Summary
이 프로토콜은 고리형 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 바이오센서, cAMP 차이 검출기 in situ (cADDis) 및 미세페리퓨전 시스템의 아데노바이러스 전달을 사용하여 일차 인간 유사섬에 의한 세포 내 신호전달 이벤트의 동기 획득 및 공동 정합 및 인슐린 및 글루카곤 분비를 위한 방법을 설명합니다.
Abstract
랑게르한스의 췌장 섬은 췌장 전체에 산재된 특수 내분비 및 지원 세포의 작은 3D 집합체로, 혈당을 낮추는 베타 세포의 인슐린 분비와 혈당을 높이는 알파 세포의 글루카곤 분비를 통해 포도당 항상성을 조절하는 데 중심적인 역할을 합니다. cAMP에 의해 매개되는 것을 포함한 세포 내 신호 전달 경로는 조절된 알파 및 베타 세포 호르몬 분비에 중요합니다. 3D 섬 구조는 조정된 섬 기능에 필수적이지만, 1차 인간 섬 세포의 세포 내 신호 전달 경로에 대한 기계론적 연구에 대한 실험적 과제를 제시합니다. 이러한 과제와 한계를 극복하기 위해 이 프로토콜은 당뇨병이 없는 기증자로부터 생성된 1차 인간 유사섬을 사용하여 형태, 구성 및 기능에서 토착 섬과 유사한 통합 생세포 이미징 및 미세유체 플랫폼을 설명합니다. 이러한 pseudoislet은 1차 인간 islet 세포의 분산 및 재응집 과정을 통해 크기가 조절됩니다. 분산된 상태에서, 섬세포 유전자 발현은 조작될 수 있다; 예를 들어, 유전적으로 인코딩된 cAMP 바이오센서, cADDis와 같은 바이오센서가 도입될 수 있다. 일단 형성되면 공초점 현미경 및 미세 주변 융합 플랫폼과 함께 유전적으로 인코딩된 바이오센서를 발현하는 유사섬을 통해 형광 바이오센서 역학과 알파 및 베타 세포 호르몬 분비 프로파일을 동시에 평가하여 세포 과정 및 기능에 대한 더 많은 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Introduction
랑게르한스 섬은 췌장 전체에 흩어져 있는 작은 기관으로, 그 기능은 포도당 항상성 유지에 매우 중요합니다. 인슐린은 포도당의 대사, ATP/ADP 비율의 증가, ATP에 민감한 칼륨 채널의 폐쇄, 원형질막의 탈분극, 세포외 칼슘의 유입에 따라 베타 세포에서 분비됩니다1. 알파 세포에서 글루카곤 분비는 잘 알려져 있지 않지만, 세포 내 및 파라크린 경로가 글루카곤 과립 엑소사이토시스 2,3,4에 기여하는 것으로 추정되었습니다. 제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병은 모두 섬세포 기능 장애와 관련이 있다 5,6,7. 따라서 섬 호르몬 분비를 매개하는 세포 내 신호 전달 경로를 규명하는 것은 췌장 섬의 생리학적 및 병리학적 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.
섬의 구형 구조는 실험에 특정 장애물을 제시합니다. 이러한 문제에는 섬의 크기 변화와 섬의 3D 특성이 포함되며, 이는 섬 코어 8,9 내에서 바이러스 전달을 감소시킵니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 유사섬 시스템(pseudoislet system)이 개발되었는데, 이 시스템에서는 인간의 1차 섬을 단일 세포로 분산시키고, 관심 표적을 암호화하는 구조체로 아데노바이러스성 형질도입하고, 유사섬(pseudoislet)이라고 하는 크기가 조절되는 섬과 같은 구조를 형성하기 위해 재응집된다7. 병렬로 배양된 동일한 기증자의 토착 섬과 비교했을 때, 이들 유사섬은 형태, 내분비세포 조성 및 호르몬 분비가 유사하다7. 이 방법은 유사섬(pseudoislet) 전체에 걸쳐 구성물의 발현을 허용하는데, 이는 1차 인간 섬(7,8,9)의 균일한 유전자 조작에 대한 이전의 장벽을 극복한다는 것을 의미한다.
이 프로토콜에서, 유사섬 시스템은 미세유체 장치와 통합되어 1차 인간 섬 세포에서 바이오센서를 발현하고 동적 주융10,11,12 동안 유사섬 호르몬 분비의 시간적 분해능을 얻습니다. 유사섬은 마이크로칩에 배치되고 연동 펌프(12)를 통해 상이한 분비물의 꾸준한 흐름에 노출된다. 마이크로칩은 투명한 유리 바닥을 가지고 있으며 컨포칼 현미경에 장착되어 바이오센서 형광 강도의 변화를 통해 세포 내 신호 역학을 기록합니다. 바이오센서 이미징은 인슐린 및 글루카곤 분비의 후속 분석을 위해 미세페리퓨전 유출물 수집과 동기화된다7. 거대주융합과 비교하여, 이러한 미세주융합 접근법은 거대주위융합 챔버(7)에 비해 미세유체 장치의 부피가 더 작기 때문에 더 적은 수의 유사섬을 사용할 수 있다.
이 시스템의 유용성을 활용하기 위해 cAMP 역학 및 호르몬 분비를 평가하기 위해 인간 유사 섬에서 순환 아데노신 일인산(cAMP) 차이 검출기(cADDis) 바이오센서를 발현했습니다. cADDis 바이오센서는 cAMP 2(EPAC2)에 의해 활성화된 교환 단백질의 힌지 영역에 위치한 원형 치환 녹색 형광 단백질(cpGFP)로 구성되어 조절 영역과 촉매 영역을 연결합니다. EPAC2의 조절 영역에 대한 cAMP의 결합은 cpGFP13에서 형광을 증가시키는 힌지 영역의 구조적 변화를 유도합니다. cAMP와 같은 세포내 메신저는 G-단백질 결합 수용체의 상류 활성화 후 인슐린과 글루카곤 분비를 유도한다14. 미세 주류주입과 결합된 살아있는 세포 이미징은 세포 내 cAMP 역학을 섬 호르몬 분비와 연결하는 데 도움이 됩니다. 구체적으로, 이 프로토콜에서, 다양한 자극에 대한 알파 및 베타 세포의 cAMP 반응을 모니터링하기 위해 cADDis-발현 유사섬이 생성된다: 낮은 포도당(2mM glucose; G 2), 고포도당 플러스 이소부틸메틸크산틴(IBMX; 20mM 글루코스 + 100μM IBMX; G 20 + IBMX), 저포도당 및 에피네프린(Epi; 2mM 포도당 + 1μM Epi; G 2 + 에피). 이 치료 워크플로우를 통해 1) 분해를 방지하여 세포 내 cAMP 수준을 향상시키는 IBMX 매개 포스포디에스테라제 억제 및 2) β-아드레날린 수용체 활성화에 의해 매개되는 알파 세포 글루카곤 분비의 알려진 cAMP 의존성 자극제인 에피네프린을 통해 세포 내 cAMP 역학을 직접 평가할 수 있습니다. 생세포 이미징 실험을 위한 미세페리퓨전 장치를 설정하는 단계, 마이크로칩에 유사섬을 로딩하는 단계, 동기식 생세포 이미징 및 미세주류융합, 마이크로플레이트 기반 호르몬 분석에 의한 바이오센서 추적 및 호르몬 분비 분석은 아래에 자세히 설명되어 있습니다.
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Protocol
인간 섬(N=4 제제)은 Integrated Islet Distribution Program, Human Pancreas Analysis Program, Prodo Laboratories, Inc. 및 Imagine Pharma와의 파트너십을 통해 획득되었습니다. 밴더빌트 대학교 기관 검토 위원회(Vanderbilt University Institutional Review Board)는 비식별화된 인간 췌장 표본을 인간 피험자 연구로 간주하지 않습니다. 이 작업은 장기 기증자와 그 가족, 장기 조달 기관이 없었다면 불가능했을 것입니다. 기증자 인구 통계 정보는 표 1 을 참조하십시오. 당뇨병이 없는 췌장 기증자의 인간 섬은 15시간 미만의 저온 허혈 시간으로 분리되었습니다.
1. 가도섬(Pseudoislet) 형성 (Walker et al.7)
- P200 피펫 및 탁상용 현미경을 사용하여 1차 인간 섬을 채취하고 직접 선택하며, 섬 배양 배지(CMRL 1066의 10% FBS, 100μg/mL 스트렙토마이신, 100U/mL 페니실린, 2mM L-글루타민) 외부의 표면에서 피펫 팁을 오염시키지 않도록 세심한 주의를 기울입니다.
- 1차 섬을 15mL 튜브로 옮기고 조직 배양 후드 아래에서 다음과 같은 pseudoislet 형성 단계를 모두 수행하여 오염을 방지합니다. 7% 트립신에 P1000 피펫을 사용하여 실온에서 0.025분 동안 1차 섬을 천천히 해리합니다. 해결책은 섬이 쪼개지기 시작하면서 불투명해질 것입니다.
- 이러한 연구를 위해 직경이 약 200μm인 200-300개의 손으로 고른 1차 섬이 500μL의 0.025% 트립신에 분산되어 1-2개의 96웰 유사 섬 플레이트를 생성합니다. 정확한 숫자는 평균 섬 크기와 생존 가능성에 따라 다를 수 있습니다. >500개의 주요 섬의 경우 1:1 비율로 사용되는 0.025% 트립신의 부피를 확대합니다(예: 600개의 엄선된 섬에 대해 0.025% 트립신 600μL).
- 사용된 트립신의 부피와 동일한 Vanderbilt Pseudoislet Media(VPM)의 부피를 추가하여 분산을 소멸시킵니다. 그런 다음 VPM 1mL로 두 번 세척합니다. 세척의 경우 탁상형 원심분리기에서 4°C에서 2-3분 동안 485 x g 에서 분산된 세포를 원심분리합니다. 계수를 위해 정의된 VPM 부피(일반적으로 1mL)에 세포를 재현탁시킵니다.
참고: 유사섬 생성 및 VPM 조성은 이전 간행물7에 자세히 설명되어 있습니다. 간단히 말해서, VPM에는 동일한 용량의 농축 CMRL 배지(20% FBS, 100μg/mL 스트렙토마이신, 100U/mL 페니실린, 1mM 피루브산 나트륨, 2mM 글루타맥스, CMRL 1066의 2mM HEPES) 및 iEC-배지(VEGF 배지 컴플리트 키트에서 FBS를 뺀 값 + 내피 세포 배지 보충제 1병)가 포함되어 있습니다. 유사섬 생성의 요약 개략도는 그림 1A에 포함되어 있습니다. - 10μL의 Trypan Blue와 10μL의 세포 현탁액을 결합하여 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포 수와 생존율을 측정합니다. 정확한 세포 수를 보장하기 위해 세포 현탁액을 잘 혼합하십시오.
- 원하는 유사섬 개수에 필요한 세포 현탁액, 바이러스 및 VPM의 부피를 계산합니다. 모든 계산은 1.4단계에서 얻은 살아있는 세포 수를 기반으로 합니다.
- 이러한 연구를 위해 총 500μL 부피의 Ad-CMV-cADDis를 사용하여 MOI 500(N=1) 또는 1,000(N=2)에서 분산된 인간 섬세포를 transduction합니다. 형질도입된 유사섬(2,000개 세포/유사섬)의 한 플레이트는 기증자당 3개의 기술 복제(32개의 유사섬/실험)를 산출합니다. 아데노바이러스는 이 연구에서 상업적으로 획득되었습니다.
- 계산된 양의 세포 현탁액, 바이러스 및 VPM을 1.5mL 튜브에 결합합니다. 위아래로 피펫팅하여 내용물을 부드럽게 섞습니다.
- transduction하는 동안 뚜껑을 열고 튜브를 배양하고 37°C 및 5% CO 2/95% 공기의 조직 배양 인큐베이터에서2시간 동안 멸균 페트리 접시로 덮습니다.
- 각 튜브에 500μL의 VPM을 추가하고 4°C에서 3분 동안 500 x g 에서 원심분리하여 세포를 세척합니다. 두 번 더 세탁하면 총 세 번 세탁할 수 있습니다. 상층액을 흡인하고 세포를 1mL의 VPM에 재현탁시킵니다.
- 총 세포 파종 부피(200μL/pseudoislet)를 계산합니다. VPM(계산된 세포 파종 부피에서 2mL를 뺀 값)을 적절한 크기의 원뿔형 튜브에 추가합니다. 1.7단계에서 형질도입된 세포 현탁액을 원추형 튜브에 추가합니다. 원뿔형 튜브를 약간 닫은 상태로 유지하되 셀의 공기 교환을 위해 단단히 닫지 마십시오.
- 1.5mL 튜브(1.7단계에서)를 1mL의 VPM으로 헹구고 내용물을 원추형 튜브로 옮기면 원뿔형 튜브에 총 세포 파종 부피가 포함되어야 합니다.
- 전동식 혈청학적 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 원추형 튜브의 내용물을 잘 혼합한 다음 내용물을 멸균 시약 저장소로 옮깁니다. 저장소가 전체 세포 파종 부피를 유지하지 못하는 경우 직렬 전달을 수행하고 각 단계에서 현탁액이 잘 혼합되었는지 확인합니다.
- 멀티채널 P200 피펫을 사용하여 균질성을 보장하기 위해 시약 저장소의 세포 현탁액을 위아래로 3-4회 피펫한 다음 세포 현탁액 200μL를 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 피펫합니다.
- 37°C 및 5% CO2/95% 공기의 조직 배양 인큐베이터에서 배지 변화 없이 6일 동안 pseudoislet을 배양합니다. 6일째가 되면 유사섬이 완전히 형성되고 실험할 준비가 됩니다(그림 1B-D).
2. 생세포 이미징 및 미세페리퓨전 준비(실험 1일 전)
참고: 마이크로페리퓨전 배지 준비에 대한 정보는 protocols.io 리소스(https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html)를 통해 확인할 수 있습니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 유사섬을 96웰 플레이트에서 멸균 페트리 접시로 옮겨 수확합니다. 그런 다음 유사섬을 손으로 골라 신선한 VPM이 들어 있는 다른 멸균 페트리 접시에 옮깁니다. pseudoislet을 37°C 및 5% CO2/95% 공기의 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.
- 초정제수 1L에 BSA(방사성 면역 분석 등급) 1g, 피루브산나트륨 0.11g, L-글루타민 0.58g, 중탄산나트륨 3.2g, HEPES 1.11g, DMEM 1병을 추가하여 DMEM 1L를 제조합니다. DMEM에서 1M 포도당 원액을 준비합니다. 두 용액을 모두 4°C에서 밤새 유지합니다.
- 실험 전날 미세 주융 시스템의 흐름을 확인하십시오. 그림 2A-B에 설명된 대로 빈 마이크로칩이 들어 있는 칩 홀더에 모든 튜브를 연결합니다. 초정화된 물을 폐수로 사용하여 분획 분취기에서 100μL/분의 유속을 확인합니다.
3. DMEM에 secretagogue 추가 (실험 당일)
- DMEM에 아스코르브산염 0.07mg/mL를 첨가하고, 포도당 함유 완충액용 1M 포도당 스톡을 사용하여 DMEM + 아스코르브산염 완충액에서 분비물을 준비합니다.
참고: 아스코르브산염은 산화를 방지하여 에피네프린을 안정화하는 데 사용됩니다. 에피네프린을 사용하지 않는 경우, 아스코르브산은 DMEM에서 생략될 수 있습니다. - 매번 새 필터를 사용하여 0.22μm 기공 필터를 통해 분비물을 두 번 걸러냅니다. 용액을 37°C로 예열하고 혈당계를 통해 포도당을 측정하여 원하는 농도를 확인합니다.
4. Microperifusion 장치 설치
- 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경의 환경 챔버를 37°C로 예열하여 모든 도어가 닫히고 챔버가 안정적인 온도를 유지하도록 합니다. 마이크로칩이 들어 있는 칩 홀더를 챔버에 넣어 예열합니다. 적외선 건으로 칩 온도를 확인합니다.
참고: 이 경우 환경 챔버는 38.5°C로 설정되어 칩이 37°C에 도달할 수 있습니다. - 모든 튜브를 칩 홀더에 연결합니다(그림 2A-B 참조). 5분 동안 기준선 사무국과 플러시 라인. 이 연구에서, 라인은 2mM 글루코스(G2)로 플러시되었습니다. 8-10회 실험마다 디버블러의 버블 트랩 멤브레인을 교체하십시오.
5. 유사섬을 마이크로칩에 적재
- 마이크로칩을 장착하기 전에 후속 IEQ(Islet Equivalents)의 정량화를 위한 실험에 사용될 유사섬의 명시야 및 암시야 이미지(10x 배율)를 촬영합니다.
참고: IEQ는 실험 전반에 걸쳐 섬 수의 변화에 대한 호르몬 분비를 정규화하는 데 사용됩니다. 이 단계는 실험 전날에도 수행할 수 있습니다. - 마이크로칩의 아래쪽과 위쪽 절반에서 여분의 액체를 흡입합니다. 마이크로칩의 위쪽 절반에는 각 웰의 적절한 밀봉을 보장하는 개스킷이 포함되어 있고, 마이크로칩의 아래쪽 절반에는 유리 커버슬립이 부착된 웰이 포함되어 있습니다. 마이크로칩에 5μL의 DMEM으로 웰을 미리 적십니다. 틈새를 적시기 위해 우물의 바깥쪽 가장자리 주위에 피펫을 사용하십시오.
- 사전 습윤된 피펫을 사용하여 23μL 부피에 30-32개의 유사섬을 수집하고 마이크로칩의 바닥 부분에 있는 웰 중앙에 유사섬을 천천히 분배합니다. 피펫 팁에 부착되었을 수 있는 유사섬이 있는지 확인합니다.
- 겔 로딩 팁을 사용하여 유사섬을 우물 중앙으로 부드럽게 움직입니다. 이렇게 하면 최대 수의 pseudoislet이 시야에서 캡처됩니다.
- 입체경의 마이크로칩에 있는 유사섬의 이미지를 촬영합니다. 이 개수는 이 프로세스 중 유사섬 손실에 대해 계산된 IEQ를 조정하는 데 사용됩니다.
- 5.3단계의 모든 유사섬이 마이크로칩에 로드되지 않은 경우 그에 따라 IEQ를 조정합니다. 예를 들어, 현재 30개의 유사섬이 시각화되었지만 5.1단계에서 32개가 시각화된 경우 5.1단계의 이미지에서 IEQ를 계산한 다음 30/32를 곱합니다.
- 마이크로칩의 바닥을 마이크로칩 홀더에 넣습니다. 녹색 개스킷 면이 아래로 향하도록 마이크로칩의 상단을 조심스럽게 놓습니다.
- 마이크로칩을 제자리에 고정한 상태에서 마이크로칩 홀더를 부드럽게 닫아 마이크로칩을 함께 고정합니다. 이 과정에서 마이크로칩에 과도한 압력을 가하지 마십시오., 그렇게 하면 우물에 포함된 유체가 대체되어 유사섬 손실이 발생할 수 있습니다. 우물에 기포가 들어가지 않도록 하십시오.
6. 동시 살아있는 세포 화상 진찰 및 microperifusion
- 홀더의 분비물, 펌프 및 마이크로칩을 컨포칼 현미경에 장착된 환경 챔버로 옮깁니다. 유출 튜브를 챔버 밖으로 분획 분취기로 향하게 합니다.
- 버퍼를 15mL 코니컬 튜브에 넣고 뚜껑에 구멍을 뚫습니다. 이 구멍은 수집 튜브가 튜브에서 표류하는 것을 방지합니다.
- 튜브를 디버블러에 나사로 고정할 때 너트와 페룰을 분리한 다음 디버블러에 나사로 고정합니다. 이렇게 하면 선이 꼬이는 것을 방지할 수 있습니다.
- 분수 집진기가 2분마다 회전하도록 설정합니다. 적절한 수의 튜브를 분획 분취기에 로드하여 세척 및 실험 분획을 고려합니다. 이 실험을 위해 15개의 세척 튜브(총 세척 30분)와 분획 분취를 위한 28개의 튜브가 사용되었습니다.
- 펌프를 시작하여 100μL/min(100μL/min 유속으로 2분 분취하면 각 분획 튜브당 200μL의 유출물이 발생함)으로 베이스라인 배지(베이스라인 포도당 농도 포함)를 전달합니다. 이 유속은 유사섬에 가해지는 순전한 응력을 제한하고 실시간 이미징 중에 상당한 유사섬 이동을 방지하기 위해 선택되었습니다.
- 유체가 장치를 통과하는 동안 다음을 확인하십시오.
- 분획 분취기 Spout의 끝에서 시스템을 통한 흐름을 나타내는 물방울을 관찰하십시오.
- 시스템에서 유출이 감소하는지 확인하십시오. 수집 튜브에 <200μL가 있는 경우 시스템이 막히거나 누출될 수 있음을 나타냅니다. 표 2 에서 폐수 부피 감소의 잠재적 원인, 해결책 및 예방 요령 목록을 확인하십시오.
- 유체가 장치를 통과하는 동안 다음을 확인하십시오.
- 유출 튜브에서 매체 흐름이 일정하게 흐르면 분획 분취기 헤드를 돌려 튜브에 분주하고 분획 분취기를 시작합니다. 처음 15개의 분획(30분)을 세척으로 수집하여 유사섬이 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 이 처음 15개 분획을 사용하여 시스템을 통한 지속적이고 정확한 배지 흐름을 보장합니다. 나중에 이 분수를 버리십시오.
- 30분 세척하는 동안 다음 매개변수에 따라 살아있는 세포 이미징을 위한 현미경을 설정합니다. 대물 렌즈: U Plan Fluorite 20x(1배 줌 포함); 형광 채널: EGFP(방출 = 510nm, 레이저 파장 = 488, 검출 파장 = 500-600nm); 시계열: 전체 실험(즉, 56분) 동안 2초마다 획득한 이미지; 샘플링 속도: 2μs/픽셀.
- 시야에서 유사섬의 바닥을 식별하고 초점면을 이 위치 위 15μm로 조정합니다. 이 프레임은 이미징 실험 전반에 걸쳐 사용됩니다.
- 30분 세척이 완료되면 분획 분취 및 이미지 획득을 시작합니다.
알림: 이 단계 전에 문제를 식별하고 수정하기 위해 모든 노력을 기울여야 합니다. 데이터 수집이 시작되면 실험이 일시 중지되거나 분비물에 과도하게 노출되면 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. - 첫 번째 기준선 수집 기간 동안 유사섬을 기준선 배지로 계속 주류융합하여 유출물을 1.5mL 튜브로 수집합니다. 실험에 적합한 시간이 되면 튜브를 베이스라인 버퍼에서 새 자극 버퍼 튜브로 수동으로 전환합니다.
- 표준 미세페리퓨전 서열이 표 3에 나타내어져 있다.
- ~10개의 분획을 채취한 후 호르몬, 특히 글루카곤의 분해를 방지하기 위해 실험이 끝날 때까지 모든 분획을 4°C 냉장고에 넣습니다.
- 각 튜브의 유출 유량을 확인하여 실험 전반에 걸쳐 시스템 흐름을 계속 모니터링합니다.
- 실험이 완료되면 기준선 배지로 다시 전환하고 펌프를 5분 동안 계속 작동시켜 기준선 배지(이 경우 2mM 포도당)로 자극을 씻어냅니다.
- 펌프를 중지하고 디버블러 및 분획 수집기에서 마이크로칩 홀더 튜브를 분리하여 환경 챔버에서 마이크로칩 홀더를 제거합니다. 온도를 유지하기 위해 마이크로칩을 제거한 후 모든 도어를 닫으십시오.
- 후속 호르몬 분석을 위해 페리푸세이트를 -80°C에서 보관합니다.
7. Pseudoislet 산 에탄올 적출
- 마이크로칩 홀더를 조심스럽게 열고 마이크로칩 상단을 들어 올립니다. 피펫과 탁상형 현미경을 사용하여 웰에서 유사섬을 골라내고 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 필요한 경우 탁상형 현미경을 사용하여 모든 유사섬을 수집하십시오.
- 5.5단계와 유사하게 섬 추출 IEQ를 조정하기 위해 웰에서 제거하기 전에 마이크로칩에 있는 유사섬의 최종 이미지를 촬영합니다.
- 500μL의 PBS로 두 번 세척합니다. 각 세척 사이에 1 x g 에서 94분 동안 pseudoislet을 회전시키고 상층액을 흡인합니다.
- 마지막 세척을 제거한 후 200μL의 산성 에탄올(95% 에탄올 5.5mL + 12N HCl 50μL)을 추가합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.
- 다음 날, 추출물을 15,989 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀 다운합니다. 45 μL를 3개의 새 튜브에 분취합니다. 호르몬 함량 분석을 위해 -80 °C에서 보관하십시오. IEQ에 대한 호르몬 분비를 정상화하는 것에 대한 대안으로서, 호르몬 분비는 또한 추출물로부터 측정된 가섬 호르몬 함량으로 정규화될 수 있다.
8. 추가 실험 및 정리
- 후속 유사섬 그룹에 대해 5-7단계를 반복하여 추가 기술 반복실험을 얻습니다.
- 모든 미세 주변 융합 실험이 끝나면 마이크로칩과 튜브를 통해 10% 표백제를 5분 동안 실행한 다음 초정화된 물을 30분 동안 실행하여 튜브를 살균합니다.
9. 데이터 분석
참고: 라이브 셀 이미징은 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 수행되었습니다. 이미지는 현미경 관련 이미징 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석되었습니다. 다음은 일반적인 지침이지만 현미경 제조업체 및 이미지 획득 소프트웨어에 따라 다를 수 있습니다.
- 데이터 정규화를 위한 IEQ(Total Islet Equivalents) 결정
- 소프트웨어 프로그램을 열고 창의 오른쪽 상단에 있는 획득 탭을 클릭합니다. 매크로 관리자(보기 > 도구 창 > 매크로 관리자)에서 일괄 번인(Batch burn-in) 기능을 선택하여 모든 암시야 이미지를 일괄 굽습니다.
- 한 번에 여러 이미지를 구우려면 매크로 관리자 내에서 실행 버튼을 클릭하기 전에 배치 모드 토글 버튼을 클릭합니다. 화면의 지시에 따라 구운 이미지의 원본 이미지 위치와 대상 위치를 선택합니다. 이미지 파일 형식으로 Tagged Imagine File Format (*.tif)을 선택합니다.
- IEQ 측정을 위해 5.1단계에서 촬영한 10x 암시야 이미지의 레코딩된 버전을 엽니다. 상단의 Count and Measure 탭을 클릭하고 왼쪽의 Manual HSV Threshold 버튼을 선택합니다.
- 드로퍼 기능을 사용하여 각 유사섬이 유사섬 경계를 넘어 확장되지 않고 빨간색으로 강조 표시될 때까지 양수 영역(빨간색)을 추가/제거합니다. Count and Measure(카운트 및 측정)를 클릭합니다.
- 자동 분할 또는 수동 분할 기능을 사용하여 함께 결합된 유사 섬을 분할합니다.
- 유사 섬을 수동으로 분할하려면 수동 분할 기능을 선택하고 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 유사 섬을 구분하는 선을 그린 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 선을 완성합니다. 자동 분할하려면 자동 분할 기능을 선택하고 관심 있는 그룹화된 유사섬을 클릭합니다. 나중에 올바른 자동 분할을 확인하십시오.
- 일괄 구워진 이미지에서는 축척 막대와 확대 텍스트가 양수로 표시될 수 있습니다. 정확한 개수를 계산하려면 마우스를 사용하여 텍스트와 축척 막대를 강조 표시하고 Delete 키보드 키를 누릅니다.
- 필터를 켜고 꺼서 모든 유사섬이 계산되고 있는지 확인합니다. 상호 참조를 위해 프로그램 외부에서 파일을 열 수도 있습니다. 완료되면 Excel로 내보내기를 클릭합니다.
- 스프레드시트를 열고 다음과 같이 수정합니다.
- 하단의 개수, 평균 및 정렬 정보를 삭제합니다. 평균 지름을 기준으로 객체를 정렬합니다. 평균 지름 뒤에 열을 삽입하고 열 이름을 "Pseudoislet count"로 지정합니다.
- 섬 수는 아래의 각 인덱스에 속하는 평균 직경을 가진 유사 섬의 수에 의해 결정됩니다. 인덱스당 의사 섬 수에 각 IEQ 변환 계수를 곱하고 이 값을 합산하여 총 IEQ를 결정합니다. 각 실험 전에 획득한 이미지에 대해 IEQ 계산을 수행합니다. 다음 인덱스 및 IEQ 변환 계수를 사용합니다.
1-49 μm : × 0.167
50-100 μm: × 0.667
101-150 μm : × 1.685
151-200 μm의 : × 3.500
201-300 μm: × 6.315
301-350 μm : × 10.352 - IEQ 카운트를 결정하기 위한 예제 스프레드시트는 보충 파일 1을 참조하세요.
- 소프트웨어 프로그램을 열고 창의 오른쪽 상단에 있는 획득 탭을 클릭합니다. 매크로 관리자(보기 > 도구 창 > 매크로 관리자)에서 일괄 번인(Batch burn-in) 기능을 선택하여 모든 암시야 이미지를 일괄 굽습니다.
- 소프트웨어에서 살아있는 세포 이미징 정량 분석
- cellSens에서 원하는 파일(.oir)을 엽니다.
- 다음과 같이 관심 영역(ROI)을 지정합니다.
- 그리기 도구를 사용하여 ROI(즉, 각 유사섬)를 지정합니다. 자유형 그리기 옵션을 사용하는 경우 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 도형을 닫습니다.
- 화살표 손 모양을 사용하여 이미지의 모든 ROI를 포함하도록 끌어서 모든 ROI를 강조 표시합니다. 모든 ROI를 강조 표시한 상태에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Convert to Dynamic ROI Over Time(시간 경과에 따른 동적 ROI로 변환)을 선택합니다
- XYT 파일을 재생하여 시간 경과에 따른 ROI가 정확한지 확인합니다. 특정 기간에 ROI가 정확하지 않은 경우 해당 기간에 크기/위치를 수정합니다. 소프트웨어는 이러한 변경 사항에 맞게 시간이 지남에 따라 ROI의 크기/위치를 점진적으로 조정합니다. 이미징 실험 전반에 걸쳐 ROI가 정확해질 때까지 이 단계를 반복합니다.
- 다음과 같이 각 ROI에 대한 강도 측정을 수행합니다.
- 도구 모음에서 Measure Intensity Profile(강도 프로파일 측정)을 클릭합니다. 분석할 ROI를 강조 표시합니다. Shift + 클릭을 사용하여 여러 ROI를 선택합니다.
참고: 소프트웨어에서 한 번에 여러 파일을 열 수 있지만 한 번에 한 파일의 ROI만 분석하십시오. - 배경 잡음을 고려하려면 각 명암 값에서 뺄 상수 값을 선택하거나 하나의 ROI를 배경으로 지정하십시오. Execute( 실행)를 클릭합니다.
- Intensity Profile 툴바에서 Export to Excel을 클릭하여 데이터를 익스포트합니다.
- 모든 데이터 포인트를 7-8분(즉, 첫 번째 기준선 매체 주위의 마지막 분)에서 측정된 강도의 평균으로 정규화합니다. 각 시점에서 이러한 정규화된 값은 상대 cADDis 강도로 정의됩니다. 이미징 데이터 분석 및 정규화의 예제 스프레드시트는 보충 파일 2를 참조하십시오.
- 도구 모음에서 Measure Intensity Profile(강도 프로파일 측정)을 클릭합니다. 분석할 ROI를 강조 표시합니다. Shift + 클릭을 사용하여 여러 ROI를 선택합니다.
- 각 분획물과 섬 추출물의 호르몬 분비를 측정합니다. 이 실험에서 인슐린과 글루카곤 농도는 ELISA로 측정되었습니다. 단계 9.1에서 결정된 IEQ 측정을 사용하여 또는 추출물 호르몬 함량에 의해 결정된 유사섬 부피에 대한 각 분획의 호르몬 분비를 정규화합니다.
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Representative Results
바이오센서-발현 인간 유사섬은 cAMP 바이오센서 cADDis를 암호화하는 작제물의 아데노바이러스 전달을 통해 생성되었다(도 1A). 그림 1B는 시간 경과에 따른 형질도입된 인간 섬세포의 재응집을 보여주며, 배양 6일 후 완전히 형성된 유사섬이 관찰되었습니다. 세포는 48시간 이내에 가시적인 cADDis 형광을 나타내기 시작했으며, 배양 기간이 끝날 무렵에는 형질도입된 세포에서 높은 바이오센서 발현이 있었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 pseudoislet은 알파 세포에서 60%, 베타 세포에서 95%의 평균 형질도입 효율을 나타냈습니다(그림 1C-D).
통합된 미세유체 및 라이브 셀 이미징 플랫폼은 그림 2에 강조 표시되어 있습니다. cADDis를 발현하는 유사섬을 수확하고 하룻밤 동안 신선한 배지에서 배양하도록 한 후, 유사섬을 마이크로칩에 미리 적시된 우물의 중앙에 로드했습니다. 그런 다음 마이크로칩을 홀더에 고정하고 현미경 스테이지에 놓았습니다. 37°C로 유지된 현미경에 부착된 환경 챔버 내부에서 pseudoislets는 알파 및 베타 세포 분비물을 포함하는 배지로 둘레에 융합되었으며, 이는 시스템에 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해 디버블러를 통해 펌핑되었습니다. 마이크로칩의 유사섬은 100μL/min의 유속으로 둘레를 융합하고, 유출물은 분획 수집기를 통해 2분 간격으로 수집했습니다(그림 2A-B). 마이크로칩 웰의 유리 바닥을 통해 시야에서 여러 유사섬의 cADDis 형광 강도를 캡처할 수 있으며, 이는 향후 분석에 필수적입니다(그림 2C).
그림 3은 당뇨병이 없는 3명의 인간 기증자로부터 분리된 토착 섬에서 생성된 cADDis 발현 유사섬과 함께 설명된 프로토콜을 사용한 대표적인 결과를 보여줍니다. cADDis 발현 유사섬을 2mM 글루코스(G2), 20mM 글루코스 및 포스포디에스테라아제 억제제 이소부틸메틸크산틴(IBMX; G 20 + IBMX), 및 2mM 글루코스와 에피네프린(G 2 + Epi)을 첨가하였다. 이 프로토콜은 알파 및 베타 세포 내에서 cAMP를 향상시키는 알려진 세포 내 경로를 유도합니다(그림 3A-B). microperifusion 설정은 cADDis 형광 및 호르몬 분비를 통해 세포 내 cAMP 역학의 동기 수집을 용이하게 합니다(그림 3C-E). 실험의 엄격성을 보장하기 위해 유사섬에 대한 실험은 동일한 공여체로부터 2-3회 반복을 통해 수행되었으며 집계 값은 그림 3C-E,D',E'에 표시되어 있습니다. G 2에 노출되었을 때, 상대적인 cADDis 강도는 인슐린 분비와 마찬가지로 낮고 안정적이었습니다(그림 3C-D). pseudoislets가 G 20 + IBMX에 노출되었을 때, 상대적인 cADDis 강도의 증가에 의해 입증 된 바와 같이 세포 내 cAMP 농도가 강력하게 증가했습니다 (그림 3C). 이러한 증가는 베타 세포와 알파 세포 모두에 기인했을 가능성이 높으며, 인슐린과 글루카곤 분비의 현저한 증가가 동시에 증가한 것으로 입증되었습니다(그림 3D-E). G2+Epi에 대한 유사섬의 노출은 세포내 cAMP 농도를 증가시켰고(그림 3C), 이는 글루카곤 분비의 증가와 관련이 있었습니다(그림 3E). G2+Epi에 대한 cAMP 반응이 IBMX 반응에 비해 상대적으로 작다는 관찰은 알파 세포와 베타 세포에서 cADDis 아데노바이러스 구조체의 낮은 형질도입 효율(그림 1D)과 이 신호의 알파 세포 특이성(그림 3E)의 조합으로 인해 발생했을 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 1차 인간 베타 및 알파 세포에서 알려진 cAMP 매개 신호 전달 경로를 기반으로 기술 및 생물학적 복제에 걸쳐 cADDis 바이오센서와 베타 및 알파 세포 호르몬 분비 프로파일의 상대적 형광 강도를 동시에 검사할 수 있는 이 통합 플랫폼의 유용성을 성공적으로 입증합니다.
그림 1: 바이오센서 발현 인간 유사섬의 형성. (A) 1차 인간 섬 해리, 단일 세포 상태에서의 바이오센서 구조체와의 형질도입 및 재응집을 보여주는 개략도. 재응집 후, 유사섬은 수확되고 동기식 살아있는 세포 이미징 및 미세 주변 융합을 거칩니다. 프로토콜 단계는 회로도 전체에 표시됩니다. (B) 6일간의 재응집 기간 동안 cADDis-발현 유사섬의 형성을 포착하는 대표 이미지; 위: 대비가 있는 명시야, 아래: cADDis 형광. 눈금 막대는 100μm입니다. (C) C-펩타이드(CPEP, 파란색) 및 글루카곤(GCG, 빨간색) 라벨링으로 각각 시각화된 알파 및 베타 세포가 있는 cADDis 발현 유사섬(녹색)의 대표 이미지. DAPI(흰색)는 핵 대조제로 사용되었습니다. 흰색 화살표는 transduction된 알파 및 베타 세포를 강조 표시합니다. 노란색 화살표는 transduction되지 않은 알파 셀을 가리킵니다. 눈금 막대는 100μm입니다. (D) HALO 세포핵 알고리즘에 의한 베타 및 알파 세포의 MOI 1,000에서 형질 도입 효율 정량화(N = 2명의 기증자, 여러 유사섬에서 기증자당 평균 601개의 베타 세포와 627개의 알파 세포 분석). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 통합 살아있는 세포 이미징 및 미세 주변 융합 시스템. (A) 살아있는 세포 이미징 및 미세 페리퓨전 시스템 구성 요소의 개요. 마이크로칩의 유사섬은 환경 챔버 내에 둘러싸인 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경의 스테이지에 배치됩니다. 이 구성은 일련의 잘 정의된 secretagogue에 대한 동적 반응 동안 바이오센서 형광의 세포 내 변화에 관한 시간적 분해능 및 세포 내 신호 이벤트와의 추가 통합을 위한 호르몬 분비의 동기 측정을 위한 pseudoislet perifusate fractions의 수집을 허용합니다. (B) 환경 챔버 외부의 미세 유체 플랫폼의 구성 요소. 유체 방향성은 다음과 같다: (1) 분비물 함유 튜브 내지 (2) 0.01 in 튜빙 대 (3) 연동 펌프 튜빙 (0.02 in 내경) 내지 (4) 0.01in 튜빙 내지 (5) 디버블러 내지 (6) 마이크로칩 입구 (0.01 in tubing) 내지 (7) 마이크로칩 홀더/마이크로칩 to (8) 마이크로칩 출구 (0.01in tubing). 참고: 0.01인치 튜빙은 원뿔형 어댑터(흰색 화살촉)를 사용하여 연동 펌프 튜빙에 연결됩니다. 튜브는 너트와 페룰(녹색 화살촉)을 통해 디버블러에 연결됩니다. 빨간색 점선은 구성 요소 간의 연결을 표시합니다. (C) 컨포칼 현미경 스테이지에 장착된 환경 챔버 내의 마이크로칩 및 홀더의 클로즈업 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 인간 pseudoislet cAMP 및 호르몬 분비 역학. (A) 베타 및 알파 세포에서 분비물 유도 cADDis 형광 및 호르몬 분비의 개략도. 베타 세포에서 에피네프린(Epi)은 Gi-결합 알파2-아드레날린 수용체와 결합하여 아데닐릴 사이클라아제(AC)의 억제, cAMP 감소 및 인슐린 분비 감소를 유도합니다. 알파 세포에서 Epi는 Gs-결합 베타1-아드레날린 수용체를 자극하여 AC의 활성화와 세포 내 cAMP의 증가를 유도합니다. 두 세포 유형 모두에서 포스포디에스테라아제(PDE) 억제제인 IBMX는 세포 내 cAMP의 분해를 방지하고 호르몬 분비를 촉진합니다. 유리 세포 내 cAMP의 결합은 cADDis 단백질의 구조적 변화를 일으켜 형광 강도를 증가시킵니다. (B) G 2 (2 mM glucose), G 20 + IBMX (20 mM glucose + IBMX) 및 G 2 + Epi (2 mM glucose + Epi)에 반응하여 살아있는 세포 이미징 중 cADDis 발현 pseudoislet의 대표 이미지. 유사 섬은 흰색 윤곽선으로 표시되고 secretagogue 유형은 왼쪽 상단 모서리에 표시됩니다. 눈금 막대는 50μm입니다. (C) 3개의 장기 기증자 제제에서 인간 섬으로 만든 cADDis 발현 유사섬에서 시간 경과에 따른 상대 cADDis 형광. (D) 표시된 분비물에 반응하여 인슐린 및 (E) 글루카곤 분비를 집계합니다. 데이터는 iLLET EQUIVALENTS(IEQ)로 표현된 islet 부피로 정규화됩니다. 유사섬은 3명의 인간 섬 기증자로부터 제조되었으며 2-3개의 기술 복제/기증자를 사용하여 분석되었습니다. 섬세포는 MOI 500(N=1) 또는 1,000(N=2)에서 cADDis 아데노바이러스 작제물로 형질도입하였다. (D',E') 가도섬 호르몬 함량. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 기증자 인구 통계. cADDis 바이오센서 발현 및 살아있는 세포 이미징을 사용하여 유사섬을 준비하는 동안 사용된 인간 섬에 대한 기증자 인구 통계 정보 요약. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 문제 해결 가이드. 발생할 수 있는 문제는 문제의 일반적인 원인, 해결 방법 및 예방 기술 목록을 포함하여 강조 표시됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: Microperifusion 프로토콜. 대표 결과에서 강조된 실험에 사용된 미세 주위 융합 프로토콜의 예. 이 프로토콜은 특히 세포 내 cAMP와 섬 호르몬 분비의 공동 등록을 위해 고안되었습니다. 대체 프로토콜은 관심있는 세포내 분자 및/또는 선택된 바이오센서 동역학에 따라 더 적절할 수 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 섬 등가물(IEQ) 계산. 각 실험에 사용된 유사섬에 대한 IEQ를 계산하는 방법의 예입니다. 시트 1의 데이터(1. 물체 측정)에는 소프트웨어에서 직접 내보낸 물체 데이터가 포함됩니다(9.1단계 참조). 녹색으로 강조 표시된 열은 9.1.6.2단계에서 각 인덱스에 속하는 유사 섬의 수를 계산하기 위해 삽입됩니다. 카운트가 시트 2(2. IEQ 계산)을 생성하고 인덱스당 적절한 변환 계수를 사용하여 IEQ로 변환합니다. 칩 로딩 중(In-chip pseudoislet #) 및 추출물 제거 전(Post-run pseudoislet #) 모든 pseudoislet 손실은 이러한 단계에서 캡처된 이미지를 사용하여 설명할 수 있습니다(각각 5.5단계 및 7.1.1단계 참조). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 데이터 분석. 9.2단계에서 얻은 데이터에서 상대적인 cADDis 강도를 계산하는 방법의 예. D-F 열의 원시 데이터는 소프트웨어에서 직접 내보내집니다. 각 시점의 원시 값은 기준선 매체의 마지막 순간(G 2, 프로토콜에서 7-8분)의 평균 강도로 정규화됩니다. 시간 경과에 따른 모든 유사섬의 평균 강도를 계산하여 그림 2C의 그래프를 생성합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
미세 주위 융합 시스템, 바이오센서 발현 유사섬 및 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 통합으로 세포 내 신호 이벤트 및 동적 호르몬 분비 프로파일의 동시 평가가 가능합니다. 동적 미세페리퓨전 시스템은 유사섬에 일련의 잘 정의된 자극을 전달할 수 있으며 상업적으로 이용 가능한 ELISA로 인슐린 및 글루카곤 농도를 측정할 수 있는 폐수 수집을 허용합니다. 동시에, 컨포칼 현미경 플랫폼에 의한 바이오센서 발현 유사섬의 살아있는 세포 이미징은 세포 내 신호 이벤트에 대한 정보를 제공하는 실시간 바이오센서 형광 활동을 캡처합니다. 시간 경과에 따른 바이오센서 신호와 호르몬 분비 프로파일의 동시 측정은 섬 호르몬 분비에 대한 세포 내 신호 전달 사건의 영향을 직접 비교할 수 있는 기회를 제공합니다.
여러 가지 고려 사항이 제시된 프로토콜의 성공의 열쇠입니다. 여기에는 바이오센서 발현 유사섬을 생성하고 유사섬 이동 없이 각 실험 동안 일정한 유속을 사용하는 것이 포함됩니다. 100μL/min의 유속과 2분의 분획 분취에서 각 분획의 페리푸세이트 부피는 200μL이며 10μL/분획 이상 변동해서는 안 됩니다. 또한, 이미징 소프트웨어는 시야 내에서 XY 평면의 미세한 유사섬 이동에 맞게 조정할 수 있지만, 미세주위융합 실험 과정에서 시야를 벗어나는 유사섬은 분석할 수 없습니다. 따라서 문제를 해결하기 위한 시도를 할 수 있도록 실험 중에 누출 및 움직임을 조기에 감지하는 것이 중요합니다. 잠재적인 문제, 일반적인 원인, 솔루션 및 문제 발생을 방지하기 위한 팁에 대한 요약은 표 2에 요약되어 있습니다. 그럼에도 불구하고 이 프로토콜에는 칩을 로드하기 전에 테스트 실험을 수행하고(2.3단계) 이미지 획득 및 미세 주위 분획 수집 전 30분 세척 기간 동안 현미경을 통해 유사섬의 중요한 움직임을 모니터링하는 등 문제를 예측할 수 있는 여러 기회가 포함되어 있습니다(6.4-6.5단계).
한 가지 한계는 현재 컨포칼 현미경 플랫폼의 시야각으로는 마이크로칩 내의 모든 유사섬을 한 번에 캡처할 수 없다는 것입니다. 미세페리푸사트에서 인슐린과 글루카곤을 안정적으로 검출하려면 최소 30개의 유사섬이 필요하지만, 20배 배율로 하위 집합만 이미지화할 수 있습니다. 유사섬을 우물 중앙에 로드하면 시야에서 캡처할 수 있는 수가 최대화됩니다. 또한 마이크로칩에는 3개의 웰이 장착되어 있지만 컨포칼 현미경과의 통합으로 측정이 한 번에 하나의 웰로 제한되므로 기술 복제는 병렬이 아닌 직렬로 수행되어야 합니다. 또한, 이 현재 접근법은 전체 pseudoislet 형광을 알파 및 베타 세포 특이적 분비 출력과 함께 공동 등록합니다. 그러나, 이것은 유전적으로 인코딩된 바이오센서의 세포 특이적 표적화를 사용하여 알파 또는 베타 세포 내 사건의 변화를 직접 측정하도록 수정될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 인슐린과 글루카곤 분비만 평가되었지만, 향후 연구에서는 델타 세포에서 소마토스타틴 분비와 같은 다른 섬 호르몬의 분비도 측정할 수 있습니다. 주목할 점은, 현재 소마토스타틴은 IBMX와 같은 매우 자극적인 분비물에 반응하여 이 플랫폼에서만 검출될 수 있다는 것입니다. 마지막으로, 고립된 섬과 유사 섬은 생체 내 섬의 신경혈관 구조가 부족하며, 이는 섬 기능에 직접적인 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.
결론적으로, 설명된 플랫폼은 바이오센서 및 호르몬 분비를 사용하여 세포 내 신호 전달 이벤트의 평가를 동기화하는 전략을 제공합니다. 이 시스템은 RNA 간섭(siRNA 또는 shRNA) 또는 CRISPR 매개 유전자 표적화 전략에 의해 도입된 기능적 섭동을 검사하기 위해 추가로 적용할 수 있습니다. 이러한 방법은 이전에 GCaMP6f7에 대해 입증된 바와 같이 cADDis 외부의 유전적으로 인코딩된 바이오센서를 사용하여 다수의 세포 내 또는 세포 외 사건에 대한 관심 경로의 생물학적 효과를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 특정 세포 유형의 선택적 형질도입 및/또는 세포 특이적 자극에 대한 노출은 인간 섬의 맥락 내에서 특정 세포 유형의 세포 내 신호 전달 사건의 표적 조사를 가능하게 할 것입니다. 예를 들어, 인간 췌장 섬의 알파 세포는 세포 표면 마커를 사용하여 정제한 후 일반적으로 사용되는 유전적으로 인코딩된 칼슘 바이오센서 GCaMP로 형질주입하여 세포 내 칼슘 역학을 평가할 수 있습니다. 그런 다음 이러한 바이러스 형질도입된 세포를 다른 형질도입되지 않은 섬세포와 재조합하여 유사섬을 형성하거나 자체적으로 재응집하도록 방치하여 제1형 당뇨병의 섬과 조성적으로 유사한 알파 세포가 풍부한 유사섬을 생성할 수 있습니다. 이러한 접근법은 Ca 2+와 같은 세포 내 분자가 로딩 Ca2+ 민감성 염료를 사용하여 측정되고 세포 동일성은 면역염색 또는 다른 수단에 의한 살아있는 세포 이미징 후에 결정되는 보다 종래의 기술과는 다르다15. 대안적으로, 측정은 단일세포 상태에서 수행되는데, 여기서 섬세포 기능에 대한 파라크린 신호전달의 영향은손실된다 15. 따라서 유사섬 시스템 및 미세주위 융합 플랫폼과 통합된 이 살아있는 세포 이미징은 섬 생물학의 이전 과제를 극복하는 동시에 통합 세포 과정에 대한 지식을 넓힙니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
장기 기증자와 그 가족들은 귀중한 기증에 감사하고 있으며, 국제장기조달기구협회(IIAM)와 국립질병연구거래소(NDRI)는 인간의 췌장 조직을 연구에 활용할 수 있도록 협력한 공로를 인정받고 있습니다. 이 연구는 Human Islet Research Network(RRID:SCR_014393), Human Pancreas Analysis Program(RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 및 DK20593(Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, 미국 재향군인회(BX000666)의 지원을 받았습니다. 미국 국립보건원(National Institutes of Health, T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 및 국립과학재단(National Science Foundation) 대학원 연구 펠로우십(1937963)의 NIGMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
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