형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템
Summary
이 프로토콜은 고리형 아데노신 모노포스페이트(cAMP) 바이오센서, cAMP 차이 검출기 in situ (cADDis) 및 미세페리퓨전 시스템의 아데노바이러스 전달을 사용하여 일차 인간 유사섬에 의한 세포 내 신호전달 이벤트의 동기 획득 및 공동 정합 및 인슐린 및 글루카곤 분비를 위한 방법을 설명합니다.
Abstract
랑게르한스의 췌장 섬은 췌장 전체에 산재된 특수 내분비 및 지원 세포의 작은 3D 집합체로, 혈당을 낮추는 베타 세포의 인슐린 분비와 혈당을 높이는 알파 세포의 글루카곤 분비를 통해 포도당 항상성을 조절하는 데 중심적인 역할을 합니다. cAMP에 의해 매개되는 것을 포함한 세포 내 신호 전달 경로는 조절된 알파 및 베타 세포 호르몬 분비에 중요합니다. 3D 섬 구조는 조정된 섬 기능에 필수적이지만, 1차 인간 섬 세포의 세포 내 신호 전달 경로에 대한 기계론적 연구에 대한 실험적 과제를 제시합니다. 이러한 과제와 한계를 극복하기 위해 이 프로토콜은 당뇨병이 없는 기증자로부터 생성된 1차 인간 유사섬을 사용하여 형태, 구성 및 기능에서 토착 섬과 유사한 통합 생세포 이미징 및 미세유체 플랫폼을 설명합니다. 이러한 pseudoislet은 1차 인간 islet 세포의 분산 및 재응집 과정을 통해 크기가 조절됩니다. 분산된 상태에서, 섬세포 유전자 발현은 조작될 수 있다; 예를 들어, 유전적으로 인코딩된 cAMP 바이오센서, cADDis와 같은 바이오센서가 도입될 수 있다. 일단 형성되면 공초점 현미경 및 미세 주변 융합 플랫폼과 함께 유전적으로 인코딩된 바이오센서를 발현하는 유사섬을 통해 형광 바이오센서 역학과 알파 및 베타 세포 호르몬 분비 프로파일을 동시에 평가하여 세포 과정 및 기능에 대한 더 많은 통찰력을 제공할 수 있습니다.
Introduction
랑게르한스 섬은 췌장 전체에 흩어져 있는 작은 기관으로, 그 기능은 포도당 항상성 유지에 매우 중요합니다. 인슐린은 포도당의 대사, ATP/ADP 비율의 증가, ATP에 민감한 칼륨 채널의 폐쇄, 원형질막의 탈분극, 세포외 칼슘의 유입에 따라 베타 세포에서 분비됩니다1. 알파 세포에서 글루카곤 분비는 잘 알려져 있지 않지만, 세포 내 및 파라크린 경로가 글루카곤 과립 엑소사이토시스 2,3,4에 기여하는 것으로 추정되었습니다. 제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병은 모두 섬세포 기능 장애와 관련이 있다 5,6,7. 따라서 섬 호르몬 분비를 매개하는 세포 내 신호 전달 경로를 규명하는 것은 췌장 섬의 생리학적 및 병리학적 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다.
섬의 구형 구조는 실험에 특정 장애물을 제시합니다. 이러한 문제에는 섬의 크기 변화와 섬의 3D 특성이 포함되며, 이는 섬 코어 8,9 내에서 바이러스 전달을 감소시킵니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 유사섬 시스템(pseudoislet system)이 개발되었는데, 이 시스템에서는 인간의 1차 섬을 단일 세포로 분산시키고, 관심 표적을 암호화하는 구조체로 아데노바이러스성 형질도입하고, 유사섬(pseudoislet)이라고 하는 크기가 조절되는 섬과 같은 구조를 형성하기 위해 재응집된다7. 병렬로 배양된 동일한 기증자의 토착 섬과 비교했을 때, 이들 유사섬은 형태, 내분비세포 조성 및 호르몬 분비가 유사하다7. 이 방법은 유사섬(pseudoislet) 전체에 걸쳐 구성물의 발현을 허용하는데, 이는 1차 인간 섬(7,8,9)의 균일한 유전자 조작에 대한 이전의 장벽을 극복한다는 것을 의미한다.
이 프로토콜에서, 유사섬 시스템은 미세유체 장치와 통합되어 1차 인간 섬 세포에서 바이오센서를 발현하고 동적 주융10,11,12 동안 유사섬 호르몬 분비의 시간적 분해능을 얻습니다. 유사섬은 마이크로칩에 배치되고 연동 펌프(12)를 통해 상이한 분비물의 꾸준한 흐름에 노출된다. 마이크로칩은 투명한 유리 바닥을 가지고 있으며 컨포칼 현미경에 장착되어 바이오센서 형광 강도의 변화를 통해 세포 내 신호 역학을 기록합니다. 바이오센서 이미징은 인슐린 및 글루카곤 분비의 후속 분석을 위해 미세페리퓨전 유출물 수집과 동기화된다7. 거대주융합과 비교하여, 이러한 미세주융합 접근법은 거대주위융합 챔버(7)에 비해 미세유체 장치의 부피가 더 작기 때문에 더 적은 수의 유사섬을 사용할 수 있다.
이 시스템의 유용성을 활용하기 위해 cAMP 역학 및 호르몬 분비를 평가하기 위해 인간 유사 섬에서 순환 아데노신 일인산(cAMP) 차이 검출기(cADDis) 바이오센서를 발현했습니다. cADDis 바이오센서는 cAMP 2(EPAC2)에 의해 활성화된 교환 단백질의 힌지 영역에 위치한 원형 치환 녹색 형광 단백질(cpGFP)로 구성되어 조절 영역과 촉매 영역을 연결합니다. EPAC2의 조절 영역에 대한 cAMP의 결합은 cpGFP13에서 형광을 증가시키는 힌지 영역의 구조적 변화를 유도합니다. cAMP와 같은 세포내 메신저는 G-단백질 결합 수용체의 상류 활성화 후 인슐린과 글루카곤 분비를 유도한다14. 미세 주류주입과 결합된 살아있는 세포 이미징은 세포 내 cAMP 역학을 섬 호르몬 분비와 연결하는 데 도움이 됩니다. 구체적으로, 이 프로토콜에서, 다양한 자극에 대한 알파 및 베타 세포의 cAMP 반응을 모니터링하기 위해 cADDis-발현 유사섬이 생성된다: 낮은 포도당(2mM glucose; G 2), 고포도당 플러스 이소부틸메틸크산틴(IBMX; 20mM 글루코스 + 100μM IBMX; G 20 + IBMX), 저포도당 및 에피네프린(Epi; 2mM 포도당 + 1μM Epi; G 2 + 에피). 이 치료 워크플로우를 통해 1) 분해를 방지하여 세포 내 cAMP 수준을 향상시키는 IBMX 매개 포스포디에스테라제 억제 및 2) β-아드레날린 수용체 활성화에 의해 매개되는 알파 세포 글루카곤 분비의 알려진 cAMP 의존성 자극제인 에피네프린을 통해 세포 내 cAMP 역학을 직접 평가할 수 있습니다. 생세포 이미징 실험을 위한 미세페리퓨전 장치를 설정하는 단계, 마이크로칩에 유사섬을 로딩하는 단계, 동기식 생세포 이미징 및 미세주류융합, 마이크로플레이트 기반 호르몬 분석에 의한 바이오센서 추적 및 호르몬 분비 분석은 아래에 자세히 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미세 주위 융합 시스템, 바이오센서 발현 유사섬 및 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 통합으로 세포 내 신호 이벤트 및 동적 호르몬 분비 프로파일의 동시 평가가 가능합니다. 동적 미세페리퓨전 시스템은 유사섬에 일련의 잘 정의된 자극을 전달할 수 있으며 상업적으로 이용 가능한 ELISA로 인슐린 및 글루카곤 농도를 측정할 수 있는 폐수 수집을 허용합니다. 동시에, 컨포칼 현미경 플랫폼에 의한 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
장기 기증자와 그 가족들은 귀중한 기증에 감사하고 있으며, 국제장기조달기구협회(IIAM)와 국립질병연구거래소(NDRI)는 인간의 췌장 조직을 연구에 활용할 수 있도록 협력한 공로를 인정받고 있습니다. 이 연구는 Human Islet Research Network(RRID:SCR_014393), Human Pancreas Analysis Program(RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 및 DK20593(Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, 미국 재향군인회(BX000666)의 지원을 받았습니다. 미국 국립보건원(National Institutes of Health, T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 및 국립과학재단(National Science Foundation) 대학원 연구 펠로우십(1937963)의 NIGMS.
Materials
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
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