蛍光バイオセンサーの動態とホルモン分泌プロファイルの同期評価のためのヒト偽島システム
Summary
このプロトコルは循環アデノシンの一リン酸塩(cAMP)の生物センサー、 その場 (cADDis)のcAMPの相違の探知器のアデノウイルス配達を使用して細胞内シグナリングでき事およびインシュリンおよびグルカゴンの分泌およびmicroperifusionシステムの同時獲得そしてco登録のための方法を記述する。
Abstract
ランゲルハンス膵島は、膵臓全体に点在する特殊な内分泌細胞と支持細胞の小さな3Dコレクションであり、血糖値を下げるベータ細胞によるインスリンの分泌と、血糖値を上昇させるアルファ細胞によるグルカゴンの分泌を介して、グルコースホメオスタシスの制御に中心的な役割を果たしています。cAMPによって媒介されるものを含む細胞内シグナル伝達経路は、アルファ細胞およびベータ細胞ホルモンの分泌調節に重要です。3D膵島構造は、協調的な膵島機能に不可欠ですが、初代ヒト膵島細胞における細胞内シグナル伝達経路の機構研究には実験上の課題があります。これらの課題と制限を克服するために、このプロトコルでは、形態、組成、および機能において天然の膵島に類似している糖尿病のないドナーから生成された一次ヒト偽膵島を使用して、統合された生細胞イメージングおよびマイクロ流体プラットフォームについて説明します。これらの偽膵島は、初代ヒト膵島細胞の分散および再凝集プロセスを通じてサイズ制御されます。分散状態では、膵島細胞の遺伝子発現を操作し得る。例えば、遺伝子コードされたcAMPバイオセンサ、cADDisなどのバイオセンサを導入することができる。いったん形成されると、遺伝子にコードされたバイオセンサーを発現する偽膵島は、共焦点顕微鏡および微小周融合プラットフォームと組み合わせることで、蛍光バイオセンサーの動態とアルファ細胞およびベータ細胞ホルモン分泌プロファイルの同期評価を可能にし、細胞のプロセスと機能に関するより多くの洞察を提供します。
Introduction
ランゲルハンス島は、膵臓全体に散らばる小さな器官であり、その機能はグルコースの恒常性の維持に不可欠です。インスリンは、グルコースの代謝、ATP/ADP比の増加、ATP感受性カリウムチャネルの閉鎖、原形質膜の脱分極、および細胞外カルシウムの流入に続いてベータ細胞から分泌されます1。アルファ細胞からのグルカゴン分泌はあまり理解されていませんが、細胞内およびパラクリン経路がグルカゴン顆粒エキソサイトーシスに寄与すると仮定されています2,3,4。1型糖尿病と2型糖尿病はどちらも膵島細胞機能障害と関連しています5,6,7。したがって、膵島ホルモン分泌を媒介する細胞内シグナル伝達経路の解明は、膵島における生理的・病態学的メカニズムの理解に不可欠です。
小島の球状構造は、実験に一定の障害をもたらします。これらの課題には、膵島サイズのばらつきや、膵島コア内のウイルス形質導入を減少させる膵島の3D特性が含まれる8,9。これらの課題を克服するために、初代ヒト膵島を単一細胞に分散させ、目的の標的をコードするコンストラクトでアデノウイルス形質導入し、再凝集して偽島と呼ばれるサイズ制御された膵島様構造を形成する偽膵島系が開発されました7。並行して培養された同じドナー由来の天然膵島と比較すると、これらの偽膵島は形態、内分泌細胞組成、およびホルモン分泌において類似している7。この方法は、偽膵島全体に構築物を発現させることを可能にし、初代ヒト膵島の均一な遺伝子操作に対する以前の障壁を克服することを意味する7,8,9。
このプロトコルでは、pseudoisletシステムはmicrofluidic装置と第一次人間の膵島のセルのbiosensorsを表現し、動的perifusion10,11,12の間にpseudoisletホルモンの分泌の一時的な決断を得るために統合される。偽膵島はマイクロチップ内に配置され、蠕動ポンプ12を介して異なる分泌促進物質の安定した流れに曝露される。マイクロチップは透明なガラス底を持ち、共焦点顕微鏡に取り付けられ、バイオセンサーの蛍光強度の変化を介して細胞内シグナル伝達の動態を記録します。バイオセンサーイメージングは、インスリンおよびグルカゴン分泌のその後の分析のために、微小周融合廃液の収集と同期されます7。大半融合と比較して、この微小半周融合アプローチは、大周輸チャンバー7と比較してマイクロ流体デバイスの体積が小さいため、使用する偽膵島が少なくて済む。
このシステムの有用性を活用するために、環状アデノシン一リン酸(cAMP)差分検出器 in situ (cADDis)バイオセンサーをヒト偽島で発現させ、cAMPの動態とホルモン分泌を評価しました。cADDisバイオセンサーは、cAMP 2(EPAC2)によって活性化された交換タンパク質のヒンジ領域に配置され、その調節領域と触媒領域をつなぐ円形に順列された緑色蛍光タンパク質(cpGFP)で構成されています。cAMPがEPAC2の調節領域に結合すると、ヒンジ領域の立体構造変化が誘発され、cpGFPからの蛍光が増加します13。cAMPなどの細胞内メッセンジャーは、Gタンパク質共役受容体の上流活性化後にインスリンおよびグルカゴン分泌を誘発する14。生細胞イメージングと微小ペリフュージョンを組み合わせることで、細胞内のcAMP動態と膵島ホルモン分泌を結びつけることができます。具体的には、このプロトコルでは、cADDis表現のpseudoisletsはさまざまな刺激にアルファおよびベータセルのcAMPの応答を監視するために生成される: 低いブドウ糖(2 mMブドウ糖;G 2)、高グルコースとイソブチルメチルキサンチン(IBMX;20 mMグルコース + 100 μM IBMX;G 20 + IBMX)、および低グルコースとエピネフリン(Epi;2 mMグルコース + 1 μM Epi;G 2 + エピ)。この処理ワークフローにより 、1) IBMXを介したホスホジエステラーゼ阻害により、細胞内のcAMPレベルの分解を防ぐこと、および2)βアドレナリン受容体の活性化によって媒介されるアルファ細胞グルカゴン分泌の既知のcAMP依存性刺激剤であるエピネフリンを介して、細胞内のcAMP動態を直接評価できます。生細胞イメージング実験用のマイクロペリフュージョン装置のセットアップ、マイクロチップへの偽膵島の装填、同期生細胞イメージングおよびマイクロペリフュージョン、およびマイクロプレートベースのホルモンアッセイによるバイオセンサーの痕跡およびホルモン分泌の分析のステップを以下に詳述する。
Protocol
Representative Results
Discussion
微小周融合システム、バイオセンサー発現偽島、レーザー走査型共焦点顕微鏡の統合により、細胞内シグナル伝達イベントと動的ホルモン分泌プロファイルの同期評価が可能になります。動的微小周輸システムは、一連の明確に定義された刺激を偽膵島に送達することができ、市販のELISAによってインスリンおよびグルカゴン濃度を測定できる廃液の収集を可能にする。同時に、共焦点顕微?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
臓器提供者とその家族は、その貴重な寄付に感謝し、国際臓器調達機構、医学振興機構(IIAM)、および国立疾病研究交換(NDRI)は、ヒトの膵臓組織を研究に利用できるようにするためのパートナーシップを認められています。この研究は、Human Islet Research Network (RRID:SCR_014393)、Human Pancreas Analysis Program (RRID:SCR_016202)、DK106755、DK123716、DK123743、DK120456、DK104211、DK108120、DK112232、DK117147、DK112217、EY032442、DK20593 (Vanderbilt Diabetes Research and Training Center)、レオナ・M・アンド・ハリー・B・ヘルムズリー慈善信託、JDRF、米国退役軍人省(BX000666)、 国立衛生研究所(T32GM007347)、F30DK134041、F30DK118830、および国立科学財団大学院研究フェローシップ(1937963)のNIGMS。
Materials
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
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