Summary
Bu protokol, bir siklik adenozin monofosfat (cAMP) biyosensörünün, bir cAMP fark detektörünün in situ (cADDis) ve bir mikroperifüzyon sisteminin adenoviral iletimini kullanarak hücre içi sinyal olaylarının senkron edinimi ve birlikte kaydı ve birincil insan psödoisletleri tarafından insülin ve glukagon salgılanması için bir yöntemi açıklar.
Abstract
Pankreas boyunca serpiştirilmiş özel endokrin ve destekleyici hücrelerin küçük 3D koleksiyonları olan Langerhans'ın pankreas adacıkları, kan şekerini düşüren beta hücreleri tarafından insülin salgılanması yoluyla glikoz homeostazının kontrolünde merkezi bir role sahiptir ve glukagon, kan şekerini yükselten alfa hücreleri tarafından. cAMP'nin aracılık ettiği hücreler de dahil olmak üzere hücre içi sinyal yolları, düzenlenmiş alfa ve beta hücre hormonu sekresyonu için anahtardır. 3D adacık yapısı, koordineli adacık işlevi için gerekli olmakla birlikte, birincil insan adacık hücrelerinde hücre içi sinyal yollarının mekanik çalışmaları için deneysel zorluklar sunar. Bu zorlukların ve sınırlamaların üstesinden gelmek için bu protokol, morfolojileri, bileşimleri ve işlevleri bakımından doğal adacıklara benzeyen, diyabeti olmayan donörlerden üretilen birincil insan psödoisletlerini kullanan entegre bir canlı hücre görüntüleme ve mikroakışkan platformunu tanımlar. Bu psödoadacıklar, birincil insan adacık hücrelerinin dağılma ve yeniden toplanma süreci yoluyla boyut kontrollüdür. Dağınık durumda, adacık hücresi gen ekspresyonu manipüle edilebilir; örneğin, genetik olarak kodlanmış cAMP biyosensörü, cADDis gibi biyosensörler tanıtılabilir. Bir kez oluşturulduktan sonra, genetik olarak kodlanmış bir biyosensörü ifade eden psödo-adacıklar, konfokal mikroskopi ve bir mikroperifüzyon platformu ile birlikte, hücresel süreçler ve işlev hakkında daha fazla bilgi sağlamak için floresan biyosensör dinamiklerinin ve alfa ve beta hücre hormonu salgı profillerinin eşzamanlı değerlendirmesine izin verir.
Introduction
Langerhans adacıkları, işlevi glikoz homeostazının sürdürülmesi için çok önemli olan pankreas boyunca dağılmış mini organlardır. İnsülin, glikoz metabolizmasını, ATP/ADP oranındaki artışı, ATP'ye duyarlı potasyum kanallarının kapanmasını, plazma zarının depolarizasyonunu ve hücre dışı kalsiyum1 akışını takiben beta hücrelerinden salgılanır. Alfa hücrelerinden glukagon sekresyonu daha az anlaşılmıştır, ancak hücre içi ve parakrin yolların glukagon granül ekzositozunakatkıda bulunduğu varsayılmıştır 2,3,4. Hem tip 1 hem de tip 2 diyabet, adacık hücresi disfonksiyonu ile ilişkilidir 5,6,7. Bu nedenle, pankreas adacıklarında adacık hormonu sekresyonuna aracılık eden hücre içi sinyal yolaklarının aydınlatılması, fizyolojik ve patolojik mekanizmaların anlaşılması için gereklidir.
Adacıkların küresel mimarisi, deney için bazı engeller sunar. Bu zorluklar arasında adacık boyutu varyasyonu ve adacıkların 3 boyutlu doğası yer alır, bu da adacık çekirdeği 8,9 içindeki viral iletimi azaltır. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, birincil insan adacıklarının tek hücrelere dağıldığı, ilgilenilen hedefleri kodlayan yapılarla adenoviral olarak dönüştürüldüğü ve psödoadacıklar7 olarak adlandırılan boyut kontrollü, adacık benzeri yapılar oluşturmak üzere yeniden toplandığı bir psödoislet sistemi geliştirilmiştir. Paralel olarak kültürlenen aynı donörden alınan doğal adacıklarla karşılaştırıldığında, bu psödoadacıklar morfoloji, endokrin hücre bileşimi ve hormon sekresyonu bakımından benzerdir7. Bu yöntem, psödoadacık boyunca yapıların ifadesine izin verir, yani birincil insan adacıklarının tek tip genetik manipülasyonunakarşı önceki bir engelin üstesinden gelir 7,8,9.
Bu protokolde, psödoislet sistemi, primer insan adacık hücrelerinde biyosensörleri eksprese etmek ve dinamik perifüzyon sırasında psödoislet hormonu sekresyonunun zamansal çözünürlüğünü kazanmak için bir mikroakışkan cihaz ile entegre edilmiştir10,11,12. Psödoadacıklar bir mikroçip içine yerleştirilir ve peristaltik bir pompa12 aracılığıyla farklı sekretagogların sabit akışına maruz bırakılır. Mikroçip şeffaf bir cam tabana sahiptir ve biyosensör floresan yoğunluğundaki değişiklikler yoluyla hücre içi sinyal dinamiklerini kaydetmek için konfokal bir mikroskop üzerine monte edilmiştir. Biyosensör görüntüleme, insülin ve glukagon sekresyonunun müteakip analizi için mikroperifüzyon atık suyunun toplanmasıyla senkronize edilir7. Makroperifüzyon ile karşılaştırıldığında, bu mikroperifüzyon yaklaşımı, makroperifüzyon odasına kıyasla mikroakışkan cihazın daha küçük hacmi nedeniyle daha az psödoadacık kullanılmasına izin verir7.
Bu sistemin faydasından yararlanmak için, cAMP dinamiklerini ve hormon sekresyonunu değerlendirmek için insan psödoisletlerinde siklik adenozin monofosfat (cAMP) fark dedektörü in situ (cADDis) biyosensörü eksprese edildi. cADDis biyosensörü, düzenleyici ve katalitik bölgelerini birbirine bağlayan, cAMP 2 (EPAC2) tarafından aktive edilen bir değişim proteininin menteşe bölgesine yerleştirilmiş dairesel olarak permütasyonlu bir yeşil floresan proteinden (cpGFP) oluşur. cAMP'nin EPAC2'nin düzenleyici bölgesine bağlanması, menteşe bölgesinde cpGFP13'ten floresansı artıran konformasyonel bir değişiklik ortaya çıkarır. cAMP gibi hücre içi haberciler, G-proteinine bağlı reseptörlerin yukarı akış aktivasyonundan sonra insülin ve glukagon sekresyonunu ortaya çıkarır14. Mikroperifüzyon ile birleştirilmiş canlı hücre görüntüleme, hücre içi cAMP dinamiklerini adacık hormonu sekresyonu ile ilişkilendirmeye yardımcı olur. Spesifik olarak, bu protokolde, alfa ve beta hücrelerinde çeşitli uyaranlara cAMP yanıtlarını izlemek için cADDis eksprese eden psödoisletler üretilir: düşük glikoz (2 mM glikoz; G 2), yüksek glikoz artı izobütilmetilksantin (IBMX; 20 mM glikoz + 100 μM IBMX; G20 + IBMX) ve düşük glukoz artı epinefrin (Epi; 2 mM glukoz + 1 μM Epi; G2 + Epi). Bu tedavi iş akışı, hücre içi cAMP dinamiklerinin doğrudan 1) bozulmasını önleyerek hücre içi cAMP seviyelerini artıran IBMX aracılı fosfodiesteraz inhibisyonu ve 2) β-adrenerjik reseptör aktivasyonunun aracılık ettiği alfa hücresi glukagon sekresyonunun bilinen bir cAMP'ye bağlı uyarıcısı olan epinefrin aracılığıyla değerlendirilmesine olanak tanır. Canlı hücre görüntüleme deneyleri için mikroperifüzyon aparatının kurulması, psödoisletlerin mikroçipe yüklenmesi, senkron canlı hücre görüntüleme ve mikroperifüzyon ve mikroplaka bazlı hormon tahlilleri ile biyosensör izlerinin ve hormon sekresyonunun analizi için adımlar aşağıda detaylandırılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan adacıkları (N = 4 preparatları), Entegre Adacık Dağıtım Programı, İnsan Pankreas Analiz Programı, Prodo Laboratories, Inc. ve Imagine Pharma ile ortaklıklar yoluyla elde edildi. Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu, tanımlanmamış insan pankreas örneklerini insan denek araştırması olarak görmez. Organ bağışçıları, aileleri ve organ tedarik kuruluşları olmadan bu çalışma mümkün olmazdı. Donör demografik bilgileri için Tablo 1'e bakınız. Diyabeti olmayan pankreas donörlerinden insan adacıkları, 15 saatten daha az soğuk iskemi süresi ile izole edildi.
1. Psödoislet oluşumu (Walker ve ark.7)
- Pipet ucunu adacık kültürü ortamının dışındaki herhangi bir yüzeye kontamine etmemeye çok dikkat ederek bir P200 pipet ve tezgah üstü mikroskop kullanarak birincil insan adacıklarını elde edin ve elle seçin (%10 FBS, 100 μg/mL streptomisin, 100 U/mL penisilin, CMRL 1066'da 2 mM L-glutamin).
- Birincil adacıkları 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve kontaminasyonu önlemek için bir doku kültürü başlığı altında aşağıdaki psödoislet oluşum adımlarının tümünü gerçekleştirin. Birincil adacıkları oda sıcaklığında 7 dakika boyunca% 0.025 tripsin içinde bir P1000 pipeti ile yavaşça ayırın. Adacıklar parçalanmaya başladıkça çözüm opak hale gelecektir.
- Bu çalışmalar için, 500 μL% 0.025 tripsin içinde dağılmış yaklaşık 200 μm çapında elle seçilmiş 200-300 birincil adacıklar, bir ila iki 96 oyuklu psödoadacık plakası verir; Kesin sayı, ortalama adacık boyutuna ve canlılığına bağlı olarak değişebilir. >500 birincil adacık için, 1:1 oranında kullanılan %0,025 tripsin hacmini artırın (örneğin, elle toplanmış 600 adacık için 600 μL %0,025 tripsin).
- Kullanılan tripsin hacmine eşdeğer bir hacimde Vanderbilt Pseudoislet Media (VPM) ekleyerek dispersiyonu söndürün. Ardından, 1 mL VPM ile iki kez yıkayın. Yıkamalar için, dağılmış hücreleri 485 x g'da 2-3 dakika boyunca 4 °C'de bir tezgah üstü santrifüjde santrifüjleyin. Hücreleri sayım için tanımlanmış bir VPM hacminde (tipik olarak 1 mL) yeniden askıya alın.
NOT: Psödoislet üretimi ve VPM bileşimi önceki bir yayındadetaylandırılmıştır 7. Kısaca, VPM eşit hacimlerde zenginleştirilmiş CMRL ortamı (%20 FBS, 100 μg/mL streptomisin, 100 U/mL penisilin, 1 mM sodyum piruvat, 2 mM Glutamax, CMRL 1066'da 2 mM HEPE) ve iEC ortamı (VEGF Medium Complete Kit eksi FBS + 1 şişe Endotel Hücreleri Orta Eki) içerir. Psödoislet oluşumunun özet şeması Şekil 1A'da yer almaktadır. - 10 μL Tripan Mavisi ile 10 μL hücre süspansiyonunu birleştirerek otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını ve canlılığını belirleyin. Doğru bir hücre sayımı sağlamak için hücre süspansiyonunu iyice karıştırın.
- İstenilen sayıda psödoadacık için gereken hücre süspansiyonu, virüs ve VPM hacmini hesaplayın. Tüm hesaplamaları adım 1.4'te elde edilen canlı hücre sayısına dayandırın.
- Bu çalışmalar için, MOI 500 (N = 1) veya 1.000'de (N = 2) toplam 500 μL hacimde Ad-CMV-cADD ile dağılmış insan adacık hücrelerini dönüştürün. Bir transdüksiyon psödoislet plakası (2.000 hücre/psödoislet), donör başına üç teknik kopya verir (32 psödoislet/deney). Adenovirüs bu çalışmada ticari olarak elde edildi.
- Hesaplanan hücre süspansiyonu, virüs ve VPM miktarlarını 1.5 mL'lik bir tüpte birleştirin. İçeriği yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın.
- Transdüksiyon sırasında, tüpleri kapakları açık olarak inkübe edin ve 37 ° C'de ve% 5 CO 2/95% havada bir doku kültürü inkübatöründe2 saat boyunca steril bir Petri kabı ile örtün.
- Her tüpe 500 μL VPM ekleyin ve hücreleri 4 °C'de 3 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyerek yıkayın. Toplam üç yıkama için iki yıkama daha tamamlayın. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 1 mL VPM'de yeniden süspanse edin.
- Toplam hücre tohumlama hacmini (200 μL/psödoislet) hesaplayın. VPM'yi (hesaplanan hücre tohumlama hacmi eksi 2 mL) uygun büyüklükte bir konik tüpe ekleyin. Adım 1.7'den dönüştürülen hücre süspansiyonunu konik tüpe ekleyin. Hücreler için hava değişimine izin vermek için konik boruyu hafifçe kapalı tutun, ancak sıkıca kapalı tutun.
- 1.5 mL tüpü (adım 1.7'den itibaren) 1 mL VPM ile durulayın ve içeriği konik tüpe aktarın, bu noktada konik tüp toplam hücre tohumlama hacmini içermelidir.
- Motorlu bir serolojik pipet ile yukarı ve aşağı pipetleyerek konik tüpün içeriğini iyice karıştırın ve ardından içeriği steril bir reaktif rezervuarına aktarın. Rezervuar tüm hücre tohumlama hacmini tutmuyorsa, seri transferler gerçekleştirin ve süspansiyonun her adımda iyice karıştırıldığından emin olun.
- Çok kanallı bir P200 pipeti kullanarak, homojenliği sağlamak için reaktif haznesindeki hücre süspansiyonunu 3-4 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından mikrokuyu plakalarının her bir oyuğuna 200 μL hücre süspansiyonu pipetleyin.
- Psödoisletleri bir doku kültürü inkübatöründe 37 °C ve %5 CO%2/95 havada 6 gün boyunca ortam değişiklikleri olmadan inkübe edin. 6. günde, psödoadacıklar tamamen oluşmalı ve deneylere hazır olmalıdır (Şekil 1B-D).
2. Canlı hücre görüntüleme ve mikroperifüzyon için hazırlık (deneyden 1 gün önce)
NOT: Mikroperifüzyon ortamının hazırlanmasına ilişkin bilgiler, protocols.io kaynağından (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html) edinilebilir.
- Psödoisletleri çok kanallı bir pipet kullanarak 96 oyuklu plakadan steril bir Petri kabına aktararak hasat edin. Daha sonra, psödoadacıkları elle seçin ve taze VPM içeren başka bir steril Petri kabına aktarın. Psödoadacıkların gece boyunca 37 °C ve %5 CO%2/95 havada bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edilmesine izin verin.
- 1 L ultra saflaştırılmış suya 1 g BSA (radyoimmunoassay derecesi), 0.11 g sodyum piruvat, 0.58 g L-glutamin, 3.2 g sodyum bikarbonat, 1.11 g HEPES ve 1 şişe DMEM ekleyerek 1 L DMEM hazırlayın. DMEM'de 1 M glikoz stok çözeltisi hazırlayın. Her iki çözeltiyi de gece boyunca 4 °C'de tutun.
- Deneyden bir gün önce mikroperifüzyon sisteminin akışını kontrol edin. Tüm boruları, Şekil 2A-B'de belirtildiği gibi boş bir mikroçip içeren bir talaş tutucuya bağlayın. Fraksiyon toplayıcıda 100 μL/dk'lık bir akış hızını doğrulamak için atık su olarak ultra arıtılmış su kullanın.
3. DMEM'e sekretagogların eklenmesi (deney günü)
- DMEM'e 0.07 mg / mL askorbat ekleyin ve glikoz içeren tamponlar için 1 M glikoz stoğu kullanarak sekretagogları DMEM + askorbat tamponunda hazırlayın.
NOT: Askorbat, oksidasyonunu önleyerek epinefrini stabilize etmek için kullanılır. Epinefrin kullanılmıyorsa, askorbat DMEM'den çıkarılabilir. - Sekretagogları, her seferinde yeni bir filtre kullanarak 0,22 μm'lik bir gözenek filtresinden iki kez süzün. Çözeltileri 37 °C'ye ısıtın ve istenen konsantrasyonu doğrulamak için glikozu bir glükometre ile ölçün.
4. Mikroperifüzyon aparatı kurulumu
- Konfokal lazer tarama mikroskobunun çevre odasını 37 °C'ye ısıtın, tüm kapıların kapalı olduğundan ve odanın sabit bir sıcaklığı koruduğundan emin olun. Isınmak için mikroçipi içeren talaş tutucuyu hazneye yerleştirin. Çip sıcaklığını kızılötesi tabanca ile doğrulayın.
NOT: Bu durumda, çevre odası 38.5 °C'ye ayarlanır, bu da çipin 37 °C'ye ulaşmasını sağlar. - Tüm boruları talaş tutucuya bağlayın (Şekil 2A-B'de belirtildiği gibi). Temel sekretagog ile 5 dakika boyunca yıkayın. Bu çalışmada hat 2 mM glukoz (G 2) ile yıkandı. Her 8-10 deneyde bir kabarcık gidericinin kabarcık kapanı membranını değiştirin.
5. Psödoadacıkların mikroçipe yüklenmesi
- Mikroçipi yüklemeden önce, deneyde kullanılacak psödoadacıkların parlak alan ve karanlık alan görüntüsünü (10x büyütme) alın.
NOT: IEQ, deneyler boyunca adacık sayısındaki değişikliklere hormon salgılanmasını normalleştirmek için kullanılır. Bu adım, deneyden bir gün önce de yapılabilir. - Mikroçipin alt ve üst yarısından fazla sıvıyı aspire edin. Mikroçipin üst yarısı, her bir kuyucuğun yeterli bir şekilde kapatılmasını sağlayan contalar içerirken, mikroçipin alt yarısı, bir cam lamel takılı kuyucukları içerir. Mikroçipte 5 μL DMEM ile iyice ıslatın. Çatlakları ıslatmak için kuyunun dış kenarlarına pipet uyguladığınızdan emin olun.
- 23 μL'lik bir hacimde 30-32 psödoislet toplamak için önceden ıslatılmış bir pipet kullanın ve psödoisletleri mikroçipin alt parçasındaki kuyunun ortasına yavaşça dağıtın. Pipetin ucunda, takılmış olabilecek herhangi bir psödoadalet olup olmadığını kontrol edin.
- Psödoadacıkları kuyu ortasına hafifçe hareket ettirmek için bir jel yükleme ucu kullanın. Bu, bir görüş alanında maksimum sayıda psödoadacık yakalanmasını sağlar.
- Stereoskoptaki mikroçipteki psödoadacıkların bir görüntüsünü alın. Bu sayı, bu işlem sırasında herhangi bir psödoislet kaybı için hesaplanan IEQ'yu ayarlamak için kullanılacaktır.
- Adım 5.3'teki tüm sözde adacıklar mikroçipe yüklenmemişse, IEQ'yu buna göre ayarlayın. Örneğin, şimdi 30 psödoadacık görselleştirilmişse ancak 32'si adım 5.1'de görselleştirilmişse, adım 5.1'deki görüntülerdeki IEQ'yu hesaplayın ve ardından 30/32 ile çarpın.
- Mikroçipin altını mikroçip tutucuya yerleştirin. Mikroçipin üst kısmını, yeşil conta tarafı aşağı bakacak şekilde dikkatlice yerleştirin.
- Mikroçipi yerinde tutarken, mikroçipi birbirine kenetlemek için mikroçip tutucuyu yavaşça kapatın. Bu işlem sırasında mikroçip üzerine aşırı basınç uygulamamaya çalışın, çünkü bunu yapmak kuyuda bulunan sıvının yerini alır ve psödoislet kaybına neden olabilir. Kuyuya hava kabarcıkları sokmaktan kaçının.
6. Senkron canlı hücre görüntüleme ve mikroperifüzyon
- Tutucudaki sekretagogları, pompayı ve mikroçipi konfokal mikroskoba takılan çevre odasına aktarın. Akış borusunu hazneden fraksiyon toplayıcıya yönlendirin.
- Tamponları, kapaklarına açıklıklar açılmış 15 mL'lik konik tüplere yerleştirin. Bu delikler, toplama borusunun borudan dışarı sürüklenmesini önler.
- Boruyu fıskiye gidericiye vidalarken, somunu ve yüksüğü ayırın ve ardından fıskiye gidericiye vidalayın. Bu, çizginin bükülmesini önler.
- Kesir toplayıcıyı her 2 dakikada bir dönecek şekilde ayarlayın. Yıkamaları ve deneysel fraksiyonları hesaba katarak fraksiyon toplayıcıya uygun sayıda tüp yükleyin. Bu deneyler için 15 yıkama tüpü (toplam 30 dakika yıkama) ve fraksiyon toplama için 28 tüp kullanılmıştır.
- Başlangıç ortamını (temel glikoz konsantrasyonunu içeren) 100 μL/dk'da (100 μL/dk akış hızında 2 dakikalık bir toplama, her bir fraksiyon tüpü başına 200 μL atık su ile sonuçlanır) sağlamak için pompayı çalıştırın. Bu akış hızı, psödoisletler üzerindeki katıksız stresi sınırlamak ve canlı görüntüleme sırasında önemli psödoislet hareketini önlemek için seçilmiştir.
- Sıvı aparattan geçerken aşağıdakilere dikkat edin:
- Fraksiyon toplayıcı musluğunun sonunda, sistemden akışı gösteren damlacıklara dikkat edin.
- Sistemden akıştaki düşüşleri izleyin; Toplama tüplerinde <200 μL varsa, bu sistemde bir tıkanıklık veya sızıntı olabileceğini gösterir. Azalan atık su hacminin olası nedenleri, çözümler ve önleme ipuçlarının bir listesi için Tablo 2'ye bakın.
- Sıvı aparattan geçerken aşağıdakilere dikkat edin:
- Akış borusundan sabit bir ortam akışı olduğunda, tüplere dağıtmak için fraksiyon toplayıcı kafasını döndürün ve fraksiyon toplayıcıyı başlatın. Psödoadacıkların dengelenmesine izin vermek için ilk 15 fraksiyonu (30 dakika) yıkama olarak toplayın. Sistemde sürekli ve doğru ortam akışı sağlamak için bu ilk 15 fraksiyonu kullanın. Bu kesirleri daha sonra atın.
- 30 dakikalık yıkama sırasında, mikroskobu canlı hücre görüntüleme için şu parametrelere göre ayarlayın: objektif lens: 1x yakınlaştırmalı U Plan Florit 20x; floresan kanalları: EGFP (emisyon = 510 nm, lazer dalga boyu = 488, algılama dalga boyu = 500-600 nm); Zaman serisi: deneyin tamamı boyunca her 2 saniyede bir elde edilen görüntü (yani, 56 dakika); Örnekleme hızı: 2 μs/piksel.
- Görüş alanındaki psödoadacıkların altını belirleyin ve odak düzlemini bu konumun 15 μm yukarısına ayarlayın. Bu, görüntüleme deneyi boyunca kullanılacak çerçevedir.
- 30 dakikalık yıkama tamamlandıktan sonra, kesir toplamaya ve görüntü almaya başlayın.
NOT: Bu adımdan önce herhangi bir sorunu belirlemek ve düzeltmek için her türlü çaba gösterilmelidir. Veri toplama başladıktan sonra, deneydeki herhangi bir duraklama veya sekretagoglara aşırı maruz kalma sonuçları olumsuz etkileyebilir. - Atık suyu 1.5 mL'lik tüplerde toplayarak, ilk temel toplama süresince psödoadacıkları başlangıç ortamı ile perifüze etmeye devam edin. Deney için zaman uygun olduğunda, boruyu temel tampondan elle yeni uyaran tampon tüpüne geçirin.
- Standart bir mikroperifüzyon dizisi Tablo 3'te gösterilmiştir.
- ~10 fraksiyonu topladıktan sonra, hormonların, özellikle glukagonun bozulmasını önlemek için tüm fraksiyonları deneyin sonuna kadar 4 °C'lik bir buzdolabına koyun.
- Her tüpteki çıkış suyu hacmini kontrol ederek deney boyunca sistem akışını izlemeye devam edin.
- Deney tamamlandığında, temel ortama geri dönün ve uyaranı temel ortamla (bu durumda 2 mM glikoz) yıkamak için pompanın 5 dakika çalışmaya devam etmesine izin verin.
- Mikroçip tutucuyu çevre odasından çıkarmak için pompayı durdurun ve fıskiye giderici ve fraksiyon toplayıcıdaki mikroçip tutucu borusunu ayırın. Sıcaklığı korumak için mikroçipi çıkardıktan sonra tüm kapıları kapatın.
- Perifusatları sonraki hormon analizi için −80 °C'de saklayın.
7. Psödoislet asit etanol ekstraksiyonu
- Mikroçip tutucuyu dikkatlice açın ve mikroçipin üst kısmını kaldırın. Kuyudan psödoadacıkları çıkarmak için bir pipet ve tezgah üstü mikroskop kullanın ve bunları 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Gerekirse bir tezgah üstü mikroskop kullanarak tüm psödoadacıkların toplanmasını sağlayın.
- Adım 5.5'e benzer şekilde, adacık ekstraktını IEQ'yu ayarlamak için kuyudan çıkarmadan önce mikroçipteki psödoadacıkların son bir görüntüsünü alın.
- 500 μL PBS ile iki kez yıkayın. Psödoadacıkları her yıkama arasında 94 x g'da 1 dakika döndürün ve süpernatanı aspire edin.
- Son yıkamayı çıkardıktan sonra 200 μL asit etanol (5.5 mL %95 etanol + 50 μL 12 N HCl) ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de saklayın.
- Ertesi gün, ekstraktları 15.989 x g ve 4 °C'de 10 dakika döndürün. 45 μL'yi üç yeni tüpe ayırın. Hormon içeriği analizi için −80 °C'de saklayın. Hormon sekresyonunun IEQ'ya normalleştirilmesine bir alternatif olarak, hormon sekresyonu, ekstraktlardan ölçülen psödoislet hormonu içeriğine de normalleştirilebilir.
8. Ek deneyler ve temizlik
- Ek teknik kopyalar elde etmek için 5-7 arasındaki adımları sonraki psödoislet gruplarıyla tekrarlayın.
- Tüm mikroperifüzyon deneylerini bitirdikten sonra, mikroçip ve borudan 5 dakika boyunca %10 çamaşır suyu ve ardından hortumu sterilize etmek için 30 dakika boyunca ultra arıtılmış su akıtın.
9. Veri analizi
NOT: Canlı hücre görüntüleme, lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılarak gerçekleştirildi. Görüntüler, mikroskopla ilişkili görüntüleme yazılım paketi kullanılarak analiz edildi. Aşağıdakiler genel yönergelerdir ancak mikroskop üreticisine ve görüntü elde etme yazılımına bağlı olarak farklılık gösterebilir.
- Veri normalizasyonu için toplam adacık eşdeğerlerinin (IEQ) belirlenmesi
- Yazılım programını açın ve pencerenin sağ üst köşesindeki Edinme sekmesine tıklayın. Makro Yöneticisi'nde (Görünüm > Aracı Windows > Makro Yöneticisi) işlevini seçerek tüm karanlık alan görüntülerinde toplu yazma.
- Aynı anda birden fazla görüntü yakmak için, Makro Yöneticisi'ndeki Çalıştır düğmesine tıklamadan önce Toplu Modu Değiştir düğmesine tıklayın. Yazılan görüntüler için kaynak görüntü konumunu ve hedef konumu seçmek için ekrandaki talimatları izleyin. Görüntü dosyası türü için Tagged Imagine File Format (*.tif) öğesini seçin.
- IEQ ölçümü için, adım 5.1'de alınan 10x karanlık alan görüntüsünün yanmış sürümünü açın. Üst kısımdaki Sayım ve Ölçüm sekmesine tıklayın ve soldaki Manuel HSV Eşiği düğmesini seçin.
- Psödoislet sınırını aşmadan her bir psödoislet kırmızıyla vurgulanana kadar pozitif alanı (kırmızı) eklemek/kaldırmak için damlalık işlevini kullanın. Say ve Ölç'e tıklayın.
- Bir araya getirilen sözde adacıkları bölmek için otomatik bölme veya manuel bölme işlevlerini kullanın.
- Sözde adacıkları manuel olarak bölmek için, manuel bölme işlevini seçin, sözde adacıkları ayıran bir çizgi çizmek için sol tıklayın ve ardından çizgiyi tamamlamak için sağ tıklayın. Otomatik bölmek için, otomatik bölme işlevini seçin ve ilgilendiğiniz gruplandırılmış sözde adacıklara tıklayın. Daha sonra doğru otomatik bölmeyi onaylayın.
- Toplu olarak yakılan görüntülerde, ölçek çubuğu ve büyütme metni pozitif olarak işaretlenebilir. Doğru bir sayım için fareyi kullanarak metni ve ölçek çubuğunu vurgulayarak ve Delete klavye tuşuna basarak bu nesneleri silin.
- Tüm sözde adacıkların sayıldığını doğrulamak için filtreyi açın ve kapatın. Dosya, çapraz referans için programın dışında da açılabilir. Bitirdiğinizde, Excel'e Aktar'a tıklayın.
- Elektronik tabloyu açın ve aşağıdaki gibi değiştirin.
- En alttaki sayı, ortalama ve sıralama bilgilerini silin. Nesneleri ortalama çaplarına göre sıralayın. Ortalama çaptan sonra bir sütun ekleyin ve sütunu "Pseudoislet sayısı" olarak adlandırın.
- Adacık sayısı, aşağıdaki her indeks içinde yer alan ortalama çaplara sahip psödoadacıkların sayısı ile belirlenir. Endeks başına psödoislet sayısını ilgili IEQ dönüşüm faktörü ile çarpın ve toplam IEQ'yu belirlemek için bu değerleri toplayın. Her deneyden önce elde edilen görüntüler üzerinde IEQ hesaplamalarını gerçekleştirin. Aşağıdaki dizinleri ve IEQ dönüştürme faktörlerini kullanın:
1-49 μm: × 0.167
50-100 μm: × 0,667
101-150 μm: × 1.685
151-200 μm: × 3.500
201-300 μm: × 6.315
301-350 μm: × 10.352 - IEQ sayımlarını belirlemeye yönelik örnek bir elektronik tablo için Ek Dosya 1'e bakın.
- Yazılım programını açın ve pencerenin sağ üst köşesindeki Edinme sekmesine tıklayın. Makro Yöneticisi'nde (Görünüm > Aracı Windows > Makro Yöneticisi) işlevini seçerek tüm karanlık alan görüntülerinde toplu yazma.
- Yazılımda canlı hücre görüntüleme ölçümü
- İstediğiniz dosyayı (.oir) cellSens'te açın.
- İlgilenilen bölgeleri (ROI'ler) aşağıdaki gibi belirleyin.
- ROI'leri (yani her bir sözde adacık) belirlemek için çizim araçlarını kullanın. Serbest çizim seçeneğini kullanıyorsanız, şekli kapatmak için sağ tıklatın.
- Ok elini kullanarak ve görüntüdeki tüm yatırım getirilerini kapsayacak şekilde sürükleyerek tüm yatırım getirilerini vurgulayın. Tüm ROI'ler vurgulandıktan sonra sağ tıklayın ve Zaman İçinde Dinamik ROI'ye Dönüştür'ü seçin
- ROI'lerin zaman içinde doğru olduğunu onaylamak için XYT dosyasını oynatın. ROI belirli bir dönemde doğru değilse, o dönemdeki boyutunu/konumunu düzeltin. Yazılım, bu değişikliklere uyması için ROI'nin boyutunu/konumunu zaman içinde kademeli olarak ayarlayacaktır. Görüntüleme deneyi boyunca ROI doğru olana kadar bu adımları tekrarlayın.
- Her ROI üzerinde yoğunluk ölçümlerini aşağıdaki gibi gerçekleştirin.
- Araç çubuğunda, Yoğunluk Profilini Ölç'e tıklayın. Analiz edilecek yatırım getirilerini vurgulayın; Birden fazla ROI seçmek için shift + tıklama tuşlarını kullanın.
NOT: Yazılımda aynı anda birden fazla dosya açık olsa da, aynı anda yalnızca bir dosyadan gelen yatırım getirilerini analiz edin. - Arka plan gürültüsünü hesaba katmak için, her yoğunluk değerinden çıkarılacak sabit bir değer seçin veya arka plan olarak bir ROI belirleyin. Yürüt'e tıklayın.
- Yoğunluk Profili araç çubuğunda, verileri dışa aktarmak için Excel'e Aktar'a tıklayın.
- Tüm veri noktalarını, 7-8 dakika arasında ölçülen yoğunlukların ortalamasına (yani, ilk başlangıç ortamı perifüzyonunun son dakikası) normalleştirin. Her zaman noktasındaki bu normalleştirilmiş değerler, göreli cADD yoğunluğu olarak tanımlanır. Görüntüleme verisi analizi ve normalleştirmenin örnek bir elektronik tablosu için Ek Dosya 2'ye bakın.
- Araç çubuğunda, Yoğunluk Profilini Ölç'e tıklayın. Analiz edilecek yatırım getirilerini vurgulayın; Birden fazla ROI seçmek için shift + tıklama tuşlarını kullanın.
- Her fraksiyondaki hormon salgısını ölçün ve adacık ekstraktını yapın. Bu deneylerde insülin ve glukagon konsantrasyonları ELISA ile ölçüldü. Adım 9.1'de belirlenen IEQ ölçümlerini veya ekstrakt hormon içeriğini kullanarak her fraksiyondaki hormon sekresyonunu psödoislet hacmine normalleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biyosensör eksprese eden insan psödoisletleri, cAMP biyosensör cADDis'i kodlayan yapıların adenoviral iletimi yoluyla oluşturuldu (Şekil 1A). Şekil 1B, 6 günlük kültürden sonra gözlemlenen tam olarak oluşmuş psödoisletler ile transdüksiyona uğramış insan adacık hücrelerinin zaman içinde yeniden toplanmasını göstermektedir. Hücreler 48 saat içinde görünür cADDis floresansı göstermeye başladı ve kültür periyodunun sonunda transdüksiyon hücrelerinde yüksek biyosensör ekspresyonu vardı. Bu protokolü kullanarak, psödoisletler alfa hücrelerinde ortalama %60 ve beta hücrelerinde %95'lik bir transdüksiyon verimliliği gösterdi (Şekil 1C-D).
Entegre mikroakışkan ve canlı hücre görüntüleme platformu Şekil 2'de vurgulanmıştır. CADDis eksprese eden psödoisletleri hasat ettikten ve gece boyunca taze ortamda inkübe etmelerine izin verdikten sonra, psödoisletler bir mikroçip üzerinde önceden ıslatılmış bir kuyunun ortasına yüklendi. Mikroçip daha sonra bir tutucuya kenetlendi ve bir mikroskop aşamasına yerleştirildi. 37 ° C'de tutulan mikroskoba bağlı çevre odasının içinde, psödoisletler, sisteme hava kabarcıklarının girmesini önlemek için bir kabarcık gidericiden pompalanan alfa ve beta hücre sekretagogları içeren ortamla perifüze edildi. Mikroçipteki psödoadacıklar 100 μL/dk'lık bir akış hızında perifüze edildi ve atık su, bir fraksiyon toplayıcı aracılığıyla 2 dakikalık aralıklarla toplandı (Şekil 2A-B). Mikroçip kuyusunun cam tabanı, daha sonraki analizler için gerekli olan bir görüş alanında birden fazla psödoadacığın cADDis floresan yoğunluğunun yakalanmasına izin verir (Şekil 2C).
Şekil 3, diyabeti olmayan üç insan donöründen izole edilen doğal adacıklardan üretilen cADDis eksprese eden psödoisletler ile açıklanan protokolü kullanan temsili sonuçları göstermektedir. cADDis eksprese eden psödoisletler, 2 mM glukoz (G2), 20 mM glukoz artı fosfodiesteraz inhibitörü izobütilmetilksantin (IBMX; G20 + IBMX) ve 2 mM glikoz artı epinefrin (G2 + Epi). Bu protokol, alfa ve beta hücrelerinde cAMP'yi geliştiren bilinen hücre içi yolları ortaya çıkarır (Şekil 3A-B). Mikroperifüzyon kurulumu, cADDis floresansı ve hormon sekresyonu yoluyla hücre içi cAMP dinamiklerinin senkron toplanmasını kolaylaştırır (Şekil 3C-E). Deneysel titizliği sağlamak için, psödoadacıklar üzerinde deneyler aynı donörden iki ila üç kopya ile gerçekleştirildi ve toplam değerler Şekil 3C-E,D',E'de çizildi. G2'ye maruz kalındığında, insülin sekresyonu gibi nispi cADDis yoğunluğu düşük ve stabildi (Şekil 3C-D). Psödoisletler G 20 + IBMX'e maruz kaldığında, nispi cADDis yoğunluğundaki bir artışla kanıtlandığı gibi, hücre içi cAMP konsantrasyonunda güçlü bir artış olmuştur (Şekil 3C). Bu artış, hem insülin hem de glukagon sekresyonunda eşlik eden belirgin artışların gösterdiği gibi, büyük olasılıkla hem beta hem de alfa hücrelerinden kaynaklanıyordu (Şekil 3D-E). Psödoisletlerin G2 + Epi'ye maruz kalması, hücre içi cAMP konsantrasyonunu arttırdı (Şekil 3C) ve bu, glukagon sekresyonunda bir artış ile ilişkilendirildi (Şekil 3E). G2 + Epi'ye cAMP yanıtının IBMX yanıtına kıyasla nispeten daha küçük olduğu gözlemi, alfa hücrelerinde beta hücrelerine karşı cADDis adenoviral yapısının daha düşük transdüksiyon verimliliğinin bir kombinasyonu nedeniyle meydana gelmiş olabilir (Şekil 1D) ve bu sinyalin alfa hücresi özgüllüğü (Şekil 3E). Bu nedenle, birincil insan beta ve alfa hücrelerinde bilinen cAMP aracılı sinyal yollarına dayanarak, bu protokol, teknik ve biyolojik kopyalar arasında cADDis biyosensörünün ve beta ve alfa hücre hormonu salgılama profillerinin nispi floresan yoğunluğunu aynı anda incelemek için bu entegre platformun faydasını başarıyla göstermektedir.
Şekil 1: Biyosensör eksprese eden insan psödoadacıklarının oluşumu . (A) Birincil insan adacık ayrışmasını, tek hücreli bir durumda biyosensör yapısı ile transdüksiyonu ve yeniden agregasyonu gösteren şematik. Yeniden agregasyonu takiben, psödoadacıklar hasat edilir ve senkron canlı hücre görüntüleme ve mikroperifüzyona tabi tutulur. Protokol adımları şema boyunca belirtilmiştir. (B) 6 günlük bir yeniden toplama periyodu sırasında cADDis eksprese eden bir psödoislet oluşumunu yakalayan temsili görüntüler; üst: kontrastlı parlak alan, alt: cADD floresandır. Ölçek çubuğu 100 μm'dir. (C) Sırasıyla C-peptid (CPEP, mavi) ve glukagon (GCG, kırmızı) etiketleme ile görselleştirilen alfa ve beta hücrelerine sahip bir cADDis eksprese eden psödoadacın (yeşil) temsili görüntüleri. DAPI (beyaz) nükleer bir karşı leke olarak kullanıldı. Beyaz oklar, dönüştürülen alfa ve beta hücrelerini vurgular. Sarı ok, dönüştürülmemiş bir alfa hücresine işaret eder. Ölçek çubuğu 100 μm'dir. (D) Beta ve alfa hücrelerinde MOI 1.000'de transdüksiyon verimliliğinin bir HALO sitonükleer algoritması ile ölçülmesi (N = 2 donör, birden fazla psödoadacıkta donör başına ortalama 601 beta hücresi ve 627 alfa hücresi analiz edildi). Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Entegre canlı hücre görüntüleme ve mikroperifüzyon sistemi. (A) Canlı hücre görüntüleme ve mikroperifüzyon sistemi bileşenlerine genel bakış. Bir mikroçip içindeki psödoadacıklar, bir çevre odası içine alınmış bir konfokal lazer tarama mikroskobu sahnesine yerleştirilir. Bu konfigürasyon, bir dizi iyi tanımlanmış sekretagoga dinamik yanıt sırasında biyosensör floresansındaki hücre içi değişikliklerle ilgili zamansal çözünürlüğe ve hücre içi sinyal olaylarıyla daha fazla entegrasyon için hormon sekresyonunun senkron ölçümü için psödoislet perifusat fraksiyonlarının toplanmasına izin verir. (B) Çevre odasının dışındaki mikroakışkan platformun bileşenleri. Akışkan yönlülüğü aşağıdaki gibidir: (1) sekretagog içeren tüpler ila (2) 0.01 boruda (3) peristaltik pompa borusu (0.02 iç çapta) ila (4) 0.01 boruda (5) kabarcık giderici için (6) mikroçip girişinde (0.01 tüpte) (7) mikroçip tutucu / mikroçip için (8) mikroçip çıkışı (tüpte 0.01). Not: Borudaki 0.01, konik adaptörlerle (beyaz ok uçları) peristaltik pompa borusuna birleştirilir. Boru, bir somun ve yüksük (yeşil ok ucu) aracılığıyla fıskiye gidericiye takılır. Kesikli kırmızı çizgi, bileşenler arasındaki bağlantıyı gösterir. (C) Konfokal mikroskop tablasına monte edilmiş çevre odası içindeki mikroçip ve tutucunun yakından görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İnsan psödoislet cAMP ve hormon sekresyon dinamikleri. (A) Beta ve alfa hücrelerinde sekretagog kaynaklı cADD floresan ve hormon sekresyonunun şemaları. Beta hücrelerinde epinefrin (Epi), adenilil siklazın (AC) inhibisyonuna, cAMP'nin azalmasına ve insülin sekresyonunun azalmasına yol açan Gi-bağlı alfa 2-adrenerjik reseptörleri bağlar. Alfa hücrelerinde Epi, Gs-bağlı beta 1-adrenerjik reseptörleri uyararak AC'nin aktivasyonuna ve hücre içi cAMP'de bir artışa yol açar. Her iki hücre tipinde de, bir fosfodiesteraz (PDE) inhibitörü olan IBMX, hücre içi cAMP'nin bozulmasını önler ve hormon salgılanmasını destekler. Serbest hücre içi cAMP'nin bağlanması, cADDis proteininde konformasyonel değişikliklere neden olur, böylece floresan yoğunluğunda bir artışa neden olur. (B) G2 (2 mM glikoz), G 20 + IBMX (20 mM glikoz + IBMX) ve G 2 + Epi'ye (2 mM glikoz + Epi) yanıt olarak canlı hücre görüntüleme sırasında cADDis eksprese eden psödoisletlerin temsili görüntüleri. Psödoadacıklar beyaz renkle belirtilmiştir ve sekretagog tipi sol üst köşede belirtilmiştir. Ölçek çubuğu 50 μm'dir. (C) Bağıl cADD, üç organ donörü preparatından insan adacıklarından yapılan cADDis eksprese eden psödoisletler arasında zaman içinde ortalama floresandır. (D) Belirtilen sekretagoglara yanıt olarak agrega insülin ve (E) glukagon sekresyonu. Veriler, adacık eşdeğeri (IEQ) cinsinden ifade edilen adacık hacmine normalleştirilir. Psödoisletler üç insan adacık donöründen hazırlandı ve iki ila üç teknik kopya/donör kullanılarak analiz edildi. Adcık hücreleri, MOI 500 (N = 1) veya 1.000'de (N = 2) cADDis adenoviral yapısı ile dönüştürüldü. (D',E') Psödoislet hormonu içeriği. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Donör demografisi. cADDis biyosensör ekspresyonu ve canlı hücre görüntüleme ile psödoadacıkların hazırlanması sırasında kullanılan insan adacıkları için donör demografik bilgilerinin özeti. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: Sorun giderme kılavuzu. Sorunların yaygın nedenleri, çözümleri ve önleme teknikleri de dahil olmak üzere karşılaşılabilecek zorluklar vurgulanır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 3: Mikroperifüzyon protokolü. Temsili sonuçlarda vurgulanan deneyler için kullanılan örnek bir mikroperifüzyon protokolü. Bu protokol özellikle hücre içi cAMP ve adacık hormonu sekresyonunun birlikte kaydedilmesine yöneliktir; İlgilenilen hücre içi moleküle ve/veya seçilen biyosensör dinamiğine bağlı olarak alternatif protokoller daha uygun olabilir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Adacık eşdeğerlerinin hesaplanması (IEQ). Her deneyde kullanılan psödoadacıklar için IEQ'nun nasıl hesaplanacağına bir örnek. Sayfa 1'deki veriler (1. Nesne Ölçümleri), doğrudan yazılımdan dışa aktarılan nesne verilerini içerir (bkz. adım 9.1). Yeşil vurgulanan sütun, adım 9.1.6.2'de her bir indeks içinde yer alan psödoadacıkların sayısını saymak için eklenir. Sayımlar Sayfa 2'ye kopyalanır (2. IEQ Hesaplaması) ve endeks başına uygun dönüştürme faktörü kullanılarak IEQ'ya dönüştürülür. Talaş yüklemesi sırasında (Çip içi psödoislet #) ve ekstraktların çıkarılmasından önce (Çalışma sonrası psödoislet #) herhangi bir psödoislet kaybı, bu aşamalar sırasında yakalanan görüntüler kullanılarak açıklanabilir (sırasıyla bkz. adım 5.5 ve adım 7.1.1). Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 2: Veri analizi. Adım 9.2'de elde edilen verilerden bağıl cADD yoğunluğunun nasıl hesaplanacağına bir örnek. D-F sütunlarındaki ham veriler doğrudan yazılımdan dışa aktarılır. Her bir zaman noktasındaki ham değerler, başlangıç ortamının son dakikasındaki ortalama yoğunluğa normalleştirilir (G 2; protokolde 7-8 dakika). Zaman içinde tüm psödoadacıklardaki ortalama yoğunluk, Şekil 2C'deki grafiği oluşturmak için hesaplanır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir mikroperifüzyon sisteminin, biyosensör eksprese eden psödoadacıkların ve lazer taramalı konfokal mikroskopinin entegrasyonu, hücre içi sinyal olaylarının ve dinamik hormon salgı profillerinin senkronize değerlendirmesine izin verir. Dinamik mikroperifüzyon sistemi, psödoisletlere bir dizi iyi tanımlanmış uyaran iletebilir ve insülin ve glukagon konsantrasyonlarının ticari olarak temin edilebilen ELISA ile ölçülebildiği atık suyun toplanmasına izin verir. Aynı zamanda, bir konfokal mikroskopi platformu tarafından biyosensör eksprese eden psödoisletlerin canlı hücre görüntülemesi, hücre içi sinyalleşme olayları hakkında bilgi sağlayan gerçek zamanlı biyosensör floresan aktivitesini yakalar. Biyosensör sinyalinin ve hormon salgı profilinin zaman içinde eş zamanlı olarak ölçülmesi, hücre içi sinyal olaylarının adacık hormon sekresyonu üzerindeki etkisini doğrudan karşılaştırma fırsatı sağlar.
Sunulan protokolün başarısı için birden fazla husus önemlidir. Bunlar, biyosensör eksprese eden psödoadacıkların üretilmesini ve psödoislet hareketi olmadan her deney sırasında sabit bir akış hızının kullanılmasını içerir. 100 μL/dak'lık bir akış hızında ve 2 dakikalık fraksiyon toplama ile, her bir fraksiyonun perifüzyon hacmi 200 μL'dir ve 10 μL/fraksiyondan fazla dalgalanmamalıdır. Ek olarak, görüntüleme yazılımı görüş alanı içindeki XY düzlemindeki küçük psödoadacık hareketine uyum sağlayabilirken, mikroperifüzyon deneyi sırasında görüş alanının dışına çıkan psödoadacıklar analiz edilemez. Bu nedenle, sorunu çözmek için girişimlerde bulunulabilmesi için deney sırasında herhangi bir sızıntı ve hareketi erkenden tespit etmek önemlidir. Potansiyel zorlukların bir özeti, ortak nedenleri, çözümleri ve bunların oluşmasını önlemeye yönelik ipuçları Tablo 2'de özetlenmiştir. Bununla birlikte, bu protokol, çipi yüklemeden önce bir test deneyi yapmak (adım 2.3) ve görüntü elde etmeden önceki 30 dakikalık yıkama periyodu boyunca psödoisletleri mikroskop aracılığıyla önemli hareketler için izlemek gibi sorunları tahmin etmek için birçok fırsat içerir ve mikroperifüzyon fraksiyonu toplama (adım 6.4-6.5).
Bir sınırlama, mevcut konfokal mikroskopi platformundaki görüş alanının, mikroçip içindeki tüm psödoadacıkların bir kerede yakalanmasına izin vermemesidir. Mikroperifusatlarda insülin ve glukagonu güvenilir bir şekilde tespit etmek için en az 30 psödoislet gerekirken, 20x büyütmede sadece bir alt küme görüntülenebilir. Psödoadacıkların kuyu merkezine yüklenmesi, görüş alanında yakalanabilecek sayıyı en üst düzeye çıkarır. Ek olarak, mikroçip üç kuyu ile donatılmışken, konfokal mikroskopi ile entegrasyon, ölçümleri bir seferde bir kuyu ile sınırlar, bu da teknik kopyaların paralel yerine seri olarak yapılması gerektiği anlamına gelir. Ayrıca, bu mevcut yaklaşım, tüm psödoislet floresansını alfa ve beta hücresine özgü salgı çıktıları ile birlikte kaydeder; Bununla birlikte, bu, genetik olarak kodlanmış biyosensörlerin hücreye özgü hedeflemesini kullanarak alfa veya beta hücre hücre içi olaylardaki değişiklikleri doğrudan ölçmek için değiştirilebilir. Bu protokolde sadece insülin ve glukagon sekresyonu değerlendirilirken, gelecekteki çalışmalar delta hücrelerinden somatostatin sekresyonu gibi diğer adacık hormonlarının salgılanmasını da ölçebilir. Şu anda, somatostatin sadece IBMX gibi oldukça uyarıcı sekretagoglara yanıt olarak bu platformla tespit edilebilir. Son olarak, izole adacıklar ve psödoadacıklar, adacıkların in vivo nörovasküler mimarisinden yoksundur ve bu da adacık fonksiyonunu doğrudan etkilediği gösterilmiştir.
Sonuç olarak, açıklanan platform, biyosensör ve hormon sekresyonu kullanarak hücre içi sinyal olaylarının değerlendirilmesini senkronize etmek için bir strateji sağlar. Bu sistem, RNA interferansı (siRNA veya shRNA) veya CRISPR aracılı gen hedefleme stratejileri tarafından ortaya çıkan fonksiyonel bozulmaları incelemek için daha da uyarlanabilir. Bu yöntemler, daha önce GCaMP6f7 için gösterildiği gibi, cADDis dışında genetik olarak kodlanmış biyosensörler kullanılarak ilgilenilen yolların çok sayıda hücre içi veya hücre dışı olay üzerindeki biyolojik etkilerini belirlemek için kullanılabilir. Ek olarak, belirli bir hücre tipinin seçici transdüksiyonu ve/veya hücreye özgü uyaranlara maruz kalma, insan adacığı bağlamında belirli bir hücre tipinin hücre içi sinyal olaylarının hedefli sorgulanmasına izin verecektir. Örneğin, insan pankreas adacıklarının alfa hücreleri, hücre yüzeyi belirteçleri kullanılarak saflaştırılabilir ve daha sonra hücre içi kalsiyum dinamiklerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan genetik olarak kodlanmış kalsiyum biyosensörü GCaMP ile dönüştürülebilir. Viral olarak transdüksiyona uğrayan bu hücreler daha sonra psödoadacıklar oluşturmak için diğer transdüksiyonsuz adacık hücreleriyle yeniden birleştirilebilir veya tip 1 diyabette bileşimsel olarak adacıklara benzeyen alfa hücresi ile zenginleştirilmiş psödoadacıklar oluşturmak için kendi başlarına yeniden toplanmaya bırakılabilir. Bu yaklaşım, Ca2+ gibi hücre içi moleküllerin yüklü Ca2 + duyarlı boyalar kullanılarak ölçüldüğü ve hücre kimliğinin immün boyama veya başka yollarla canlı hücre görüntülemeden sonra belirlendiği daha geleneksel tekniklerden farklıdır15. Alternatif olarak, ölçümler, parakrin sinyalizasyonunun adacık hücresi fonksiyonu üzerindeki etkisinin kaybolduğu tek hücreli durumda yapılır15. Bu nedenle, bir psödoislet sistemi ve mikroperifüzyon platformu ile entegre edilen bu canlı hücre görüntüleme, entegre hücresel süreçlerin bilgisini genişletirken adacık biyolojisindeki önceki zorlukların üstesinden gelir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Organ bağışçıları ve aileleri paha biçilmez bağışları için takdir edilmektedir ve Uluslararası Organ Tedarik Organizasyonları Enstitüsü, Tıbbın İlerlemesi (IIAM) ve Ulusal Hastalık Araştırma Değişimi (NDRI), insan pankreas dokusunu araştırma için erişilebilir hale getirme konusundaki ortaklıkları için kabul edilmektedir. Bu çalışma, İnsan Adacık Araştırma Ağı (RRID:SCR_014393), İnsan Pankreas Analiz Programı (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 ve DK20593 (Vanderbilt Diyabet Araştırma ve Eğitim Merkezi), Leona M. ve Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, ABD Gazi İşleri Bakanlığı (BX000666), Ulusal Sağlık Enstitüleri (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 ve Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu (1937963) NIGMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
- Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
- Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells. Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).
- Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium. Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Halban, P. A., et al. β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).
- Brissova, M., et al. α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
- Walker, J. T., et al. Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells. JCI Insight. 5 (10), e06990 (2020).
- Giannoukakis, N., et al. Infection of intact human islets by a lentiviral vector. Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).
- Curran, M. A., et al. Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1. Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).
- Kayton, N. S., et al. Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).
- Lenguito, G., et al. Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets. Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).
- Tengholm, A. Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell. Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).
- Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).
