プラスチックフィルムは剥がさないでください。
メモ: 画像化するサンプルのサイズに応じて、使用するテープのサイズを決定します( 補足図S1I、Jの特大サンプルの例を参照)。ナノテープは、アクリルまたはポリウレタンゲル材料のいずれかで入手可能です。両方のタイプは、蛍光および共焦点イメージングに有効である24。テープの変色を防ぐため、暗い容器に保管して、長時間光にさらされないように保護してください。 - 手順2.1で説明するように、ワイヤーストリッパーで古い葉の上部を取り除くことにより、シュートの解剖を開始します。
- 中胚軸でシュートを持ち、歯のプローブで周囲の葉を慎重に取り除き、原基を抽出します。これを行うには、苗条の根元から葉を取り除き、関心のある原基が露出するまで一度に1つずつ広げます。
- あるいは、ワイヤーストリッパーを使用して、シュートの基底領域に切り込みを入れることにより、葉の原基を直接抽出します(補足図S1E-G)。
注:この方法では、原基がスナップするリスクが高くなります。
- 原基の取り付けとイメージング。
- テープから保護フィルムをはがします。露出した原基をテープの上に置きます。かみそりの刃を使用して基部で原基を切り、基底茎と胚軸を捨てます(図1F)。
- 針を曲げた歯科用プローブ(先端直径0.25〜0.6 mm)を使用して原基を広げます。3 mm未満の原基(P3から初期P4)には、マイクロプローブ(先端直径0.15〜0.2 mm)を使用します。
- 針先を表面に平行に配置し、外側の基底縁を広げて、テープにそっと押し付けます。
- よりスムーズに巻き戻すには、針の先端を100%グリセロールに浸して、葉の内面(軸方向)を滑らかにします。
- 外側の縁がテープに付着した状態で、針先を葉の長軸に平行に合わせます。針をゆっくりと横にスライドさせて広げ、葉をテープの上に平らにします(図1F)。
注意: 展開中に葉を壊したり損傷したりすることは、特に堅牢な中央肋骨を備えたより大きな原基で一般的です(図3E-Gを参照)。葉を激しく広げると、その表面が傷つき、イメージング中にアーティファクトが発生する可能性があります(図3H)。これらの問題に対する推奨解決策については、表 2 および説明を参照してください。 - 広げた原基に一滴の水をかけます。すぐに水滴と原基の上にカバーガラスを置きます。カバーガラスの端をゆっくりと押し下げて、テープに付着させます。
注意: テープに接着するための余分な領域がある大きな長方形のカバースリップ(50 mm x 24 mmまたは60 mm x 24 mm)を使用することをお勧めします。葉を歪め、光の屈折が不均一になる可能性のある気泡の形成を最小限に抑えます(図3I-Kを参照)。取り付けられた原基の余白が緩く接着したカバーガラスの下でロールバックする可能性があるため、カバースリップがテープに完全に付着していることを確認してください(図3Lを参照)。 - スライドを落射蛍光( 補助図S1K参照)または共焦点レーザー走査型顕微鏡のステージに置き、必要に応じて焦点と設定を調整して蛍光色素30を視覚化します。選択したトウモロコシFPレポーターラインに使用される照明および画像取得設定については、 表1 を参照してください。
- 葉全体または特定のROIを様々な検出チャネル30を通して画像化する。葉全体を画像化するには、葉のモザイク画像を手動でキャプチャするか、低倍率(4倍または10倍)で顕微鏡のタイリング操作を使用します。
注:最小倍率でも、トウモロコシの葉の原基は大きすぎて落射蛍光または共焦点レーザー走査型顕微鏡で画像化できない可能性があり、その結果、イメージング時間が長くなり、光退色( 図3Mを参照)またはバックグラウンド自家蛍光の増加が発生する可能性があります。したがって、5 mmを超える全葉サンプルのイメージングには、蛍光実体顕微鏡を使用することをお勧めします。 - 共焦点イメージングでは、葉の厚さを含むzスタックを取得する必要があります(ステップ2.2.9を参照)。
- すべての画像ファイルとそれに関連するメタデータ (使用可能な場合) を保存します。
表2:トウモロコシの葉の原基の横断面とマウント全体のイメージングにおける一般的な問題のトラブルシューティング。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図3:トウモロコシの葉の原基の最適ではない横断面と全マウントの準備。 (A-D)原基膜マーカーPIP2-1-CFP(A)と原形質膜結合性蛍光色素FM 4-64(B)による葉原基の横断切片の代表的な共焦点画像と、対応する明視野画像(C、D)。PIP2-1-CFPと比較すると、FM 4-64はセルの輪郭の最適ではない視覚化を表示します。(イーエム)裂け目(E-G)、傷ついた表面†(H)、気泡*(I-K)、ロールバックマージン(L)、およびフォトブリーチング領域‡(M)の存在を示す葉の原基のマウント全体の代表的な蛍光画像。葉原基はDII-金星(E-G)、GAR2-YFP(H-J)、mDII-金星(K)、PIN1a-YFP(L)、およびDR5-RFP(M)を表します。スケールバー = 200 μm (A-D);500 μm (E-M)図3AはRobilとMcSteen24の許可を得て修正および複製されていますが、図5B-Mは著者からの未発表データです。略語:P =プラストクロン;YFP = 黄色蛍光タンパク質;RFP = 赤色蛍光タンパク質;CFP = シアン蛍光タンパク質;PIP2-1-CFP = p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP;DII-Venus = pZmUbi:DII:YFP-NLS;GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP;mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS;PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP;DR5-RFP = DR5rev::mRFPer;BF =明視野。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. 画像J/FIJIを使用した画像の処理
- 最大強度投影 (MIP) を使用した z スタックの平坦化
- ImageJ/FIJIを起動して画像のスタックを開くか、画像|スタック |メニューからスタックする画像。
- イメージ スタックを選択します。メニューから [画像 |スタック |Zプロジェクト...。[Z プロジェクト]ダイアログ ボックスで、[投影タイプ]ドロップダウン メニューから[最大強度]を選択します。[OK]をクリックして、最大強度の Z 投影を作成します。
注:平坦化された画像は、zスタック50全体で最も高い強度を持つピクセルの2D投影です。この方法は、蛍光色素の可視化には適していますが、厚い横断面や葉全体のマウントの明視野画像における解剖学的特徴の可視化には適していません。 - [ファイル]を選択して、画像をTIFF(タグ付き画像ファイル形式)として保存します |名前を付けて保存 |ティフ。ファイルの名前を入力し、[ 保存] をクリックします。
注:画像を保存するときに品質と詳細を保持するため、蛍光画像と共焦点画像の保存にはTIFFを使用することをお勧めします。
- 拡張被写界深度 (EDF) プラグイン51 を使用した z スタックの平坦化
- EDF プラグイン52 をインストールします。http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ から Extended_Depth_Field.jar ファイル(バージョン17.05.2021)をダウンロードし、ImageJ/FIJIの「plugins」フォルダに配置します。
- ImageJ/FIJIを起動して画像のスタックを開くか、画像|スタック |メニューからスタックする画像。
- イメージ スタックを選択します。メニューから プラグイン |被写界深度の拡大 |EDFイージーモード。[ 被写界深度の拡張 ]ダイアログ ボックスで、[速度 /品質] の下のスライダを使用して目的の品質と処理速度を設定し、[ 高さマップ登録 ]を使用して地形の滑らかさのレベルを設定します。[ 実行 ] をクリックして、再構築されたイメージを作成します。
注:EDFは、最適なフォーカス51を投影することにより、スタックを鮮明な合成2D画像に結合します。この手法は、限られた焦点深度を克服するのに役立ち、厚い横断面または全葉マウントの明視野画像を再構築するのに適しています。このフィルターを適用して蛍光色素を可視化する場合は、MIPとは異なり、EDFは画像のコントラストを調整し、ピクセル強度に影響を与えるため、注意してください。 - 画像を TIFF ファイルとして保存するには、[ ファイル] |名前を付けて保存 |ティフ。ファイルの名前を入力し、[ 保存] をクリックします。
- グリッド/コレクションを使用した画像のつなぎ合わせ ステッチプラグイン53
- つなぎ合わせる画像または画像スタックのコレクションを1つのディレクトリに保存します。
- ImageJ/FIJI を起動してプラグインを選択する |ステッチ |メニューからグリッド/コレクションステッチ。[グリッド/コレクション ステッチ] ダイアログ ボックスで、[種類] ドロップダウン メニューから [不明な位置] を選択し、[順序] から [ディレクトリ内のすべてのファイル] を選択します。OK をクリックします。
- [グリッド スティッチング: 不明な位置]、[ディレクトリ内のすべてのファイル] ダイアログ ボックスで、[ディレクトリ] テキスト フィールドにディレクトリ パスを入力するか貼り付けるか、[参照...] をクリックしてディレクトリの場所を指定します。[OK] をクリックして、ステッチ プロセスを開始します。
注: グリッド/コレクションステッチプラグインの不明な位置オプションは、重なり合う領域を分析することにより、連続した画像のセットから合成画像を再構築します。したがって、このオプションは、タイルスキャン操作を使用して取得されない横断面または全葉マウントの画像のモザイクをステッチする場合に便利です。 - ステッチングが終了すると、ステッチされた画像を含む新しいウィンドウが表示されます。画像を TIFF ファイルとして保存するには、[ ファイル] |名前を付けて保存 |ティフ。ファイルの名前を入力し、[ 保存] をクリックします。
注:2Dおよび3D画像の大きなモンタージュのステッチングは、顕微鏡ソフトウェアの画像再構成コマンドまたはImageJ/FIJIの Bio-Formatsインポートオプション を使用して行うこともできます。
- 「チャンネルを結合」コマンドを使用した複数のチャンネルの結合
- ImageJ/FIJIを起動し、マージする画像または画像スタックを開きます。
注: イメージ スタックは、最初に手順 4.1 または 4.2 を使用してフラット化できます。蛍光色素チャネルの平坦化にはMIPが推奨されますが、EDFは明視野チャネルや焦点深度の異なる他のチャネルの平坦化に適しています。 - 画像で画像の明るさとコントラストを調整する |調整 |明るさ/コントラスト。スライダーまたは入力フィールドを使用してパラメーターを調整し、[ 適用] をクリックします。または、線形ヒストグラム ストレッチ法を使用して、[ プロセス |コントラストを高める...。 飽和ピクセルの割合を設定し、「 ノーマライズ」を選択してから、「 OK」をクリックします。
注:画像間で蛍光色素のシグナル強度を定量化または比較する場合、画像の相対ピクセル強度が変化し、測定と比較に影響を与える可能性があるため、明るさやコントラストを調整しないことをお勧めします。 - チャンネルを区別するには、ルックアップテーブル(LUT)を使用して特定の画像に擬似カラーを適用します。これを行うには、イメージを選択し、[ImageJ/FIJI] メニューから [ イメージ] を選択し、[ ルックアップ テーブル] をクリックして、ドロップダウン リストから適切な LUT を選択します。
- メニューから [ 画像 |カラー |チャンネルをマージします。各チャンネル(C1、 C2、 C3など)で、ドロップダウンリストを使用して、そのチャンネルに割り当てる画像を選択します。[ OK ] をクリックしてチャネルを結合します。
- [ ファイル] |名前を付けて保存 |ティフ。ファイルの名前を入力し、[ 保存] をクリックします。
- ImageJ/FIJIを起動し、マージする画像または画像スタックを開きます。
Representative Results
トウモロコシ葉原基の横断面解析
プロトコルセクション2を使用して、静脈数を定量化し、FPを伴うトウモロコシの葉原基の横断面のホルモン応答パターンを特徴付けました(図4)24。葉の成長と葉脈形成における植物ホルモンオーキシンの役割を評価するために、オーキシン欠乏トウモロコシ変異体であるバニシングタッセル254の葉原基の静脈数を定量化しました。初期のプラストクロンでは、発達中の静脈は、トウモロコシの葉の原基21,22の中央細胞層で明確な細胞化を示します。しかしながら、従来の組織学的技術22を用いて静脈を同定および計数することは、労働集約的であり、時間がかかる可能性がある。そこで、静脈の定量化に、トウモロコシオーキシン排出タンパク質マーカーp Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41(以下、PIN1a-YFP)を利用し、発達中の静脈および前形成層鎖(PCS;図4A)。プロトコルセクション2を使用して、セクショニング前に原基を測定することにより、横断セクションサンプリングを標準化することができました(図4B、C)。我々は、vt2が通常よりも広い原基と多くの葉脈を有する傾向を発見し(図4D,E)24、これは完全に拡張された葉55のデータと一致し、vt2の欠陥が葉の発達の初期に始まったことを示している。プロトコルセクション2を使用して、葉原基におけるホルモン応答FPレポーターの発現パターンを体系的に調べることができました(図4F-Iの画像の例を参照)。標準化された横断サンプリングスキームを通じて、オーキシン、サイトカイニン(CK)、およびジベレリン酸(GA)応答の分布をさまざまなプラストクロンおよび葉原基の領域にわたってマッピングし、葉の成長と葉脈形成に影響を与えると仮定する新しい応答パターンを発見しました24。したがって、これらの代表的な結果は、トウモロコシの葉原基の横断断面分析のためのプロトコルセクション2の有用性を実証する。
図4:トウモロコシ葉原基の横断面解析の代表的な結果。 (A-E)オーキシン排出タンパク質マーカーPIN1a-YFPによる正常および消失タッセル2の葉原基の静脈数と原基幅の定量化。(A)発達中の静脈および前形成層鎖におけるPIN1a-YFPを発現するP5からP7の横断部の代表的な蛍光画像。横断切片をFITCフィルター(495-519 nm励起)を用いた落射蛍光顕微鏡で画像化した。静脈の数と原基の幅は、それぞれFIJI/ImageJのマルチポイントツールとフリーハンドラインツールを使用して定量化されました。(B)4枚目の葉の先端を露出させるためにワイヤーストリッパーで上部の葉の渦巻きを取り除いたトウモロコシ苗(L4)。括弧は投影された原基の長さにまたがり、破線は中間の長さを示します。(C)原基の形状をP5からP7まで変化させた模式図で、原基の発達段階によって中央長(水平破線)の静脈数と原基幅がどのように変化するかを示しています。(D,E)正常およびvt2のL4の中央長部分における原基幅(D)および静脈数(E)の測定。近似曲線は、測定値の10mm移動平均±平均の標準誤差(SEM)を表します。(F-I)PIN1a-YFP、オーキシン応答レポーター、DR5-RFP、サイトカイニン応答レポーター、TCS-トマト、ジベレリン酸応答マーカー、GAR2-YFP、およびオーキシンシグナル伝達入力レポーターDII-Venusの変異バージョンであるmDII-Venusの組み合わせを発現する葉原基の横断切片の代表的な共焦点画像。FPチャンネルは、各画像の明視野チャンネルに重ね合わされます。スケールバー = 200 μm (A);10ミリメートル(B);100 μm (F-I)この図は、RobilとMcSteen24の許可を得て変更および複製されています。略語:DAG =発芽後の日数。P =プラストクロン;vt2 = 消失するタッセル2;PCS = 前形成層鎖;YFP = 黄色蛍光タンパク質;FITC = フルオレセインイソチオシアネート;RFP = 赤色蛍光タンパク質;PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP;DR5-RFP = DR5rev::mRFPer;TCS-トマト = TCSv2::NLS-tdトマト;GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP;mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
トウモロコシ葉原基のホールマウント分析
プロトコルセクション3に従って、トウモロコシ葉原基の全葉マウントにおけるFP発現を視覚化および分析しました(図5)。PIN1a-YFPで静脈パターンを可視化することで、初期のプラストクロンでは原基全体で静脈の形成が起こるが、発生後期の近位領域ではこの過程が制限されることが分かった(図5A)24。横断面解析を補完する全葉マウント解析では、静脈形成中のホルモン応答の組織および病期特異的パターンが明らかになりました24。一例は、PIN1a-YFP発現に対するCK応答レポーターTCSv2::NLS-tdトマト37(TCS-トマト)の発現パターンである(図5B)24。プロトコルセクション3に従うことにより、葉原基におけるFP発現の定性的および定量的分析の両方を実行することができました(図5D-F;未発表データ)。オーキシン応答レポーターDR5rev::mRFPer41(DR5-RFP)とGA応答性マーカーp Zm GAR2::ZmGAR2:YFP39(GAR2-YFP)の発現パターンを、vt2および矮性植物3(d3)の全葉マウントで調べました(図5D)。また、細胞周期57におけるG1/S転移のマーカーであるpZmCyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42(Cyclin-D2B-YFP)を用いて、正常葉原基とvt2葉原基の細胞増殖の相対レベルを比較した(図5E、F)。正常とvt2の間に有意差はなかったが、Cyclin-D2B-YFP発現は初期プラストクロンの既知の細胞増殖プロファイルと一致した31。プロトコルセクション3は、ロール形態のために画像化が困難なトウモロコシ葉原基のマウント全体を分析するための効果的な方法であると結論付けました。
図5:トウモロコシ葉原基のホールマウント分析の代表的な結果。 (A)オーキシン排出タンパク質マーカーPIN1a-YFPによってマークされた、発達中の静脈および形成層鎖を示す7つのDAGトウモロコシ苗の葉の原基の代表的な蛍光画像。P3-P6原基を基部から摘出し、巻き出し、軸方向を上にして平らにした。挿入図は、P3 と P4 のクローズアップを示しています。P5およびP6では、破線が増殖帯の遠位端を画定しており、そこでは形成層鎖の大部分がまだ発達および伸長している。(B,C)P5原基の近位辺縁領域におけるPIN1a-YFPおよびサイトカイニン応答レポーターTCS-Tomatoの発現を示す代表的な共焦点画像。(D)消失するタッセル2および矮性植物3の正常および単一および二重変異体におけるオーキシン応答レポーターDR5-RFP、およびジベレリン酸応答マーカーGAR2-YFPの発現を示すP4原基の代表的な蛍光画像。(E)細胞周期におけるG1/S遷移のレポーターであるサイクリン-D2B-YFPの発現を示すP3および/またはP4の代表的な共焦点画像。(F)ImageJ/FIJIを用いて原基の領域にわたるサイクリン-D2B-YFPシグナルの集積密度を測定することによって定量化された、正常およびvt2のP3/P4葉原基における細胞増殖の相対量。バーは、平均測定値±平均の標準誤差を表します。スケールバー = 500 μm (A、D、E);200 μm (B);100 μm (C)図4A-CはRobilとMcSteen24の許可を得て修正および複製されていますが、図4D-Fは著者からの未発表データです。略語:DAG =発芽後の日数。P =プラストクロン;VT2 =消えるタッセル2; d3 =矮性植物3; YFP = 黄色蛍光タンパク質;RFP = 赤色蛍光タンパク質;PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP;TCS-トマト = TCSv2::NLS-tdトマト;DR5-RFP = DR5rev::mRFPer;GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP;サイクリン-D2B-YFP = p Zm サイクリン-D2B::Zmサイクリン-D2B:YFP;ns = 有意差なし。au = 任意の単位。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:トウモロコシ苗における葉発育病期分類の例。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S1:プロトコルで使用される植物サンプルと材料。 (A,B)ワイヤーストリッパーを使用して上部の葉の渦巻きを取り除いたトウモロコシの苗7-8 DAG。(B)挿入図は、露出したP6原基でのシュートのクローズアップを示しています。(C-G)横断面分析(C,D)のために上部の渦巻きが除去されたトウモロコシ苗の苗条と、全マウント分析(E-G)のために周囲の葉が完全に除去された。(h)ポリウレタンゲル透明両面ナノテープのロール体。(I,J)P6葉原基(I)およびP8葉(J)の近位領域をロールアウトし、ナノテープでスライドガラス上にマウントした。(k)落射蛍光顕微鏡のステージに取り付けられた、展開された葉の原基を備えたスライドガラス。略語:DAG =発芽後の日数。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
細胞イメージング用のトウモロコシ葉原基を調製するための2つの方法を提示する。第1の方法(プロトコルセクション2)は、横断面分析のための原基の測定を可能にし、第2の方法(プロトコルセクション3)は、全マウント分析のための原基の展開および平坦化を可能にする。これらの方法は、トウモロコシの葉の原基24におけるFPの細胞イメージングを容易にし(図4および図5に示すように)、トウモロコシの葉のイメージングの課題に対する簡単な解決策を提供します。プロトコルセクション2は、ステージングパラメータ9、16のみに依存するのではなく、セクショニング前に原基を測定することにより、解剖時間を短縮し、サンプリング精度を向上させます。市販のナノテープを用いて、プロトコルセクション3は、トウモロコシの全葉原基のイメージングの長年の問題を解決する。このプロトコルは、透析チューブ31を使用した以前の方法を改善し、CTおよびMRI11、32、33よりもはるかに安価な代替手段です。ただし、葉の解剖学的特徴を視覚化し、最適な結果を生成することになると、両方のプロトコルにいくつかの制限があり、表2に概説し、以下で詳しく説明します。
プロトコルセクション2では、葉原基の厚い横断切片の細胞輪郭を視覚化することが困難であり、細胞壁または原形質膜結合蛍光色素による対比染色は満足のいく結果を提供しませんでした。例えば、FM 4-64は、原形質膜FPマーカーであるp Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39(PIP2-1-CFP;図3A-D)。この制限を克服するために、ビブラトームを使用してより薄い組織切片(~0.1 mm)58を作成し、細胞の輪郭の鮮明な明視野イメージングを可能にしたり、対比染色プロトコルを最適化したりすることをお勧めします47,59。
プロトコルセクション3の主な制限は、プロトコルステップ3.2.5〜3.2.6(図3E-K)で詳しく説明されているように、引き裂き、損傷、または気泡なしでリーフを取り付けるのが難しいことです。トウモロコシの葉は左右対称であるため、視覚化9には、葉全体のマウントではなく、ハーフリーフマウントで十分な場合があります。これを行うには、原基を中央肋骨まで広げた後、縦軸に沿ってかみそりの刃で切断し、葉の半分だけを取り付けることができます。プロトコルセクション3の別の制限は、葉の厚さがディープイメージング中の蛍光色素シグナルの光学分解能を制限し得ることである。この問題に対処するために、組織透明化技術60を採用することができる。しかし、植物組織のイメージングに一般的に使用されている透明化試薬であるClearSee61は、サンプルとカバーガラスがナノテープから剥離するため、プロトコルに適合しないことがわかりました。この問題に対する潜在的な解決策は、葉試料の上に半透膜31を適用し、ナノテープによって所定の位置に保持されたまま透明溶液で処理することを可能にすることである。展開した葉に液体溶液を適用することを可能にするこのような方法は、以前はトウモロコシの花序の発達には最適化されていたが、全葉原基には最適化されていない全マウントRNAin situハイブリダイゼーションおよび免疫局在技術にも使用できる62,63。
実生段階でも大きな葉の原基を持つトウモロコシのプロトコルについて説明しました。イネ、オオムギ、コムギ、セタリア、ブラキポディウム16,23,64,65,66など、葉の原基がはるかに小さい他の草種では、これらのプロトコルを効果的に適用するために追加の精密ツールの使用が必要になる場合があります。さらに、これらのプロトコルは、組織形成と細胞応答のリアルタイムの動的プロセスをキャプチャする生細胞イメージングを目的としていませんでした。しかし、植物の生細胞イメージングにおいて蛍光プローブ、イメージング技術、およびコンピューティング能力が進歩し続けるにつれて67、将来の研究はこれらのプロトコルに基づいて、草の葉原基のユニークな特徴に合わせたライブセルイメージング戦略を開発する可能性があります。
Disclosures
著者には、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、トウモロコシ遺伝学協力、トウモロコシ細胞ゲノミクスプロジェクト、デイブジャクソン(ニューヨーク州コールドスプリングハーバー研究所)、アンW.シルベスター(イリノイ州シカゴ大学海洋生物学研究所)、アンドレアガラボッティ(ニュージャージー州ラトガース大学)、キャロリンG.ラスムッセン(カリフォルニア大学リバーサイド校)、および変異株とトランスジェニック株を提供してくれたこと、および大学の高度な光学顕微鏡コアのロバートF.ベイカーとアレクサンダーユルケビッチに感謝しますミズーリ州-コロンビア州は、共焦点顕微鏡検査の支援をしてくれました。JMRは、J.ウィリアムフルブライトフェローシップ、ダイアンP.およびロバートE.シャープ基金、および国立科学財団の植物ゲノム研究プログラム(IOS-1546873)からPMへの支援を受けました。CDTC、EDCDP、およびRJRRは、DOST-SEI S&T Undergraduate Scholarshipによってサポートされています。DODLは、トーマス・スタインバグラー神父SJ学術奨学金によってサポートされています。RJRRは、Aiducation International–Pathways to Higher Education Scholarshipによってサポートされています。この研究は、アテネオデマニラ大学の理工学部とリサール図書館の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick | EZlifego Store (Amazon) | B07YB1ZXG6 | 1 roll |
| Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in | Bausch & Lomb | N1692 9 | 1 pc |
| Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in | Storz Opthalmic Instruments | E0542 | 1 pc |
| Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in) | Ted Pella | 13553 | 1 pc |
| DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper | Dowell Store (Amazon) | 10-22 AWG | 1 pc |
| Feather Double Edge Carbon Steel Blades | Ted Pella | 121-9 | pkg/10; for fine sectioning |
| Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm | Ted Pella | 260442 | pkg/144 |
| GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades | Ted Pella | 121-1 | box/200; for general cutting/sectioning |
| Glycerol | Thermo Scientific | PI17904 | 1 liter |
| ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin | National Institutes of Health (NIH) USA | version 2.9.0/1.54s | The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG). |
| Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm | Kimtech Science | 34155 | box/280 ply |
| Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick | Ted Pella | 260140 | 1 ounce |
| PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick | Yecaye Store (Amazon) | L354 W1.18 | 2 rolls |
| Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick | Ted Pella | 260166 | 1 ounce |
| Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick | Ted Pella | 260168 | 1 ounce |
| Tempered Glass Cutting Board | Hacaroa (Amazon) | B09XMXBT5S | 4 pc |
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