Summary

Humant pseudoisletsystem til synkron vurdering af fluorescerende biosensordynamik og hormonsekretoriske profiler

Published: November 03, 2023
doi:

Summary

Denne protokol beskriver en metode til synkron erhvervelse og medregistrering af intracellulære signalhændelser og udskillelse af insulin og glukagon af primære humane pseudoislets ved hjælp af adenoviral levering af en cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) biosensor, en cAMP-differensdetektor in situ (cADDis) og et mikroperifusionssystem.

Abstract

Langerhansøerne i bugspytkirtlen, som er små 3D-samlinger af specialiserede endokrine og understøttende celler spredt gennem bugspytkirtlen, har en central rolle i kontrollen af glukosehomeostase gennem udskillelse af insulin af betaceller, hvilket sænker blodsukkeret og glukagon af alfaceller, hvilket hæver blodsukkeret. Intracellulære signalveje, herunder dem, der medieres af cAMP, er nøglen til reguleret alfa- og betacellehormonsekretion. 3D-østrukturen, selvom den er afgørende for koordineret øfunktion, præsenterer eksperimentelle udfordringer for mekanistiske undersøgelser af de intracellulære signalveje i primære humane øceller. For at overvinde disse udfordringer og begrænsninger beskriver denne protokol en integreret levende cellebilleddannelse og mikrofluidisk platform ved hjælp af primære humane pseudoislets genereret fra donorer uden diabetes, der ligner indfødte øer i deres morfologi, sammensætning og funktion. Disse pseudoislets er størrelsesstyret gennem dispersions- og reaggregeringsprocessen af primære humane øceller. I dispergeret tilstand kan øcellegenekspression manipuleres; for eksempel kan biosensorer som den genetisk kodede cAMP-biosensor, cADDis, introduceres. Når pseudoislets, der udtrykker en genetisk kodet biosensor i kombination med konfokal mikroskopi og en mikroperifusionsplatform, giver mulighed for synkron vurdering af fluorescerende biosensordynamik og alfa- og betacellehormonsekretoriske profiler for at give mere indsigt i cellulære processer og funktion.

Introduction

Langerhansøerne er miniorganer spredt over hele bugspytkirtlen, hvis funktion er afgørende for opretholdelsen af glukosehomeostase. Insulin udskilles fra betaceller efter metabolismen af glucose, en stigning i ATP / ADP-forholdet, lukningen af ATP-følsomme kaliumkanaler, depolarisering af plasmamembranen og tilstrømningen af ekstracellulært calcium1. Glucagon sekretion fra alfaceller er mindre forstået, men det er blevet postuleret, at intracellulære og parakrin veje bidrager til glucagon granulat exocytose 2,3,4. Både type 1 og type 2 diabetes er forbundet med øcelledysfunktion 5,6,7. Derfor er belysning af de intracellulære signalveje, der medierer øhormonsekretion, afgørende for at forstå fysiologiske og patologiske mekanismer i bugspytkirteløer.

Den sfæriske arkitektur af holme præsenterer visse hindringer for eksperimentering. Disse udfordringer omfatter variationer i holmstørrelsen og 3D-karakteren af holme, hvilket reducerer viral transduktion inden for holmens kerne 8,9. For at overvinde disse udfordringer blev der udviklet et pseudoislet-system, hvor primære menneskelige øer spredes i enkeltceller, adenoviralt transduceret med konstruktioner, der koder for mål af interesse, og reaggregeres til dannelse af størrelseskontrollerede, ølignende strukturer kaldet pseudoislets7. Sammenlignet med indfødte øer fra samme donor, der er dyrket parallelt, er disse pseudoislets ens i morfologi, endokrin cellesammensætning og hormonsekretion7. Denne metode giver mulighed for ekspression af konstruktioner i hele pseudoislet, hvilket betyder, at den overvinder en tidligere barriere for ensartet genetisk manipulation af primære menneskelige øer 7,8,9.

I denne protokol er pseudoisletsystemet integreret med en mikrofluidisk enhed til at udtrykke biosensorer i primære humane øceller og opnå tidsmæssig opløsning af pseudoislethormonsekretion under dynamisk perifusion10,11,12. Pseudoisletterne placeres i en mikrochip og udsættes for en jævn strøm af forskellige sekretagoger via en peristaltisk pumpe12. Mikrochippen har en gennemsigtig glasbund og er monteret på et konfokalmikroskop for at registrere den intracellulære signaldynamik via ændringer i biosensorens fluorescensintensitet. Biosensorbilleddannelse synkroniseres med opsamling af mikroperifusionsspildevand til efterfølgende analyse af insulin og glukagonsekretion7. Sammenlignet med makroperifusion giver denne mikroperifusionsmetode mulighed for at anvende færre pseudoisletter på grund af det mindre volumen af den mikrofluidiske enhed sammenlignet med makroperifusionskammeret7.

For at udnytte nytten af dette system blev den cykliske adenosinmonophosphat (cAMP) differensdetektor in situ (cADDis) biosensor udtrykt i humane pseudoislets for at vurdere cAMP-dynamik og hormonsekretion. cADDis-biosensoren består af et cirkulært permuteret grønt fluorescerende protein (cpGFP) placeret i hængselområdet i et udvekslingsprotein aktiveret af cAMP 2 (EPAC2), der forbinder dets regulatoriske og katalytiske regioner. Bindingen af cAMP til EPAC2’s regulatoriske område fremkalder en konformationsændring i hængselområdet, der øger fluorescensen fra cpGFP13. Intracellulære budbringere såsom cAMP fremkalder insulin og glukagonsekretion efter opstrømsaktivering af G-proteinkoblede receptorer14. Levende cellebilleddannelse kombineret med mikroperifusion hjælper med at forbinde den intracellulære cAMP-dynamik med øhormonsekretion. Specifikt genereres cADDis-ekspressive pseudoislets i denne protokol for at overvåge cAMP-responser i alfa- og betaceller til forskellige stimuli: lav glukose (2 mM glucose; G 2), høj glucose plus isobutylmethylxanthin (IBMX; 20 mM glucose + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX) og lav glukose plus adrenalin (Epi; 2 mM glucose + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Denne behandlingsarbejdsgang muliggør vurdering af den intracellulære cAMP-dynamik direkte via 1) IBMX-medieret phosphodiesterasehæmning, hvilket forbedrer intracellulære cAMP-niveauer ved at forhindre dets nedbrydning, og 2) adrenalin, en kendt cAMP-afhængig stimulator af alfacelleglukagonsekretion medieret af β-adrenerg receptoraktivering. Trinene til opsætning af mikroperifusionsapparatet til levende cellebilleddannelsesforsøg, indlæsning af pseudoislets i mikrochippen, synkron levende cellebilleddannelse og mikroperifusion og analyse af biosensorspor og hormonsekretion ved mikropladebaserede hormonassays er beskrevet nedenfor.

Protocol

Menneskelige øer (N = 4 præparater) blev opnået gennem partnerskaber med Integrated Islet Distribution Program, Human Pancreas Analysis Program, Prodo Laboratories, Inc. og Imagine Pharma. Vanderbilt University Institutional Review Board betragter ikke deidentificerede humane bugspytkirtelprøver som forskning i mennesker. Dette arbejde ville ikke være muligt uden organdonorer, deres familier og organindkøbsorganisationer. Se tabel 1 for demografiske oplysninger om donorer. Humane øer fra bugspytki…

Representative Results

Biosensor-udtrykkende humane pseudoislets blev skabt via adenoviral levering af konstruktioner, der koder for cAMP-biosensoren cADDis (figur 1A). Figur 1B viser reaggregeringen af de transducerede humane øceller over tid, med fuldt dannede pseudoislets observeret efter 6 dages dyrkning. Cellerne begyndte at vise synlig cADDis-fluorescens inden for 48 timer, og der var høj biosensorekspression i transducerede celler ved slutningen af dyrkningsperioden….

Discussion

Integrationen af et mikroperifusionssystem, biosensor-ekspressive pseudoislets og laser-scanning konfokal mikroskopi muliggør synkron vurdering af intracellulære signalhændelser og dynamiske hormonsekretoriske profiler. Det dynamiske mikroperifusionssystem kan levere en række veldefinerede stimuli til pseudoislets og giver mulighed for opsamling af spildevandet, hvor insulin- og glukagonkoncentrationerne kan måles ved hjælp af kommercielt tilgængelig ELISA. Samtidig fanger levende cellebilleddannelse af de biosens…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Organdonorer og deres familier værdsættes for deres uvurderlige donationer, og International Institute for Organ Procurement Organizations, Advancement of Medicine (IIAM) og National Disease Research Exchange (NDRI) anerkendes for deres partnerskab med at gøre humant bugspytkirtelvæv tilgængeligt for forskning. Dette arbejde blev støttet af Human Islet Research Network (RRID: SCR_014393), Human Pancreas Analysis Program (RRID: SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 og DK20593 (Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), Leona M. og Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, US Department of Veterans Affairs (BX000666), NIGMS fra National Institutes of Health (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 og National Science Foundation Graduate Research Fellowship (1937963).

Materials

Ad-CMV-cADDis Welgen Not applicable
 0.01” FEP tubing IDEX 1527L
1 M HEPES Gibco 15630-080 Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes Any Any
10 μm PTFE filter Cole-Parmer SK-21940-41 Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate Thermo Scientific 11360070 Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol Decon labs 2816 Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement Gibco 35050061 Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate Sigma A5960 DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin Sigma A7888 DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap  Omnifit 006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates Perkin Elmer 6055330
cellSens analysis software Olympus v3.1 Software used for data analysis
CMRL 1066 MediaTech  15-110-CV Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794) IDEX P-794
D-(+)-Glucose Sigma G7528 Glucose Buffer Component
DMEM  Sigma D5030 DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber okolab IX83
Epinepherine (Epi) Sigma E4250 Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated Sigma 12306C Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA Mercodia 10-1281-01
Glucagon Kit HTRF Cisbio 62CGLPEH
HCl (12N) Any Any Acid Ethanol Component
HEPES Sigma H7523 DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement Cell Dynamics M1019 iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 Cole-Parmer EW-00414-LW
Insulin ELISA Mercodia 10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX) Sigma I5879 Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope Olympus FV3000
L-Glutamine Sigma G8540 DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W) University of Miami FP-3W
Microchip holder  Micronit Microfluidics FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector Biorad 7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips Any Any
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump  Instech P720
Phosphate Buffered Saline Gibco 14190-144 Wash Islets
Sarstedt dishes Sarstedt depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate Sigma S6014 DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate Sigma P2256  DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope Olympus SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm) Millipore SCGP00525 Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit LifeLine Cell Technology LL-0003 iEC Media Component

References

  1. Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
  2. Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells. Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).
  3. Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium. Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).
  4. Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
  5. Halban, P. A., et al. β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).
  6. Brissova, M., et al. α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
  7. Walker, J. T., et al. Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells. JCI Insight. 5 (10), e06990 (2020).
  8. Giannoukakis, N., et al. Infection of intact human islets by a lentiviral vector. Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).
  9. Curran, M. A., et al. Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1. Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).
  10. Kayton, N. S., et al. Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).
  11. Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).
  12. Lenguito, G., et al. Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets. Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).
  13. Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).
  14. Tengholm, A. Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell. Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).
  15. Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).

Play Video

Cite This Article
Richardson, T. M., Pettway, Y. D., Walker, J. T., Nelson, H. A., Ishahak, M., Poffenberger, G., Aramandla, R., Reihsmann, C., Agarwal, A., Powers, A. C., Brissova, M. Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles. J. Vis. Exp. (201), e65259, doi:10.3791/65259 (2023).

View Video