Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה סינכרונית ורישום משותף של אירועי איתות תוך תאיים והפרשת אינסולין וגלוקגון על ידי פסאודואיסטים אנושיים ראשוניים באמצעות העברה אדנו-ויראלית של ביו-סנסור מחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP), גלאי הפרשי cAMP באתרו (cADDis) ומערכת מיקרופריפיוזיה.
Abstract
איי הלבלב של לנגרהנס, שהם אוספים תלת-ממדיים קטנים של תאים אנדוקריניים ותומכים מיוחדים הפזורים ברחבי הלבלב, הם בעלי תפקיד מרכזי בשליטה על הומאוסטזיס גלוקוז באמצעות הפרשת אינסולין על ידי תאי בטא, אשר מוריד את רמת הגלוקוז בדם, וגלוקגון על ידי תאי אלפא, אשר מעלה את רמת הגלוקוז בדם. מסלולי איתות תוך-תאיים, כולל אלה המתווכים על-ידי cAMP, חיוניים להפרשת הורמוני אלפא ובטא מוסדרים. מבנה האיון התלת-ממדי, אף שהוא חיוני לתפקוד מתואם של האיונים, מציב אתגרים ניסיוניים למחקרים מכניסטיים של מסלולי האיתות התוך-תאיים בתאי איון אנושיים ראשוניים. כדי להתגבר על אתגרים ומגבלות אלה, פרוטוקול זה מתאר דימות משולב של תאים חיים ופלטפורמה מיקרופלואידית באמצעות פסאודואיסטים אנושיים ראשוניים שנוצרו מתורמים ללא סוכרת הדומים לאיונים מקומיים במורפולוגיה, בהרכב ובתפקוד שלהם. פסאודואיסטים אלה נשלטים בגודל באמצעות תהליך הפיזור והצבירה מחדש של תאי איון אנושיים ראשוניים. במצב המפוזר, ביטוי גנים של תאי איון יכול להיות מניפולציה; לדוגמה, ניתן להציג ביו-חיישנים כגון cAMP biosensor המקודד גנטית, cADDis. לאחר היווצרותם, פסאודואיסטים המבטאים ביו-סנסור מקודד גנטית, בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי ופלטפורמת מיקרופריפוזיה, מאפשרים הערכה סינכרונית של דינמיקה של ביו-חיישנים פלואורסצנטיים ופרופילי הפרשת הורמוני אלפא ובטא כדי לספק תובנה רבה יותר לגבי תהליכים ותפקוד תאיים.
Introduction
האיים של לנגרהנס הם מיני איברים המפוזרים ברחבי הלבלב שתפקידם חיוני לשמירה על הומאוסטזיס גלוקוז. אינסולין מופרש מתאי בטא בעקבות חילוף חומרים של גלוקוז, עלייה ביחס ATP/ADP, סגירת תעלות אשלגן רגישות ל-ATP, דפולריזציה של קרום הפלזמה וזרימה של סידן1 חוץ-תאי. הפרשת גלוקגון מתאי אלפא מובנת פחות, אך הועלתה השערה כי מסלולים תוך-תאיים ופרקריניים תורמים לאקסוציטוזה של גרגרי גלוקגון 2,3,4. הן סוכרת מסוג 1 והן סוכרת מסוג 2 קשורות לתפקוד לקוי של תאי איון 5,6,7. לכן, הבהרת מסלולי האיתות התוך-תאיים המתווכים את הפרשת הורמון האיון חיונית להבנת מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים באיי הלבלב.
הארכיטקטורה הכדורית של איים מציגה מכשולים מסוימים לניסויים. אתגרים אלה כוללים את השונות בגודל האיון ואת הטבע התלת-ממדי של האיונים, אשר מפחית את התמרה נגיפית בתוך ליבת האיון 8,9. כדי להתגבר על אתגרים אלה, פותחה מערכת פסאודואיסלט, שבה איים אנושיים ראשוניים מפוזרים לתאים בודדים, מומרים אדנו-ויראליות עם מבנים המקודדים מטרות מעניינות, ומצטברים מחדש ליצירת מבנים דמויי איונים מבוקרי גודל המכונים פסאודו-איונים7. בהשוואה לאיים מקומיים מאותו תורם שגודלו בתרבית במקביל, פסאודואיסטים אלה דומים במורפולוגיה, בהרכב התאים האנדוקריניים ובהפרשת הורמונים7. שיטה זו מאפשרת ביטוי של מבנים ברחבי הפסאודואיון, כלומר היא מתגברת על מחסום קודם למניפולציה גנטית אחידה של איים אנושיים ראשוניים 7,8,9.
בפרוטוקול זה, מערכת הפסאודואיסלט משולבת עם מכשיר מיקרופלואידי כדי לבטא ביוסנסורים בתאי איון אנושיים ראשוניים ולקבל רזולוציה זמנית של הפרשת הורמון פסאודואיסלט במהלך פריפוזיה דינמית10,11,12. הפסאודואיסטים מונחים בתוך שבב ונחשפים לזרימה קבועה של סודות שונים באמצעות משאבה פריסטלטית12. לשבב יש תחתית זכוכית שקופה והוא מורכב על מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להקליט את דינמיקת האיתות התוך תאי באמצעות שינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות של הביו-סנסור. הדמיה Biosensor מסונכרן עם אוסף של שפכי microperifusion לניתוח הבא של אינסולין הפרשת גלוקגון7. בהשוואה למקרופריפוזיה, גישת מיקרופריפיוז'ן זו מאפשרת שימוש בפחות פסאודואיסטים בשל הנפח הקטן יותר של המכשיר המיקרופלואידי בהשוואה לתא המקרופריפיוז'ן7.
כדי לרתום את התועלת של מערכת זו, הביוסנסור המחזורי אדנוזין מונופוספט (cAMP) מתבטא בפסאודואיסטים אנושיים כדי להעריך דינמיקה של cAMP והפרשת הורמונים. הביוסנסור cADDis מורכב מחלבון פלואורסצנטי ירוק בעל תמורות מעגליות (cpGFP) הממוקם באזור הציר של חלבון חליפין המופעל על ידי cAMP 2 (EPAC2), ומחבר בין אזורי הבקרה והקטליטים שלו. הקישור של cAMP לאזור הרגולציה של EPAC2 מעורר שינוי קונפורמטיבי באזור הציר שמגביר את הפלואורסצנטיות מה-cpGFP13. שליחים תוך-תאיים כגון cAMP מעוררים הפרשת אינסולין וגלוקגון לאחר הפעלה במעלה הזרם של קולטנים מצומדים לחלבון G14. הדמיה של תאים חיים בשילוב עם מיקרופריפוזיה מסייעת לחבר את דינמיקת cAMP תוך תאית עם הפרשת הורמון איון. באופן ספציפי, בפרוטוקול זה, פסאודואיסטים המבטאים cADDis נוצרים כדי לנטר תגובות cAMP בתאי אלפא ובטא לגירויים שונים: גלוקוז נמוך (2 מילימטר גלוקוז; G 2), גלוקוז גבוה בתוספת איזובוטילמתילקסנטין (IBMX; 20 מ"מ גלוקוז + 100 מיקרומטר IBMX; G 20 + IBMX), וגלוקוז נמוך בתוספת אפינפרין (Epi; 2 mM גלוקוז + 1 μM Epi; G 2 + Epi). זרימת עבודה טיפולית זו מאפשרת הערכה של דינמיקת cAMP תוך תאית ישירות באמצעות 1) עיכוב פוספודיאסטראז בתיווך IBMX, אשר משפר את רמות cAMP תוך תאי על ידי מניעת התפרקותו, ו -2) אפינפרין, ממריץ תלוי cAMP ידוע של הפרשת גלוקגון תאי אלפא בתיווך הפעלת קולטן β-אדרנרגי. השלבים להקמת מנגנון המיקרופריפיוז'ן לניסויי הדמיה של תאים חיים, טעינת הפסאודואיסטים לתוך השבב, דימות סינכרוני של תאים חיים ומיקרופריפוזיה, וניתוח עקבות הביו-חיישנים והפרשת הורמונים על ידי בדיקות הורמונים מבוססות מיקרו-צלחות מפורטים להלן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
איים אנושיים (N = 4 תכשירים) הושגו באמצעות שותפויות עם תוכנית ההפצה המשולבת של האיים, תוכנית ניתוח הלבלב האנושי, מעבדות פרודו בע"מ ואימג'ין פארמה. ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת ונדרבילט אינה מתייחסת לדגימות לבלב אנושיות לא מזוהות כמחקר בבני אדם. עבודה זו לא הייתה מתאפשרת ללא תורמי איברים, משפחותיהם וארגונים לרכישת איברים. ראו טבלה 1 למידע דמוגרפי על תורמים. איים אנושיים מתורמי לבלב ללא סוכרת בודדו עם פחות מ -15 שעות של זמן איסכמיה קרה.
1. היווצרות Pseudoislet (מפורט ב Walker et al.7)
- השג ובחר ידנית איים אנושיים ראשוניים באמצעות פיפטה P200 ומיקרוסקופ benchtop, תוך שימת לב רבה לא לזהם את קצה פיפטה על משטחים מחוץ למדיום תרבית האיים (10% FBS, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 100 U/mL פניצילין, 2 mM L-גלוטמין ב- CMRL 1066).
- העבר איים ראשוניים לתוך צינור של 15 מ"ל, ובצע את כל שלבי היווצרות הפסאודואיסלט הבאים תחת מכסה מנוע של תרבית רקמה כדי למנוע זיהום. נתקו באיטיות את האיים הראשיים למשך 7 דקות בטמפרטורת החדר עם פיפטה P1000 ב-0.025% טריפסין. הפתרון יהפוך לאטום כאשר האיים יתחילו להתפרק.
- עבור מחקרים אלה, 200-300 איים ראשוניים שנבחרו בקפידה עם קטרים של כ -200 מיקרומטר מפוזרים ב 500 μL של 0.025% טריפסין מניב אחד או שניים לוחות 96 באר של pseudoislets; המספר המדויק עשוי להשתנות בהתאם לגודל האי הממוצע והכדאיות. עבור >500 איים עיקריים, הגדילו את הנפח של 0.025% טריפסין המשמש ביחס של 1:1 (למשל, 600 מיקרוליטר של 0.025% טריפסין עבור 600 איים שנבחרו בקפידה).
- להרוות את הפיזור על ידי הוספת נפח של Vanderbilt Pseudoislet Media (VPM) שווה ערך לנפח טריפסין בשימוש. לאחר מכן, לשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של VPM. עבור שטיפות, צנטריפוגה את התאים המפוזרים ב 485 x גרם במשך 2-3 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה ספסל. השהה מחדש את התאים בנפח מוגדר של VPM (בדרך כלל 1 מ"ל) לצורך ספירה.
הערה: דור הפסאודואיסלט והרכב VPM מפורטים בפרסום קודם7. בקצרה, VPM מכיל נפחים שווים של מדיה מועשרת CMRL (20% FBS, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 100 U / מ"ל פניצילין, 1 mM נתרן פירובט, 2 mM Glutamax, 2 mM HEPES ב CMRL 1066) ו iEC-media (VEGF Medium Complete Kit פחות FBS + 1 בקבוק של תאים אנדותל תוספת בינונית). סכמת סיכום של יצירת פסאודואיסלט כלולה באיור 1A. - קבע את ספירת התאים ואת הכדאיות באמצעות מונה תאים אוטומטי על ידי שילוב של 10 μL של כחול טריפאן עם 10 μL של השעיית התא. ערבבו היטב את מתלה התא כדי להבטיח ספירת תאים מדויקת.
- חשב את נפח השעיית התא, וירוס ו- VPM הדרושים למספר הרצוי של פסאודו-איים. בסס את כל החישובים על ספירת התאים החיים המתקבלת בשלב 1.4.
- עבור מחקרים אלה, התמירו תאי איון אנושיים מפוזרים ב-MOI 500 (N = 1) או 1,000 (N = 2) עם Ad-CMV-cADDis בנפח כולל של 500 μL. צלחת אחת של פסאודואיסלטים מומרים (2,000 תאים/פסאודואיסלט) מניבה שלושה העתקים טכניים לכל תורם (32 פסאודואיסלטים לניסוי). אדנווירוס הושג באופן מסחרי בעבודה זו.
- שלב את הכמויות המחושבות של תרחיף תאים, וירוסים ו- VPM לצינור של 1.5 מ"ל. מערבבים בעדינות את התוכן על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
- במהלך ההתמרה יש לדגור על הצינורות בכובעים פתוחים, ולכסות אותם בצלחת פטרי סטרילית למשך שעתיים באינקובטור תרבית רקמות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2/95% אוויר.
- הוסף 500 μL של VPM לכל צינור, ושטוף את התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 500 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C. השלימו שתי שטיפות נוספות ובסך הכל שלוש כביסות. לשאוף supernatant, ולהשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של VPM.
- חשב את נפח זריעת התאים הכולל (200 μL/pseudoislet). הוסף את ה- VPM (נפח זריעת התאים המחושב פחות 2 מ"ל) לצינור חרוטי בגודל מתאים. הוסף את תרחיף התא המומר משלב 1.7 לצינור החרוט. שמור על הצינור החרוטי סגור מעט אך לא סגור היטב כדי לאפשר חילופי אוויר לתאים.
- שטוף את הצינור 1.5 מ"ל (משלב 1.7) עם 1 מ"ל של VPM, ולהעביר את התוכן לצינור החרוט, ואז הצינור החרוטי צריך להכיל את נפח הזריעה הכולל של התא.
- מערבבים היטב את תכולת הצינור החרוטי על ידי פיפטציה למעלה ולמטה עם פיפטה סרולוגית ממונעת, ולאחר מכן מעבירים את התוכן למאגר מגיב סטרילי. אם המאגר אינו מחזיק את כל נפח הזריעה של התא, בצע העברות טוריות וודא כי התרחיף מעורבב היטב בכל שלב.
- באמצעות פיפטה רב-ערוצית P200, צנרת את תרחיף התא במאגר מגיב למעלה ולמטה 3-4 פעמים כדי להבטיח הומוגניות, ולאחר מכן צינור 200 μL של תרחיף התא לתוך כל באר של לוחות microwell.
- לדגור על הפסאודואיסטים באינקובטור תרבית רקמה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2/95% אוויר למשך 6 ימים ללא שינויים בינוניים. עד יום 6, הפסאודו-איים צריכים להיווצר באופן מלא ולהיות מוכנים לניסויים (איור 1B-D).
2. הכנה להדמיית תאים חיים ומיקרופריפוזיה (יום לפני הניסוי)
הערה: מידע על הכנת אמצעי microperifusion זמין באמצעות משאב protocols.io (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html).
- קוצרים את הפסאודואיסלטים באמצעות פיפטה רב ערוצית על ידי העברתם מצלחת 96 הקידוחים לצלחת פטרי סטרילית. לאחר מכן, בחרו ידנית את הפסאודו-איסלטים, והעבירו אותם לצלחת פטרי סטרילית אחרת המכילה VPM טרי. אפשרו לפסאודואיסטים לדגור באינקובטור תרבית רקמות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2/95% אוויר למשך הלילה.
- הכן 1 ליטר של DMEM על ידי הוספת 1 גרם של BSA (כיתה רדיואימונית), 0.11 גרם של פירובט נתרן, 0.58 גרם של L-גלוטמין, 3.2 גרם של סודיום ביקרבונט, 1.11 גרם של HEPES, ובקבוק 1 של DMEM ל 1 ליטר של מים מטוהרים במיוחד. הכן תמיסת מלאי גלוקוז של 1 M ב- DMEM. יש לשמור את שתי התמיסות על 4°C למשך הלילה.
- בדוק את זרימת מערכת המיקרופריפוזיה יום לפני הניסוי. חברו את כל הצינוריות למחזיק שבב המכיל שבב ריק, כפי שמתואר באיור 2A-B. השתמש במים מטוהרים במיוחד כקולחים כדי לאשר קצב זרימה של 100 מיקרוליטר לדקה בקולט השברים.
3. הוספת סודות ל-DMEM (יום הניסוי)
- הוסף 0.07 מ"ג / מ"ל אסקורבט ל- DMEM, והכן את הסוד במאגר DMEM + אסקורבט באמצעות מלאי גלוקוז של 1 M עבור המאגרים המכילים גלוקוז.
הערה: אסקורבט משמש לייצוב אפינפרין על ידי מניעת חמצון שלו. אם אפינפרין אינו בשימוש, אסקורבט ניתן להשמיט מן DMEM. - סננו את הסוד פעמיים דרך מסנן נקבוביות בגודל 0.22 מיקרומטר, ובכל פעם השתמשו בפילטר טרי. חממו את התמיסות ל-37°C, ומדדו את הגלוקוז באמצעות גלוקומטר כדי לאשר את הריכוז הרצוי.
4. הגדרת מנגנון מיקרופריפיוז'ן
- חממו את התא הסביבתי של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי לטמפרטורה של 37°C, וודאו שכל הדלתות סגורות והחדר שומר על טמפרטורה יציבה. הניחו את מחזיק השבב המכיל את השבב בתא כדי להתחמם. אמת את טמפרטורת השבב באמצעות אקדח אינפרא אדום.
הערה: במקרה זה, התא הסביבתי מוגדר ל- 38.5 מעלות צלזיוס, מה שמאפשר לשבב להגיע ל- 37 מעלות צלזיוס. - חברו את כל הצינוריות למחזיק השבבים (כמתואר באיור 2A-B). קו שטיפה עם סוד קו הבסיס למשך 5 דקות. במחקר זה, הקו היה סמוק עם 2 mM גלוקוז (G 2). שנו את קרום מלכודת הבועות של הדה-בועה כל 8-10 ניסויים.
5. טעינת pseudoislets לתוך השבב
- לפני טעינת השבב, צלם תמונת שדה בהיר ושדה כהה (הגדלה של פי 10) של הפסאודואיסטים שישמשו בניסוי לכימות הבא של מקבילות איים (IEQ).
הערה: IEQ משמש לנרמל את הפרשת ההורמון לשינויים במספר האיון לאורך הניסויים. שלב זה יכול להיעשות גם יום לפני הניסוי. - שאפו כל נוזל נוסף מהחצי התחתון והעליון של השבב. החצי העליון של השבב מכיל אטמים המבטיחים אטימה נאותה של כל באר, ואילו החצי התחתון של השבב מכיל את הבארות עם כיסוי זכוכית מחובר. מראש להרטיב היטב אחד שבב עם 5 μL של DMEM. הקפידו לזלף סביב הקצוות החיצוניים של הבאר כדי להרטיב את הסדקים.
- השתמש פיפטה רטובה מראש לאסוף 30-32 pseudoislets בנפח 23 μL, ולאט לאט לפזר pseudoislets למרכז הבאר בחלק התחתון של השבב. בדוק את קצה פיפטה עבור כל pseudoislets שאולי מחוברים.
- השתמש בקצה העמסת ג'ל כדי לתמרן בעדינות את pseudoislets למרכז הבאר. זה מבטיח כי המספר המרבי של pseudoislets יילכדו בשדה ראייה.
- צלם תמונה של pseudoislets בשבב על הסטריאוסקופ. ספירה זו תשמש להתאמת IEQ המחושב עבור כל אובדן פסאודואיסלט במהלך תהליך זה.
- אם כל הפסאודואים משלב 5.3 אינם נטענים לתוך השבב, התאם את IEQ בהתאם. לדוגמה, אם 30 pseudoislets הם דמיינו עכשיו אבל 32 היו חזותית בשלב 5.1, לחשב את IEQ על התמונות משלב 5.1 ולאחר מכן להכפיל ב 30/32.
- הניחו את תחתית השבב במחזיק השבב. מניחים בזהירות את החלק העליון של השבב עם האטם הירוק כלפי מטה.
- תוך כדי החזקת השבב במקומו, סגור בעדינות את מחזיק השבב כדי להדק את השבב יחד. נסו לא להפעיל לחץ מוגזם על השבב במהלך תהליך זה, שכן פעולה זו תעקור את הנוזל הכלול בבאר ועלולה להוביל לאובדן פסאודואיסלט. הימנעו מהחדרת בועות אוויר לבאר.
6. הדמיה סינכרונית של תאים חיים ומיקרופריפוזיה
- מעבירים את הסוד, המשאבה והשבב שבמחזיק לתא הסביבתי המותאם למיקרוסקופ הקונפוקלי. כוונו את צינורות השטף אל מחוץ לתא אל קולט השברים.
- הכניסו את החוצצים לצינורות חרוטיים בנפח 15 מ"ל עם פתחים שנקדחו בכובעיהם. חורים אלה מונעים מצינור האיסוף להיסחף אל מחוץ לצינור.
- בעת הברגת הצינור לתוך de-bubbler, להפריד את האגוז ואת ferrule, ולאחר מכן להבריג לתוך de-bubbler. פעולה זו מונעת את פיתול הקו.
- הגדר את אספן השברים כך שיסובב כל 2 דקות. טען את המספר המתאים של צינורות לתוך אספן השברים, תוך התחשבות בשטיפות ובשברים ניסיוניים. עבור ניסויים אלה נעשה שימוש ב-15 צינורות שטיפה (כביסה כוללת של 30 דקות) וב-28 צינורות לאיסוף שברים.
- הפעל את המשאבה כדי לספק את התווך הבסיסי (המכיל את ריכוז הגלוקוז הבסיסי) ב- 100 μL / min (איסוף של 2 דקות בקצב זרימה של 100 μL / min מביא ל- 200 μL של קולחים לכל צינור שבר). קצב זרימה זה נבחר כדי להגביל את הלחץ העצום על הפסאודואיסטים ולמנוע תנועה משמעותית של פסאודואיסלט במהלך ההדמיה החיה.
- בזמן שהנוזל זורם דרך המנגנון, שימו לב לדברים הבאים:
- שימו לב לטיפות בקצה פיה של אספן השברים, המציינות זרימה דרך המערכת.
- שימו לב לירידות בשטף מהמערכת; אם יש <200 μL בצינורות האיסוף, הדבר מצביע על כך שייתכן שיש סתימה או דליפה במערכת. ראו טבלה 2 לקבלת רשימה של הגורמים האפשריים לירידה בנפח הקולחים, תמיסות וטיפים למניעה.
- בזמן שהנוזל זורם דרך המנגנון, שימו לב לדברים הבאים:
- ברגע שיש זרימה בינונית קבועה מצינור השטף, סובב את ראש אספן השברים כדי לחלק לתוך הצינורות, והפעל את קולט השברים. אספו את 15 השברים הראשונים (30 דקות) ככביסה כדי לאפשר לפסאודואיסטים להתאזן. השתמש ב-15 השברים הראשונים הללו כדי להבטיח זרימה בינונית רציפה ומדויקת דרך המערכת. השליכו את השברים האלה לאחר מכן.
- במהלך 30 דקות השטיפה, הגדר את המיקרוסקופ להדמיית תאים חיים על פי הפרמטרים הבאים: עדשה אובייקטיבית: U Plan Fluorite 20x עם זום 1x; תעלות פלואורסצנטיות: EGFP (פליטה = 510 ננומטר, אורך גל לייזר = 488, אורך גל גילוי = 500-600 ננומטר); סדרת זמן: התמונה נרכשת כל 2 שניות לכל הניסוי (כלומר, 56 דקות); מהירות דגימה: 2 μs / pixel.
- זהה את החלק התחתון של pseudoislets בשדה הראייה ולהתאים את מישור המוקד ל 15 מיקרומטר מעל מיקום זה. זוהי המסגרת שתשמש לאורך כל ניסוי ההדמיה.
- לאחר השלמת הכביסה בת 30 הדקות, התחל באיסוף שברים ורכישת תמונות.
הערה: יש לעשות את כל המאמצים כדי לזהות ולתקן בעיות כלשהן לפני שלב זה. ברגע שאיסוף הנתונים מתחיל, כל הפסקה בניסוי או חשיפה עודפת למפרישים עלולה להשפיע לרעה על התוצאות. - המשך perifusing pseudoislets עם מדיום הבסיס למשך אוסף הבסיס הראשון, איסוף השפכים לתוך צינורות 1.5 מ"ל. העבר את הצינור מהמאגר הבסיסי באופן ידני לצינור חיץ הגירוי החדש כאשר הזמן מתאים לניסוי.
- רצף מיקרופריפוזיה סטנדרטי מוצג בטבלה 3.
- לאחר איסוף ~ 10 שברים, מניחים את כל השברים במקרר 4 מעלות צלזיוס עד סוף הניסוי כדי למנוע את התפרקות ההורמונים, במיוחד גלוקגון.
- המשך לעקוב אחר זרימת המערכת לאורך כל הניסוי על ידי בדיקת נפח הקולחים בכל צינור.
- לאחר השלמת הניסוי, חזור למדיום הבסיסי, ואפשר למשאבה להמשיך לפעול במשך 5 דקות כדי לשטוף את הגירוי עם מדיום הבסיס (במקרה זה, 2 מילימטר גלוקוז).
- עצור את המשאבה, ונתק את צינור מחזיק השבב במנטרל הבועות ובקולט השברים כדי להסיר את מחזיק השבב מתא הסביבה. סגור את כל הדלתות לאחר הסרת השבב כדי לשמור על הטמפרטורה.
- אחסנו את הפריפוזטים בטמפרטורה של -80°C לניתוח הורמונלי לאחר מכן.
7. מיצוי אתנול חומצה פסאודואיסלט
- פתח בזהירות את מחזיק השבב והרם את החלק העליון של השבב. השתמש פיפטה ומיקרוסקופ benchtop כדי לבחור pseudoislets מתוך הבאר ולהעביר אותם צינור 1.5 מ"ל. ודא את האוסף של כל pseudoislets באמצעות מיקרוסקופ benchtop במידת הצורך.
- צלם תמונה סופית של הפסאודואיסטים בשבב לפני ההסרה מהבאר כדי להתאים את IEQ תמצית האיון, בדומה לשלב 5.5.
- יש לשטוף פעמיים עם 500 מיקרוליטר של PBS. סובבו את הפסאודואיסלטים במשך דקה אחת במהירות של 94 x גרם בין כל כביסה, ושאפו לרדת מהסופרנטנט.
- לאחר הסרת הכביסה האחרונה, להוסיף 200 μL של אתנול חומצה (5.5 מ"ל של 95% אתנול + 50 μL של 12 N HCl). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
- למחרת, סחררו את התמציות במשך 10 דקות בטמפרטורה של 15,989 x גרם ו-4°C. Aliquot 45 μL לתוך שלושה צינורות חדשים. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C לניתוח תכולת הורמונים. כחלופה לנרמול הפרשת ההורמון ל- IEQ, ניתן לנרמל את הפרשת ההורמון גם לתכולת ההורמון המדומה הנמדדת מהתמציות.
8. ניסויים נוספים וניקוי
- חזור על שלבים 5-7 עם קבוצות עוקבות של פסאודואיסטים כדי להשיג שכפולים טכניים נוספים.
- לאחר סיום כל ניסויי המיקרופריפיוז'ן, העבירו 10% אקונומיקה דרך השבב והצינור למשך 5 דקות ולאחר מכן מים מטוהרים במיוחד למשך 30 דקות כדי לחטא את הצינור.
9. ניתוח נתונים
הערה: הדמיה של תאים חיים בוצעה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. התמונות נותחו באמצעות חבילת תוכנת הדמיה המשויכת למיקרוסקופ. להלן הנחיות כלליות, אך עשויות להשתנות בהתאם ליצרן המיקרוסקופ ולתוכנה לרכישת תמונות.
- קביעת סך כל שווי האי (IEQ) לנורמליזציה של נתונים
- פתח את התוכנה ולחץ על הכרטיסייה רכישה בפינה השמאלית העליונה של החלון. צריבת אצווה בכל תמונות השדה הכהה על-ידי בחירה בפונקציה צריבת אצווה במנהל המאקרו (הצג כלי > Windows > מנהל המאקרו).
- כדי לצרוב תמונות מרובות בבת אחת, לחץ על הלחצן Toggle Batch Mode לפני לחיצה על לחצן הפעל בתוך מנהל המאקרו. בצע את ההוראות שעל המסך לבחירת מיקום תמונת המקור ומיקום היעד עבור התמונות הצרובות. לסוג קובץ התמונה, בחרו Tagged Imagine File Format (*.tif).
- עבור מדידת IEQ, פתח את הגרסה הצרובה של תמונת השדה הכהה פי 10 שצולמה בשלב 5.1. לחץ על הכרטיסייה ספירה ומדידה בחלק העליון, ובחר את ידני HSV סף כפתור בצד שמאל.
- השתמש בפונקציית הטפטפת כדי להוסיף/להסיר את האזור החיובי (באדום) עד שכל פסאודואיסלט יסומן באדום, מבלי להתרחב מעבר לגבול הפסאודואיסלט. לחץ על ספירה ומדידה.
- השתמש בפונקציות הפיצול האוטומטי או הפיצול הידני כדי לפצל את הפסאודואיסטים שחוברו יחד.
- כדי לפצל ידנית את הפסאודו-איים, בחר את פונקציית הפיצול הידני, לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי כדי לצייר קו המפריד בין הפסאודואיסטים ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להשלים את השורה. כדי לפצל אוטומטית, בחר את פונקציית הפיצול האוטומטי ולחץ על הפסאודואים המקובצים של עניין. אשר את הפיצול האוטומטי הנכון לאחר מכן.
- בתמונות שנשרפו באצווה, סרגל קנה המידה וטקסט ההגדלה עשויים להיות מסומנים כחיוביים. מחק אובייקטים אלה לקבלת ספירה מדויקת על-ידי הדגשת הטקסט וסרגל קנה המידה באמצעות העכבר והקשה על מקש Delete keyboard .
- הפעל וכבה את המסנן כדי לוודא שכל הפסאודואיסטים נספרים. ניתן לפתוח את הקובץ גם מחוץ לתוכנית לצורך הצלבה. כשתסיים, לחץ על ייצוא ל- Excel.
- פתח את הגיליון האלקטרוני ושנה אותו באופן הבא.
- מחק את פרטי הספירה, הממוצע והמיון בחלק התחתון. מיין את האובייקטים לפי הקוטר הממוצע שלהם. הוסף עמודה אחרי הקוטר הממוצע, ותן לעמודה את השם "ספירת פסאודואיסלט".
- ספירת האיונים נקבעת על ידי מספר הפסאודואיסטים בעלי הקטרים הממוצעים הנמצאים בכל מדד שמתחתיו. הכפל את מספר הפסאודו-islets לכל מדד בגורם ההמרה המתאים של IEQ, וסכם ערכים אלה כדי לקבוע את IEQ הכולל. בצע את חישובי IEQ על התמונות שנרכשו לפני כל ניסוי. השתמש באינדקסים הבאים ובגורמי ההמרה של IEQ:
1-49 מיקרומטר : × 0.167
50-100 מיקרומטר : × 0.667
101-150 מיקרומטר : × 1.685
151-200 מיקרומטר: × 3.500
201-300 מיקרומטר : × 6.315
301-350 מיקרומטר: × 10.352 - לקבלת גיליון אלקטרוני לדוגמה לקביעת ספירות IEQ, ראה קובץ משלים 1.
- פתח את התוכנה ולחץ על הכרטיסייה רכישה בפינה השמאלית העליונה של החלון. צריבת אצווה בכל תמונות השדה הכהה על-ידי בחירה בפונקציה צריבת אצווה במנהל המאקרו (הצג כלי > Windows > מנהל המאקרו).
- כימות הדמיה של תאים חיים בתוכנה
- פתח את הקובץ הרצוי ( .oir) ב- cellSens.
- הגדר את אזורי העניין (ROIs) באופן הבא.
- השתמש בכלי השרטוט כדי לייעד את החזר ההשקעה (כלומר, כל פסאודואיון). אם אתה משתמש באפשרות הציור ביד חופשית, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לסגור את הצורה.
- סמן את כל החזר ההשקעה באמצעות מחוג החץ וגרירתו כדי להקיף את כל החזר ההשקעה בתמונה. כאשר כל החזר ההשקעה מסומן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר המר להחזר השקעה דינמי לאורך זמן
- הפעל את קובץ XYT כדי לוודא שההחזר על ההשקעה מדויק לאורך זמן. אם החזר ההשקעה אינו מדויק בתקופה מסוימת, תקן את גודלו/מיקומו באותה תקופה. התוכנה תתאים בהדרגה את הגודל/מיקום של החזר ההשקעה לאורך זמן כדי להתאים לשינויים אלה. חזור על שלבים אלה עד שהחזר ההשקעה יהיה מדויק לאורך כל ניסוי ההדמיה.
- בצע מדידות עוצמה על כל החזר השקעה באופן הבא.
- בסרגל הכלים, לחץ על Measure Intensity Profile. הדגש את החזר ההשקעה כדי לנתח; השתמש ב- Shift + לחיצה כדי לבחור החזר השקעה מרובים.
הערה: בעוד שקבצים מרובים עשויים להיות פתוחים בכל פעם בתוכנה, נתח רק את החזר ההשקעה מקובץ אחד בכל פעם. - כדי להתחשב ברעשי רקע, בחרו ערך קבוע לחיסור מכל ערך עוצמה, או הקצו החזר השקעה אחד כרקע. לחץ על ביצוע.
- בסרגל הכלים פרופיל עוצמה , לחץ על ייצוא ל- Excel כדי לייצא את הנתונים.
- נרמל את כל נקודות הנתונים לממוצע העוצמות שנמדדו בין 7-8 דקות (כלומר, הדקה האחרונה של הפריפוזיה הבינונית הבסיסית הראשונה). ערכים מנורמלים אלה בכל נקודת זמן מוגדרים כעוצמת cADDis היחסית. לקבלת גיליון אלקטרוני לדוגמה של ניתוח ונורמליזציה של נתוני הדמיה, ראה קובץ משלים 2.
- בסרגל הכלים, לחץ על Measure Intensity Profile. הדגש את החזר ההשקעה כדי לנתח; השתמש ב- Shift + לחיצה כדי לבחור החזר השקעה מרובים.
- מדדו את הפרשת ההורמונים בכל שבר ותמצית איון. בניסויים אלה נמדדו ריכוזי אינסולין וגלוקגון על ידי ELISA. נרמל את הפרשת ההורמון בכל שבר לנפח הפסאודואיסלט באמצעות מדידות IEQ שנקבעו בשלב 9.1 או לפי תכולת הורמון החילוץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פסאודואיסטים אנושיים המבטאים ביוסנסורים נוצרו באמצעות העברה אדנו-ויראלית של מבנים המקודדים את cAMP biosensor cADDis (איור 1A). איור 1B מראה את הצבירה מחדש של תאי איון אנושי מותמרים לאורך זמן, כאשר פסאודואיסטים שנוצרו במלואם נצפו לאחר 6 ימי תרבית. התאים החלו להראות פלואורסצנטיות cADDis גלויה תוך 48 שעות, והיה ביטוי ביוסנסורי גבוה בתאים מותמרים בסוף תקופת התרבית. באמצעות פרוטוקול זה, הפסאודואיסטים הציגו יעילות התמרה ממוצעת של 60% בתאי אלפא ו-95% בתאי בטא (איור 1C-D).
פלטפורמת הדימות המשולבת של מיקרופלואידים ותאים חיים מודגשת באיור 2. לאחר קצירת הפסאודואיסטים המבטאים cADDis ואיפשרו להם לדגור בתווך טרי במשך הלילה, הפסאודואיסלטים הועמסו למרכז באר שהורטבה מראש על שבב. לאחר מכן הידק את השבב במחזיק והונח על במת מיקרוסקופ. בתוך התא הסביבתי המחובר למיקרוסקופ, שנשמר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הפסאודואיים היו משולבים במדיה שהכילה מפרישי תאי אלפא ובטא, אשר נשאבו דרך מנטרל בועות כדי למנוע הכנסת בועות אוויר למערכת. הפסאודו-איונים שבשבב היו היקפיים בקצב זרימה של 100 מיקרוליטר/דקה, והשפכים נאספו במרווחים של 2 דקות באמצעות קולט שברים (איור 2A-B). תחתית הזכוכית של באר השבב מאפשרת ללכוד את עוצמת הפלואורסצנטיות cADDis של פסאודואיסטים מרובים בשדה ראייה, שהיא חיונית לניתוח מאוחר יותר (איור 2C).
איור 3 מראה תוצאות מייצגות באמצעות הפרוטוקול המתואר עם פסאודואיסטים המבטאים cADDis שנוצרו מאיונים מקומיים שבודדו משלושה תורמים אנושיים ללא סוכרת. הפסאודואיסטים המבטאים cADDis התמזגו עם גלוקוז של 2 מילימטר (G 2), גלוקוז של 20 מילימטר בתוספת מעכב פוספודיאסטראז איזובוטילמתילקסנטין (IBMX; G 20 + IBMX), ו 2 mM גלוקוז בתוספת אפינפרין (G 2 + Epi). פרוטוקול זה מעורר מסלולים תוך-תאיים ידועים המשפרים cAMP בתוך תאי אלפא ובטא (איור 3A-B). מערך המיקרופריפוזיה מאפשר איסוף סינכרוני של דינמיקת cAMP תוך-תאית באמצעות פלואורסצנטיות cADDis והפרשת הורמונים (איור 3C-E). כדי להבטיח קפדנות ניסויית, ניסויים על הפסאודו-איים בוצעו מאותו תורם עם שניים עד שלושה עותקים משוכפלים, והערכים המצטברים משורטטים באיור 3C-E,D',E'. בחשיפה ל-G 2, עוצמת ה-cADDis היחסית הייתה נמוכה ויציבה, וכך גם הפרשת האינסולין (איור 3C-D). כאשר הפסאודואיסטים נחשפו ל-G 20 + IBMX, הייתה עלייה חזקה בריכוז ה-cAMP התוך-תאי, כפי שמעידה עלייה בעוצמת cADDis היחסית (איור 3C). העלייה הזו נבעה ככל הנראה גם מתאי בטא וגם מתאי אלפא, כפי שהודגם על-ידי העלייה הניכרת במקביל הן בהפרשת אינסולין והן בהפרשת גלוקגון (איור 3D-E). החשיפה של הפסאודואיסטים ל-G 2 + Epi העלתה את ריכוז ה-cAMP התוך-תאי (איור 3C), וזה היה קשור לעלייה בהפרשת גלוקגון (איור 3E). התצפית שתגובת cAMP ל-G 2 + Epi הייתה קטנה יחסית בהשוואה לתגובת IBMX התרחשה ככל הנראה כתוצאה משילוב של יעילות ההולכה הנמוכה יותר של המבנה האדנו-ויראלי cADDis בתאי אלפא לעומת תאי בטא (איור 1D) והספציפיות של תאי אלפא של אות זה (איור 3E). לכן, בהתבסס על מסלולי איתות ידועים בתיווך cAMP בתאי בטא ואלפא אנושיים ראשוניים, פרוטוקול זה מדגים בהצלחה את התועלת של פלטפורמה משולבת זו לבחון בו זמנית את עוצמת הפלואורסצנטיות היחסית של הביוסנסור cADDis ופרופילי הפרשת הורמוני בטא ואלפא על פני שכפולים טכניים וביולוגיים.
איור 1: היווצרות פסאודואיסטים אנושיים המבטאים חיישנים ביולוגיים. (A) סכמטי המראה דיסוציאציה ראשונית של איון אנושי, התמרה עם מבנה הביו-סנסור במצב של תא יחיד, וצבירה מחדש. לאחר צבירה מחדש, הפסאודואיסטים נקצרים ועוברים הדמיה סינכרונית של תאים חיים ומיקרופריפוזיה. שלבי הפרוטוקול מצוינים לאורך הסכמה. (B) תמונות מייצגות הלוכדות את היווצרותו של פסאודואיסלט המבטא cADDis במהלך תקופת צבירה מחדש של 6 ימים; למעלה: שדה בהיר עם ניגודיות, למטה: cADDis fluorescence. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. (C) תמונות מייצגות של פסאודואיסלט המבטא cADDis (ירוק) עם תאי אלפא ובטא המתוארים באמצעות תיוג C-peptide (CPEP, כחול) וגלוקגון (GCG, אדום), בהתאמה. DAPI (לבן) שימש ככתם נגד גרעיני. החיצים הלבנים מדגישים את תאי האלפא והבטא המותמרים. החץ הצהוב מצביע על תא אלפא שלא עבר טרנספורמציה. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. (D) כימות יעילות ההולכה ב-MOI 1,000 בתאי בטא ואלפא על ידי אלגוריתם ציטו-גרעיני HALO (N = 2 תורמים, עם ממוצע של 601 תאי בטא ו-627 תאי אלפא שנותחו לכל תורם על פני פסאודואיסטים מרובים). קווי השגיאה מציינים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דימות משולב של תאים חיים ומערכת מיקרופריפיוזיה. (A) סקירה כללית של רכיבי ההדמיה של תאים חיים ומערכת מיקרופריפיוז'ן. הפסאודואיסטים בשבב ממוקמים על הבמה של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הסגור בתוך תא סביבתי. תצורה זו מאפשרת רזולוציה טמפורלית לגבי השינויים התוך-תאיים בפלואורסצנטיות של ביו-סנסור במהלך התגובה הדינמית לסדרה של סודות מוגדרים היטב ואיסוף של שברים פריפוזטיים מדומים למדידה סינכרונית של הפרשת ההורמון לצורך אינטגרציה נוספת עם אירועי איתות תוך-תאיים. (B) מרכיבי המצע המיקרופלואידי מחוץ לתא הסביבתי. כיווניות הנוזל היא כדלקמן: (1) צינורות המכילים סוד ל-(2) 0.01 בצינורות ל-(3) צינורות משאבה פריסטלטית (0.02 בקוטר פנימי) עד (4) 0.01 בצינורות ל-(5) דה-בוער ל-(6) כניסת שבב (0.01 בצינורות) ל-(7) מחזיק שבב/שבב ל-(8) שקע שבב (0.01 בצינורות). הערה: ה-0.01 בצינורות מחובר לצינורות המשאבה הפריסטלטיים באמצעות מתאמים חרוטיים (ראשי חץ לבנים). הצינור מחובר למנטרל הבועות באמצעות אגוז ופרול (ראש חץ ירוק). הקו האדום המקווקו מציג את הקישוריות בין הרכיבים. (C) מבט מקרוב על השבב והמחזיק בתוך התא הסביבתי המורכב על במת המיקרוסקופ הקונפוקלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: cAMP פסאודואיסלט אנושי ודינמיקה של הפרשת הורמונים. (A) סכמות של פלואורסצנטיות cADDis המושרה על ידי הפרשה והפרשת הורמונים בתאי בטא ואלפא. בתאי בטא, אפינפרין (Epi) קושר קולטני אלפא 2-אדרנרגיים מצומדים Gi, מה שמוביל לעיכוב של ציקלז אדניליל (AC), ירידה ב- cAMP והפרשת אינסולין מופחתת. בתאי אלפא, Epi מגרה קולטני בטא 1-אדרנרגיים מצומדים ל-Gs, מה שמוביל להפעלת AC ולעלייה ב-cAMP תוך-תאי. בשני סוגי התאים, IBMX, מעכב פוספודיאסטראז (PDE), מונע פירוק של cAMP תוך תאי ומקדם הפרשת הורמונים. הקישור של cAMP תוך-תאי חופשי גורם לשינויים קונפורמטיביים בחלבון cADDis, ובכך גורם לעלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות. (B) תמונות מייצגות של פסאודואיסטים המבטאים cADDis במהלך הדמיה של תאים חיים בתגובה ל-G 2 (2 mM גלוקוז), G 20 + IBMX (20 mM גלוקוז + IBMX) ו-G 2 + Epi (2 mM גלוקוז + Epi). הפסאודואיים מסומנים בלבן, וסוג הסוד מצוין בפינה השמאלית העליונה. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. (C) פלואורסצנטיות יחסית של cADDis לאורך זמן בממוצע על פני פסאודואיסטים המבטאים cADDis העשויים מאיים אנושיים משלושה תכשירים של תורמי איברים. (D) אינסולין מצטבר ו-(E) הפרשת גלוקגון בתגובה למפרישים שצוינו. הנתונים מנורמלים לנפח האיון, המתבטא במקבילות איים (IEQs). הפסאודואיונים הוכנו משלושה תורמי איים אנושיים ונותחו באמצעות שניים עד שלושה משכפלים טכניים/תורמים. תאי האיון הותמרו במבנה אדנו-ויראלי cADDis ב-MOI 500 (N = 1) או 1,000 (N = 2). (ד', ה') תכולת הורמון pseudoislet. קווי השגיאה מציינים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: נתונים דמוגרפיים של תורמים. סיכום של מידע דמוגרפי של תורמים עבור האיים האנושיים המשמשים במהלך הכנת pseudoislets עם cADDis, ביטוי biosensor והדמיית תאים חיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: מדריך לפתרון בעיות. אתגרים שעשויים להיתקל מודגשים, כולל רשימה של גורמים נפוצים לבעיות, פתרונות וטכניקות מניעה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: פרוטוקול מיקרופריפיוז'ן. פרוטוקול מיקרופריפיוז'ן לדוגמה המשמש לניסויים המודגש בתוצאות המייצגות. פרוטוקול זה מיועד במיוחד לרישום משותף של cAMP תוך תאי והפרשת הורמון איון; פרוטוקולים חלופיים עשויים להיות מתאימים יותר בהתאם למולקולה התוך-תאית המעניינת ו/או לדינמיקה הביו-חיישנית שנבחרה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
קובץ משלים 1: חישוב שווי ערך לאיונים (IEQ). דוגמה כיצד לחשב את IEQ עבור pseudoislets המשמשים בכל ניסוי. הנתונים בגיליון 1 (1. מדידות אובייקטים) כוללות נתוני אובייקטים המיוצאים ישירות מהתוכנה (ראה שלב 9.1). העמודה המסומנת בירוק נוספת כדי לספור את מספר הפסאודו-איונים הכלולים בכל אינדקס בשלב 9.1.6.2. הספירות מועתקות לגיליון 2 (2. חישוב IEQ) ומומר ל- IEQ באמצעות מקדם ההמרה המתאים לכל מדד. כל אובדן pseudoislet במהלך טעינת שבב (In-chip pseudoislet #) ולפני הסרת תמציות (Post-run pseudoislet #) יכול להיחשב באמצעות התמונות שצולמו במהלך שלבים אלה (ראה שלב 5.5 ושלב 7.1.1, בהתאמה). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: ניתוח נתונים. דוגמה לאופן חישוב עוצמת cADDis היחסית מהנתונים שהתקבלו בשלב 9.2. הנתונים הגולמיים בעמודות D-F מיוצאים ישירות מהתוכנה. ערכי הגלם בכל נקודת זמן מנורמלים לעוצמה הממוצעת בדקה האחרונה של מדיום הבסיס (G 2; 7-8 דקות בפרוטוקול). העוצמה הממוצעת בכל הפסאודו-איים לאורך זמן מחושבת כדי ליצור את הגרף באיור 2C. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השילוב של מערכת מיקרופריפוזיה, פסאודואיסטים המבטאים חיישנים ביולוגיים ומיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר מאפשר הערכה סינכרונית של אירועי איתות תוך תאיים ופרופילי הפרשת הורמונים דינמיים. מערכת המיקרופריפוזיה הדינמית יכולה לספק סדרה של גירויים מוגדרים היטב לפסאודואיסטים ומאפשרת איסוף קולחים, בהם ניתן למדוד את ריכוזי האינסולין והגלוקגון על ידי ELISA הזמין מסחרית. במקביל, הדמיה של תאים חיים של פסאודואיסטים המבטאים ביו-חיישנים על ידי פלטפורמת מיקרוסקופיה קונפוקלית לוכדת את הפעילות הפלואורסצנטית של הביו-סנסור בזמן אמת, המספקת מידע על אירועי איתות תוך-תאיים. המדידה הסימולטנית של האות הביוסנסורי ופרופיל הפרשת ההורמונים לאורך זמן מספקת הזדמנות להשוות ישירות את ההשפעה של אירועי איתות תוך תאיים על הפרשת הורמון האיון.
שיקולים מרובים הם המפתח להצלחת הפרוטוקול המוצג. אלה כוללים יצירת פסאודואיסטים המבטאים חיישנים ביולוגיים ושימוש בקצב זרימה קבוע במהלך כל ניסוי ללא תנועת פסאודואיסלט. בקצב זרימה של 100 μL/min ועם 2 דקות של איסוף שברים, נפח הפריפוזט של כל שבר הוא 200 μL ולא אמור להשתנות ביותר מ-10 μL/שבר. בנוסף, בעוד שתוכנת ההדמיה יכולה להתאים את עצמה לתנועת פסאודואיסלט מינורית במישור XY בתוך שדה הראייה, לא ניתן לנתח פסאודואיסטים שיוצאים משדה הראייה במהלך ניסוי המיקרופריפיוז'ן. לכן, חשוב לאתר דליפות ותזוזות בשלב מוקדם במהלך הניסוי, כך שניתן יהיה לנסות לתקן את הבעיה. סיכום של האתגרים הפוטנציאליים, הגורמים המשותפים להם, פתרונותיהם ועצות למניעת התרחשותם מסוכמים בטבלה 2. עם זאת, פרוטוקול זה כולל הזדמנויות רבות לצפות בעיות, כגון ביצוע ניסוי בדיקה לפני טעינת השבב (שלב 2.3) וניטור הפסאודו-איילטים לתנועה משמעותית באמצעות מיקרוסקופ במהלך תקופת השטיפה של 30 דקות לפני רכישת התמונה ואיסוף שברי מיקרופריפיוז'ן (שלבים 6.4-6.5).
מגבלה אחת היא ששדה הראייה בפלטפורמת המיקרוסקופ הקונפוקלי הנוכחית אינו מאפשר לכוד את כל הפסאודו-איים בתוך השבב בבת אחת. בעוד שנדרשים לפחות 30 פסאודואיסטים כדי לזהות באופן אמין אינסולין וגלוקגון במיקרופריפוזטים, ניתן לצלם רק תת-קבוצה בהגדלה של פי 20. טעינת הפסאודואיסטים למרכז הבאר ממקסמת את המספר שניתן לתפוס בשדה הראייה. בנוסף, בעוד השבב מצויד בשלוש בארות, השילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי מגביל את המדידות לבאר אחת בכל פעם, כלומר שכפולים טכניים חייבים להיעשות בסדרות ולא במקביל. יתר על כן, גישה נוכחית זו רושמת את כל הפלואורסצנטיות של פסאודואיסלט עם יציאות הפרשה ספציפיות לתאי אלפא ובטא; עם זאת, ניתן לשנות זאת כדי למדוד ישירות שינויים באירועים תוך-תאיים של תאי אלפא או בטא באמצעות מיקוד ספציפי לתא של ביו-חיישנים מקודדים גנטית. בעוד שרק הפרשת אינסולין וגלוקגון הוערכה בפרוטוקול זה, מחקרים עתידיים יוכלו גם למדוד את הפרשת הורמוני איון אחרים, כגון הפרשת סומטוסטטין מתאי דלתא. יש לציין, בשלב זה, somatostatin ניתן לגילוי רק עם פלטפורמה זו בתגובה מפרישים מאוד מגרה כגון IBMX. לבסוף, איים מבודדים ופסאודואיסטים חסרים את הארכיטקטורה הנוירו-וסקולרית של איים in vivo, אשר הוכחה כמשפיעה ישירות על תפקוד האיון.
לסיכום, הפלטפורמה המתוארת מספקת אסטרטגיה לסנכרון הערכת אירועי איתות תוך תאיים באמצעות biosensor והפרשת הורמונים. מערכת זו יכולה להיות מותאמת עוד יותר כדי לבחון את ההפרעות התפקודיות המוחדרות על ידי הפרעות RNA (siRNA או shRNA) או אסטרטגיות מיקוד גנים בתיווך CRISPR. שיטות אלה יכולות לשמש כדי לקבוע את ההשפעות הביולוגיות של מסלולים מעניינים על מספר רב של אירועים תוך תאיים או חוץ-תאיים באמצעות ביו-חיישנים מקודדים גנטית מחוץ ל- cADDis, כפי שהוכח בעבר עבור GCaMP6f7. בנוסף, התמרה סלקטיבית של סוג תא מסוים ו/או חשיפה לגירויים ספציפיים לתא תאפשר חקירה ממוקדת של אירועי איתות תוך-תאיים מסוג תא מסוים בהקשר של האי האנושי. לדוגמה, תאי אלפא של איי לבלב אנושיים יכולים להיות מטוהרים באמצעות סמנים של פני השטח של התא ולאחר מכן להיות מומרים עם biosensor סידן מקודד גנטית נפוץ GCaMP כדי להעריך את הדינמיקה סידן תאיים. תאים אלה שעברו טרנספורמציה נגיפית יכולים להיות משולבים מחדש עם תאי איון אחרים שלא עברו טרנספורמציה כדי ליצור פסאודואיסלטים או להשאיר אותם לצבור מחדש בעצמם כדי ליצור פסאודואיסלטים מועשרים בתאי אלפא הדומים בהרכבם לאיונים בסוכרת מסוג 1. גישה זו שונה מטכניקות קונבנציונליות יותר, שבהן מולקולות תוך-תאיות כגון Ca 2+ נמדדות באמצעות צבעים רגישים ל-Ca2+ וזהות התא נקבעת לאחר הדמיה של תאים חיים על ידי אימונוסטיין או אמצעים אחרים15. לחלופין, המדידות נעשות במצב התא הבודד, שבו ההשפעה של איתות פרקריני על תפקוד תא האיון אובדת15. לפיכך, הדמיה זו של תאים חיים בשילוב עם מערכת פסאודואיסלט ופלטפורמת מיקרופריפיוז'ן מתגברת על אתגרים קודמים בביולוגיה של איונים תוך הרחבת הידע על תהליכים תאיים אינטגרליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
תורמי איברים ובני משפחותיהם זוכים להערכה על תרומותיהם שלא יסולא בפז, והמכון הבינלאומי לארגונים לרכישת איברים, קידום הרפואה (IIAM) והבורסה הלאומית לחקר מחלות (NDRI) מוכרים על שותפותם בהנגשת רקמת הלבלב האנושית למחקר. עבודה זו נתמכה על ידי רשת המחקר של האי האנושי (RRID:SCR_014393), התוכנית לניתוח לבלב אנושי (RRID:SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 ו-DK20593 (מרכז המחקר וההדרכה לסוכרת ונדרבילט), קרן הצדקה ע"ש ליאונה מ. והארי ב. הלמסלי, JDRF, המחלקה לענייני חיילים משוחררים של ארה"ב (BX000666), NIGMS של המכונים הלאומיים לבריאות (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830, ואת הקרן הלאומית למחקר בוגר מחקר (1937963).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
- Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
- Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells. Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).
- Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium. Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Halban, P. A., et al. β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).
- Brissova, M., et al. α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
- Walker, J. T., et al. Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells. JCI Insight. 5 (10), e06990 (2020).
- Giannoukakis, N., et al. Infection of intact human islets by a lentiviral vector. Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).
- Curran, M. A., et al. Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1. Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).
- Kayton, N. S., et al. Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).
- Lenguito, G., et al. Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets. Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).
- Tengholm, A. Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell. Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).
- Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).
