Summary
Denne protokollen beskriver semi-automatisert isolering av stromal vaskulær fraksjon (SVF) fra murine fettvev for å oppnå preadipocytter og oppnå adipocyttdifferensiering in vitro. Ved hjelp av en vevsdissosiator for kollagenasefordøyelse reduseres eksperimentell variasjon og øker reproduserbarheten.
Abstract
In vitro-studien av hvit, brun og beige adipocytterdifferensiering muliggjør undersøkelse av celleautonome funksjoner av adipocytter og deres mekanismer. Immortaliserte hvite preadipocyttcellelinjer er offentlig tilgjengelige og mye brukt. Imidlertid er fremveksten av beige adipocytter i hvitt fettvev som respons på eksterne signaler vanskelig å rekapitulere i full grad ved bruk av offentlig tilgjengelige hvite adipocyttcellelinjer. Isolering av stromal vaskulær fraksjon (SVF) fra murine fettvev utføres vanligvis for å oppnå primære preadipocytter og utføre adipocytdifferensiering. Imidlertid kan hakking og kollagenase fordøyelse av fettvev for hånd resultere i eksperimentell variasjon og er utsatt for forurensning. Her presenterer vi en modifisert halvautomatisert protokoll som bruker en vevsdissosiator for kollagenasefordøyelse for å oppnå lettere isolering av SVF, med sikte på å redusere eksperimentell variasjon, redusere forurensning og øke reproduserbarheten. De oppnådde preadipocytter og differensierte adipocytter kan brukes til funksjonelle og mekanistiske analyser.
Introduction
Fettvevsbiologi har fått stadig økende oppmerksomhet på grunn av den økende forekomsten av fedme og type 2 diabetes globalt1. Adipocytter lagrer overflødig energi i form av lipiddråper, som frigjøres ved sult. Videre opprettholder fettvev systemisk energi homeostase ved å tjene som et endokrint organ og kommunisere med andre vev 2,3. Oppsiktsvekkende nok er både overflødig fettvev (fedme) og fetttap (lipodystrofi) knyttet til insulinresistens og diabetes1. Adipocytter er delt inn i tre typer: hvit, brun og beige1. Hvite adipocytter lagrer hovedsakelig overskuddsenergi som lipider, mens brune og beige adipocytter sprer energi i form av varme via mitokondrielt frakoblingsprotein-1 (Ucp1)1,4. Spesielt forekommer beige adipocytter (også kalt "induserbare" brune adipocytter) i hvitt fettvev som respons på kald eller sympatisk stimulering og viser genuttrykksmønstre som overlapper med, men er forskjellige fra de av "klassiske" brune adipocytter5. Nylig har brune og beige adipocytter blitt forventet som potensielle mål for anti-fedme og anti-diabetesbehandlinger rettet mot å "øke energispredningen" i stedet for å "undertrykke energiinntaket"4. Støttende rapporteres risikoallelen til FTO-fedmevarianten rs1421085 hos mennesker, som viser den sterkeste tilknytningen til høyere kroppsmasseindeks (BMI) blant vanlige varianter 6,7 og utviser forskjellige genmiljøinteraksjoner8,9, å negativt regulere beige adipocytdifferensiering og funksjon10. Peroksisomproliferatoraktivert reseptor γ (PPARγ) er kjent som en master transkripsjonell regulator av adipogenese og er nødvendig og tilstrekkelig for adipocytdifferensiering11. Transkripsjonsregulatorer, som PRD1-BF1-RIZ1 homologt domene som inneholder 16 (PRDM16), tidlig b-cellefaktor 2 (EBF2) og nukleær faktor I-A (NFIA), er avgjørende for brun og beige adipocytdifferensiering og funksjon 12,13,14,15,16,17,18. På den annen side krever programmering av hvite adipocytter transkripsjonsregulatorer, for eksempel transducinlignende forsterkerprotein 3 (TLE3) og sinkfingerprotein 423 (ZFP423) 19,20,21.
In vitro modellsystemer gjør det mulig å utføre molekylære studier som tar sikte på å forbedre forståelsen av mekanismen(e) som ligger til grunn for funksjonene og dysfunksjonene til adipocytter. Selv om offentlig tilgjengelige og immortaliserte preadipocyttcellelinjer som 3T3-L1 og 3T3-F442A eksisterer22,23,24, vil kulturen av primære preadipocytter og differensiering i adipocytter være en mer egnet modell for å studere in vivo adipogenese. Isolering av stromal vaskulær fraksjon (SVF) fra murine fettvev er en velkjent metode for å oppnå primære preadipocytter25,26. Imidlertid kan kollagenasefordøyelse av fettvev, som vanligvis utføres ved hjelp av en bakteriell shaker med et rørstativ, resultere i eksperimentell variasjon og er utsatt for forurensning27,28. Her beskriver vi en alternativ protokoll som bruker en mild magnetisk-aktivert cellesortering (MACS) vevsdissosiator for kollagenasefordøyelse for å oppnå lettere isolering av SVF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk beskrevet i denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Tokyo og utført i henhold til institusjonelle retningslinjer fra University of Tokyo.
1. Fremstilling av enzymoppløsning og medium
- Sett begge sider av inguinal hvitt fettvev (høyre og venstre side, ca. 150 mg) fra en 7-8 uker gammel mus og 2,5 ml enzymoppløsning i rør C av dissosiatoren.
- Rekonstituer enzym D med 3 ml Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM)/F12 uten føtalt bovint serum (FBS) eller antibiotika, enzym R med 2,7 ml DMEM/F12 uten FBS eller antibiotika og enzym A med 1 ml buffer A.
- Forbered 2,5 ml enzymoppløsning ved å tilsette 100 μL enzym D, 50 μL enzym R, 12,5 μL enzym A og 2,35 ml DMEM / F12 uten FBS eller antibiotika i rør C. Sett rør C med enzymoppløsning på is.
2. Isolering av fettvev
- Avlive 7-8 uker gamle mannlige C57BL/6J mus (ca. 20 g) ved cervical dislokasjon.
- På en ren benk, for å isolere inguinal hvitt fettvev, klipp huden med butt / skarp saks på magen og mot underekstremitetene. Isoler fettvevet fra innsiden av lårene med skarp/skarp saks. Den ene siden av inguinal fettvev wieghs ~ 75 mg.
- Sett det isolerte fettvevet i rør C med enzymløsning på is, og hold røret i den rene benken for å opprettholde steriliteten.
3. Hakking og fordøyelse av fettvev
- Ved den rene benken, tilsett 2,5 ml enzymoppløsning til rør C.
- Hakk fettvevet i små biter ved å skjære med skarp/skarp saks 50 ganger. Skjær fettvevet i ~ 2 mm2 stykker.
- Lukk hetten på rør C tett, skru røret opp ned og fest det til hylsen på vevsdissosiatorenmed hetten på. Fordøy deretter prøven i ~40 min ved 37 °C.
MERK: Denne studien brukte gentleMACS Octo Dissociator med varmeovner (Miltenyi Biotec 130-096-427), og det forhåndsinstallerte programmet "37C_mr_ATDK_1" ble fulgt.
4. Filtrering av cellesuspensjon
- Forvarmende DMEM/F12 inneholdende 10 % FBS og 1 % penicillin-streptomycin til 37 °C.
- Løsne rør C fra vevsdissosiatoren og stopp fordøyelsen ved å tilsette 5 ml DMEM / F12 inneholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin og forsiktig pipettere fire ganger.
- Sentrifuge ved 700 x g i 10 minutter ved 20 °C.
- Aspirer supernatanten forsiktig uten å forstyrre cellepelleten.
- Resuspender pelleten ved å tilsette 10 ml DMEM / F12 inneholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin og forsiktig pipettere fem ganger.
- Filtrer cellesuspensjonen gjennom en cellesil på 70 μm diameter plassert på et nytt 50 ml rør.
- Sentrifuger ved 250 x g i 5 minutter og resuspender pelleten i 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
5. Cell plating
- Sentrifuge ved 500 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten ved å tilsette 10 ml DMEM / F12 inneholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin og pipettering ti ganger.
- Plate cellesuspensjonen på en 10 cm kollagenbelagt tallerken og legg oppvasken i en cellekulturinkubator (37 ° C, 5% CO 2) i1-2 timer.
MERK: Kollagenbelagte retter er ikke absolutt nødvendig. Imidlertid, basert på erfaring, hjelper kollagenbelagte retter adherens av preadipocytter og dermed øker overlevelsen av cellene. - Aspirer mediet og vask cellene to ganger med 3 ml PBS per vask.
- Tilsett 10 ml DMEM / F12 inneholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin og returner oppvasken til cellekulturinkubatoren (37 ° C, 5% CO2).
6. Passering av preadipocytter
- Neste dag, aspirer mediet (cellene vil være adherent, og dermed kan mediet aspireres), vask cellene to ganger med 3 ml PBS per vask, og tilsett 10 ml DMEM / F12 inneholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
- Når cellene når 80% sammenløp (vanligvis 4 dager etter SVF-isolasjon), splitt cellene i fire 10 cm kollagenbelagte retter.
- Spesielt aspirerer mediet, vask cellene med PBS (romtemperatur [RT]), tilsett 1 ml forvarmet 0,05% trypsin og inkuber i 5 minutter i cellekulturinkubatoren.
- Tilsett 10 ml DMEM / F12 inneholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin for å slukke trypsinaktiviteten. Etter pipettering, sentrifuge ved 440 x g i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten, resuspender cellene ved å tilsette 40 ml DMEM / F12 inneholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin, og plate cellene i fire 10 cm kollagenbelagte retter.
- Pass cellene igjen når de når 80% sammenløp.
7. Fremstilling av retrovirus som uttrykker SV40 stort T-antigen for immortalisering av preadipocytter (valgfritt)
- Minst 3 dager før immortalisering, plate Platinum-E (Plat-E) emballasjeceller29 med en tetthet på 3,0 x 105 celler / ml i 2 ml DMEM med 10% FBS uten antibiotika. Bruk et hemacytometer til å telle cellene.
- Neste dag, transfekt 4 μg pBABE-neo largeTcDNA (legg til genplasmid #1780) ved hjelp av Lipofectamine 2000, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Etter 24 timer, aspirer mediet og tilsett 2 ml DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
- Neste dag, høst den retrovirale supernatanten. Retroviruset kan brukes til immortalisering umiddelbart eller lagres ved -80 °C.
8. Immortalisering av preadipocytter med SV40 stort T-antigen (valgfritt)
- Passasje og utvide preadipocytter to ganger etter SVF-isolasjon.
- Plate cellene i 6-brønnsplater med en tetthet på 0,5-1,0 x 104 celler / ml i 2 ml DMEM / F12 med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Bruk et hemacytometer til å telle cellene.
- På neste dag, lag 250 μL fersk eller tint retrovirus som uttrykker SV40 stort T-antigen per brønn av 6-brønnplatene. Sentrifuger ved 440 x g i 5 minutter og plasser supernatanten i et nytt rør.
- Tilsett 750 μL DMEM / F12 inneholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin og 1 μL polybren per 250 μL retroviral supernatant for å lage arbeidsviruset.
- Aspirer mediet og tilsett 1000 μL av det arbeidende retroviruset til hver brønn som inneholder preadipocytter.
- Tilsett 1 ml DMEM / F12 med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin 4 timer senere.
- Neste dag, skille de infiserte preadipocytter i en 10 cm tallerken og velg de infiserte cellene med DMEM / F12 som inneholder 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin og 500 μg / ml neomycin. For å overvåke antibiotikavalget, tilbered en tallerken med uinfiserte celler med neomycin.
- Fortsett å passere de infiserte cellene med neomycin til alle uinfiserte celler i skjermantennen er døde.
9. Adipocytter differensiering
- Plate cellene. For 12-brønnsplater, plate cellene med en tetthet på 4,0 x 104 celler / ml i 1 ml DMEM / F12 inneholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
- Når preadipocytter blir konfluente (48-72 timer etter plettering), aspirer mediet og erstatt det med differensieringsmedium (se tabell 1 for sammensetning).
- Ved dag 2 av differensiering (dvs. 48 timer etter indusering av differensiering), erstatt mediet med vedlikeholdsmedium (se tabell 1 for sammensetning). Etterpå bytter du vedlikeholdsmedium hver 2. Terminal differensiering oppnås på dag 7 av differensiering.
- Olje rød o farging
- For oljerød o-farging, aspirer mediet og skyll cellene med 1 ml PBS per brønn. Fiks cellene ved å legge til 1 ml 4% formaldehyd per brønn, og inkuber cellene i 15 minutter ved RT.
- Under inkubasjonen, fortynn den 0,5% oljerøde o-stamløsningen (i isopropylalkohol) til 0,3% ved bruk av ddH2O og filtrer arbeidsløsningen ved hjelp av et filterpapir.
- Etter 15 min inkubasjon, fjern formaldehydet, skyll cellene med 60% isopropylalkohol, tilsett 1 ml filtrert olje rød o arbeidsløsning, og inkuber i 1 time ved RT.
- Etter inkubasjonen, vask cellene med rennende vann. Deretter observerer lipidbelastede adipocytter under et omvendt mikroskop (forstørrelse: 20x objektiv og 10x okular).
- mRNA-ekspresjonsanalyse
MERK: Se tabell 2 for listen over primere som ble brukt i denne studien.- Aspirer mediet og tilsett 1 ml / brønn trizol til brønnen.
- Inkuber i 15 minutter ved RT, løsne cellene ved pipettering, og samle prøvene i 1,5 ml rør. Prøvene kan oppbevares ved -80 °C inntil RNA-ekstraksjon.
- Tine den frosne prøven til RT, tilsett 200 μL kloroform til prøven, og rist kraftig i 15 s.
- Inkuber prøven ved RT i 3 minutter og sentrifugerer deretter ved 20 000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Fjern forsiktig den vandige fasen (topp, fargeløs) og overfør til nye rør. Overfør aldri proteinfasen (midtre, hvit) eller fenol-/kloroformfasen (nederst, rosa).
- Tilsett sakte et likt volum på 70% EtOH og bland forsiktig. Ikke virvel.
- Legg prøven (opptil 700 μL) i en RNA-spinnkolonne som sitter i et oppsamlingsrør. Sørg for å inkludere bunnfall som kan ha dannet seg.
- Spinn ved 9000 x g i 30 s ved 4 °C, og kast deretter gjennomstrømningen.
- Tilsett 700 μL buffer RW1, spinn ved 9000 x g i 30 s ved 4 °C, og kast deretter gjennomstrømningen.
- Overfør kolonnen til et nytt oppsamlingsrør og tilsett 500 μL buffer-RPE.
- Spinn ved 9000 x g i 30 s ved 4 °C og kast deretter gjennomstrømningen.
- Tilsett 500 μL buffer-RPE, spinn ved 9000 x g i 2 minutter ved 4 °C, og kast deretter gjennomstrømningen.
- Overfør søylen til et nytt oppsamlingsrør, og sentrifugerer (søyler uten buffer) ved 9 000 x g i 1-2 min ved 4 °C.
- Overfør kolonnen til et nytt 1,5 ml oppsamlingsrør og tilsett 30 μL RNase-fritt vann direkte på kolonnemembranen.
- Inkuber prøven ved RT i 1-2 min. Spinn deretter ved 9000 x g i 1 minutt ved 4 °C for å eluere RNA.
- Kontroller RNA-konsentrasjonen ved hjelp av et fluorospektrometer.
MERK: Det anbefales å justere konsentrasjonen her. - Utfør omvendt transkripsjon ved hjelp av ~ 200 ng RNA-mal. Bruk et kommersielt kvantitativt sanntids polymerasekjedereaksjonssett (qPCR-RT) og følg produsentens protokoll. Etter reaksjonen, fortynn cDNA 20 ganger til 200 μL.
- Tilsett 2,0 μL cDNA, 3,0 μL Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μL 100 μM qPCR fremoverprimer, 0,018 μL 100 μM qPCR reversprimer og 0,96 μL ddH2O til hver brønn på en 384-brønnsplate.
- Kjør en qPCR (hold trinnet: 50 °C i 2 minutter og 95 °C i 2 minutter; PCR-stadium: 40 sykluser på 95 °C i 15 s og 60 °C i 1 min; smeltekurvetrinn: 95 °C i 15 s, 60 °C i 1 minutt og 95 °C i 15 s). Bruk standard kurvemetode for kvantifisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen gir fullt differensierte, lipidbelastede adipocytter 7 dager etter indusering av adipocytdifferensiering. Graden av adipocytdifferensiering kan evalueres ved oljerød o-farging av triglyserider og lipider (figur 1A), eller mRNA-ekspresjonsanalyse ved bruk av qPCR-RT av adipocyttgener, slik som hovedregulatoren for adipogenese Pparg og dens mål Fabp4 (figur 1B). For å indusere beige adipocyttdifferensiering in vitro kan en tiazolidindionklasse av PPARγ-agonist, slik som rosiglitazon, brukes. Faktisk, i eksperimenter med rosiglitazon, observerer vi en doseavhengig effekt av konsentrasjoner opp til 1 μM på ekspresjonsnivåene av de brune fettspesifikke gener, som Ucp1 og Ppargc1a. På den annen side er effekten av rosiglitazon på Fabp4 mettet ved en konsentrasjon på 0,1 μM (figur 1C).
Differensierte adipocytter oppnådd ved denne protokollen kan brukes til forskjellige funksjonelle og mekanistiske analyser, for eksempel oksygenforbrukshastighet (OCR) analyse 16,30 (figur 2A) og kromatinimmunoprecipitasjon 31 (ChIP; Figur 2B). Immortaliserte preadipocytter kan lagres i et flytende nitrogencellelagringssystem uten tap av levedyktighet og kan tines når som helst for bruk i eksperimenter.
Figur 1 Differensiering av preadipocytter til lipidbelastede adipocytter. (A) SVFs fra inguinal hvitt fettvev (iWAT) av villtypemus ble farget med oljerød o ved dag 0 eller 7 av adipocytdifferensiering. (B) mRNA-ekspresjonsnivåer av Pparg og Fabp4 ved dag 0 og dag 7 av adipocytdifferensiering (gjennomsnittlig ± standardfeil for gjennomsnittet [S.E.M.]; N = 3). (C) mRNA-ekspresjon av den generelle adipocyttmarkøren Fabp4 og de brune fettspesifikke genene Ucp1 og Ppargc1a i SVF-avledede adipocytter behandlet med 0,1, 0,2, 0,5 og 1,0 μM rosiglitazon, sammen med differensierings- og vedlikeholdsmediet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempler på funksjonelle og mekanistiske analyser med differensierte adipocytter. (A) OCR-analyse av iWAT SVF-deriverte adipocytter (N = 10). (B) ChIP-qPCR for H3K27Ac i Nfia flox / flox iWAT SVF-avledede adipocytter ved dag 0 og 7 av differensiering. Ins-0.4 kb og Fabp4-13 kb nettstedet vises som bakgrunnssider (gjennomsnittlig ± SEM; N = 2). For begge eksperimentene ble 1,0 μM rosiglitazon tilsatt sammen med differensierings- og vedlikeholdsmediet for å indusere beige adipocytdifferensiering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Sammensetning av differensierings- og vedlikeholdsmedium. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Liste over primere brukt i denne studien. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi en protokoll for isolering av SVF fra murine fettvev for å oppnå preadipocytter og utføre adipocytdifferensiering in vitro. Bruken av en vevsdissosiator for kollagenasefordøyelse reduserte eksperimentell variasjon, reduserte risikoen for forurensning og økte reproduserbarheten. Selv om denne prosedyren er et kritisk trinn i den presenterte protokollen, er prosessen svært automatisert og optimalisering er ikke nødvendig. Avhengig av musens alder og fettvevsdepot, kan det imidlertid være nødvendig med optimalisering av hakking, for eksempel størrelsesstykker eller skjæretid.
SVF er kjent som en heterogen populasjon bestående av preadipocytter, immunceller som makrofager, endotelceller og andre celler. Fordi preadipocytter holder seg til kulturretter og er tolerante mot vask og middels endringer, blir de beriket i cellepopulasjonen under passasjene. Det er imidlertid rimelig å anta at "preadipocytter" oppnådd ved denne protokollen fortsatt er heterogene. Fluorescerende aktivert cellesortering (FACS) ved bruk av antistoffer mot tidligere rapporterte overflatemarkører av preadipocytter som PDGFRα32 ville være nødvendig for å oppnå en renere preadipocytterpopulasjon.
Oppsummert beskrev vi her en protokoll for SVF-isolasjon ved hjelp av en vevsdissosiator for kollagenasefordøyelse. Denne protokollen gir enklere isolering av SVF sammenlignet med den konvensjonelle protokollen ved bruk av en bakteriell shaker med et rørstativ, og gir redusert eksperimentell variasjon, redusert forurensning og økt reproduserbarhet16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har konkurrerende økonomiske interesser knyttet til dette arbeidet.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Takahito Wada og Saiko Yoshida (Universitetet i Tokyo, Tokyo, Japan) for deres eksperimentelle hjelp. Dette arbeidet ble finansiert av følgende tilskudd til YH: forskningsstipend fra University of Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for forskere i tidlig karriere, stipendnummer 19K17976; tilskudd til Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) fra Japan Foundation for Applied Enzymology, stipendnummer 17F005; tilskudd fra Farmakologisk forskningsstiftelse; tilskudd fra Mochida Memorial Foundation for medisinsk og farmasøytisk forskning; tilskudd fra MSD Life Science Foundation; tilskudd fra Daiwa Securities Health Foundation; tilskudd fra Tokyo Biochemical Research Foundation; Life Science Research stipend fra Takeda Science Foundation; og tilskudd fra SENSHIN Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
