Semi-automatisert isolering av den stromale vaskulære fraksjonen fra murine hvitt fettvev ved bruk av en vevsdissosiator
Summary
Denne protokollen beskriver semi-automatisert isolering av stromal vaskulær fraksjon (SVF) fra murine fettvev for å oppnå preadipocytter og oppnå adipocyttdifferensiering in vitro. Ved hjelp av en vevsdissosiator for kollagenasefordøyelse reduseres eksperimentell variasjon og øker reproduserbarheten.
Abstract
In vitro-studien av hvit, brun og beige adipocytterdifferensiering muliggjør undersøkelse av celleautonome funksjoner av adipocytter og deres mekanismer. Immortaliserte hvite preadipocyttcellelinjer er offentlig tilgjengelige og mye brukt. Imidlertid er fremveksten av beige adipocytter i hvitt fettvev som respons på eksterne signaler vanskelig å rekapitulere i full grad ved bruk av offentlig tilgjengelige hvite adipocyttcellelinjer. Isolering av stromal vaskulær fraksjon (SVF) fra murine fettvev utføres vanligvis for å oppnå primære preadipocytter og utføre adipocytdifferensiering. Imidlertid kan hakking og kollagenase fordøyelse av fettvev for hånd resultere i eksperimentell variasjon og er utsatt for forurensning. Her presenterer vi en modifisert halvautomatisert protokoll som bruker en vevsdissosiator for kollagenasefordøyelse for å oppnå lettere isolering av SVF, med sikte på å redusere eksperimentell variasjon, redusere forurensning og øke reproduserbarheten. De oppnådde preadipocytter og differensierte adipocytter kan brukes til funksjonelle og mekanistiske analyser.
Introduction
Fettvevsbiologi har fått stadig økende oppmerksomhet på grunn av den økende forekomsten av fedme og type 2 diabetes globalt1. Adipocytter lagrer overflødig energi i form av lipiddråper, som frigjøres ved sult. Videre opprettholder fettvev systemisk energi homeostase ved å tjene som et endokrint organ og kommunisere med andre vev 2,3. Oppsiktsvekkende nok er både overflødig fettvev (fedme) og fetttap (lipodystrofi) knyttet til insulinresistens og diabetes1. Adipocytter er delt inn i tre typer: hvit, brun og beige1. Hvite adipocytter lagrer hovedsakelig overskuddsenergi som lipider, mens brune og beige adipocytter sprer energi i form av varme via mitokondrielt frakoblingsprotein-1 (Ucp1)1,4. Spesielt forekommer beige adipocytter (også kalt “induserbare” brune adipocytter) i hvitt fettvev som respons på kald eller sympatisk stimulering og viser genuttrykksmønstre som overlapper med, men er forskjellige fra de av “klassiske” brune adipocytter5. Nylig har brune og beige adipocytter blitt forventet som potensielle mål for anti-fedme og anti-diabetesbehandlinger rettet mot å “øke energispredningen” i stedet for å “undertrykke energiinntaket”4. Støttende rapporteres risikoallelen til FTO-fedmevarianten rs1421085 hos mennesker, som viser den sterkeste tilknytningen til høyere kroppsmasseindeks (BMI) blant vanlige varianter 6,7 og utviser forskjellige genmiljøinteraksjoner8,9, å negativt regulere beige adipocytdifferensiering og funksjon10. Peroksisomproliferatoraktivert reseptor γ (PPARγ) er kjent som en master transkripsjonell regulator av adipogenese og er nødvendig og tilstrekkelig for adipocytdifferensiering11. Transkripsjonsregulatorer, som PRD1-BF1-RIZ1 homologt domene som inneholder 16 (PRDM16), tidlig b-cellefaktor 2 (EBF2) og nukleær faktor I-A (NFIA), er avgjørende for brun og beige adipocytdifferensiering og funksjon 12,13,14,15,16,17,18. På den annen side krever programmering av hvite adipocytter transkripsjonsregulatorer, for eksempel transducinlignende forsterkerprotein 3 (TLE3) og sinkfingerprotein 423 (ZFP423) 19,20,21.
In vitro modellsystemer gjør det mulig å utføre molekylære studier som tar sikte på å forbedre forståelsen av mekanismen(e) som ligger til grunn for funksjonene og dysfunksjonene til adipocytter. Selv om offentlig tilgjengelige og immortaliserte preadipocyttcellelinjer som 3T3-L1 og 3T3-F442A eksisterer22,23,24, vil kulturen av primære preadipocytter og differensiering i adipocytter være en mer egnet modell for å studere in vivo adipogenese. Isolering av stromal vaskulær fraksjon (SVF) fra murine fettvev er en velkjent metode for å oppnå primære preadipocytter25,26. Imidlertid kan kollagenasefordøyelse av fettvev, som vanligvis utføres ved hjelp av en bakteriell shaker med et rørstativ, resultere i eksperimentell variasjon og er utsatt for forurensning27,28. Her beskriver vi en alternativ protokoll som bruker en mild magnetisk-aktivert cellesortering (MACS) vevsdissosiator for kollagenasefordøyelse for å oppnå lettere isolering av SVF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrev vi en protokoll for isolering av SVF fra murine fettvev for å oppnå preadipocytter og utføre adipocytdifferensiering in vitro. Bruken av en vevsdissosiator for kollagenasefordøyelse reduserte eksperimentell variasjon, reduserte risikoen for forurensning og økte reproduserbarheten. Selv om denne prosedyren er et kritisk trinn i den presenterte protokollen, er prosessen svært automatisert og optimalisering er ikke nødvendig. Avhengig av musens alder og fettvevsdepot, kan det imidlertid være nø…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Takahito Wada og Saiko Yoshida (Universitetet i Tokyo, Tokyo, Japan) for deres eksperimentelle hjelp. Dette arbeidet ble finansiert av følgende tilskudd til YH: forskningsstipend fra University of Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for forskere i tidlig karriere, stipendnummer 19K17976; tilskudd til Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) fra Japan Foundation for Applied Enzymology, stipendnummer 17F005; tilskudd fra Farmakologisk forskningsstiftelse; tilskudd fra Mochida Memorial Foundation for medisinsk og farmasøytisk forskning; tilskudd fra MSD Life Science Foundation; tilskudd fra Daiwa Securities Health Foundation; tilskudd fra Tokyo Biochemical Research Foundation; Life Science Research stipend fra Takeda Science Foundation; og tilskudd fra SENSHIN Medical Research Foundation.
Materials
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
