Humant pseudoisletsystem til synkron vurdering af fluorescerende biosensordynamik og hormonsekretoriske profiler

Summary

Denne protokol beskriver en metode til synkron erhvervelse og medregistrering af intracellulære signalhændelser og udskillelse af insulin og glukagon af primære humane pseudoislets ved hjælp af adenoviral levering af en cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) biosensor, en cAMP-differensdetektor in situ (cADDis) og et mikroperifusionssystem.

Abstract

Langerhansøerne i bugspytkirtlen, som er små 3D-samlinger af specialiserede endokrine og understøttende celler spredt gennem bugspytkirtlen, har en central rolle i kontrollen af glukosehomeostase gennem udskillelse af insulin af betaceller, hvilket sænker blodsukkeret og glukagon af alfaceller, hvilket hæver blodsukkeret. Intracellulære signalveje, herunder dem, der medieres af cAMP, er nøglen til reguleret alfa- og betacellehormonsekretion. 3D-østrukturen, selvom den er afgørende for koordineret øfunktion, præsenterer eksperimentelle udfordringer for mekanistiske undersøgelser af de intracellulære signalveje i primære humane øceller. For at overvinde disse udfordringer og begrænsninger beskriver denne protokol en integreret levende cellebilleddannelse og mikrofluidisk platform ved hjælp af primære humane pseudoislets genereret fra donorer uden diabetes, der ligner indfødte øer i deres morfologi, sammensætning og funktion. Disse pseudoislets er størrelsesstyret gennem dispersions- og reaggregeringsprocessen af primære humane øceller. I dispergeret tilstand kan øcellegenekspression manipuleres; for eksempel kan biosensorer som den genetisk kodede cAMP-biosensor, cADDis, introduceres. Når pseudoislets, der udtrykker en genetisk kodet biosensor i kombination med konfokal mikroskopi og en mikroperifusionsplatform, giver mulighed for synkron vurdering af fluorescerende biosensordynamik og alfa- og betacellehormonsekretoriske profiler for at give mere indsigt i cellulære processer og funktion.

Introduction

Langerhansøerne er miniorganer spredt over hele bugspytkirtlen, hvis funktion er afgørende for opretholdelsen af glukosehomeostase. Insulin udskilles fra betaceller efter metabolismen af glucose, en stigning i ATP / ADP-forholdet, lukningen af ATP-følsomme kaliumkanaler, depolarisering af plasmamembranen og tilstrømningen af ekstracellulært calcium¹. Glucagon sekretion fra alfaceller er mindre forstået, men det er blevet postuleret, at intracellulære og parakrin veje bidrager til glucagon granulat exocytose ^2,3,4. Både type 1 og type 2 diabetes er forbundet med øcelledysfunktion ^5,6,7. Derfor er belysning af de intracellulære signalveje, der medierer øhormonsekretion, afgørende for at forstå fysiologiske og patologiske mekanismer i bugspytkirteløer.

Den sfæriske arkitektur af holme præsenterer visse hindringer for eksperimentering. Disse udfordringer omfatter variationer i holmstørrelsen og 3D-karakteren af holme, hvilket reducerer viral transduktion inden for holmens kerne ^8,9. For at overvinde disse udfordringer blev der udviklet et pseudoislet-system, hvor primære menneskelige øer spredes i enkeltceller, adenoviralt transduceret med konstruktioner, der koder for mål af interesse, og reaggregeres til dannelse af størrelseskontrollerede, ølignende strukturer kaldet pseudoislets⁷. Sammenlignet med indfødte øer fra samme donor, der er dyrket parallelt, er disse pseudoislets ens i morfologi, endokrin cellesammensætning og hormonsekretion⁷. Denne metode giver mulighed for ekspression af konstruktioner i hele pseudoislet, hvilket betyder, at den overvinder en tidligere barriere for ensartet genetisk manipulation af primære menneskelige øer ^7,8,9.

I denne protokol er pseudoisletsystemet integreret med en mikrofluidisk enhed til at udtrykke biosensorer i primære humane øceller og opnå tidsmæssig opløsning af pseudoislethormonsekretion under dynamisk perifusion^10,11,12. Pseudoisletterne placeres i en mikrochip og udsættes for en jævn strøm af forskellige sekretagoger via en peristaltisk pumpe¹². Mikrochippen har en gennemsigtig glasbund og er monteret på et konfokalmikroskop for at registrere den intracellulære signaldynamik via ændringer i biosensorens fluorescensintensitet. Biosensorbilleddannelse synkroniseres med opsamling af mikroperifusionsspildevand til efterfølgende analyse af insulin og glukagonsekretion⁷. Sammenlignet med makroperifusion giver denne mikroperifusionsmetode mulighed for at anvende færre pseudoisletter på grund af det mindre volumen af den mikrofluidiske enhed sammenlignet med makroperifusionskammeret⁷.

For at udnytte nytten af dette system blev den cykliske adenosinmonophosphat (cAMP) differensdetektor in situ (cADDis) biosensor udtrykt i humane pseudoislets for at vurdere cAMP-dynamik og hormonsekretion. cADDis-biosensoren består af et cirkulært permuteret grønt fluorescerende protein (cpGFP) placeret i hængselområdet i et udvekslingsprotein aktiveret af cAMP 2 (EPAC2), der forbinder dets regulatoriske og katalytiske regioner. Bindingen af cAMP til EPAC2's regulatoriske område fremkalder en konformationsændring i hængselområdet, der øger fluorescensen fra cpGFP¹³. Intracellulære budbringere såsom cAMP fremkalder insulin og glukagonsekretion efter opstrømsaktivering af G-proteinkoblede receptorer¹⁴. Levende cellebilleddannelse kombineret med mikroperifusion hjælper med at forbinde den intracellulære cAMP-dynamik med øhormonsekretion. Specifikt genereres cADDis-ekspressive pseudoislets i denne protokol for at overvåge cAMP-responser i alfa- og betaceller til forskellige stimuli: lav glukose (2 mM glucose; G 2), høj glucose plus isobutylmethylxanthin (IBMX; 20 mM glucose + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX) og lav glukose plus adrenalin (Epi; 2 mM glucose + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Denne behandlingsarbejdsgang muliggør vurdering af den intracellulære cAMP-dynamik direkte via 1) IBMX-medieret phosphodiesterasehæmning, hvilket forbedrer intracellulære cAMP-niveauer ved at forhindre dets nedbrydning, og 2) adrenalin, en kendt cAMP-afhængig stimulator af alfacelleglukagonsekretion medieret af β-adrenerg receptoraktivering. Trinene til opsætning af mikroperifusionsapparatet til levende cellebilleddannelsesforsøg, indlæsning af pseudoislets i mikrochippen, synkron levende cellebilleddannelse og mikroperifusion og analyse af biosensorspor og hormonsekretion ved mikropladebaserede hormonassays er beskrevet nedenfor.

Protocol

Menneskelige øer (N = 4 præparater) blev opnået gennem partnerskaber med Integrated Islet Distribution Program, Human Pancreas Analysis Program, Prodo Laboratories, Inc. og Imagine Pharma. Vanderbilt University Institutional Review Board betragter ikke deidentificerede humane bugspytkirtelprøver som forskning i mennesker. Dette arbejde ville ikke være muligt uden organdonorer, deres familier og organindkøbsorganisationer. Se tabel 1 for demografiske oplysninger om donorer. Humane øer fra bugspytkirteldonorer uden diabetes blev isoleret med mindre end 15 timers kold iskæmitid.

1. Pseudoislet dannelse (detaljeret i Walker et al.⁷)

1. Få og håndpluk primære menneskelige øer ved hjælp af en P200-pipette og et bordmikroskop, og vær meget opmærksom på ikke at forurene pipettespidsen på overflader uden for økulturmediet (10% FBS, 100 μg/ml streptomycin, 100 U/ml penicillin, 2 mM L-glutamin i CMRL 1066).
2. Overfør primære øer til et 15 ml rør, og udfør alle følgende pseudoisletdannelsestrin under en vævskulturhætte for at forhindre forurening. Afbryd langsomt de primære øer i 7 minutter ved stuetemperatur med en P1000-pipette i 0,025% trypsin. Opløsningen bliver uigennemsigtig, når øerne begynder at bryde fra hinanden.
   1. Til disse undersøgelser giver 200-300 håndplukkede primære øer med diametre på ca. 200 μm dispergeret i 500 μL 0,025% trypsin en til to 96-brøndplader af pseudoislets; Det nøjagtige antal kan variere afhængigt af den gennemsnitlige østørrelse og levedygtighed. For >500 primære øer skal du opskalere volumenet på 0,025% trypsin, der anvendes i forholdet 1: 1 (f.eks. 600 μL 0,025% trypsin til 600 håndplukkede øer).
3. Sluk dispersionen ved at tilføje et volumen Vanderbilt Pseudoislet Media (VPM) svarende til det anvendte volumen trypsin. Vask derefter to gange med 1 ml VPM. Til vaskerne centrifugeres de dispergerede celler ved 485 x g i 2-3 minutter ved 4 °C i en bordcentrifuge. Ophæv cellerne igen i en defineret volumen VPM (typisk 1 ml) til tælling.
   BEMÆRK: Pseudoisletgenereringen og VPM-sammensætningen er detaljeret beskrevet i en tidligere publikation⁷. Kort fortalt indeholder VPM lige store mængder berigede CMRL-medier (20% FBS, 100 μg/ml streptomycin, 100 E/ml penicillin, 1 mM natriumpyruvat, 2 mM glutamax, 2 mM HEPES i CMRL 1066) og iEC-medier (VEGF Medium Complete Kit minus FBS + 1 flaske endotelceller Medium Supplement). Figur 1A indeholder et oversigtsskema over generering af pseudoislet.
4. Bestem celletal og levedygtighed ved hjælp af en automatiseret celletæller ved at kombinere 10 μL trypanblå med 10 μL af cellesuspensionen. Bland cellesuspensionen godt for at sikre et nøjagtigt celletal.
5. Beregn mængden af cellesuspension, virus og VPM, der kræves til det ønskede antal pseudoislets. Alle beregningerne baseres på antallet af levende celler i trin 1.4.
   1. Til disse undersøgelser transducerer dispergerede humane øceller ved MOI 500 (N = 1) eller 1.000 (N = 2) med Ad-CMV-cADDis i et samlet volumen på 500 μL. En plade af transducerede pseudoislets (2.000 celler/pseudoislet) giver tre tekniske replikater pr. donor (32 pseudoøer/eksperiment). Adenoviruset blev kommercielt opnået i dette arbejde.
6. Kombiner de beregnede mængder cellesuspension, virus og VPM i et 1,5 ml rør. Bland forsigtigt indholdet ved pipettering op og ned.
7. Under transduktionen inkuberes rørene med åbne hætter og dækkes med en steril petriskål i 2 timer i en vævskulturinkubator ved 37 °C og 5% CO₂/95% luft.
8. Der tilsættes 500 μL VPM til hvert glas, og cellerne vaskes ved at centrifugere dem ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C. Gennemfør yderligere to vaske til i alt tre vaske. Opsug supernatanten og genopslæm cellerne i 1 ml VPM.
9. Beregn det samlede cellesåningsvolumen (200 μL/pseudoislet). Tilsæt VPM (det beregnede cellesåvolumen minus 2 ml) til et konisk rør af passende størrelse. Der tilsættes den transducerede cellesuspension fra trin 1.7 til det koniske rør. Hold det koniske rør let lukket, men ikke tæt lukket for at tillade luftudveksling for cellerne.
10. Skyl 1,5 ml røret (fra trin 1.7) med 1 ml VPM, og overfør indholdet til det koniske rør, hvorefter det koniske rør skal indeholde det samlede cellesåningsvolumen.
11. Bland indholdet af det koniske rør godt ved pipettering op og ned med en motoriseret serologisk pipette, og overfør derefter indholdet til et sterilt reagensreservoir. Hvis reservoiret ikke holder hele cellesåningsvolumenet, skal du udføre serielle overførsler og sikre, at suspensionen blandes godt ved hvert trin.
12. Brug en multikanals P200-pipette til at pipettere cellesuspensionen i reagensbeholderen op og ned 3-4 gange for at sikre homogenitet, og pipet derefter 200 μL af cellesuspensionen ind i hvert hul i mikrobrøndpladerne.
13. Pseudoisletterne inkuberes i en vævskulturinkubator ved 37 °C og 5% CO₂/95% luft i 6 dage uden mellemstore ændringer. På dag 6 skal pseudoisletterne være fuldt dannede og klar til eksperimenter (figur 1B-D).

2. Forberedelse til billeddannelse i levende celler og mikroperifusion (1 dag før forsøget)

BEMÆRK: Oplysninger om mikroperifusionsmediets forberedelse er tilgængelige via protocols.io ressourcen (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html).

1. Høst pseudoisletterne ved hjælp af en multikanalpipette ved at overføre dem fra 96-brøndpladen til en steril petriskål. Derefter håndplukkes pseudoisletterne, og overfør dem til en anden steril petriskål, der indeholder frisk VPM. Lad pseudoisletterne inkubere i en vævskulturkuvøse ved 37 °C og 5% CO₂ / 95% luft natten over.
2. Forbered 1 liter DMEM ved at tilsætte 1 g BSA (radioimmunoassay-grade), 0,11 g natriumpyruvat, 0,58 g L-glutamin, 3,2 g natriumbicarbonat, 1,11 g HEPES og 1 flaske DMEM til 1 liter ultrarenset vand. Forbered en 1 M glucosestamopløsning i DMEM. Opbevar begge opløsninger ved 4 °C natten over.
3. Kontroller mikroperifusionssystemets flow dagen før eksperimentet. Tilslut hele slangen til en chipholder, der indeholder en tom mikrochip, som beskrevet i figur 2A-B. Brug ultrarenset vand som spildevand for at bekræfte en strømningshastighed på 100 μL / min ved fraktionsopsamleren.

3. Tilføjelse af sekretærer til DMEM (eksperimentets dag)

1. Der tilsættes 0,07 mg/ml ascorbat til DMEM, og sekretagogerne fremstilles i DMEM + ascorbatbuffer ved hjælp af en 1 M glucosestamme til de glucoseholdige buffere.
   BEMÆRK: Ascorbat bruges til at stabilisere adrenalin ved at forhindre dets oxidation. Hvis epinephrin ikke anvendes, kan ascorbat udelades fra DMEM.
2. Filtrer secretagogerne to gange gennem et 0,22 μm porefilter ved hjælp af et nyt filter hver gang. Opløsningerne opvarmes til 37 °C, og glukosen måles via et glucometer for at bekræfte den ønskede koncentration.

4. Opsætning af mikroperifusionsapparater

1. Opvarm miljøkammeret i et konfokal laserscanningsmikroskop til 37 °C, og sørg for, at alle døre er lukkede, og at kammeret opretholder en stabil temperatur. Anbring chipholderen med mikrochippen i kammeret for at varme op. Kontroller chiptemperaturen med en infrarød pistol.
   BEMÆRK: I dette tilfælde er miljøkammeret indstillet til 38,5 °C, hvilket gør det muligt for chippen at nå 37 °C.
2. Tilslut hele slangen til spånholderen (som beskrevet i figur 2A-B). Flush-line med baseline secretagogue i 5 min. I denne undersøgelse blev linjen skyllet med 2 mM glucose (G 2). Skift boblefældemembranen på de-bobleren hver 8-10 eksperimenter.

5. Indlæsning af pseudoislets i mikrochip

1. Før du lægger mikrochippen, skal du tage et brightfield- og darkfield-billede (10x forstørrelse) af pseudoislets, der vil blive brugt i eksperimentet til efterfølgende kvantificering af øækvivalenter (IEQ).
   BEMÆRK: IEQ bruges til at normalisere hormonsekretionen til variationer i øantallet på tværs af forsøgene. Dette trin kan også udføres dagen før eksperimentet.
2. Opsug eventuel ekstra væske fra mikrochippens nederste og øverste halvdel. Den øverste halvdel af mikrochipet indeholder pakninger, der sikrer en passende forsegling af hver brønd, mens den nederste halvdel af mikrochippen indeholder brøndene med et glasdæksel fastgjort. Forvåd en brønd i mikrochippen med 5 μL DMEM. Sørg for at pipet rundt om brøndens ydre kanter for at våde sprækkerne.
3. Brug en forvædet pipette til at opsamle 30-32 pseudoisletter i et volumen på 23 μL, og fordel langsomt pseudoisletterne i midten af brønden i mikrochipens nederste stykke. Kontroller pipettens spids for eventuelle pseudoisletter, der kan være fastgjort.
4. Brug en gelpåfyldningsspids til forsigtigt at manøvrere pseudoislets ind i midten af brønden. Dette sikrer, at det maksimale antal pseudoislets vil blive fanget i et synsfelt.
5. Tag et billede af pseudoislets i mikrochipet på stereoskopet. Denne optælling bruges til at justere den beregnede IEQ for ethvert pseudoislettab under denne proces.
   1. Hvis alle pseudoislets fra trin 5.3 ikke er indlæst i mikrochippen, skal IEQ justeres i overensstemmelse hermed. Hvis 30 pseudoislets f.eks. visualiseres nu, men 32 blev visualiseret i trin 5.1, skal du beregne IEQ på billederne fra trin 5.1 og derefter gange med 30/32.
6. Placer bunden af mikrochippen i mikrochipholderen. Placer forsigtigt toppen af mikrochippen med den grønne pakning nedad.
7. Mens du holder mikrochippen på plads, skal du forsigtigt lukke mikrochipholderen for at klemme mikrochippen sammen. Prøv ikke at anvende for stort tryk på mikrochipet under denne proces, da det vil fortrænge væsken indeholdt i brønden og kan føre til pseudoislettab. Undgå at indføre luftbobler i brønden.

6. Synkron levende cellebilleddannelse og mikroperifusion

1. Overfør sekretærerne, pumpen og mikrochippen i holderen til det miljøkammer, der er monteret på konfokalmikroskopet. Ret effluxslangen ud af kammeret til fraktionsopsamleren.
   1. Anbring bufferne i 15 ml koniske rør med åbninger boret ind i deres hætter. Disse huller forhindrer opsamlingsslangen i at glide ud af røret.
   2. Når du skruer slangen ind i de-bobleren, skal du adskille møtrikken og ferrulen og derefter skrue ind i de-bobleren. Dette forhindrer vridning af linjen.
2. Indstil brøkopsamleren til at rotere hvert 2. minut. Læg det passende antal rør i fraktionsopsamleren, idet der tages højde for vaske og eksperimentelle fraktioner. Til disse eksperimenter blev der anvendt 15 vaskerør (30 min total vask) og 28 rør til fraktionsopsamling.
3. Start pumpen for at levere baselinemediet (indeholdende baseline glucosekoncentrationen) ved 100 μL/min (en 2 minutters opsamling ved en 100 μL/min strømningshastighed resulterer i 200 μL spildevand pr. fraktionsrør). Denne strømningshastighed blev valgt for at begrænse den store belastning på pseudoislets og forhindre signifikant pseudoisletbevægelse under levende billeddannelse.
   1. Mens væsken løber gennem apparatet, skal du holde øje med følgende:
      1. Hold øje med dråber i slutningen af fraktionskollektortuden, som angiver strømning gennem systemet.
      2. Hold øje med fald i udstrømningen fra systemet; hvis der er <200 μL i opsamlingsrørene, indikerer dette, at der kan være en blokering eller lækage i systemet. Se tabel 2 for en liste over de potentielle årsager til nedsat spildevandsvolumen, opløsninger og forebyggelsestips.
4. Når der er en jævn mediestrøm fra effluxslangen, drejes fraktionsopsamlerhovedet for at dispensere i rørene, og fraktionsopsamleren startes. De første 15 fraktioner (30 min) samles som vask for at lade pseudoisletterne ekvilibrere. Brug disse første 15 fraktioner til at sikre kontinuerligt og nøjagtigt medieflow gennem systemet. Kassér disse fraktioner bagefter.
5. I løbet af 30 minutters vask skal du indstille mikroskopet til levende cellebilleddannelse i henhold til disse parametre: objektiv linse: U Plan Fluorite 20x med 1x zoom; fluorescenskanaler: EGFP (emission = 510 nm, laserbølgelængde = 488, detektionsbølgelængde = 500-600 nm); tidsserie: billede erhvervet hver 2. sek. for hele eksperimentet (dvs. 56 min); Samplinghastighed: 2 μs/pixel.
   1. Identificer bunden af pseudoislets i synsfeltet, og juster brændplanet til 15 μm over denne position. Dette er den ramme, der vil blive brugt under hele billeddannelseseksperimentet.
6. Når 30 minutters vask er færdig, skal du begynde fraktionsindsamling og billedoptagelse.
   BEMÆRK: Der skal gøres alt for at identificere og rette eventuelle problemer inden dette trin. Når dataindsamlingen begynder, kan eventuelle pauser i eksperimentet eller overdreven eksponering for secretagoger påvirke resultaterne negativt.
7. Fortsæt med at perifuse pseudoislets med baseline-substrat i varigheden af den første baseline-indsamling, opsaml spildevandet i 1,5 ml rør. Skift slangen fra baselinebufferen manuelt til det nye stimulusbufferrør, når tiden er passende for eksperimentet.
   1. En standard mikroperifusionssekvens er vist i tabel 3.
   2. Efter opsamling af ~10 fraktioner anbringes alle fraktionerne i et køleskab på 4 °C indtil forsøgets afslutning for at forhindre nedbrydning af hormonerne, især glukagon.
   3. Fortsæt med at overvåge systemflowet under hele eksperimentet ved at kontrollere spildevandsvolumenet i hvert rør.
8. Når eksperimentet er afsluttet, skal du skifte tilbage til baseline-mediet og lade pumpen fortsætte med at køre i 5 minutter for at vaske stimulus ud med baseline-medium (i dette tilfælde 2 mM glucose).
9. Stop pumpen, og frakobl mikrochipholderslangen ved de-bobleren og fraktionsopsamleren for at fjerne mikrochipholderen fra miljøkammeret. Luk alle dørene efter fjernelse af mikrochip for at opretholde temperaturen.
10. Perifusaterne opbevares ved -80 °C til efterfølgende hormonanalyse.

7. Pseudoisletsyre ethanol ekstraktion

1. Åbn forsigtigt mikrochipholderen, og løft toppen af mikrochippen af. Brug en pipette og et benchtopmikroskop til at plukke pseudoislets ud af brønden og overføre dem til et 1,5 ml rør. Sørg for indsamling af alle pseudoislets ved hjælp af et bordmikroskop, hvis det er nødvendigt.
   1. Tag et endeligt billede af pseudoislets i mikrochippen, før du fjerner det fra brønden for at justere øekstraktet IEQ, svarende til i trin 5.5.
2. Der vaskes to gange med 500 μL PBS. Centrifuger pseudoisletterne i 1 min ved 94 x g mellem hver vask, og sug supernatanten af.
3. Efter fjernelse af den sidste vask tilsættes 200 μL syreethanol (5,5 ml 95% ethanol + 50 μL 12 N HCI). Opbevares ved 4 °C natten over.
4. Den næste dag centrifugeres ekstrakterne i 10 minutter ved 15.989 x g og 4 °C. Alikvote 45 μL i tre nye rør. Opbevares ved -80 °C til analyse af hormonindhold. Som et alternativ til normalisering af hormonsekretionen til IEQ kan hormonsekretionen også normaliseres til pseudoislethormonindholdet målt ud fra ekstrakterne.

8. Yderligere eksperimenter og oprydning

1. Gentag trin 5-7 med efterfølgende grupper af pseudoislets for at opnå yderligere tekniske replikater.
2. Når du er færdig med alle mikroperifusionseksperimenterne, skal du køre 10% blegemiddel gennem mikrochippen og slangen i 5 minutter og derefter ultrarenset vand i 30 minutter for at desinficere slangen.

9. Analyse af data

BEMÆRK: Levende cellebilleddannelse blev udført ved hjælp af et laserscanningskonfokalmikroskop. Billederne blev analyseret ved hjælp af den mikroskop-associerede billedbehandlingssoftwarepakke. Følgende er generelle retningslinjer, men kan variere afhængigt af mikroskopproducenten og billedoptagelsessoftwaren.

1. Bestemmelse af de samlede øækvivalenter (IEQ) til datanormalisering
   1. Åbn softwareprogrammet, og klik på fanen Erhvervelse øverst til højre i vinduet. Batch-burn i alle de mørke feltbilleder ved at vælge funktionen Batchbrænding i Makrostyring (Vis > værktøj Windows > Makrostyring).
      1. For at brænde flere billeder på én gang skal du klikke på knappen Skift batchtilstand, før du klikker på knappen Kør i Macro Manager. Følg vejledningen på skærmen for at vælge kildebilledets placering og destinationsplacering for de brændte billeder. Som billedfiltype skal du vælge Tagged Imagine File Format (*.tif).
   2. Til IEQ-målingen skal du åbne den brændte version af 10x darkfield-billedet, der blev taget i trin 5.1. Klik på fanen Tæl og mål øverst, og vælg knappen Manuel HSV-tærskel til venstre.
      1. Brug dropperfunktionen til at tilføje/fjerne det positive område (i rødt), indtil hver pseudoislet er fremhævet med rødt, uden at strække sig forbi pseudoisletgrænsen. Klik på Tæl og mål.
   3. Brug funktionerne automatisk opdeling eller manuel opdeling til at opdele pseudoislets, der blev sammenføjet.
      1. Hvis du vil opdele pseudoisletterne manuelt, skal du vælge funktionen manuel opdeling, venstreklikke for at tegne en linje, der adskiller pseudoøerne, og derefter højreklikke for at fuldføre linjen. For automatisk opdeling skal du vælge funktionen til automatisk opdeling og klikke på de grupperede pseudoislets af interesse. Bekræft den korrekte autoopdeling bagefter.
   4. I batchbrændte billeder kan skalalinjen og forstørrelsesteksten være markeret som positive. Slet disse objekter for at få en nøjagtig optælling ved at fremhæve teksten og skalalinjen ved hjælp af musen og trykke på tastaturtasten Slet .
   5. Slå filteret til og fra for at bekræfte, at alle pseudoislets tælles. Filen kan også åbnes uden for programmet til krydshenvisning. Når du er færdig, skal du klikke på Eksporter til Excel.
   6. Åbn regnearket, og rediger det som følger.
      1. Slet oplysningerne om optælling, middelværdi og sortering nederst. Sorter objekterne baseret på deres gennemsnitlige diameter. Indsæt en kolonne efter middeldiameteren, og navngiv kolonnen "Antal pseudoislet".
      2. Antallet af øer bestemmes af antallet af pseudoislets med gennemsnitlige diametre, der falder inden for hvert indeks nedenfor. Multiplicer antallet af pseudoislets pr. indeks med den respektive IEQ-konverteringsfaktor, og sum disse værdier for at bestemme den samlede IEQ. Udfør IEQ-beregningerne på de billeder, der er taget før hvert eksperiment. Brug følgende indekser og IEQ-konverteringsfaktorer:
         1-49 μm: × 0,167
         50-100 μm: × 0,667
         101-150 μm: × 1.685
         151-200 μm: × 3.500
         201-300 μm: × 6.315
         301-350 μm: × 10.352
      3. Du kan finde et eksempel på et regneark til bestemmelse af IEQ-tællingerne under Supplerende fil 1.
2. Kvantificering af levende celler i software
   1. Åbn den ønskede fil (.oir) i cellSens.
   2. Angiv interesseområderne (ROI'er) som følger.
      1. Brug tegneværktøjerne til at angive ROI'erne (dvs. hver pseudoislet). Hvis du bruger frihåndstegningsindstillingen, skal du højreklikke for at lukke figuren.
      2. Fremhæv alle investeringsafkastene ved at bruge pilehånden og trække den for at omfatte alle investeringsafkastene i billedet. Når alle investeringsafkastene er fremhævet, skal du højreklikke og vælge Konverter til dynamisk investeringsafkast over tid
      3. Afspil XYT-filen for at bekræfte, at ROI'erne er nøjagtige over tid. Hvis investeringsafkastet ikke er nøjagtigt i en bestemt periode, skal du rette dets størrelse/placering i den pågældende periode. Softwaren justerer gradvist ROI's størrelse / placering over tid for at matche disse ændringer. Gentag disse trin, indtil investeringsafkastet er nøjagtigt under hele billeddannelseseksperimentet.
   3. Udfør intensitetsmålinger på hvert investeringsafkast som følger.
      1. I værktøjslinjen skal du klikke på Mål intensitetsprofil. Fremhæv ROI'erne, der skal analyseres; Brug Skift + klik for at vælge flere ROI'er.
         BEMÆRK: Selvom flere filer kan være åbne ad gangen i softwaren, skal du kun analysere ROI'erne fra en fil ad gangen.
      2. Hvis du vil tage højde for baggrundsstøj, skal du vælge en konstant værdi, der skal trækkes fra hver intensitetsværdi, eller angive et investeringsafkast som baggrund. Klik på Udfør.
      3. I værktøjslinjen Intensitetsprofil skal du klikke på Eksporter til Excel for at eksportere dataene.
      4. Normaliser alle datapunkter til gennemsnittet af intensiteterne målt fra 7-8 min (dvs. den sidste min af den første baseline medium perifusion). Disse normaliserede værdier på hvert tidspunkt defineres som den relative cADDis-intensitet. For et eksempel på regneark med analyse og normalisering af billeddata, se Supplerende fil 2.
3. Mål hormonsekretionen i hver fraktion og øekstrakt. I disse eksperimenter blev insulin- og glukagonkoncentrationer målt med ELISA. Normaliser hormonsekretionen i hver fraktion til pseudoisletvolumenet ved hjælp af IEQ-målingerne bestemt i trin 9.1 eller ved ekstraktionshormonindholdet.

Representative Results

Biosensor-udtrykkende humane pseudoislets blev skabt via adenoviral levering af konstruktioner, der koder for cAMP-biosensoren cADDis (figur 1A). Figur 1B viser reaggregeringen af de transducerede humane øceller over tid, med fuldt dannede pseudoislets observeret efter 6 dages dyrkning. Cellerne begyndte at vise synlig cADDis-fluorescens inden for 48 timer, og der var høj biosensorekspression i transducerede celler ved slutningen af dyrkningsperioden. Ved hjælp af denne protokol viste pseudoislets en gennemsnitlig transduktionseffektivitet på 60% i alfaceller og 95% i betaceller (figur 1C-D).

Den integrerede mikrofluidiske og levende cellebilleddannelsesplatform er fremhævet i figur 2. Efter høst af de cADDis-ekspressive pseudoislets og lade dem inkubere i frisk medium natten over, blev pseudoislets indlæst i midten af en forvædet brønd på en mikrochip. Mikrochippen blev derefter fastspændt i en holder og anbragt på et mikroskoptrin. Inde i miljøkammeret fastgjort til mikroskopet, som blev opretholdt ved 37 ° C, blev pseudoislets perifuseret med medier indeholdende alfa- og betacellesekretagoger, som blev pumpet gennem en de-bobler for at forhindre introduktion af luftbobler i systemet. Pseudoisletterne i mikrochippen blev perifunderet med en strømningshastighed på 100 μL/min, og spildevandet blev opsamlet med 2 minutters mellemrum via en fraktionsopsamler (figur 2A-B). Glasbunden af mikrochipbrønden gør det muligt at fange cADDis-fluorescensintensiteten af flere pseudoisletter i et synsfelt, hvilket er afgørende for senere analyse (figur 2C).

Figur 3 viser repræsentative resultater ved anvendelse af den beskrevne protokol med cADDis-ekspressive pseudoislets genereret fra indfødte øer isoleret fra tre humane donorer uden diabetes. De cADDis-ekspressive pseudoislets blev perifunderet med 2 mM glucose (G 2), 20 mM glucose plus phosphodiesterasehæmmeren isobutylmethylxanthin (IBMX; G 20 + IBMX) og 2 mM glucose plus adrenalin (G 2 + Epi). Denne protokol fremkalder kendte intracellulære veje, der forbedrer cAMP i alfa- og betaceller (figur 3A-B). Mikroperifusionsopsætningen letter den synkrone indsamling af den intracellulære cAMP-dynamik gennem cADDis-fluorescens og hormonsekretion (figur 3C-E). For at sikre eksperimentel stringens blev eksperimenter på pseudoislets udført fra den samme donor med to til tre replikater, og de samlede værdier er plottet i figur 3C-E, D ', E'. Ved eksponering for G2 var den relative cADDis-intensitet lav og stabil, ligesom insulinsekretionen (figur 3C-D). Når pseudoislets blev udsat for G 20 + IBMX, var der en robust stigning i den intracellulære cAMP-koncentration, hvilket fremgår af en stigning i den relative cADDis-intensitet (figur 3C). Denne stigning skyldtes sandsynligvis både beta- og alfaceller, som det fremgår af de samtidige markante stigninger i både insulin og glukagonsekretion (figur 3D-E). Pseudoislets eksponering for G 2 + Epi øgede den intracellulære cAMP-koncentration (figur 3C), og dette var forbundet med en stigning i glukagonsekretion (figur 3E). Observationen af, at cAMP-responset på G 2 + Epi var relativt mindre sammenlignet med IBMX-responset, kan have fundet sted på grund af en kombination af den lavere transduktionseffektivitet af cADDis adenoviral konstruktion i alfaceller versus betaceller (figur 1D) og alfacellespecificiteten af dette signal (figur 3E). Baseret på kendte cAMP-medierede signalveje i primære humane beta- og alfaceller demonstrerer denne protokol derfor med succes nytten af denne integrerede platform til samtidig at undersøge den relative fluorescensintensitet af cADDis-biosensoren og beta- og alfacellehormonsekretoriske profiler på tværs af tekniske og biologiske replikater.

Figur 1: Dannelse af biosensor-ekspressive humane pseudoislets . (A) Skematisk visning af primær human ø-dissociation, transduktion med biosensorkonstruktionen i en enkeltcelletilstand og reaggregering. Efter reaggregering høstes pseudoislets og gennemgår synkron levende cellebilleddannelse og mikroperifusion. Protokoltrinnene er angivet i hele skemaet. (B) Repræsentative billeder, der fanger dannelsen af en cADDis-ekspresserende pseudoislet i løbet af en 6-dages reaggregeringsperiode; øverst: brightfield med kontrast, bund: cADDis fluorescens. Skalabjælken er 100 μm. (C) Repræsentative billeder af en cADDis-ekspresserende pseudoislet (grøn) med alfa- og betaceller visualiseret ved henholdsvis C-peptid (CPEP, blå) og glukagon (GCG, rød) mærkning. DAPI (hvid) blev brugt som en nuklear modplet. De hvide pile fremhæver de transducerede alfa- og betaceller. Den gule pil peger på en ikke-transduceret alfacelle. Skalabjælken er 100 μm. (D) Kvantificering af transduktionseffektiviteten ved MOI 1.000 i beta- og alfaceller ved hjælp af en HALO-cytonukleær algoritme (N = 2 donorer, med et gennemsnit på 601 betaceller og 627 alfaceller analyseret pr. donor på tværs af flere pseudoislets). Fejlbjælkerne angiver standardfejlen i middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Integreret system til billeddannelse og mikroperifusion af levende celler . (A) Oversigt over komponenterne i live-cell-billeddannelses- og mikroperifusionssystemet. Pseudoislets i en mikrochip placeres på scenen af et konfokal laserscanningsmikroskop indesluttet i et miljøkammer. Denne konfiguration muliggør tidsmæssig opløsning vedrørende de intracellulære ændringer i biosensorfluorescens under det dynamiske respons på en række veldefinerede sekretagoger og indsamling af pseudoisletperifusatfraktioner til synkron måling af hormonsekretionen til yderligere integration med intracellulære signalhændelser. B) Komponenterne i den mikrofluidiske platform uden for miljøkammeret. Væskeretningsvirkningen er som følger: (1) sekretagogholdige rør til (2) 0,01 i slanger til (3) peristaltisk pumpeslange (0,02 i indvendig diameter) til (4) 0,01 i slanger til (5) de-bobler til (6) mikrochipindtag (0,01 i slanger) til (7) mikrochipholder/mikrochip til (8) mikrochipudløb (0,01 i slanger). Bemærk: 0,01 tommer slangen er forbundet med den peristaltiske pumpeslange med koniske adaptere (hvide pilespidser). Slangen tilsluttes de-bobleren via en møtrik og ferrule (grøn pilespids). Den stiplede røde linje viser forbindelsen mellem komponenterne. C) Nærbillede af mikrochippen og holderen i det omgivende kammer, der er monteret på det konfokale mikroskopstadium. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Human pseudoislet cAMP og hormonsekretionsdynamik. (A) Skemaer over sekretagoginduceret cADDis fluorescens og hormonsekretion i beta- og alfaceller. I betaceller binder epinephrin (Epi) G_i-koblede alfa-2-adrenerge receptorer, hvilket fører til hæmning af adenylylcyklase (AC), nedsat cAMP og reduceret insulinsekretion. I alfaceller stimulerer Epi G s-koblede beta_1-adrenerge receptorer, hvilket fører til aktivering af AC og en stigning i intracellulær cAMP. I begge celletyper forhindrer IBMX, en phosphodiesterase (PDE) hæmmer, nedbrydning af intracellulær cAMP og fremmer hormonsekretion. Bindingen af fri intracellulær cAMP forårsager konformationelle ændringer i cADDis-proteinet, hvilket forårsager en stigning i fluorescensintensiteten. (B) Repræsentative billeder af cADDis-ekspressive pseudoisletter under levende cellebilleddannelse som reaktion på G 2 (2 mM glucose), G 20 + IBMX (20 mM glucose + IBMX) og G 2 + Epi (2 mM glucose + Epi). Pseudoislets er skitseret i hvidt, og secretagogue-typen er angivet i øverste venstre hjørne. Skalabjælken er 50 μm. (C) Relativ cADDis-fluorescens over tid i gennemsnit på tværs af cADDis-ekspressive pseudoisletter fremstillet af humane øer fra tre organdonorpræparater. (D) Samlet insulin og (E) glukagonsekretion som reaktion på de angivne sekretagoger. Dataene normaliseres til øvolumenet, udtrykt i øækvivalenter (IEQ'er). Pseudoislets blev fremstillet fra tre humane ødonorer og analyseret ved hjælp af to til tre tekniske replikater / donor. Øcellerne blev transduceret med cADDis adenoviral konstruktion ved MOI 500 (N = 1) eller 1.000 (N = 2). (D',E') Indholdet af pseudoislethormon. Fejlbjælkerne angiver standardfejlen i middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Demografi for donorer. Resumé af donordemografiske oplysninger for de menneskelige øer, der anvendes under forberedelsen af pseudoislets med cADDis biosensorekspression og levende cellebilleddannelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Fejlfindingsvejledning. Udfordringer, der kan opstå, fremhæves, herunder en liste over almindelige årsager til problemer, løsninger og forebyggelsesteknikker. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Mikroperifusionsprotokol. Et eksempel på en mikroperifusionsprotokol, der anvendes til eksperimenterne, fremhævet i de repræsentative resultater. Denne protokol er specifikt rettet mod co-registrering af intracellulær cAMP og øhormonsekretion; Alternative protokoller kan være mere hensigtsmæssige afhængigt af det intracellulære molekyle af interesse og/eller den valgte biosensordynamik. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende fil 1: Beregning af øækvivalenter (IEQ). Et eksempel på, hvordan man beregner IEQ for de pseudoislets, der anvendes i hvert eksperiment. Oplysningerne i ark 1 (1. Objektmålinger) omfatter objektdata, der eksporteres direkte fra softwaren (se trin 9.1). Den grønne fremhævede kolonne indsættes for at tælle antallet af pseudoislets, der falder inden for hvert indeks i trin 9.1.6.2. Optællingerne kopieres til ark 2 (2. IEQ-beregning) og konverteret til IEQ ved hjælp af den relevante konverteringsfaktor pr. indeks. Ethvert pseudoislettab under chipindlæsning (In-chip pseudoislet #) og før fjernelse af ekstrakter (Post-run pseudoislet #) kan redegøres for ved hjælp af de billeder, der er taget i disse faser (se henholdsvis trin 5.5 og trin 7.1.1). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Dataanalyse. Et eksempel på, hvordan man beregner den relative cADDis-intensitet ud fra de data, der er opnået i trin 9.2. De rå data i kolonne D-F eksporteres direkte fra softwaren. Råværdierne på hvert tidspunkt normaliseres til gennemsnitsintensiteten i det sidste minut af basismediet (G 2; 7-8 min i protokollen). Den gennemsnitlige intensitet på tværs af alle pseudoislets over tid beregnes for at generere grafen i figur 2C. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Integrationen af et mikroperifusionssystem, biosensor-ekspressive pseudoislets og laser-scanning konfokal mikroskopi muliggør synkron vurdering af intracellulære signalhændelser og dynamiske hormonsekretoriske profiler. Det dynamiske mikroperifusionssystem kan levere en række veldefinerede stimuli til pseudoislets og giver mulighed for opsamling af spildevandet, hvor insulin- og glukagonkoncentrationerne kan måles ved hjælp af kommercielt tilgængelig ELISA. Samtidig fanger levende cellebilleddannelse af de biosensor-ekspressive pseudoislets ved hjælp af en konfokal mikroskopiplatform realtidsbiosensorfluorescensaktiviteten, som giver information om intracellulære signalhændelser. Den samtidige måling af biosensorsignalet og hormonsekretorisk profil over tid giver mulighed for direkte at sammenligne indflydelsen af intracellulære signalhændelser på øhormonsekretion.

Flere overvejelser er nøglen til succesen med den præsenterede protokol. Disse omfatter generering af biosensor-ekspressive pseudoislets og anvendelse af en konstant strømningshastighed under hvert eksperiment uden pseudoisletbevægelse. Ved en strømningshastighed på 100 μL/min og med 2 minutters fraktionsopsamling er perifusatvolumenet for hver fraktion 200 μL og bør ikke svinge med mere end 10 μL/fraktion. Hertil kommer, at mens billeddannelsessoftwaren kan tilpasse sig mindre pseudoisletbevægelse i XY-planet inden for synsfeltet, kan pseudoislets, der bevæger sig ud af synsfeltet i løbet af mikroperifusionseksperimentet, ikke analyseres. Det er derfor vigtigt at opdage eventuelle lækager og bevægelser tidligt i eksperimentet, så der kan gøres forsøg på at løse problemet. Et resumé af de potentielle udfordringer, deres almindelige årsager, løsninger og tips til at forhindre dem i at forekomme er opsummeret i tabel 2. Ikke desto mindre indeholder denne protokol flere muligheder for at forudse problemer, såsom at udføre et testeksperiment inden ilægning af chippen (trin 2.3) og overvågning af pseudoislets for betydelig bevægelse via et mikroskop i løbet af 30 minutters vaskeperiode forud for billedoptagelse og mikroperifusionsfraktionindsamling (trin 6.4-6.5).

En begrænsning er, at synsfeltet på den nuværende konfokale mikroskopiplatform ikke tillader, at alle pseudoislets i mikrochipet fanges på én gang. Mens der kræves mindst 30 pseudoislets for pålideligt at detektere insulin og glukagon i mikroperifusaterne, kan kun en delmængde afbildes ved 20x forstørrelse. Indlæsning af pseudoislets i midten af brønden maksimerer det antal, der kan fanges i synsfeltet. Derudover, mens mikrochippen er udstyret med tre brønde, begrænser integrationen med konfokalmikroskopi målingerne til en brønd ad gangen, hvilket betyder, at tekniske replikater skal udføres i serie snarere end parallelt. Desuden registrerer denne nuværende tilgang hele pseudoisletfluorescensen sammen med alfa- og betacellespecifikke sekretoriske output; Dette kan dog ændres til direkte at måle ændringer i alfa- eller betacelle intracellulære hændelser ved hjælp af cellespecifik målretning af genetisk kodede biosensorer. Mens kun insulin og glukagonsekretion blev vurderet i denne protokol, kunne fremtidige undersøgelser også måle sekretionen af andre øhormoner, såsom somatostatinsekretion fra deltaceller. Bemærk, at somatostatin på nuværende tidspunkt kun kan påvises med denne platform som reaktion på stærkt stimulerende secretagogues som IBMX. Endelig mangler isolerede øer og pseudoislets den neurovaskulære arkitektur af øer in vivo, hvilket har vist sig at påvirke øfunktionen direkte.

Afslutningsvis giver den beskrevne platform en strategi til synkronisering af vurderingen af intracellulære signalhændelser ved hjælp af biosensor og hormonsekretion. Dette system kan tilpasses yderligere til at undersøge de funktionelle forstyrrelser introduceret af RNA-interferens (siRNA eller shRNA) eller CRISPR-medierede genmålretningsstrategier. Disse metoder kan bruges til at bestemme de biologiske virkninger af veje af interesse på en lang række intracellulære eller ekstracellulære begivenheder ved hjælp af genetisk kodede biosensorer uden for cADDis, som det tidligere er blevet demonstreret for GCaMP6f⁷. Derudover vil selektiv transduktion af en bestemt celletype og/eller eksponering for cellespecifikke stimuli muliggøre målrettet forhør af intracellulære signalhændelser af en bestemt celletype inden for rammerne af den menneskelige ø. For eksempel kunne alfaceller fra humane bugspytkirteløer renses ved hjælp af celleoverflademarkører og efterfølgende transduceres med den almindeligt anvendte genetisk kodede calciumbiosensor GCaMP for at vurdere den intracellulære calciumdynamik. Disse viralt transducerede celler kunne derefter rekombineres med andre utransducerede øceller for at danne pseudoislets eller efterlades for at reaggregere alene for at generere alfacelleberigede pseudoislets, der sammensætningsmæssigt ligner øer i type 1-diabetes. Denne tilgang adskiller sig fra mere konventionelle teknikker, hvor intracellulære molekyler såsom Ca 2+ måles ved hjælp af indlæste Ca²⁺-følsomme farvestoffer, og celleidentiteten bestemmes efter levende cellebilleddannelse ved immunfarvning eller andre midler¹⁵. Alternativt foretages målinger i enkeltcelletilstand, hvor virkningen af parakrin signalering på øcellefunktionen går tabt¹⁵. Således overvinder denne levende cellebilleddannelse integreret med et pseudoisletsystem og mikroperifusionsplatform tidligere udfordringer inden for øbiologi, samtidig med at kendskabet til integrerede cellulære processer udvides.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component