Summary
Detta protokoll beskriver en metod för synkron insamling och samregistrering av intracellulära signaleringshändelser och utsöndring av insulin och glukagon av primära humana pseudoöar med hjälp av adenoviral tillförsel av en cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP) biosensor, en cAMP-differensdetektor in situ (cADDis) och ett mikroperifusionssystem.
Abstract
De Langerhanska öarna i bukspottkörteln, som är små 3D-samlingar av specialiserade endokrina celler och stödceller insprängda i bukspottkörteln, har en central roll i kontrollen av glukoshomeostas genom utsöndring av insulin av betaceller, vilket sänker blodsockret, och glukagon av alfaceller, vilket höjer blodsockret. Intracellulära signalvägar, inklusive de som medieras av cAMP, är nyckeln till reglerad alfa- och betacellshormonutsöndring. 3D-östrukturen, även om den är nödvändig för koordinerad öfunktion, utgör experimentella utmaningar för mekanistiska studier av de intracellulära signalvägarna i primära humana ö-celler. För att övervinna dessa utmaningar och begränsningar beskriver detta protokoll en integrerad plattform för avbildning av levande celler och mikrofluidik som använder primära humana pseudoöar som genereras från donatorer utan diabetes och som liknar inhemska öar i sin morfologi, sammansättning och funktion. Dessa pseudoislets är storlekskontrollerade genom dispersions- och reaggregeringsprocessen av primära humana öceller. I det dispergerade tillståndet kan genuttrycket hos ö-celler manipuleras; Till exempel kan biosensorer som den genetiskt kodade cAMP-biosensorn, cADDis, introduceras. När pseudoöar väl har bildats kan de uttrycka en genetiskt kodad biosensor, i kombination med konfokalmikroskopi och en mikroperifusionsplattform, möjliggöra synkron bedömning av fluorescerande biosensordynamik och alfa- och betacellshormonsekretoriska profiler för att ge mer insikt i cellulära processer och funktion.
Introduction
De Langerhanska öarna är miniorgan utspridda i bukspottkörteln vars funktion är avgörande för upprätthållandet av glukoshomeostas. Insulin utsöndras från betaceller efter metabolism av glukos, en ökning av ATP/ADP-kvoten, stängning av ATP-känsliga kaliumkanaler, depolarisering av plasmamembranet och inflöde av extracellulärt kalcium1. Glukagonsekretionen från alfaceller är mindre känd, men det har antagits att intracellulära och parakrina vägar bidrar till glukagongranulär exocytos 2,3,4. Både typ 1- och typ 2-diabetes är associerade med ö-cellsdysfunktion 5,6,7. Därför är det viktigt att belysa de intracellulära signalvägarna som förmedlar ö-hormonutsöndring för att förstå fysiologiska och patologiska mekanismer i bukspottkörtelns öar.
Holmarnas sfäriska arkitektur utgör vissa hinder för experiment. Dessa utmaningar inkluderar variation i östorlek och 3D-karaktären hos öar, vilket minskar viral transduktion inom ökärnan 8,9. För att övervinna dessa utmaningar utvecklades ett pseudoislet-system, där primära mänskliga öar sprids i enskilda celler, adenoviralt transduceras med konstruktioner som kodar för mål av intresse, och reaggregeras för att bilda storlekskontrollerade, ö-liknande strukturer som kallas pseudoislets7. Jämfört med inhemska öar från samma donator som har odlats parallellt, är dessa pseudoöar likartade i morfologi, endokrin cellsammansättning och hormonutsöndring7. Denna metod gör det möjligt att uttrycka konstruktioner i hela pseudoön, vilket innebär att den övervinner en tidigare barriär för enhetlig genetisk manipulation av primära mänskliga öar 7,8,9.
I detta protokoll är pseudoislet-systemet integrerat med en mikrofluidisk anordning för att uttrycka biosensorer i primära humana ö-celler och få tidsmässig upplösning av pseudoislet-hormonutsöndring under dynamisk perifusion10,11,12. Pseudoöarna placeras i ett mikrochip och utsätts för ett jämnt flöde av olika sekretagoger via en peristaltisk pump12. Mikrochipet har en genomskinlig glasbotten och är monterat på ett konfokalmikroskop för att registrera den intracellulära signaldynamiken via förändringar i biosensorns fluorescensintensitet. Biosensoravbildning synkroniseras med uppsamling av mikroperifusionsavloppsvatten för efterföljande analys av insulin- och glukagonsekretion7. Jämfört med makroperifusion gör denna mikroperifusionsmetod det möjligt att använda färre pseudoöar på grund av den mindre volymen av den mikrofluidiska enheten jämfört med makroperifusionskammaren7.
För att utnyttja användbarheten av detta system uttrycktes den cykliska adenosinmonofosfatdosametern (cADDis) biosensor in situ (cADDis) i humana pseudoöar för att bedöma cAMP-dynamik och hormonutsöndring. cADDis-biosensorn består av ett cirkulärt permuterat grönt fluorescerande protein (cpGFP) placerat i gångjärnsregionen av ett utbytesprotein som aktiveras av cAMP 2 (EPAC2), som förbinder dess regulatoriska och katalytiska regioner. Bindningen av cAMP till den regulatoriska regionen av EPAC2 framkallar en konformationsförändring i gångjärnsområdet som ökar fluorescensen från cpGFP13. Intracellulära budbärare såsom cAMP framkallar insulin- och glukagonsekretion efter uppströmsaktivering av G-proteinkopplade receptorer14. Avbildning av levande celler i kombination med mikroperifusion hjälper till att koppla ihop den intracellulära cAMP-dynamiken med utsöndring av ö-hormon. Specifikt, i detta protokoll, genereras cADDis-uttryckande pseudoislets för att övervaka cAMP-svar i alfa- och betaceller på olika stimuli: lågt glukos (2 mM glukos; G 2), högt glukos plus isobutylmetylxantin (IBMX; 20 mM glukos + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX) och lågt glukos plus adrenalin (Epi; 2 mM glukos + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Detta behandlingsarbetsflöde möjliggör bedömning av den intracellulära cAMP-dynamiken direkt via 1) IBMX-medierad fosfodiesterashämning, som förbättrar intracellulära cAMP-nivåer genom att förhindra dess nedbrytning, och 2) adrenalin, en känd cAMP-beroende stimulator av alfacellsglukagonsekretion medierad av β-adrenerg receptoraktivering. Stegen för att installera mikroperifusionsapparaten för avbildningsexperiment med levande celler, laddning av pseudoislets i mikrochipet, synkron avbildning av levande celler och mikroperifusion samt analys av biosensorspår och hormonutsöndring med mikroplattbaserade hormonanalyser beskrivs nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humana öar (N = 4 preparat) erhölls genom partnerskap med Integrated Islet Distribution Program, Human Pancreas Analysis Program, Prodo Laboratories, Inc. och Imagine Pharma. Vanderbilt University Institutional Review Board betraktar inte avidentifierade prover från bukspottkörteln som forskning på människor. Detta arbete skulle inte vara möjligt utan organdonatorer, deras familjer och organisationer som tillvaratar organ. Se tabell 1 för information om donatordemografi. Humana öar från bukspottkörteldonatorer utan diabetes isolerades med mindre än 15 timmars kall ischemitid.
1. Pseudoislet-bildning (beskrivs i Walker et al.7)
- Erhåll och handplocka primära mänskliga öar med hjälp av en P200-pipett och bänkmikroskop, var noga med att inte kontaminera pipettspetsen på några ytor utanför ökulturmediet (10 % FBS, 100 μg/ml streptomycin, 100 U/ml penicillin, 2 mM L-glutamin i CMRL 1066).
- Överför primära öar till ett 15 ml rör och utför alla följande pseudoisbildningssteg under en vävnadsodlingshuv för att förhindra kontaminering. Dissociera långsamt de primära öarna i 7 minuter vid rumstemperatur med en P1000-pipett i 0,025 % trypsin. Lösningen kommer att bli ogenomskinlig när öarna börjar brytas isär.
- För dessa studier ger 200-300 handplockade primära öar med diametrar på cirka 200 μm dispergerade i 500 μL 0,025 % trypsin en till två 96-brunnars plattor av pseudoislets; Det exakta antalet kan variera beroende på den genomsnittliga östorleken och livskraften. För > 500 primära öar, skala upp volymen av 0,025 % trypsin som används i förhållandet 1:1 (t.ex. 600 μL 0,025 % trypsin för 600 handplockade öar).
- Dämpa dispersionen genom att tillsätta en volym Vanderbilt Pseudoislet Media (VPM) som motsvarar den använda trypsinvolymen. Tvätta sedan två gånger med 1 ml VPM. För tvättarna, centrifugera de dispergerade cellerna vid 485 x g i 2-3 minuter vid 4 °C i en bänkcentrifug. Återsuspendera cellerna i en definierad volym VPM (vanligtvis 1 ml) för räkning.
OBS: Pseudoisletgenerering och VPM-sammansättning beskrivs i detalj i en tidigare publikation7. Kortfattat innehåller VPM lika stora volymer anrikade CMRL-medier (20% FBS, 100 μg/ml streptomycin, 100 E/ml penicillin, 1 mM natriumpyruvat, 2 mM Glutamax, 2 mM HEPES i CMRL 1066) och iEC-media (VEGF Medium Complete Kit minus FBS + 1 flaska Endothelial Cells Medium Supplement). En sammanfattande schematisk bild av pseudoisletgenerering ingår i figur 1A. - Bestäm cellantalet och viabiliteten med hjälp av en automatiserad cellräknare genom att kombinera 10 μl trypanblått med 10 μl cellsuspension. Blanda cellsuspensionen väl för att säkerställa en korrekt cellräkning.
- Beräkna volymen av cellsuspension, virus och VPM som krävs för önskat antal pseudoislets. Basera alla beräkningar på antalet levande celler som erhölls i steg 1.4.
- För dessa studier transduceras dispergerade humana ö-celler vid MOI 500 (N = 1) eller 1 000 (N = 2) med Ad-CMV-cADDis i en total volym av 500 μL. En platta med transducerade pseudoislets (2 000 celler/pseudoislet) ger tre tekniska replikat per donator (32 pseudoislets/experiment). Adenoviruset erhölls kommersiellt i detta arbete.
- Kombinera de beräknade mängderna cellsuspension, virus och VPM i ett 1,5 ml rör. Blanda försiktigt innehållet genom att pipettera upp och ner.
- Under transduktionen inkuberas rören med öppna lock och täcks med en steril petriskål i 2 timmar i en vävnadsinkubator vid 37 °C och 5 % CO2/95 % luft.
- Tillsätt 500 μl VPM till varje rör och tvätta cellerna genom att centrifugera dem vid 500 x g i 3 minuter vid 4 °C. Slutför ytterligare två tvättar för totalt tre tvättar. Aspirera bort supernatant och återsuspendera cellerna i 1 ml VPM.
- Beräkna den totala cellsåddsvolymen (200 μL/pseudoislet). Tillsätt VPM (den beräknade cellsåddsvolymen minus 2 ml) till ett koniskt rör av lämplig storlek. Tillsätt den transducerade cellsuspensionen från steg 1.7 till det koniska röret. Håll det koniska röret något stängt men inte tätt stängt för att möjliggöra luftutbyte för cellerna.
- Skölj 1.5 ml-röret (från steg 1.7) med 1 ml VPM och överför innehållet till det koniska röret, vid vilken tidpunkt det koniska röret ska innehålla den totala cellsåddvolymen.
- Blanda innehållet i det koniska röret väl genom att pipettera upp och ner med en motoriserad serologisk pipett och överför sedan innehållet till en steril reagensbehållare. Om behållaren inte rymmer hela cellsåddsvolymen, utför seriella överföringar och se till att suspensionen är väl blandad vid varje steg.
- Använd en flerkanalig P200-pipett, pipettera cellsuspensionen i reagensbehållaren upp och ner 3-4 gånger för att säkerställa homogenitet, och pipettera sedan 200 μL av cellsuspensionen i varje brunn på mikrobrunnsplattorna.
- Inkubera pseudoisarna i en vävnadsodlingsinkubator vid 37 °C och 5 % CO2/95 % luft i 6 dagar utan förändringar i mediet. På dag 6 bör pseudoöarna vara färdigformade och redo för experiment (Figur 1B-D).
2. Förberedelse för avbildning av levande celler och mikroperifusion (1 dag före försöket)
OBS: Information om beredningen av mikroperifusionsmediet finns tillgänglig via protocols.io-resursen (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html).
- Skörda pseudoislets med hjälp av en flerkanalspipett genom att överföra dem från plattan med 96 brunnar till en steril petriskål. Handplocka sedan pseudoöarna och överför dem till en annan steril petriskål som innehåller färsk VPM. Låt pseudoholmarna inkubera i en vävnadsodlingsinkubator vid 37 °C och 5 % CO2/95 % luft över natten.
- Bered 1 l DMEM genom att tillsätta 1 g BSA (radioimmunoassay-grade), 0,11 g natriumpyruvat, 0,58 g L-glutamin, 3,2 g natriumbikarbonat, 1,11 g HEPES och 1 flaska DMEM till 1 L ultrarenat vatten. Bered en stamlösning av 1 M glukos i DMEM. Förvara båda lösningarna vid 4 °C över natten.
- Kontrollera flödet i mikroperifusionssystemet dagen före experimentet. Anslut alla slangar till en spånhållare som innehåller ett tomt mikrochip, enligt beskrivningen i figur 2A-B. Använd ultrarenat vatten som avloppsvatten för att bekräfta en flödeshastighet på 100 μL/min vid fraktionsuppsamlaren.
3. Tillägg av sekretagoger till DMEM (dagen för experimentet)
- Tillsätt 0,07 mg/ml askorbat till DMEM och förbered sekretagogerna i DMEM + askorbatbuffert med en 1 M glukosstam för de glukoshaltiga buffertarna.
OBS: Askorbat används för att stabilisera adrenalin genom att förhindra dess oxidation. Om adrenalin inte används kan askorbat uteslutas från DMEM. - Filtrera sekretagogerna två gånger genom ett 0,22 μm porfilter, med ett nytt filter varje gång. Värm lösningarna till 37 °C och mät glukosen med en glukometer för att bekräfta önskad koncentration.
4. Installation av mikroperifusionsapparat
- Värm omgivningskammaren i ett konfokalt laserskanningsmikroskop till 37 °C, se till att alla dörrar är stängda och att kammaren håller en stabil temperatur. Placera chiphållaren som innehåller mikrochipet i kammaren för att värma upp. Kontrollera spåntemperaturen med en infraröd pistol.
OBS: I detta fall är miljökammaren inställd på 38.5 °C, vilket gör att chipet kan nå 37 °C. - Anslut alla slangar till spånhållaren (enligt beskrivningen i figur 2A-B). Spola med baslinjesekretagog i 5 min. I denna studie spolades ledningen med 2 mM glukos (G 2). Byt bubbelfällans membran på bubbelfällan var 8-10:e experiment.
5. Laddning av pseudoislets i mikrochipet
- Innan du laddar mikrochipet, ta en ljusfälts- och mörkfältsbild (10x förstoring) av pseudoöarna som kommer att användas i experimentet för efterföljande kvantifiering av ö-ekvivalenter (IEQ).
IEQ används för att normalisera hormonutsöndringen till variationer i antalet öar över experimenten. Detta steg kan också göras dagen före experimentet. - Sug upp eventuell extra vätska från den nedre och övre halvan av mikrochipet. Den övre halvan av mikrochipet innehåller packningar som säkerställer en tillräcklig tätning av varje brunn, medan den nedre halvan av mikrochipet innehåller brunnarna med ett glastäcke fäst. Förfukta en brunn i mikrochipet med 5 μL DMEM. Se till att pipettera runt brunnens ytterkanter för att blöta springorna.
- Använd en förfuktad pipett för att samla upp 30-32 pseudoislets i en volym på 23 μL och fördela långsamt pseudoislets i mitten av brunnen i mikrochipets nedre del. Kontrollera spetsen på pipetten för eventuella pseudoislets som kan ha fästs.
- Använd en gelladdningsspets för att försiktigt manövrera pseudoislets in i mitten av brunnen. Detta säkerställer att det maximala antalet pseudoislets kommer att fångas i ett synfält.
- Ta en bild av pseudoöarna i mikrochipet på stereoskopet. Detta antal kommer att användas för att justera den beräknade IEQ för eventuell pseudoisletförlust under denna process.
- Om alla pseudoöar från steg 5.3 inte är laddade i mikrochipet, justera IEQ i enlighet med detta. Om till exempel 30 pseudoöar visualiseras nu men 32 visualiserades i steg 5.1 beräknar du IEQ på bilderna från steg 5.1 och multiplicerar sedan med 30/32.
- Placera mikrochipets undersida i mikrochiphållaren. Placera försiktigt toppen av mikrochipet med den gröna packningssidan nedåt.
- Medan du håller mikrochipet på plats, stäng försiktigt mikrochiphållaren för att clamp ihop mikrochipet. Försök att inte applicera överdrivet tryck på mikrochipet under denna process, eftersom det kommer att tränga undan vätskan i brunnen och kan leda till pseudoisletförlust. Undvik att föra in luftbubblor i brunnen.
6. Synkron avbildning av levande celler och mikroperifusion
- Överför sekretagogerna, pumpen och mikrochipet i hållaren till miljökammaren som är monterad på konfokalmikroskopet. Rikta utloppsslangen ut ur kammaren till fraktionsuppsamlaren.
- Placera buffertarna i 15 ml koniska rör med öppningar borrade i locken. Dessa hål förhindrar att uppsamlingsslangen glider ut ur röret.
- När du skruvar in slangen i bubblaren, separera muttern och hylsan och skruva sedan in i bubblaren. Detta förhindrar att linan vrids.
- Ställ in fraktionsuppsamlaren så att den roterar varannan minut. Fyll på lämpligt antal rör i fraktionsuppsamlaren, med hänsyn till tvättarna och de experimentella fraktionerna. För dessa experiment användes 15 tvättrör (30 min total tvätt) och 28 rör för fraktionsuppsamling.
- Starta pumpen för att leverera baslinjemediet (som innehåller baslinjeglukoskoncentrationen) vid 100 μL/min (en 2 minuters uppsamling vid en flödeshastighet på 100 μL/min resulterar i 200 μL avloppsvatten per varje fraktionsrör). Denna flödeshastighet valdes för att begränsa den stora stressen på pseudoöarna och förhindra betydande pseudoislet-rörelser under live-avbildningen.
- Medan vätskan rinner genom apparaten, se efter följande:
- Se upp för droppar i slutet av fraktionsuppsamlarens pip, som indikerar flöde genom systemet.
- Se upp för minskningar i utflödet från systemet; om det finns <200 μL i uppsamlingsrören indikerar detta att det kan finnas en blockering eller läckage i systemet. Se tabell 2 för en lista över de potentiella orsakerna till minskad avloppsvolym, lösningar och förebyggande tips.
- Medan vätskan rinner genom apparaten, se efter följande:
- När det finns ett jämnt medieflöde från utloppsslangen, vrid fraktionsuppsamlingshuvudet för att mata ut i rören och starta fraktionsuppsamlaren. Samla upp de första 15 fraktionerna (30 min) som tvätt så att pseudoisarna kan komma i jämvikt. Använd dessa första 15 fraktioner för att säkerställa ett kontinuerligt och exakt medieflöde genom systemet. Kassera dessa fraktioner efteråt.
- Under 30 minuters tvätt, ställ in mikroskopet för avbildning av levande celler enligt dessa parametrar: objektivlins: U Plan Fluorite 20x med 1x zoom; fluorescenskanaler: EGFP (emission = 510 nm, laservåglängd = 488, detektionsvåglängd = 500-600 nm); Tidsserie: bild tagen varannan sekund under hela experimentet (dvs. 56 min); Samplingshastighet: 2 μs/pixel.
- Identifiera pseudoholmarnas botten i synfältet och justera fokalplanet till 15 μm över denna position. Detta är den ram som kommer att användas under hela avbildningsexperimentet.
- När 30 minuters tvätt är klar, börja fraktionsinsamling och bildinsamling.
OBS: Alla ansträngningar bör göras för att identifiera och åtgärda eventuella problem före detta steg. När datainsamlingen väl har påbörjats kan eventuella pauser i experimentet eller överdriven exponering för sekretagoger påverka resultaten negativt. - Fortsätt att perfuderas pseudoislets med baslinjemedium under den första baslinjesamlingen och samla upp avloppsvattnet i 1,5 ml rör. Byt slangen från baslinjebufferten för hand till det nya stimulusbuffertröret när tiden är lämplig för experimentet.
- En standardsekvens för mikroperifusion visas i tabell 3.
- Efter att ha samlat in ~10 fraktioner, placera alla fraktioner i ett kylskåp på 4 °C tills experimentet är slut för att förhindra nedbrytning av hormonerna, särskilt glukagon.
- Fortsätt att övervaka systemflödet under hela experimentet genom att kontrollera avloppsvolymen i varje rör.
- När experimentet är klart, byt tillbaka till baslinjemediet och låt pumpen fortsätta att gå i 5 minuter för att tvätta ut stimulansen med baslinjemediet (i det här fallet 2 mM glukos).
- Stoppa pumpen och koppla bort mikrochiphållarslangen vid bubblaren och fraktionsuppsamlaren för att ta bort mikrochiphållaren från miljökammaren. Stäng alla dörrar efter att du har tagit bort mikrochipet för att bibehålla temperaturen.
- Förvara perifusaterna vid −80 °C för efterföljande hormonanalys.
7. Extraktion av pseudoislet sur etanol
- Öppna försiktigt hållaren för mikrochip och lyft av toppen av mikrochipet. Använd en pipett och ett bänkmikroskop för att plocka pseudoislets ur brunnen och överför dem till ett 1,5 ml rör. Se till att samla in alla pseudoislets med hjälp av ett bänkmikroskop om det behövs.
- Ta en sista bild av pseudoöarna i mikrochipet innan du tar bort dem från brunnen för att justera ö-extraktets IEQ, liknande i steg 5.5.
- Tvätta två gånger med 500 μL PBS. Snurra ner pseudoislets i 1 minut med 94 x g mellan varje tvätt och sug upp supernatanten.
- Efter att ha tagit bort den sista tvätten, tillsätt 200 μL sur etanol (5,5 ml 95 % etanol + 50 μL 12 N HCl). Förvaras vid 4 °C över natten.
- Nästa dag centrifugeras extrakten i 10 minuter vid 15 989 x g och 4 °C. Alikvot 45 μL i tre nya rör. Förvaras vid −80 °C för analys av hormoninnehållet. Som ett alternativ till att normalisera hormonutsöndringen till IEQ kan hormonutsöndringen också normaliseras till pseudoöhormoninnehållet mätt från extrakten.
8. Ytterligare experiment och sanering
- Upprepa steg 5-7 med efterföljande grupper av pseudoislets för att få ytterligare tekniska replikat.
- Efter att ha avslutat alla mikroperifusionsexperiment, kör 10 % blekmedel genom mikrochipet och slangen i 5 minuter och ultrarenat vatten i 30 minuter för att desinficera slangen.
9. Analys av data
OBS: Avbildning av levande celler utfördes med hjälp av ett konfokalmikroskop med laserskanning. Bilderna analyserades med hjälp av det mikroskopassocierade bildprogramvarupaketet. Följande är allmänna riktlinjer men kan variera beroende på mikroskoptillverkare och bildinsamlingsprogram.
- Fastställa det totala antalet ö-ekvivalenter (IEQ) för datanormalisering
- Öppna programmet och klicka på fliken Förvärv längst upp till höger i fönstret. Batch-bränn i alla mörka fältbilder genom att välja funktionen Batch-inbränning i makrohanteraren (Visa > verktyg Windows > Macro Manager).
- För att bränna flera bilder samtidigt, klicka på knappen Växla batchläge innan du klickar på knappen Kör i makrohanteraren. Följ instruktionerna på skärmen för att välja källbildens plats och målplats för de brända bilderna. För bildfiltypen väljer du Tagged Imagine File Format (*.tif).
- För IEQ-mätningen öppnar du den brända versionen av 10x darkfield-bilden som togs i steg 5.1. Klicka på fliken Räkna och mät högst upp och välj knappen Manuell HSV-tröskel till vänster.
- Använd pipettfunktionen för att lägga till/ta bort det positiva området (i rött) tills varje pseudoö är rödmarkerad, utan att sträcka sig utanför pseudoholmens kant. Klicka på Räkna och mät.
- Använd funktionerna för automatisk delning eller manuell delning för att dela upp pseudoislets som har sammanfogats.
- Om du vill dela upp pseudoöarna manuellt väljer du funktionen för manuell delning, vänsterklickar för att rita en linje som skiljer pseudoöarna åt och högerklickar sedan för att slutföra raden. Om du vill dela upp automatiskt väljer du funktionen för automatisk delning och klickar på de grupperade pseudoöarna av intresse. Bekräfta den korrekta automatiska delningen efteråt.
- I gruppbrända bilder kan skalstrecket och förstoringstexten markeras som positiva. Ta bort dessa objekt för en korrekt räkning genom att markera texten och skalstrecket med musen och trycka på Delete-tangenten.
- Slå på och av filtret för att bekräfta att alla pseudoöar räknas. Filen kan också öppnas utanför programmet för korsreferenser. När du är klar klickar du på Exportera till Excel.
- Öppna kalkylarket och ändra det på följande sätt.
- Ta bort informationen om antal, medelvärde och sortering längst ned. Sortera objekten baserat på deras medeldiameter. Infoga en kolumn efter medeldiametern och ge kolumnen namnet "Antal pseudoöar".
- Antalet öar bestäms av antalet pseudoöar med medeldiametrar som faller inom varje index nedan. Multiplicera antalet pseudoislets per index med respektive IEQ-omvandlingsfaktor och summera dessa värden för att bestämma den totala IEQ. Utför IEQ-beräkningarna på de bilder som tagits före varje experiment. Använd följande index och IEQ-konverteringsfaktorer:
1-49 μm: × 0,167
50-100 μm: × 0,667
101-150 μm: × 1,685
151-200 μm: × 3.500
201-300 μm: × 6,315
301-350 μm: × 10,352 - Ett exempel på ett kalkylblad för att fastställa IEQ-antalet finns i Tilläggsfil 1.
- Öppna programmet och klicka på fliken Förvärv längst upp till höger i fönstret. Batch-bränn i alla mörka fältbilder genom att välja funktionen Batch-inbränning i makrohanteraren (Visa > verktyg Windows > Macro Manager).
- Kvantifiering av avbildning av levande celler i programvara
- Öppna önskad fil (.oir) i cellSens.
- Ange de intressanta regionerna (ROI) enligt följande.
- Använd ritverktygen för att ange ROI (dvs. varje pseudoö). Om du använder alternativet för frihandsteckning högerklickar du för att stänga formen.
- Markera alla ROI:er genom att använda pilhanden och dra den så att den omfattar alla ROI:er i bilden. När alla ROI:er är markerade högerklickar du och väljer Konvertera till dynamisk ROI över tid
- Spela upp XYT-filen för att bekräfta att avkastningen på investeringen är korrekt över tid. Om avkastningen inte är korrekt vid en viss period, korrigera dess storlek/plats vid den perioden. Programvaran kommer gradvis att justera ROI:s storlek/plats över tid för att matcha dessa förändringar. Upprepa dessa steg tills ROI är korrekt under hela avbildningsexperimentet.
- Utför intensitetsmätningar på varje ROI enligt följande.
- I verktygsfältet klickar du på Mät intensitetsprofil. Markera de ROI:er som ska analyseras; använd Skift + klick för att välja flera ROI:er.
OBS: Även om flera filer kan vara öppna samtidigt i programvaran, analysera bara ROI från en fil i taget. - Om du vill ta hänsyn till bakgrundsbrus väljer du ett konstant värde för att subtrahera från varje intensitetsvärde eller anger en ROI som bakgrund. Klicka på Kör.
- I verktygsfältet Intensity Profile klickar du på Exportera till Excel för att exportera data.
- Normalisera alla datapunkter till medelvärdet av intensiteterna uppmätta från 7-8 minuter (dvs. den sista minuten av den första baslinjemediets perifusion). Dessa normaliserade värden vid varje tidpunkt definieras som den relativa cADDis-intensiteten. Ett exempel på ett kalkylblad för analys och normalisering av bilddata finns i Tilläggsfil 2.
- I verktygsfältet klickar du på Mät intensitetsprofil. Markera de ROI:er som ska analyseras; använd Skift + klick för att välja flera ROI:er.
- Mät hormonutsöndringen i varje fraktion och ö-extrakt. I dessa experiment mättes insulin- och glukagonkoncentrationerna med ELISA. Normalisera hormonutsöndringen i varje fraktion till pseudoö-volymen med hjälp av IEQ-mätningarna som bestämdes i steg 9.1 eller med hjälp av extrakthormoninnehållet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biosensoruttryckande humana pseudoislets skapades via adenoviral leverans av konstrukt som kodar för cAMP-biosensorn cADDis (Figur 1A). Figur 1B visar återaggregeringen av de transducerade humana ö-cellerna över tid, med fullt utvecklade pseudoöar observerade efter 6 dagars odling. Cellerna började visa synlig cADDis-fluorescens inom 48 timmar, och det fanns ett högt biosensoruttryck i transducerade celler i slutet av odlingsperioden. Med hjälp av detta protokoll uppvisade pseudoöarna en genomsnittlig transduktionseffektivitet på 60 % i alfaceller och 95 % i betaceller (Figur 1C-D).
Den integrerade mikrofluidik- och livecellavbildningsplattformen är markerad i figur 2. Efter att ha skördat de cADDis-uttryckande pseudoöarna och låtit dem inkubera i färskt medium över natten, laddades pseudoöarna i mitten av en förfuktad brunn på ett mikrochip. Mikrochipet klämdes sedan fast i en hållare och placerades på ett mikroskopsteg. Inne i mikroskopets miljökammare, som hölls vid 37 °C, genomsyrades pseudoöarna med medier som innehöll alfa- och betacellssekretagoger, som pumpades genom en bubblare för att förhindra att luftbubblor fördes in i systemet. Pseudoislets i mikrochipet perfunderades med en flödeshastighet på 100 μL/min, och utflödet samlades upp med 2 minuters intervall via en fraktionsuppsamlare (Figur 2A-B). Mikrochipbrunnens glasbotten gör det möjligt att fånga cADDis fluorescensintensitet hos flera pseudoöar i ett synfält, vilket är viktigt för senare analys (figur 2C).
Figur 3 visar representativa resultat med användning av det beskrivna protokollet med cADDis-uttryckande pseudoöar genererade från naturliga öar isolerade från tre mänskliga donatorer utan diabetes. De cADDis-uttryckande pseudoöarna perifunderades med 2 mM glukos (G 2), 20 mM glukos plus fosfodiesterashämmaren isobutylmetylxantin (IBMX; G 20 + IBMX) och 2 mM glukos plus adrenalin (G 2 + Epi). Detta protokoll framkallar kända intracellulära vägar som förstärker cAMP i alfa- och betaceller (Figur 3A-B). Mikroperifusionsuppställningen underlättar den synkrona insamlingen av den intracellulära cAMP-dynamiken genom cADDis-fluorescens och hormonutsöndring (Figur 3C-E). För att säkerställa experimentell noggrannhet utfördes experiment på pseudoöarna från samma donator med två till tre replikat, och de aggregerade värdena plottas i figur 3C-E,D',E'. Vid exponering för G 2 var den relativa cADDis-intensiteten låg och stabil, liksom insulinutsöndringen (Figur 3C-D). När pseudoöarna exponerades för G 20 + IBMX skedde en kraftig ökning av den intracellulära cAMP-koncentrationen, vilket framgår av en ökning av den relativa cADDis-intensiteten (Figur 3C). Denna ökning berodde troligen på både beta- och alfaceller, vilket påvisades av den samtidiga markanta ökningen av både insulin- och glukagonsekretionen (Figur 3D-E). Exponeringen av pseudoislets för G 2 + Epi ökade den intracellulära cAMP-koncentrationen (Figur 3C), och detta var associerat med en ökning av glukagonsekretionen (Figur 3E). Observationen att cAMP-svaret på G 2 + Epi var relativt mindre jämfört med IBMX-svaret kan ha inträffat på grund av en kombination av den lägre transduktionseffektiviteten hos cADDis adenovirala konstruktion i alfaceller jämfört med betaceller (Figur 1D) och alfacellsspecificiteten hos denna signal (Figur 3E). Därför, baserat på kända cAMP-medierade signalvägar i primära humana beta- och alfaceller, demonstrerar detta protokoll framgångsrikt användbarheten av denna integrerade plattform för att samtidigt undersöka den relativa fluorescensintensiteten hos cADDis-biosensorn och beta- och alfacellshormonsekretoriska profiler över tekniska och biologiska replikat.
Figur 1: Bildning av humana pseudoöar som uttrycker biosensorer . (A) Schematisk bild av primär dissociation av humana öar, transduktion med biosensorkonstruktionen i encellstillstånd och återaggregering. Efter återaggregering skördas pseudoöarna och genomgår synkron avbildning av levande celler och mikroperifusion. Protokollstegen anges i hela schemat. (B) Representativa bilder som fångar bildandet av en cADDis-uttryckande pseudoö under en 6-dagars reaggregeringsperiod; överst: ljusfält med kontrast, nederst: cADDis fluorescens. Skalstapeln är 100 μm. (C) Representativa bilder av en cADDis-uttryckande pseudoö (grön) med alfa- och betaceller visualiserade med C-peptid (CPEP, blå) respektive glukagon (GCG, röd) märkning. DAPI (vit) användes som en nukleär motfärg. De vita pilarna markerar de transducerade alfa- och betacellerna. Den gula pilen pekar på en alfacell som inte har transducerats. Skalstapeln är 100 μm. (D) Kvantifiering av transduktionseffektiviteten vid MOI 1 000 i beta- och alfaceller med en HALO cytonukleär algoritm (N = 2 donatorer, med ett genomsnitt av 601 betaceller och 627 alfaceller analyserade per donator över flera pseudoöar). Felstaplarna anger medelvärdets standardfel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Integrerat system för avbildning av levande celler och mikroperifusion. A) Översikt över komponenterna i systemet för avbildning av levande celler och mikroperifusion. Pseudoöarna i ett mikrochip placeras på scenen i ett konfokalt laserskanningsmikroskop inneslutet i en miljökammare. Denna konfiguration möjliggör tidsmässig upplösning av de intracellulära förändringarna i biosensorfluorescens under det dynamiska svaret på en serie väldefinierade sekretagoger och insamling av pseudois-perifusatfraktioner för synkron mätning av hormonutsöndringen för vidare integration med intracellulära signaleringshändelser. (B) Komponenterna i den mikrofluidiska plattformen utanför miljökammaren. Vätskans riktning är som följer: (1) sekretagoghaltiga rör till (2) 0,01 i slangar till (3) peristaltiska pumpslangar (0,02 i innerdiameter) till (4) 0,01 i slangar till (5) avbubblare till (6) mikrochipinlopp (0,01 i slangar) till (7) mikrochiphållare/mikrochip till (8) mikrochiputlopp (0,01 i slangar). Notera: 0.01 tum-slangen är ansluten till den peristaltiska pumpslangen med koniska adaptrar (vita pilspetsar). Slangen ansluts till bubblaren via en mutter och hylsa (grön pilspets). Den streckade röda linjen visar anslutningen mellan komponenterna. C) Närbild av mikrochipet och hållaren i den miljökammare som är monterad på konfokalmikroskopet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Dynamik i human pseudoislet cAMP och hormonutsöndring. (A) Schematiska bilder av sekretagog-inducerad cADDis-fluorescens och hormonutsöndring i beta- och alfaceller. I betaceller binder adrenalin (Epi) Gi-kopplade alfa 2-adrenerga receptorer, vilket leder till hämning av adenylylcyklas (AC), minskad cAMP och minskad insulinutsöndring. I alfaceller stimulerarEpi GS-kopplade beta 1-adrenerga receptorer, vilket leder till aktivering av AC och en ökning av intracellulär cAMP. I båda celltyperna förhindrar IBMX, en fosfodiesterashämmare (PDE), nedbrytningen av intracellulär cAMP och främjar hormonutsöndringen. Bindningen av fri intracellulär cAMP orsakar konformationsförändringar i cADDis-proteinet, vilket orsakar en ökning av fluorescensintensiteten. (B) Representativa bilder av cADDis-uttryckande pseudoislets under avbildning av levande celler som svar på G 2 (2 mM glukos), G 20 + IBMX (20 mM glukos + IBMX) och G 2 + Epi (2 mM glukos + Epi). Pseudoöarna är konturerade i vitt, och sekretagogtypen anges i det övre vänstra hörnet. Skalstapeln är 50 μm. (C) Relativ cADDis-fluorescens över tid i medelvärde för cADDis-uttryckande pseudoöar gjorda från humana öar från tre organdonatorpreparat. (D) Aggregera insulin och (E) glukagonsekretion som svar på de angivna sekretagogerna. Data normaliseras till övolymen, uttryckt i ö-ekvivalenter (IEQ). Pseudoöarna framställdes från tre humana ö-donatorer och analyserades med hjälp av två till tre tekniska replikat/donator. Ö-cellerna transducerades med cADDis adenoviral konstruktion vid MOI 500 (N = 1) eller 1 000 (N = 2). (D',E') Innehållet av pseudoislethormon. Felstaplarna anger medelvärdets standardfel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Givardemografi. Sammanfattning av donatordemografisk information för de mänskliga öarna som använts under beredningen av pseudoöarna med cADDis biosensoruttryck och avbildning av levande celler. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Felsökningsguide. Utmaningar som kan uppstå lyfts fram, inklusive en lista över vanliga orsaker till problem, lösningar och förebyggande tekniker. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Protokoll för mikroperifusion. Ett exempel på ett protokoll för mikroperifusion som används för experimenten och som lyfts fram i de representativa resultaten. Detta protokoll är specifikt inriktat på samregistrering av intracellulär cAMP och ö-hormonutsöndring; Alternativa protokoll kan vara lämpligare beroende på den intracellulära molekylen av intresse och/eller den valda biosensordynamiken. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tilläggsfil 1: Beräkning av ö-ekvivalenter (IEQ). Ett exempel på hur man beräknar IEQ för de pseudoöar som används i varje experiment. Uppgifterna i blad 1 (1. Objektmätningar) inkluderar objektdata som exporteras direkt från programvaran (se steg 9.1). Den grönmarkerade kolumnen infogas för att räkna antalet pseudoöar som faller inom varje index i steg 9.1.6.2. Antalsmåtten kopieras till blad 2 (2. IEQ-beräkning) och konverteras till IEQ med hjälp av lämplig omvandlingsfaktor per index. Eventuell pseudoislet-förlust under chip-laddning (In-chip pseudoislet #) och före borttagning av extrakt (Post-run pseudoislet #) kan redovisas med hjälp av de bilder som tagits under dessa faser (se steg 5.5 respektive steg 7.1.1). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: Dataanalys. Ett exempel på hur man beräknar den relativa cADDis-intensiteten från de data som erhållits i steg 9.2. Rådata i kolumnerna D-F exporteras direkt från programvaran. Råvärdena vid varje tidpunkt normaliseras till den genomsnittliga intensiteten under den sista minuten av baslinjemediet (G 2; 7-8 min i protokollet). Den genomsnittliga intensiteten för alla pseudoöar över tid beräknas för att generera grafen i figur 2C. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Integreringen av ett mikroperifusionssystem, pseudoöar som uttrycker biosensorer och konfokalmikroskopi med laserskanning möjliggör synkron bedömning av intracellulära signaleringshändelser och dynamiska hormonsekretoriska profiler. Det dynamiska mikroperifusionssystemet kan leverera en serie väldefinierade stimuli till pseudoöarna och möjliggör uppsamling av avloppsvattnet, där insulin- och glukagonkoncentrationerna kan mätas med kommersiellt tillgängliga ELISA. Samtidigt fångar levande cellavbildning av de biosensoruttryckande pseudoöarna med hjälp av en konfokalmikroskopiplattform biosensorns fluorescensaktivitet i realtid, vilket ger information om intracellulära signaleringshändelser. Den samtidiga mätningen av biosensorsignalen och hormonsekretoriska profilen över tid ger möjlighet att direkt jämföra påverkan av intracellulära signalhändelser på ö-hormonutsöndring.
Flera överväganden är nyckeln till framgången för det presenterade protokollet. Dessa inkluderar att generera biosensoruttryckande pseudoislets och att använda en konstant flödeshastighet under varje experiment utan pseudoislet-rörelse. Vid en flödeshastighet på 100 μL/min och med 2 minuters fraktionsuppsamling är perifusatvolymen för varje fraktion 200 μL och bör inte fluktuera med mer än 10 μL/fraktion. Dessutom, medan avbildningsprogrammet kan anpassa sig till mindre pseudoisletrörelser i XY-planet inom synfältet, kan pseudoislets som rör sig utanför synfältet under mikroperifusionsexperimentet inte analyseras. Därför är det viktigt att upptäcka eventuella läckor och rörelser tidigt under experimentet så att försök kan göras för att åtgärda problemet. En sammanfattning av de potentiella utmaningarna, deras gemensamma orsaker, lösningar och tips för att förhindra att de uppstår sammanfattas i tabell 2. Icke desto mindre innehåller detta protokoll flera möjligheter att förutse problem, såsom att utföra ett testexperiment innan chipet laddas (steg 2.3) och övervaka pseudoislets för betydande rörelser via ett mikroskop under den 30 minuter långa tvättperioden före bildtagning och insamling av mikroperifusionsfraktion (steg 6.4-6.5).
En begränsning är att synfältet på den nuvarande konfokalmikroskopiplattformen inte tillåter att alla pseudoöar i mikrochipet fångas upp på en gång. Medan minst 30 pseudoislets krävs för att på ett tillförlitligt sätt detektera insulin och glukagon i mikroperifusaterna, kan endast en delmängd avbildas vid 20x förstoring. Genom att ladda pseudoöarna i mitten av brunnen maximeras antalet som kan fångas i synfältet. Dessutom, medan mikrochipet är utrustat med tre brunnar, begränsar integrationen med konfokalmikroskopi mätningarna till en brunn i taget, vilket innebär att tekniska replikat måste göras i serie snarare än parallellt. Dessutom samregistrerar detta nuvarande tillvägagångssätt hela pseudoislet-fluorescensen med alfa- och betacellsspecifika sekretoriska utgångar; Detta kan dock modifieras för att direkt mäta förändringar i intracellulära händelser i alfa- eller betaceller med hjälp av den cellspecifika inriktningen av genetiskt kodade biosensorer. Även om endast insulin- och glukagonutsöndring bedömdes i detta protokoll, skulle framtida studier också kunna mäta utsöndringen av andra ö-hormoner, såsom somatostatinutsöndring från deltaceller. Det är värt att notera att somatostatin för närvarande endast kan detekteras med denna plattform som svar på mycket stimulerande sekretagoger som IBMX. Slutligen saknar isolerade öar och pseudoöar den neurovaskulära arkitekturen hos öar in vivo, vilket har visat sig ha en direkt inverkan på öfunktionen.
Sammanfattningsvis ger den beskrivna plattformen en strategi för att synkronisera bedömningen av intracellulära signaleringshändelser med hjälp av biosensor och hormonsekretion. Detta system kan anpassas ytterligare för att undersöka de funktionella störningar som introduceras av RNA-interferens (siRNA eller shRNA) eller CRISPR-medierade strategier för riktad genmodifiering. Dessa metoder kan användas för att bestämma de biologiska effekterna av signalvägar av intresse på en mängd intracellulära eller extracellulära händelser med hjälp av genetiskt kodade biosensorer utanför cADDis, vilket tidigare har visats för GCaMP6f7. Dessutom skulle den selektiva transduktionen av en viss celltyp och/eller exponering för cellspecifika stimuli möjliggöra riktad utfrågning av intracellulära signalhändelser av en specifik celltyp inom ramen för den mänskliga ön. Till exempel kan alfaceller från humana öar i bukspottkörteln renas med hjälp av cellytemarkörer och därefter transduceras med den vanligen använda genetiskt kodade kalciumbiosensorn GCaMP för att bedöma den intracellulära kalciumdynamiken. Dessa viralt transducerade celler kan sedan rekombineras med andra otransducerade ö-celler för att bilda pseudoöar eller lämnas att reaggregera på egen hand för att generera alfacellsberikade pseudoöar som kompositionellt liknar öar i typ 1-diabetes. Detta tillvägagångssätt skiljer sig från mer konventionella tekniker, där intracellulära molekyler som Ca 2+ mäts med hjälp av laddade Ca2+-känsliga färgämnen och cellidentiteten bestäms efter avbildning av levande celler genom immunfärgning eller på annat sätt15. Alternativt görs mätningar i encellstillstånd, där effekten av parakrin signalering på ö-cellens funktion går förlorad15. Således övervinner denna avbildning av levande celler integrerad med ett pseudoislet-system och mikroperifusionsplattform tidigare utmaningar inom ö-biologi samtidigt som den breddar kunskapen om integrerade cellulära processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Organdonatorer och deras familjer uppskattas för sina ovärderliga donationer, och International Institute for Organ Procurement Organizations, Advancement of Medicine (IIAM) och National Disease Research Exchange (NDRI) uppmärksammas för sitt samarbete för att göra mänsklig bukspottkörtelvävnad tillgänglig för forskning. Detta arbete stöddes av Human Islet Research Network (RRID:SCR_014393), Human Pancreas Analysis Program (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 och DK20593 (Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), Leona M. och Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, U.S. Department of Veterans Affairs (BX000666), NIGMS från National Institutes of Health (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 och National Science Foundation Graduate Research Fellowship (1937963).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
- Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
- Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells. Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).
- Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium. Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Halban, P. A., et al. β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).
- Brissova, M., et al. α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
- Walker, J. T., et al. Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells. JCI Insight. 5 (10), e06990 (2020).
- Giannoukakis, N., et al. Infection of intact human islets by a lentiviral vector. Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).
- Curran, M. A., et al. Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1. Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).
- Kayton, N. S., et al. Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).
- Lenguito, G., et al. Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets. Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).
- Tengholm, A. Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell. Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).
- Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).
