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Biology

फ्लोरोसेंट बायोसेंसर डायनामिक्स और हार्मोन स्रावी प्रोफाइल के तुल्यकालिक मूल्यांकन के लिए मानव स्यूडोआइलेट सिस्टम

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/65259
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 2, 2, 2, 3, 1,2,4, 2
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, 2Division of Diabetes, Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 4VA Tennessee Valley Healthcare System
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग घटनाओं के तुल्यकालिक अधिग्रहण और सह-पंजीकरण और प्राथमिक मानव स्यूडोआइलेट्स द्वारा इंसुलिन और ग्लूकागन के स्राव के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जिसमें चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीएमपी) बायोसेंसर, सीटू में एक सीएमपी अंतर डिटेक्टर (सीएडीडीआईएस), और एक माइक्रोपेरिफ्यूजन सिस्टम के एडेनोवायरल वितरण का उपयोग किया जाता है।

Abstract

लैंगरहैंस के अग्नाशयी आइलेट्स, जो पूरे अग्न्याशय में फैले विशेष अंतःस्रावी और सहायक कोशिकाओं के छोटे 3 डी संग्रह हैं, बीटा कोशिकाओं द्वारा इंसुलिन के स्राव के माध्यम से ग्लूकोज होमियोस्टैसिस के नियंत्रण में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, जो रक्त शर्करा को कम करता है, और अल्फा कोशिकाओं द्वारा ग्लूकागन, जो रक्त शर्करा को बढ़ाता है। इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्ग, जिनमें सीएमपी द्वारा मध्यस्थता शामिल है, विनियमित अल्फा और बीटा सेल हार्मोन स्राव के लिए महत्वपूर्ण हैं। 3 डी आइलेट संरचना, जबकि समन्वित आइलेट फ़ंक्शन के लिए आवश्यक है, प्राथमिक मानव आइलेट कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्गों के यांत्रिक अध्ययन के लिए प्रयोगात्मक चुनौतियां प्रस्तुत करती है। इन चुनौतियों और सीमाओं को दूर करने के लिए, यह प्रोटोकॉल मधुमेह के बिना दाताओं से उत्पन्न प्राथमिक मानव स्यूडोआइलेट्स का उपयोग करके एक एकीकृत लाइव-सेल इमेजिंग और माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म का वर्णन करता है जो उनकी आकृति विज्ञान, संरचना और कार्य में देशी आइलेट्स से मिलते जुलते हैं। ये स्यूडोआइलेट्स प्राथमिक मानव आइलेट कोशिकाओं के फैलाव और पुनर्एकत्रीकरण प्रक्रिया के माध्यम से आकार-नियंत्रित होते हैं। छितरी हुई अवस्था में, आइलेट सेल जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, बायोसेंसर जैसे आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीएएमपी बायोसेंसर, सीएडीडीआईएस, पेश किए जा सकते हैं। एक बार बनने के बाद, एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर को व्यक्त करने वाले स्यूडोआइलेट्स, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और एक माइक्रोपेरिफ्यूजन प्लेटफॉर्म के साथ संयोजन में, फ्लोरोसेंट बायोसेंसर डायनामिक्स और अल्फा और बीटा सेल हार्मोन स्रावी प्रोफाइल के तुल्यकालिक मूल्यांकन की अनुमति देते हैं ताकि सेलुलर प्रक्रियाओं और कार्य में अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सके।

Introduction

लैंगरहैंस के आइलेट्स अग्न्याशय में बिखरे हुए छोटे अंग हैं जिनका कार्य ग्लूकोज होमियोस्टैसिस के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है। ग्लूकोज के चयापचय, एटीपी / एडीपी अनुपात में वृद्धि, एटीपी-संवेदनशील पोटेशियम चैनलों के बंद होने, प्लाज्मा झिल्ली के विध्रुवण और बाह्य कैल्शियम1 की आमद के बाद बीटा कोशिकाओं से इंसुलिन स्रावित होता है। अल्फा कोशिकाओं से ग्लूकागन स्राव को कम समझा जाता है, लेकिन यह माना गया है कि इंट्रासेल्युलर और पैराक्राइन मार्ग ग्लूकागन ग्रेन्युल एक्सोसाइटोसिस 2,3,4 में योगदान करते हैं। टाइप 1 और टाइप 2 मधुमेह दोनों आइलेट सेल डिसफंक्शन 5,6,7 से जुड़े हैं। इसलिए, अग्नाशय ी आइलेट्स में शारीरिक और पैथोलॉजिकल तंत्र को समझने के लिए आइलेट हार्मोन स्राव की मध्यस्थता करने वाले इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्गों को स्पष्ट करना आवश्यक है।

आइलेट्स की गोलाकार वास्तुकला प्रयोग के लिए कुछ बाधाएं प्रस्तुत करती है। इन चुनौतियों में आइलेट आकार भिन्नता और आइलेट्स की 3 डी प्रकृति शामिल है, जो आइलेट कोर 8,9 के भीतर वायरल ट्रांसडक्शन को कम करती है। इन चुनौतियों को दूर करने के लिए, एक स्यूडोआइलेट प्रणाली विकसित की गई थी, जिसमें प्राथमिक मानव आइलेट्स को एकल कोशिकाओं में फैलाया जाता है, रुचि के एन्कोडिंग लक्ष्यों के साथ एडेनोवायरल रूप से ट्रांसड्यूस किया जाता है, और आकार-नियंत्रित, आइलेट जैसी संरचनाओं को बनाने के लिए पुन: एकत्रित किया जाता है जिसे स्यूडोआइलेट्स7 कहा जाता है। एक ही दाता से देशी आइलेट्स की तुलना में जिन्हें समानांतर में सुसंस्कृत किया गया है, ये स्यूडोआइलेट्स आकृति विज्ञान, अंतःस्रावी कोशिका संरचना और हार्मोन स्राव7 में समान हैं। यह विधि पूरे स्यूडोआइलेट में संरचनाओं की अभिव्यक्ति की अनुमति देती है, जिसका अर्थ है कि यह प्राथमिक मानव आइलेट्स 7,8,9 के समान आनुवंशिक हेरफेर के लिए पिछली बाधा को दूर करता है।

इस प्रोटोकॉल में, स्यूडोआइलेट प्रणाली को प्राथमिक मानव आइलेट कोशिकाओं में बायोसेंसर को व्यक्त करने और गतिशील पेरिफ्यूजन10,11,12 के दौरान स्यूडोइलेट हार्मोन स्राव के अस्थायी संकल्प को प्राप्त करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के साथ एकीकृत किया जाता है। स्यूडोआइलेट्स को एक माइक्रोचिप में रखा जाता है और एक पेरिस्टालिक पंप12 के माध्यम से विभिन्न स्रावकों के स्थिर प्रवाह के संपर्क में लाया जाता है। माइक्रोचिप में एक पारदर्शी ग्लास बॉटम होता है और बायोसेंसर फ्लोरेसेंस तीव्रता में परिवर्तन के माध्यम से इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग गतिशीलता को रिकॉर्ड करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर लगाया जाता है। बायोसेंसर इमेजिंग को इंसुलिन और ग्लूकागन स्राव के बाद के विश्लेषण के लिए माइक्रोपेरिफ्यूजन बहिस्त्राव के संग्रह के साथ सिंक्रनाइज़ कियाजाता है। मैक्रोपेरिफ्यूजन की तुलना में, यह माइक्रोपेरिफ्यूजन दृष्टिकोण मैक्रोपेरिफ्यूजन चैंबर7 की तुलना में माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की छोटी मात्रा के कारण कम स्यूडोआइलेट्स का उपयोग करने की अनुमति देता है।

इस प्रणाली की उपयोगिता का उपयोग करने के लिए, चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीएमपी) अंतर डिटेक्टर इन सीटू (सीएडीडीआईएस) बायोसेंसर को सीएमपी गतिशीलता और हार्मोन स्राव का आकलन करने के लिए मानव स्यूडोआइलेट्स में व्यक्त किया गया था। कैडिस बायोसेंसर एक गोलाकार हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीपीजीएफपी) से बना है, जो सीएमपी 2 (ईपीएसी 2) द्वारा सक्रिय एक्सचेंज प्रोटीन के हिंज क्षेत्र में स्थित है, जो इसके नियामक और उत्प्रेरक क्षेत्रों को जोड़ता है। ईपीएसी 2 के नियामक क्षेत्र में सीएमपी का बंधन हिंज क्षेत्र में एक संवहन परिवर्तन प्राप्त करता है जो सीपीजीएफपी13 से प्रतिदीप्ति बढ़ाता है। सीएमपी जैसे इंट्रासेल्युलर संदेशवाहक जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स14 के अपस्ट्रीम सक्रियण के बाद इंसुलिन और ग्लूकागन स्राव प्राप्त करते हैं। माइक्रोपेरिफ्यूजन के साथ युग्मित लाइव-सेल इमेजिंग आइलेट हार्मोन स्राव के साथ इंट्रासेल्युलर सीएमपी गतिशीलता को जोड़ने में मदद करता है। विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल में, विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए अल्फा और बीटा कोशिकाओं में सीएमपी प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए सीएडीआईएस-व्यक्त स्यूडोआइलेट्स उत्पन्न होते हैं: कम ग्लूकोज (2 एमएम ग्लूकोज; जी 2), उच्च ग्लूकोज प्लस आइसोब्यूटिलमिथाइलक्सैंथिन (आईबीएमएक्स; 20 एमएम ग्लूकोज + 100 μM IBMX; जी 20 + आईबीएमएक्स), और कम ग्लूकोज प्लस एपिनेफ्रीन (एपि; 2 एमएम ग्लूकोज + 1 μM एपि; जी 2 + एपि)। यह उपचार वर्कफ़्लो सीधे इंट्रासेल्युलर सीएमपी गतिशीलता के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है 1) आईबीएमएक्स-मध्यस्थता फॉस्फोडिएस्टरेज़ निषेध, जो इसके क्षरण को रोककर इंट्रासेल्युलर सीएमपी स्तर को बढ़ाता है, और 2) एपिनेफ्रीन, अल्फा सेल ग्लूकागन स्राव का एक ज्ञात सीएमपी-निर्भर उत्तेजक β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर सक्रियण द्वारा मध्यस्थता की जाती है। लाइव-सेल इमेजिंग प्रयोगों के लिए माइक्रोपेरिफ्यूजन उपकरण स्थापित करने के चरण, माइक्रोचिप में स्यूडोआइलेट्स की लोडिंग, सिंक्रोनस लाइव-सेल इमेजिंग और माइक्रोपेरिफ्यूजन, और माइक्रोप्लेट-आधारित हार्मोन परख द्वारा बायोसेंसर निशान और हार्मोन स्राव का विश्लेषण नीचे विस्तृत है।

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Protocol

मानव आइलेट्स (एन = 4 तैयारी) एकीकृत आइलेट वितरण कार्यक्रम, मानव अग्न्याशय विश्लेषण कार्यक्रम, प्रोडो प्रयोगशालाओं, इंक और इमेजिन फार्मा के साथ साझेदारी के माध्यम से प्राप्त किए गए थे। वेंडरबिल्ट यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड मानव विषयों के अनुसंधान के रूप में अज्ञात मानव अग्नाशय के नमूनों पर विचार नहीं करता है। यह काम अंग दाताओं, उनके परिवारों और अंग खरीद संगठनों के बिना संभव नहीं होगा। दाता जनसांख्यिकीय जानकारी के लिए तालिका 1 देखें। मधुमेह के बिना अग्न्याशय दाताओं से मानव आइलेट्स को ठंड इस्किमिया समय के 15 घंटे से कम के साथ अलग किया गया था।

1. स्यूडोआइलेट गठन (वॉकर एट अल में विस्तृत)।7)

  1. पी 200 पिपेट और बेंचटॉप माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राथमिक मानव आइलेट प्राप्त करें और हाथ से चुनें, आइलेट कल्चर माध्यम के बाहर किसी भी सतह पर पिपेट टिप को दूषित न करने पर पूरा ध्यान दें (10% एफबीएस, 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, 100 U / mL पेनिसिलिन, सीएमआरएल 1066 में 2 mM L-ग्लूटामाइन)।
  2. प्राथमिक आइलेट्स को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और संदूषण को रोकने के लिए ऊतक संस्कृति हुड के तहत निम्नलिखित सभी स्यूडोआइलेट गठन चरणों का प्रदर्शन करें। धीरे-धीरे कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए प्राथमिक आइलेट्स को 0.025% ट्रिप्सिन में पी 1000 पिपेट के साथ अलग करें। समाधान अपारदर्शी हो जाएगा क्योंकि आइलेट्स अलग होने लगते हैं।
    1. इन अध्ययनों के लिए, लगभग 200 μm के व्यास के साथ 200-300 हाथ से चुने गए प्राथमिक आइलेट्स 0.025% ट्रिप्सिन के 500 μL में फैले हुए हैं, जो स्यूडोआइलेट्स की एक से दो 96-वेल प्लेटों का उत्पादन करते हैं; औसत आइलेट आकार और व्यवहार्यता के आधार पर सटीक संख्या भिन्न हो सकती है। >500 प्राथमिक आइलेट्स के लिए, 1: 1 अनुपात में उपयोग किए जाने वाले 0.025% ट्रिप्सिन की मात्रा को स्केल करें (उदाहरण के लिए, 600 हाथ से चुने गए आइलेट्स के लिए 0.025% ट्रिप्सिन का 600 μL)।
  3. उपयोग किए गए ट्रिप्सिन की मात्रा के बराबर वेंडरबिल्ट स्यूडोइसलेट मीडिया (वीपीएम) की मात्रा जोड़कर फैलाव को बुझाएं। फिर, 1 एमएल वीपीएम के साथ दो बार धो लें। धोने के लिए, एक बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 मिनट के लिए 485 x g पर बिखरी हुई कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। गिनती के लिए वीपीएम (आमतौर पर 1 एमएल) की परिभाषित मात्रा में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    नोट: स्यूडोआइलेट पीढ़ी और वीपीएम संरचना एक पूर्व प्रकाशन7 में विस्तृत हैं। संक्षेप में, वीपीएम में समृद्ध-सीएमआरएल मीडिया (20% एफबीएस, 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, 100 U / mL पेनिसिलिन, 1 mM सोडियम पाइरूवेट, 2 mM ग्लूटामैक्स, CMRL 1066 में 2 mM HEPES) और iEC-मीडिया (वीईजीएफ मीडियम कम्प्लीट किट माइनस एफबीएस + एंडोथेलियल सेल मीडियम सप्लीमेंट की 1 बोतल) की बराबर मात्रा होती है। स्यूडोआइलेट पीढ़ी का एक सारांश योजनाबद्ध चित्र 1 ए में शामिल है।
  4. सेल निलंबन के 10 μL के साथ Trypan Blue के 10 μL के संयोजन से एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल गिनती और व्यवहार्यता निर्धारित करें। एक सटीक सेल गिनती सुनिश्चित करने के लिए सेल सस्पेंशन को अच्छी तरह से मिलाएं।
  5. स्यूडोआइलेट्स की वांछित संख्या के लिए आवश्यक सेल सस्पेंशन, वायरस और वीपीएम की मात्रा की गणना करें। चरण 1.4 में प्राप्त लाइव सेल गिनती पर सभी गणनाओं को आधार बनाएं।
    1. इन अध्ययनों के लिए, एमओआई 500 (एन = 1) या 1,000 (एन = 2) पर ट्रांसड्यूस मानव आइलेट कोशिकाओं को एडी-सीएमवी-सीएडीडी के साथ 500 μL की कुल मात्रा में ट्रांसड्यूस किया गया। ट्रांसड्यूस्ड स्यूडोआइलेट्स (2,000 कोशिकाओं / स्यूडोआइलेट) की एक प्लेट प्रति दाता तीन तकनीकी प्रतिकृतियां (32 स्यूडोआइलेट्स / प्रयोग) उत्पन्न करती है। इस काम में एडेनोवायरस व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया था।
  6. सेल सस्पेंशन, वायरस और वीपीएम की गणना की गई मात्रा को 1.5 एमएल ट्यूब में मिलाएं। धीरे-धीरे सामग्री को ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
  7. पारगमन के दौरान, ट्यूबों को खुली टोपी के साथ इनक्यूबेट करें, और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2/95% हवा पर ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में2 घंटे के लिए बाँझ पेट्री डिश के साथ कवर करें।
  8. प्रत्येक ट्यूब में वीपीएम के 500 μL जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 500 x g पर उन्हें सेंट्रीफ्यूज करके कोशिकाओं को धोएं। कुल तीन धोने के लिए दो और धोने को पूरा करें। सतह पर तैरने वाला एस्पिरेट करें, और वीपीएम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  9. कुल सेल सीडिंग वॉल्यूम (200 μL/ स्यूडोइसलेट) की गणना करें। उचित आकार के शंक्वाकार ट्यूब में वीपीएम (गणना की गई सेल सीडिंग वॉल्यूम माइनस 2 एमएल) जोड़ें। शंक्वाकार ट्यूब में चरण 1.7 से ट्रांसड्यूस्ड सेल निलंबन जोड़ें। शंक्वाकार ट्यूब को थोड़ा बंद रखें लेकिन कोशिकाओं के लिए हवा के आदान-प्रदान की अनुमति देने के लिए कसकर बंद न करें।
  10. 1.5 एमएल ट्यूब (चरण 1.7 से) को 1 एमएल वीपीएम के साथ कुल्ला करें, और सामग्री को शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें, जिस बिंदु पर शंक्वाकार ट्यूब में कुल सेल सीडिंग वॉल्यूम होना चाहिए।
  11. शंक्वाकार ट्यूब की सामग्री को एक मोटरचालित सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं, और फिर सामग्री को बाँझ अभिकर्मक जलाशय में स्थानांतरित करें। यदि जलाशय पूरे सेल सीडिंग वॉल्यूम को नहीं रखता है, तो सीरियल ट्रांसफर करें, और सुनिश्चित करें कि निलंबन प्रत्येक चरण में अच्छी तरह से मिश्रित है।
  12. मल्टीचैनल पी 200 पिपेट का उपयोग करके, समरूपता सुनिश्चित करने के लिए अभिकर्मक जलाशय में सेल निलंबन को 3-4 बार ऊपर और नीचे पाइप करें, और फिर माइक्रोवेल प्लेटों के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 200 μL को पाइप करें।
  13. स्यूडोआइलेट्स को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2/95% हवा में 37 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम परिवर्तन के बिना 6 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें। दिन 6 तक, स्यूडोआइलेट्स पूरी तरह से गठित और प्रयोगों के लिए तैयार होना चाहिए (चित्रा 1 बी-डी)।

2. लाइव-सेल इमेजिंग और माइक्रोपेरिफ्यूजन के लिए तैयारी (प्रयोग से 1 दिन पहले)

नोट: माइक्रोपेरिफ्यूजन माध्यम तैयारी पर जानकारी protocols.io संसाधन (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html) के माध्यम से उपलब्ध है।

  1. 96-वेल प्लेट से बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करके मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके स्यूडोआइलेट्स की कटाई करें। फिर, स्यूडोआइलेट्स को हाथ से चुनें, और उन्हें ताजा वीपीएम युक्त एक और बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। स्यूडोआइलेट्स को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2/95% हवा में रात भर एक ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
  2. 1 ग्राम बीएसए (रेडियोइम्यूनोसे-ग्रेड), 0.11 ग्राम सोडियम पाइरूवेट, 0.58 ग्राम एल-ग्लूटामाइन, 3.2 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट, 1.11 ग्राम एचईपीईएस और डीएमईएम की 1 बोतल को 1 लीटर अल्ट्रा-शुद्ध पानी में जोड़कर डीएमईएम का 1 एल तैयार करें। डीएमईएम में 1 एम ग्लूकोज स्टॉक समाधान तैयार करें। दोनों घोल ों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. प्रयोग से एक दिन पहले माइक्रोपेरिफ्यूजन सिस्टम के प्रवाह की जांच करें। सभी ट्यूबिंग को एक खाली माइक्रोचिप वाले चिप धारक से कनेक्ट करें, जैसा कि चित्रा 2 ए-बी में उल्लिखित है। अंश कलेक्टर पर 100 μL/min की प्रवाह दर की पुष्टि करने के लिए बहिस्त्राव के रूप में अति-शुद्ध पानी का उपयोग करें।

3. डीएमईएम (प्रयोग का दिन) में स्रावकों को जोड़ना

  1. डीएमईएम में 0.07 मिलीग्राम / एमएल एस्कॉर्बेट जोड़ें, और ग्लूकोज युक्त बफर के लिए 1 एम ग्लूकोज स्टॉक का उपयोग करके डीएमईएम + एस्कॉर्बेट बफर में स्रावक तैयार करें।
    नोट: एस्कॉर्बेट का उपयोग इसके ऑक्सीकरण को रोककर एपिनेफ्रीन को स्थिर करने के लिए किया जाता है। यदि एपिनेफ्रीन का उपयोग नहीं किया जा रहा है, तो एस्कॉर्बेट को डीएमईएम से छोड़ा जा सकता है।
  2. हर बार एक ताजा फिल्टर का उपयोग करके, 0.22 μm पोर फ़िल्टर के माध्यम से स्रावकों को दो बार फ़िल्टर करें। समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, और वांछित एकाग्रता की पुष्टि करने के लिए ग्लूकोमीटर के माध्यम से ग्लूकोज को मापें।

4. माइक्रोपेरिफ्यूजन उपकरण सेटअप

  1. एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के पर्यावरण कक्ष को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सभी दरवाजे बंद हैं और कक्ष एक स्थिर तापमान बनाए रखता है। गर्म होने के लिए कक्ष में माइक्रोचिप युक्त चिप धारक रखें। एक इन्फ्रारेड बंदूक के साथ चिप तापमान की पुष्टि करें।
    नोट: इस मामले में, पर्यावरण कक्ष 38.5 डिग्री सेल्सियस पर सेट है, जो चिप को 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने की अनुमति देता है।
  2. सभी ट्यूबिंग को चिप धारक से कनेक्ट करें (जैसा कि चित्रा 2 ए-बी में उल्लिखित है)। 5 मिनट के लिए बेसलाइन सेक्रेटेगॉग के साथ फ्लश-लाइन। इस अध्ययन में, लाइन को 2 एमएम ग्लूकोज (जी 2) के साथ फ्लश किया गया था। हर 8-10 प्रयोगों में डी-बबलर के बुलबुला जाल झिल्ली को बदलें।

5. माइक्रोचिप में स्यूडोआइलेट्स लोड करना

  1. माइक्रोचिप लोड करने से पहले, स्यूडोआइलेट्स की एक उज्ज्वल क्षेत्र और डार्कफील्ड छवि (10x आवर्धन) लें जिसका उपयोग आइलेट समकक्षों (आईईक्यू) के बाद के परिमाणीकरण के लिए प्रयोग में किया जाएगा।
    नोट: प्रयोगों में आइलेट संख्या में भिन्नता के लिए हार्मोन स्राव को सामान्य करने के लिए आईईक्यू का उपयोग किया जाता है। यह चरण प्रयोग से एक दिन पहले भी किया जा सकता है।
  2. माइक्रोचिप के नीचे और शीर्ष हिस्सों से किसी भी अतिरिक्त तरल पदार्थ को एस्पिरेट करें। माइक्रोचिप के शीर्ष आधे हिस्से में गैसकेट होते हैं जो प्रत्येक कुएं की पर्याप्त सील सुनिश्चित करते हैं, जबकि माइक्रोचिप के निचले आधे हिस्से में ग्लास कवरस्लिप के साथ कुएं होते हैं। डीएमईएम के 5 μL के साथ माइक्रोचिप में एक अच्छी तरह से गीला करें। दरारों को गीला करने के लिए कुएं के बाहरी किनारों के चारों ओर पाइप करना सुनिश्चित करें।
  3. 23 μL वॉल्यूम में 30-32 स्यूडोआइलेट्स इकट्ठा करने के लिए एक पूर्व-गीले पिपेट का उपयोग करें, और धीरे-धीरे माइक्रोचिप के निचले टुकड़े में कुएं के केंद्र में स्यूडोआइलेट्स को वितरित करें। किसी भी स्यूडोआइलेट्स के लिए पिपेट की नोक की जांच करें जो संलग्न हो सकता है।
  4. कुएं के केंद्र में स्यूडोआइलेट्स को धीरे से पैंतरेबाज़ी करने के लिए जेल लोडिंग टिप का उपयोग करें। यह सुनिश्चित करता है कि दृश्य के क्षेत्र में स्यूडोआइलेट्स की अधिकतम संख्या कैप्चर की जाएगी।
  5. स्टीरियोस्कोप पर माइक्रोचिप में स्यूडोआइलेट्स की एक छवि लें। इस गणना का उपयोग इस प्रक्रिया के दौरान किसी भी स्यूडोआइलेट हानि के लिए गणना किए गए आईईक्यू को समायोजित करने के लिए किया जाएगा।
    1. यदि चरण 5.3 से सभी स्यूडोआइलेट्स माइक्रोचिप में लोड नहीं किए गए हैं, तो तदनुसार आईईक्यू को समायोजित करें। उदाहरण के लिए, यदि 30 स्यूडोआइलेट्स अब विज़ुअलाइज़ किए गए हैं, लेकिन चरण 5.1 में 32 की कल्पना की गई थी, तो चरण 5.1 से छवियों पर आईईक्यू की गणना करें और फिर 30/32 से गुणा करें।
  6. माइक्रोचिप के निचले हिस्से को माइक्रोचिप धारक में रखें। ध्यान से माइक्रोचिप के शीर्ष को हरे रंग के गैसकेट साइड के साथ नीचे रखें।
  7. माइक्रोचिप को पकड़ते समय, माइक्रोचिप को एक साथ दबाने के लिए माइक्रोचिप धारक को धीरे से बंद करें। इस प्रक्रिया के दौरान माइक्रोचिप पर अत्यधिक दबाव लागू करने की कोशिश न करें, क्योंकि ऐसा करने से कुएं में निहित तरल पदार्थ विस्थापित हो जाएगा और स्यूडोआइलेट हानि हो सकती है। कुएं में हवा के बुलबुले डालने से बचें।

6. सिंक्रोनस लाइव-सेल इमेजिंग और माइक्रोपेरिफ्यूज़न

  1. धारक में स्राव, पंप और माइक्रोचिप को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में फिट किए गए पर्यावरण कक्ष में स्थानांतरित करें। एफ्लक्स ट्यूबिंग को कक्ष से बाहर अंश कलेक्टर तक निर्देशित करें।
    1. बफर को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में रखें, जिसमें उनके कैप में छेद किया गया हो। ये छेद संग्रह ट्यूबिंग को ट्यूब से बाहर निकलने से रोकते हैं।
    2. डी-बबलर में टयूबिंग को पेंच करते समय, अखरोट और फेररूल को अलग करें, और फिर डी-बबलर में पेंच करें। यह लाइन के घुमाव को रोकता है।
  2. अंश कलेक्टर को हर 2 मिनट में घुमाने के लिए सेट करें। ट्यूबों की उचित संख्या को अंश कलेक्टर में लोड करें, धोने और प्रयोगात्मक अंशों के लिए लेखांकन। इन प्रयोगों के लिए, 15 वॉश ट्यूब (30 मिनट कुल धुलाई) और अंश संग्रह के लिए 28 ट्यूबों का उपयोग किया गया था।
  3. 100 μL/min पर बेसलाइन माध्यम (बेसलाइन ग्लूकोज एकाग्रता युक्त) देने के लिए पंप शुरू करें (100 μL/min प्रवाह दर पर 2 मिनट संग्रह के परिणामस्वरूप प्रत्येक अंश ट्यूब में 200 μL प्रवाह होता है)। इस प्रवाह दर को स्यूडोआइलेट्स पर सरासर तनाव को सीमित करने और लाइव इमेजिंग के दौरान महत्वपूर्ण स्यूडोआइलेट आंदोलन को रोकने के लिए चुना गया था।
    1. जब तरल पदार्थ उपकरण के माध्यम से चल रहा है, तो निम्नलिखित के लिए देखें:
      1. अंश कलेक्टर स्पाउट के अंत में बूंदों को देखें, जो सिस्टम के माध्यम से प्रवाह का संकेत देते हैं।
      2. सिस्टम से एफ्लक्स में कमी के लिए देखें; यदि संग्रह ट्यूबों में <200 μL है, तो यह इंगित करता है कि सिस्टम में रुकावट या रिसाव हो सकता है। बहिस्त्राव की मात्रा में कमी के संभावित कारणों, समाधानों और रोकथाम युक्तियों की सूची के लिए तालिका 2 देखें।
  4. एक बार जब एफ्लक्स ट्यूबिंग से एक स्थिर मध्यम प्रवाह होता है, तो ट्यूबों में वितरित करने के लिए अंश कलेक्टर हेड को घुमाएं, और अंश कलेक्टर शुरू करें। पहले 15 अंशों (30 मिनट) को धोने के रूप में इकट्ठा करें ताकि स्यूडोआइलेट्स को समतुल्य करने की अनुमति मिल सके। सिस्टम के माध्यम से निरंतर और सटीक माध्यम प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए इन पहले 15 अंशों का उपयोग करें। बाद में इन अंशों को त्याग दें।
  5. 30 मिनट धोने के दौरान, इन मापदंडों के अनुसार लाइव-सेल इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप स्थापित करें: उद्देश्य लेंस: यू प्लान फ्लोराइट 20 एक्स 1एक्स ज़ूम के साथ; प्रतिदीप्ति चैनल: ईजीएफपी (उत्सर्जन = 510 एनएम, लेजर तरंग दैर्ध्य = 488, पहचान तरंग दैर्ध्य = 500-600 एनएम); समय श्रृंखला: प्रयोग की संपूर्णता के लिए हर 2 सेकंड में प्राप्त छवि (यानी, 56 मिनट); नमूना गति: 2 μs /
    1. दृश्य के क्षेत्र में स्यूडोआइलेट्स के तल की पहचान करें और फोकल प्लेन को इस स्थिति से 15 μm ऊपर समायोजित करें। यह वह फ्रेम है जिसका उपयोग इमेजिंग प्रयोग के दौरान किया जाएगा।
  6. एक बार 30 मिनट धोने के बाद, अंश संग्रह और छवि अधिग्रहण शुरू करें।
    नोट: इस कदम से पहले किसी भी समस्या को पहचानने और सही करने के लिए सभी प्रयास किए जाने चाहिए। एक बार डेटा संग्रह शुरू होने के बाद, प्रयोग में कोई भी ठहराव या स्रावके अतिरिक्त संपर्क परिणामों पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकता है।
  7. पहले बेसलाइन संग्रह की अवधि के लिए बेसलाइन माध्यम के साथ स्यूडोआइलेट्स को पेरिफ्यूज करना जारी रखें, अपशिष्ट को 1.5 एमएल ट्यूबों में इकट्ठा करें। प्रयोग के लिए उपयुक्त समय होने पर ट्यूबिंग को हाथ से बेसलाइन बफर से नए स्टिमुलस बफर ट्यूब में स्विच करें।
    1. एक मानक माइक्रोपेरिफ्यूजन अनुक्रम तालिका 3 में दिखाया गया है।
    2. ~ 10 अंशों को इकट्ठा करने के बाद, हार्मोन, विशेष रूप से ग्लूकागन के क्षरण को रोकने के लिए प्रयोग के अंत तक सभी अंशों को 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रखें।
    3. प्रत्येक ट्यूब में बहिस्त्राव की मात्रा की जांच करके पूरे प्रयोग में सिस्टम प्रवाह की निगरानी करना जारी रखें।
  8. जब प्रयोग पूरा हो जाता है, तो बेसलाइन माध्यम पर वापस स्विच करें, और पंप को बेसलाइन माध्यम (इस मामले में, 2 एमएम ग्लूकोज) के साथ उत्तेजना को धोने के लिए 5 मिनट तक चलने की अनुमति दें।
  9. पंप को रोकें, और पर्यावरण कक्ष से माइक्रोचिप धारक को हटाने के लिए डी-बबलर और अंश कलेक्टर पर माइक्रोचिप धारक ट्यूबिंग को डिस्कनेक्ट करें। तापमान बनाए रखने के लिए माइक्रोचिप को हटाने के बाद सभी दरवाजे बंद कर दें।
  10. बाद के हार्मोन विश्लेषण के लिए पेरिफ्यूसेट को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. स्यूडोआइलेट एसिड इथेनॉल निष्कर्षण

  1. माइक्रोचिप धारक को ध्यान से खोलें और माइक्रोचिप के शीर्ष से उठाएं। कुएं से स्यूडोआइलेट्स लेने और उन्हें 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट और बेंचटॉप माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो तो बेंचटॉप माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सभी स्यूडोआइलेट्स का संग्रह सुनिश्चित करें।
    1. आइलेट एक्सट्रैक्ट आईईक्यू को समायोजित करने के लिए कुएं से हटाने से पहले माइक्रोचिप में स्यूडोआइलेट्स की अंतिम छवि लें, जैसा कि चरण 5.5 में है।
  2. पीबीएस के 500 μL के साथ दो बार धोएं। प्रत्येक धोने के बीच 94 x g पर 1 मिनट के लिए स्यूडोआइलेट्स को घुमाएं, और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  3. अंतिम धोने के बाद, 200 μL एसिड इथेनॉल (95% इथेनॉल का 5.5 एमएल + 12 एन एचसीएल का 50 μL) जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. अगले दिन, अर्क को 10 मिनट के लिए 15,989 x g और 4 °C पर स्पिन करें। एलिकोट 45 μL तीन नए ट्यूबों में। हार्मोन सामग्री विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। आईईक्यू में हार्मोन स्राव को सामान्य करने के विकल्प के रूप में, हार्मोन स्राव को अर्क से मापा जाने वाले स्यूडोइसलेट हार्मोन सामग्री के लिए भी सामान्यीकृत किया जा सकता है।

8. अतिरिक्त प्रयोग और सफाई

  1. अतिरिक्त तकनीकी प्रतिकृतियां प्राप्त करने के लिए स्यूडोआइलेट्स के बाद के समूहों के साथ चरण 5-7 दोहराएं।
  2. सभी माइक्रोपेरिफ्यूजन प्रयोगों को पूरा करने के बाद, माइक्रोचिप और टयूबिंग के माध्यम से 5 मिनट के लिए 10% ब्लीच चलाएं और फिर ट्यूबिंग को साफ करने के लिए 30 मिनट के लिए अल्ट्रा-शुद्ध पानी चलाएं।

9. डेटा विश्लेषण

नोट: लाइव-सेल इमेजिंग एक लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया गया था। माइक्रोस्कोप से जुड़े इमेजिंग सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करके छवियों का विश्लेषण किया गया था। निम्नलिखित सामान्य दिशानिर्देश हैं लेकिन माइक्रोस्कोप निर्माता और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।

  1. डेटा सामान्यीकरण के लिए कुल आइलेट समकक्ष (IEQ) का निर्धारण
    1. सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम खोलें, और विंडो के शीर्ष दाईं ओर अधिग्रहण टैब पर क्लिक करें। मैक्रो मैनेजर (टूल विंडोज > मैक्रो मैनेजर देखें) में बैच बर्न इन फ़ंक्शन का चयन करके सभी डार्क फील्ड छवियों > बैच-बर्न करें।
      1. एक बार में कई छवियों को जलाने के लिए, मैक्रो मैनेजर के भीतर रन बटन पर क्लिक करने से पहले टॉगल बैच मोड बटन पर क्लिक करें। जली हुई छवियों के लिए स्रोत छवि स्थान और गंतव्य स्थान का चयन करने के लिए ऑन-स्क्रीन निर्देशों का पालन करें। छवि फ़ाइल प्रकार के लिए, टैग की गई कल्पना फ़ाइल स्वरूप (*.tif) चुनें.
    2. IEQ माप के लिए, चरण 5.1 में ली गई 10x डार्कफील्ड छवि का जला हुआ संस्करण खोलें। शीर्ष पर गणना और माप टैब पर क्लिक करें, और बाईं ओर मैनुअल एचएसवी थ्रेशोल्ड बटन चुनें।
      1. सकारात्मक क्षेत्र (लाल रंग में) को जोड़ने / हटाने के लिए ड्रॉपर फ़ंक्शन का उपयोग करें जब तक कि प्रत्येक स्यूडोआइलेट को लाल रंग में हाइलाइट नहीं किया जाता है, स्यूडोआइलेट सीमा से आगे बढ़ाए बिना। गिनती और माप पर क्लिक करें।
    3. एक साथ जुड़े स्यूडोआइलेट्स को विभाजित करने के लिए ऑटो-स्प्लिट या मैनुअल-स्प्लिट फ़ंक्शंस का उपयोग करें।
      1. स्यूडोआइलेट्स को मैन्युअल रूप से विभाजित करने के लिए, मैनुअल-स्प्लिट फ़ंक्शन चुनें, स्यूडोआइलेट्स को अलग करने वाली रेखा खींचने के लिए बाएं-क्लिक करें, और फिर लाइन को पूरा करने के लिए राइट-क्लिक करें। ऑटो-स्प्लिट करने के लिए, ऑटो-स्प्लिट फ़ंक्शन चुनें, और रुचि के समूहीकृत स्यूडोआइलेट्स पर क्लिक करें। बाद में सही ऑटो-विभाजन की पुष्टि करें।
    4. बैच-जली हुई छवियों में, स्केल बार और आवर्धन पाठ को सकारात्मक के रूप में चिह्नित किया जा सकता है। माउस का उपयोग करके पाठ और स्केल बार को हाइलाइट करके और कीबोर्ड हटाएं कुंजी दबाकर सटीक गणना के लिए इन ऑब्जेक्ट्स को हटाएं ।
    5. यह पुष्टि करने के लिए फ़िल्टर को चालू और बंद करें कि सभी स्यूडोआइलेट्स की गिनती की जा रही है। फ़ाइल को क्रॉस-संदर्भित करने के लिए प्रोग्राम के बाहर भी खोला जा सकता है। समाप्त होने पर, Excel में निर्यात करें पर क्लिक करें.
    6. स्प्रेडशीट खोलें, और इसे निम्नानुसार संशोधित करें।
      1. नीचे दी गई जानकारी की गिनती, माध्य और सॉर्ट हटाएँ. वस्तुओं को उनके माध्य व्यास के आधार पर क्रमबद्ध करें। माध्य व्यास के बाद एक स्तंभ सम्मिलित करें, और स्तंभ को "स्यूडोइसलेट गिनती" नाम दें।
      2. आइलेट गिनती औसत व्यास के साथ स्यूडोआइलेट्स की संख्या से निर्धारित होती है जो नीचे दिए गए प्रत्येक सूचकांक के भीतर आती है। संबंधित आईईक्यू रूपांतरण कारक द्वारा प्रति सूचकांक स्यूडोआइलेट्स की संख्या को गुणा करें, और कुल आईईक्यू निर्धारित करने के लिए इन मानों को योग करें। प्रत्येक प्रयोग से पहले प्राप्त छवियों पर आईईक्यू गणना करें। निम्न अनुक्रमणिका और IEQ रूपांतरण कारकों का उपयोग करें:
        1-49 μm: × 0.167
        50-100 μm: × 0.667
        101-150 μm: × 1.685
        151-200 μm: × 3.500
        201-300 μm: × 6.315
        301-350 μm: × 10.352
      3. आईईक्यू गणना निर्धारित करने के लिए एक उदाहरण स्प्रेडशीट के लिए, पूरक फ़ाइल 1 देखें।
  2. सॉफ्टवेयर में लाइव-सेल इमेजिंग परिमाणीकरण
    1. CellSens में वांछित फ़ाइल (.oir) खोलें।
    2. रुचि के क्षेत्रों (आरओआई) को निम्नानुसार नामित करें।
      1. आरओआई (यानी, प्रत्येक स्यूडोआइलेट) को नामित करने के लिए ड्राइंग टूल का उपयोग करें। यदि फ्रीहैंड आरेखण विकल्प का उपयोग कर रहे हैं, तो आकृति को बंद करने के लिए राइट-क्लिक करें.
      2. तीर हाथ का उपयोग करके सभी आरओआई को हाइलाइट करें और छवि में सभी आरओआई को शामिल करने के लिए इसे खींचें। सभी ROI हाइलाइट किए जाने के साथ, राइट-क्लिक करें, और समय के साथ डायनामिक ROI में कनवर्ट करें का चयन करें
      3. यह पुष्टि करने के लिए XYT फ़ाइल चलाएँ कि ROI समय के साथ सटीक हैं। यदि आरओआई किसी विशिष्ट अवधि में सटीक नहीं है, तो उस अवधि में इसके आकार / स्थान को सही करें। सॉफ्टवेयर धीरे-धीरे इन परिवर्तनों से मेल खाने के लिए समय के साथ आरओआई के आकार / स्थान को समायोजित करेगा। इन चरणों को तब तक दोहराएं जब तक कि इमेजिंग प्रयोग के दौरान आरओआई सटीक न हो।
    3. प्रत्येक आरओआई पर तीव्रता माप निम्नानुसार करें।
      1. टूलबार में, तीव्रता प्रोफ़ाइल मापें पर क्लिक करें। विश्लेषण करने के लिए आरओआई को हाइलाइट करें; एकाधिक आरओआई का चयन करने के लिए शिफ्ट + क्लिक का उपयोग करें।
        नोट: जबकि सॉफ्टवेयर में एक समय में कई फाइलें खुली हो सकती हैं, एक समय में केवल एक फ़ाइल से आरओआई का विश्लेषण करें।
      2. पृष्ठभूमि शोर के लिए, प्रत्येक तीव्रता मान से घटाने के लिए एक स्थिर मान का चयन करें, या एक ROI को पृष्ठभूमि के रूप में नामित करें। निष्पादित करें पर क्लिक करें।
      3. तीव्रता प्रोफ़ाइल टूलबार के भीतर, डेटा निर्यात करने के लिए Excel में निर्यात करें पर क्लिक करें.
      4. सभी डेटा बिंदुओं को 7-8 मिनट (यानी, पहले बेसलाइन मीडियम पेरिफ्यूजन के अंतिम मिनट) से मापी गई तीव्रता के औसत पर सामान्य करें। प्रत्येक समय बिंदु पर इन सामान्यीकृत मानों को सापेक्ष सीएडीडीआईएस तीव्रता के रूप में परिभाषित किया जाता है। इमेजिंग डेटा विश्लेषण और सामान्यीकरण के एक उदाहरण स्प्रेडशीट के लिए, पूरक फ़ाइल 2 देखें।
  3. प्रत्येक अंश और आइलेट अर्क में हार्मोन स्राव को मापें। इन प्रयोगों में, एलिसा द्वारा इंसुलिन और ग्लूकागन सांद्रता को मापा गया था। चरण 9.1 में निर्धारित आईईक्यू माप का उपयोग करके या अर्क हार्मोन सामग्री द्वारा स्यूडोआइलेट वॉल्यूम के प्रत्येक अंश में हार्मोन स्राव को सामान्य करें।

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Representative Results

बायोसेंसर-व्यक्त करने वाले मानव स्यूडोआइलेट्स को सीएमपी बायोसेंसर सीएडीडीआईएस (चित्रा 1 ए) को एन्कोडिंग करने वाले निर्माणों के एडेनोवायरल वितरण के माध्यम से बनाया गया था। चित्रा 1 बी समय के साथ ट्रांसड्यूस ्ड मानव आइलेट कोशिकाओं के पुनर्एकत्रीकरण को दर्शाता है, जिसमें संस्कृति के 6 दिनों के बाद पूरी तरह से गठित स्यूडोआइलेट्स देखे जाते हैं। कोशिकाओं ने 48 घंटे के भीतर दृश्यमान कैडिस फ्लोरेसेंस दिखाना शुरू कर दिया, और संस्कृति अवधि के अंत तक ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं में उच्च बायोसेंसर अभिव्यक्ति थी। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, स्यूडोआइलेट्स ने अल्फा कोशिकाओं में 60% और बीटा कोशिकाओं में 95% की औसत पारगमन दक्षता प्रदर्शित की (चित्रा 1 सी-डी)।

एकीकृत माइक्रोफ्लुइडिक और लाइव-सेल इमेजिंग प्लेटफॉर्म को चित्रा 2 में हाइलाइट किया गया है। कैडिस-व्यक्त स्यूडोआइलेट्स की कटाई के बाद और उन्हें रात भर ताजा माध्यम में इनक्यूबेट करने की अनुमति देने के बाद, स्यूडोआइलेट्स को एक माइक्रोचिप पर पूर्व-गीले कुएं के केंद्र में लोड किया गया था। माइक्रोचिप को तब एक धारक में दबाया गया और एक माइक्रोस्कोप मंच पर रखा गया। माइक्रोस्कोप से जुड़े पर्यावरण कक्ष के अंदर, जिसे 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था, स्यूडोआइलेट्स को अल्फा और बीटा सेल स्राववाले मीडिया के साथ जोड़ा गया था, जिन्हें सिस्टम में हवा के बुलबुले की शुरूआत को रोकने के लिए डी-बबलर के माध्यम से पंप किया गया था। माइक्रोचिप में स्यूडोआइलेट्स को 100 μL / min की प्रवाह दर पर परिचालित किया गया था, और प्रवाह को एक अंश कलेक्टर (चित्रा 2 ए-बी) के माध्यम से 2 मिनट के अंतराल पर एकत्र किया गया था। माइक्रोचिप का ग्लास बॉटम अच्छी तरह से एक क्षेत्र में कई स्यूडोआइलेट्स की सीएडीडीआईएस फ्लोरेसेंस तीव्रता को कैप्चर करने की अनुमति देता है, जो बाद के विश्लेषण के लिए आवश्यक है (चित्रा 2 सी)।

चित्रा 3 मधुमेह के बिना तीन मानव दाताओं से अलग किए गए देशी आइलेट्स से उत्पन्न सीएडीआईएस-व्यक्त स्यूडोआइलेट्स के साथ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है। सीएडीडीआईएस-व्यक्त करने वाले स्यूडोआइलेट्स को 2 एमएम ग्लूकोज (जी 2), 20 एमएम ग्लूकोज और फॉस्फोडिएस्टरेज़ इनहिबिटर आइसोबुटिलमिथाइलक्सैंथिन (आईबीएमएक्स) के साथ जोड़ा गया था। जी 20 + आईबीएमएक्स), और 2 एमएम ग्लूकोज प्लस एपिनेफ्रीन (जी 2 + एपि)। यह प्रोटोकॉल ज्ञात इंट्रासेल्युलर मार्गों को प्राप्त करता है जो अल्फा और बीटा कोशिकाओं (चित्रा 3 ए-बी) के भीतर सीएमपी को बढ़ाते हैं। माइक्रोपेरिफ्यूजन सेटअप सीएडीडीआईएस फ्लोरेसेंस और हार्मोन स्राव (चित्रा 3 सी-ई) के माध्यम से इंट्रासेल्युलर सीएमपी गतिशीलता के तुल्यकालिक संग्रह की सुविधा प्रदान करता है। प्रयोगात्मक कठोरता सुनिश्चित करने के लिए, स्यूडोआइलेट्स पर प्रयोग एक ही दाता से दो से तीन प्रतिकृतियों के साथ किए गए थे, और कुल मूल्यों को चित्रा 3 सी-ई, डी', ई ' में प्लॉट किया गया है। जी 2 के संपर्क में, सापेक्ष सीएडीएस तीव्रता कम और स्थिर थी, जैसा कि इंसुलिन स्राव था (चित्रा 3 सी-डी)। जब स्यूडोआइलेट्स को जी 20 + आईबीएमएक्स के संपर्क में लाया गया था, तो इंट्रासेल्युलर सीएमपी एकाग्रता में एक मजबूत वृद्धि हुई थी, जैसा कि सापेक्ष सीएडीडीआईएस तीव्रता (चित्रा 3 सी) में वृद्धि से स्पष्ट है। यह वृद्धि बीटा और अल्फा कोशिकाओं दोनों के कारण होने की सबसे अधिक संभावना थी, जैसा कि इंसुलिन और ग्लूकागन स्राव (चित्रा 3 डी-ई) दोनों में सहवर्ती चिह्नित वृद्धि से प्रदर्शित होता है। जी 2 + एपि के लिए स्यूडोआइलेट्स के संपर्क ने इंट्रासेल्युलर सीएमपी एकाग्रता (चित्रा 3 सी) में वृद्धि की, और यह ग्लूकागन स्राव (चित्रा 3 ई) में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ था। यह अवलोकन कि जी 2 + एपि के लिए सीएमपी प्रतिक्रिया आईबीएमएक्स प्रतिक्रिया की तुलना में अपेक्षाकृत छोटी थी, अल्फा कोशिकाओं बनाम बीटा कोशिकाओं (चित्रा 1 डी) और इस सिग्नल की अल्फा सेल-विशिष्टता (चित्रा 3 ई) में सीएडीडीआईएस एडेनोवायरल निर्माण की कम पारगमन दक्षता के संयोजन के कारण हो सकती है। इसलिए, प्राथमिक मानव बीटा और अल्फा कोशिकाओं में ज्ञात सीएमपी-मध्यस्थता सिग्नलिंग मार्गों के आधार पर, यह प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक इस एकीकृत मंच की उपयोगिता को प्रदर्शित करता है ताकि तकनीकी और जैविक प्रतिकृतियों में सीएडीडीआईएस बायोसेंसर और बीटा और अल्फा सेल हार्मोन स्रावी प्रोफाइल की सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता की एक साथ जांच की जा सके।

Figure 1
चित्रा 1: बायोसेंसर-व्यक्त मानव स्यूडोआइलेट्स का गठन। (ए) प्राथमिक मानव आइलेट पृथक्करण, एकल-कोशिका अवस्था में बायोसेंसर निर्माण के साथ पारगमन और पुन: एकत्रीकरण दिखाने वाला योजनाबद्ध। पुनर्एकत्रीकरण के बाद, स्यूडोआइलेट्स को काटा जाता है और तुल्यकालिक लाइव-सेल इमेजिंग और माइक्रोपेरिफ्यूजन से गुजरना पड़ता है। प्रोटोकॉल चरणों को पूरे योजनाबद्ध तरीके से इंगित किया गया है। (बी) 6 दिन की पुनर्एकत्रीकरण अवधि के दौरान एक सीएडीडीआईएस-व्यक्त स्यूडोआइलेट के गठन को कैप्चर करने वाली प्रतिनिधि छवियां; शीर्ष: कंट्रास्ट के साथ ब्राइटफील्ड, नीचे: सीएडीडी प्रतिदीप्ति है। स्केल बार 100 μm है। (C) क्रमशः C-पेप्टाइड (CPEP, नीला) और ग्लूकागन (GCG, लाल) लेबलिंग द्वारा देखे गए अल्फा और बीटा कोशिकाओं के साथ एक cADdis-व्यक्त स्यूडोआइलेट (हरा) की प्रतिनिधि छवियां। DAPI (सफेद) का उपयोग परमाणु काउंटरस्टेन के रूप में किया गया था। सफेद तीर ट्रांसड्यूस्ड अल्फा और बीटा कोशिकाओं को उजागर करते हैं। पीला तीर एक अपरिवर्तित अल्फा सेल को इंगित करता है। स्केल बार 100 μm है। (डी) हेलो साइटोन्यूक्लियर एल्गोरिदम द्वारा बीटा और अल्फा कोशिकाओं में एमओआई 1,000 पर पारगमन दक्षता का परिमाणीकरण (एन = 2 दाता, औसतन 601 बीटा कोशिकाओं और 627 अल्फा कोशिकाओं के साथ प्रति दाता कई स्यूडोआइलेट्स में विश्लेषण किया जाता है)। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि को इंगित करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एकीकृत लाइव-सेल इमेजिंग और माइक्रोपेरिफ्यूजन सिस्टम। (ए) लाइव-सेल इमेजिंग और माइक्रोपेरिफ्यूजन सिस्टम घटकों का अवलोकन। एक माइक्रोचिप में स्यूडोआइलेट्स को एक पर्यावरण कक्ष के भीतर संलग्न एक कॉन्फोकल लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के चरण पर रखा जाता है। यह विन्यास अच्छी तरह से परिभाषित स्रावकों की एक श्रृंखला के लिए गतिशील प्रतिक्रिया के दौरान बायोसेंसर फ्लोरेसेंस में इंट्रासेल्युलर परिवर्तनों के बारे में अस्थायी संकल्प की अनुमति देता है और इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग घटनाओं के साथ आगे एकीकरण के लिए हार्मोन स्राव के तुल्यकालिक माप के लिए स्यूडोआइलेट पेरिफ्यूसेट अंशों का संग्रह करता है। (बी) पर्यावरण कक्ष के बाहर माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म के घटक। द्रव दिशात्मकता इस प्रकार है: (1) स्रावित युक्त ट्यूबों से (2) ट्यूबिंग में 0.01 से (3) पेरिस्टालिक पंप ट्यूबिंग (आंतरिक व्यास में 0.02) से (4) टयूबिंग में 0.01 से (5) डी-बबलर से (6) माइक्रोचिप इनलेट (टयूबिंग में 0.01) से (7) माइक्रोचिप धारक / माइक्रोचिप से (8) माइक्रोचिप आउटलेट (टयूबिंग में 0.01)। नोट: ट्यूबिंग में 0.01 शंक्वाकार एडाप्टर (सफेद तीर) के साथ पेरिस्टालिक पंप ट्यूबिंग से जुड़ा हुआ है। टयूबिंग को एक अखरोट और फर्रूल (हरे तीर) के माध्यम से डी-बबलर में प्लग किया जाता है। डैश्ड रेड लाइन घटकों के बीच कनेक्टिविटी प्रदर्शित करती है। (सी) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप चरण पर लगाए गए पर्यावरण कक्ष के भीतर माइक्रोचिप और धारक का क्लोज-अप दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: मानव स्यूडोआइलेट सीएमपी और हार्मोन स्राव गतिशीलता। (ए) बीटा और अल्फा कोशिकाओं में स्राव-प्रेरित सीएडीडी प्रतिदीप्ति और हार्मोन स्राव की योजनाबद्धता। बीटा कोशिकाओं में, एपिनेफ्रीन (एपि) जीआई-युग्मित अल्फा 2-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स को बांधता है, जिससे एडेनिल साइक्लेज (एसी) का निषेध होता है, सीएमपी में कमी आती है, और इंसुलिन स्राव कम हो जाता है। अल्फा कोशिकाओं में, एपि जीएस-युग्मित बीटा 1-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स को उत्तेजित करता है, जिससे एसी की सक्रियता और इंट्रासेल्युलर सीएमपी में वृद्धि होती है। दोनों सेल प्रकारों में, आईबीएमएक्स, एक फॉस्फोडिएस्टरेज़ (पीडीई) अवरोधक, इंट्रासेल्युलर सीएमपी के क्षरण को रोकता है और हार्मोन स्राव को बढ़ावा देता है। मुक्त इंट्रासेल्युलर सीएमपी का बंधन सीएडीडीआईएस प्रोटीन में विरूपण परिवर्तन का कारण बनता है, इस प्रकार प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि होती है। (बी) जी 2 (2 एमएम ग्लूकोज), जी 20 + आईबीएमएक्स (20 एमएम ग्लूकोज + आईबीएमएक्स), और जी 2 + एपि (2 एमएम ग्लूकोज + एपि) के जवाब में लाइव-सेल इमेजिंग के दौरान सीएडीडीआईएस-व्यक्त स्यूडोआइलेट्स की प्रतिनिधि छवियां। स्यूडोआइलेट्स को सफेद रंग में रेखांकित किया गया है, और सेक्रेटेगोग प्रकार को शीर्ष-बाएं कोने में इंगित किया गया है। स्केल बार 50 μm है। (C) सापेक्ष cADDis प्रतिदीप्ति समय के साथ तीन अंग दाता तैयारी से मानव आइलेट्स से बने CADDis-व्यक्त स्यूडोआइलेट्स में औसत है। (डी) संकेतित स्रावों के जवाब में कुल इंसुलिन और (ई) ग्लूकागन स्राव। डेटा को आइलेट वॉल्यूम में सामान्यीकृत किया जाता है, जिसे आइलेट समकक्षों (आईईक्यू) में व्यक्त किया जाता है। स्यूडोआइलेट्स को तीन मानव आइलेट दाताओं से तैयार किया गया था और दो से तीन तकनीकी प्रतिकृति / दाता का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। आइलेट कोशिकाओं को एमओआई 500 (एन = 1) या 1,000 (एन = 2) पर सीएडीडीआईएस एडेनोवायरल निर्माण के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था। (D', E') स्यूडोआइलेट हार्मोन सामग्री। त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि को इंगित करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: दाता जनसांख्यिकी। सीएडीडीआईएस बायोसेंसर अभिव्यक्ति और लाइव-सेल इमेजिंग के साथ स्यूडोआइलेट्स की तैयारी के दौरान उपयोग किए जाने वाले मानव आइलेट्स के लिए दाता जनसांख्यिकीय जानकारी का सारांश। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: समस्या निवारण गाइड। जिन चुनौतियों का सामना किया जा सकता है, उन पर प्रकाश डाला गया है, जिसमें मुद्दों, समाधानों और रोकथाम तकनीकों के सामान्य कारणों की सूची शामिल है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: माइक्रोपेरिफ्यूजन प्रोटोकॉल। प्रतिनिधि परिणामों में हाइलाइट किए गए प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले एक उदाहरण माइक्रोपेरिफ्यूजन प्रोटोकॉल। यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से इंट्रासेल्युलर सीएमपी और आइलेट हार्मोन स्राव के सह-पंजीकरण की ओर अग्रसर है; रुचि के इंट्रासेल्युलर अणु और / या चुने हुए बायोसेंसर गतिशीलता के आधार पर वैकल्पिक प्रोटोकॉल अधिक उपयुक्त हो सकते हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: आइलेट समकक्षों (आईईक्यू) की गणना। प्रत्येक प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले स्यूडोआइलेट्स के लिए आईईक्यू की गणना करने का एक उदाहरण। शीट 1 (1) में डेटा। ऑब्जेक्ट माप) में सॉफ़्टवेयर से सीधे निर्यात किए गए ऑब्जेक्ट डेटा शामिल हैं (चरण 9.1 देखें)। चरण 9.1.6.2 में प्रत्येक अनुक्रमणिका के भीतर आने वाले स्यूडोआइलेट्स की संख्या को गिनने के लिए हरे रंग का हाइलाइट किया गया कॉलम डाला गया है। गिनती शीट 2 (2) में कॉपी की जाती है। IEQ गणना) और प्रति सूचकांक उपयुक्त रूपांतरण कारक का उपयोग करके IEQ में परिवर्तित किया गया। चिप लोडिंग (इन-चिप स्यूडोआइलेट #) के दौरान और अर्क (पोस्ट-रन स्यूडोआइलेट #) को हटाने से पहले किसी भी स्यूडोआइलेट हानि को इन चरणों के दौरान कैप्चर की गई छवियों का उपयोग करके हिसाब लगाया जा सकता है (क्रमशः चरण 5.5 और चरण 7.1.1 देखें)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: डेटा विश्लेषण। चरण 9.2 में प्राप्त डेटा से सापेक्ष सीएडीडी तीव्रता की गणना करने के तरीके का एक उदाहरण। कॉलम डी-एफ में कच्चा डेटा सीधे सॉफ्टवेयर से निर्यात किया जाता है। प्रत्येक समय बिंदु पर कच्चे मूल्यों को बेसलाइन माध्यम (जी 2; प्रोटोकॉल में 7-8 मिनट) के अंतिम मिनट में औसत तीव्रता के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। समय के साथ सभी स्यूडोआइलेट्स में औसत तीव्रता की गणना चित्रा 2 सी में ग्राफ उत्पन्न करने के लिए की जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एक माइक्रोपेरिफ्यूजन सिस्टम, बायोसेंसर-व्यक्त स्यूडोआइलेट्स और लेजर-स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का एकीकरण इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग घटनाओं और गतिशील हार्मोन स्रावी प्रोफाइल के तुल्यकालिक मूल्यांकन की अनुमति देता है। गतिशील माइक्रोपेरिफ्यूजन सिस्टम स्यूडोआइलेट्स को अच्छी तरह से परिभाषित उत्तेजनाओं की एक श्रृंखला प्रदान कर सकता है और बहिःस्राव के संग्रह की अनुमति देता है, जिसमें इंसुलिन और ग्लूकागन सांद्रता को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलिसा द्वारा मापा जा सकता है। समवर्ती रूप से, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी प्लेटफॉर्म द्वारा बायोसेंसर-व्यक्त स्यूडोआइलेट्स की लाइव-सेल इमेजिंग वास्तविक समय बायोसेंसर फ्लोरेसेंस गतिविधि को कैप्चर करती है, जो इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग घटनाओं के बारे में जानकारी प्रदान करती है। समय के साथ बायोसेंसर सिग्नल और हार्मोन स्रावी प्रोफ़ाइल का एक साथ माप आइलेट हार्मोन स्राव पर इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग घटनाओं के प्रभाव की सीधे तुलना करने का अवसर प्रदान करता है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल की सफलता के लिए कई विचार महत्वपूर्ण हैं। इनमें बायोसेंसर-व्यक्त स्यूडोआइलेट्स उत्पन्न करना और स्यूडोआइलेट आंदोलन के बिना प्रत्येक प्रयोग के दौरान निरंतर प्रवाह दर का उपयोग करना शामिल है। 100 μL/min की प्रवाह दर पर और 2 मिनट के अंश संग्रह के साथ, प्रत्येक अंश का पेरिफ्यूसेट आयतन 200 μL है और इसमें 10 μL/अंश से अधिक उतार-चढ़ाव नहीं होना चाहिए। इसके अलावा, जबकि इमेजिंग सॉफ्टवेयर दृश्य के क्षेत्र के भीतर एक्सवाई विमान में मामूली स्यूडोआइलेट आंदोलन को समायोजित कर सकता है, माइक्रोपेरिफ्यूजन प्रयोग के दौरान दृश्य के क्षेत्र से बाहर जाने वाले स्यूडोआइलेट्स का विश्लेषण नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, प्रयोग के दौरान किसी भी लीक और आंदोलन का पता लगाना महत्वपूर्ण है ताकि समस्या को ठीक करने के प्रयास किए जा सकें। संभावित चुनौतियों, उनके सामान्य कारणों, समाधानों और उन्हें होने से रोकने के लिए युक्तियों का सारांश तालिका 2 में सारांशित किया गया है। फिर भी, इस प्रोटोकॉल में मुद्दों का अनुमान लगाने के कई अवसर शामिल हैं, जैसे कि चिप लोड करने से पहले एक परीक्षण प्रयोग करना (चरण 2.3) और छवि अधिग्रहण और माइक्रोपेरिफ्यूजन अंश संग्रह (चरण 6.4-6.5) से पहले 30 मिनट की धोने की अवधि के दौरान माइक्रोस्कोप के माध्यम से महत्वपूर्ण आंदोलन के लिए स्यूडोआइलेट्स की निगरानी करना।

एक सीमा यह है कि वर्तमान कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी प्लेटफॉर्म पर दृश्य का क्षेत्र माइक्रोचिप के भीतर सभी स्यूडोआइलेट्स को एक बार में कैप्चर करने की अनुमति नहीं देता है। जबकि माइक्रोपेरिफ्यूसेट में इंसुलिन और ग्लूकागन का विश्वसनीय रूप से पता लगाने के लिए न्यूनतम 30 स्यूडोआइलेट्स की आवश्यकता होती है, केवल एक उप-समूह को 20x आवर्धन पर चित्रित किया जा सकता है। कुएं के केंद्र में स्यूडोआइलेट्स लोड करने से उस संख्या को अधिकतम किया जा सकता है जिसे दृश्य के क्षेत्र में कैप्चर किया जा सकता है। इसके अलावा, जबकि माइक्रोचिप तीन कुओं से लैस है, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ एकीकरण माप को एक समय में एक अच्छी तरह से सीमित करता है, जिसका अर्थ है कि तकनीकी प्रतिकृति समानांतर के बजाय श्रृंखला में की जानी चाहिए। इसके अलावा, यह वर्तमान दृष्टिकोण अल्फा और बीटा सेल-विशिष्ट स्रावी आउटपुट के साथ पूरे स्यूडोआइलेट फ्लोरेसेंस को सह-पंजीकृत करता है; हालांकि, इसे आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर के सेल-विशिष्ट लक्ष्यीकरण का उपयोग करके अल्फा या बीटा सेल इंट्रासेल्युलर घटनाओं में परिवर्तन को सीधे मापने के लिए संशोधित किया जा सकता है। जबकि इस प्रोटोकॉल में केवल इंसुलिन और ग्लूकागन स्राव का आकलन किया गया था, भविष्य के अध्ययन अन्य आइलेट हार्मोन के स्राव को भी माप सकते हैं, जैसे कि डेल्टा कोशिकाओं से सोमाटोस्टैटिन स्राव। ध्यान दें, इस समय, सोमाटोस्टैटिन केवल आईबीएमएक्स जैसे अत्यधिक उत्तेजक स्रावकों के जवाब में इस मंच के साथ पता लगाने योग्य है। अंत में, पृथक आइलेट्स और स्यूडोआइलेट्स में विवो में आइलेट्स के न्यूरोवास्कुलर आर्किटेक्चर की कमी होती है, जिसे सीधे आइलेट फ़ंक्शन को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है।

अंत में, वर्णित मंच बायोसेंसर और हार्मोन स्राव का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग घटनाओं के मूल्यांकन को सिंक्रनाइज़ करने की रणनीति प्रदान करता है। इस प्रणाली को आरएनए हस्तक्षेप (सीआरएनए या एसएचआरएनए) या सीआरआईएसपीआर-मध्यस्थता जीन लक्ष्यीकरण रणनीतियों द्वारा पेश किए गए कार्यात्मक परेशानियों की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इन विधियों का उपयोग सीएडीडीआईएस के बाहर आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड बायोसेंसर का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर या बाह्य घटनाओं की भीड़ पर रुचि के मार्गों के जैविक प्रभावों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि पहले जीसीएएमपी 6 एफ7 के लिए प्रदर्शित किया गया है। इसके अतिरिक्त, एक विशेष सेल प्रकार का चयनात्मक पारगमन और / या सेल-विशिष्ट उत्तेजनाओं के संपर्क में मानव आइलेट के संदर्भ में एक विशिष्ट सेल प्रकार के इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग घटनाओं की लक्षित पूछताछ की अनुमति देगा। उदाहरण के लिए, मानव अग्नाशय ी आइलेट्स की अल्फा कोशिकाओं को सेल सतह मार्करों का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है और बाद में इंट्रासेल्युलर कैल्शियम गतिशीलता का आकलन करने के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम बायोसेंसर जीसीएएमपी के साथ ट्रांसड्यूस किया जा सकता है। इन वायरल ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को तब स्यूडोआइलेट्स बनाने के लिए अन्य अपरिवर्तित आइलेट कोशिकाओं के साथ फिर से जोड़ा जा सकता है या अल्फा सेल-समृद्ध स्यूडोआइलेट्स उत्पन्न करने के लिए अपने दम पर पुन: एकत्रित करने के लिए छोड़ दिया जा सकता है जो टाइप 1 मधुमेह में आइलेट्स से मिलते जुलते हैं। यह दृष्टिकोण अधिक पारंपरिक तकनीकों से अलग है, जिसमें सीए 2 + जैसे इंट्रासेल्युलर अणुओं को लोड किए गए सीए2 + संवेदनशील रंगों का उपयोग करके मापा जाता है और सेल की पहचान इम्यूनोस्टेनिंग या अन्य साधनों15 द्वारा लाइव-सेल इमेजिंग के बाद निर्धारित की जाती है। वैकल्पिक रूप से, माप एकल-कोशिका अवस्था में किए जाते हैं, जहां आइलेट सेल फ़ंक्शन पर पैराक्रिन सिग्नलिंग काप्रभाव खो जाता है। इस प्रकार, एक स्यूडोआइलेट सिस्टम और माइक्रोपेरिफ्यूजन प्लेटफॉर्म के साथ एकीकृत यह लाइव-सेल इमेजिंग अभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं के ज्ञान को व्यापक बनाते हुए आइलेट जीव विज्ञान में पिछली चुनौतियों को दूर करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

अंग दाताओं और उनके परिवारों को उनके अमूल्य दान के लिए सराहा जाता है, और इंटरनेशनल इंस्टीट्यूट फॉर ऑर्गन प्रोक्योरमेंट ऑर्गनाइजेशन, एडवांसमेंट ऑफ मेडिसिन (आईआईएएम) और नेशनल डिजीज रिसर्च एक्सचेंज (एनडीआरआई) को अनुसंधान के लिए मानव अग्नाशय के ऊतकों को सुलभ बनाने में उनकी साझेदारी के लिए स्वीकार किया जाता है। इस काम को ह्यूमन आइलेट रिसर्च नेटवर्क (आरआरआईडी: SCR_014393), मानव अग्न्याशय विश्लेषण कार्यक्रम (आरआरआईडी: SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 और DK20593 (वेंडरबिल्ट डायबिटीज रिसर्च एंड ट्रेनिंग सेंटर), लियोना एम और हैरी बी हेल्मस्ले चैरिटेबल ट्रस्ट, जेडीआरएफ, यूएस डिपार्टमेंट ऑफ वेटरन्स अफेयर्स (BX000666) द्वारा समर्थित किया गया था। राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप (1937963) के एनआईजीएमएस।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ad-CMV-cADDis Welgen Not applicable
 0.01” FEP tubing IDEX 1527L
1 M HEPES Gibco 15630-080 Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes Any Any
10 μm PTFE filter Cole-Parmer SK-21940-41 Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate Thermo Scientific 11360070 Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol Decon labs 2816 Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement Gibco 35050061 Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate Sigma A5960 DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin Sigma A7888 DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap  Omnifit 006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates Perkin Elmer 6055330
cellSens analysis software Olympus v3.1 Software used for data analysis
CMRL 1066 MediaTech  15-110-CV Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794) IDEX P-794
D-(+)-Glucose Sigma G7528 Glucose Buffer Component
DMEM  Sigma D5030 DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber okolab IX83
Epinepherine (Epi) Sigma E4250 Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated Sigma 12306C Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA Mercodia 10-1281-01
Glucagon Kit HTRF Cisbio 62CGLPEH
HCl (12N) Any Any Acid Ethanol Component
HEPES Sigma H7523 DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement Cell Dynamics M1019 iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 Cole-Parmer EW-00414-LW
Insulin ELISA Mercodia 10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX) Sigma I5879 Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope Olympus FV3000
L-Glutamine Sigma G8540 DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W) University of Miami FP-3W
Microchip holder  Micronit Microfluidics FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector Biorad 7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips Any Any
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122 Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump  Instech P720
Phosphate Buffered Saline Gibco 14190-144 Wash Islets
Sarstedt dishes Sarstedt depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate Sigma S6014 DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate Sigma P2256  DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope Olympus SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm) Millipore SCGP00525 Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit LifeLine Cell Technology LL-0003 iEC Media Component

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References

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Richardson, T. M., Pettway, Y. D., Walker, J. T., Nelson, H. A., Ishahak, M., Poffenberger, G., Aramandla, R., Reihsmann, C., Agarwal, A., Powers, A. C., Brissova, M. Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles. J. Vis. Exp. (201), e65259, doi:10.3791/65259 (2023).

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