Summary
Denne protokol beskriver den halvautomatiske isolering af den stromale vaskulære fraktion (SVF) fra murine fedtvæv for at opnå preadipocytter og opnå adipocytdifferentiering in vitro. Brug af en vævsdissociator til kollagenasefordøjelse reducerer eksperimentel variation og øger reproducerbarheden.
Abstract
In vitro-undersøgelsen af hvid, brun og beige adipocytdifferentiering muliggør undersøgelse af celleautonome funktioner af adipocytter og deres mekanismer. Udødeliggjorte hvide preadipocytcellelinjer er offentligt tilgængelige og meget udbredt. Imidlertid er fremkomsten af beige adipocytter i hvidt fedtvæv som reaktion på eksterne signaler vanskeligt at rekapitulere i fuldt omfang ved hjælp af offentligt tilgængelige hvide adipocytcellelinjer. Isolering af den stromale vaskulære fraktion (SVF) fra murine fedtvæv udføres almindeligvis for at opnå primære preadipocytter og udføre adipocytdifferentiering. Imidlertid kan hakket og kollagenasefordøjelse af fedtvæv i hånden resultere i eksperimentel variation og er tilbøjelig til forurening. Her præsenterer vi en modificeret halvautomatisk protokol, der anvender en vævsdissociator til kollagenasefordøjelse for at opnå lettere isolering af SVF med det formål at reducere eksperimentel variation, reducere forurening og øge reproducerbarheden. De opnåede preadipocytter og differentierede adipocytter kan anvendes til funktionelle og mekanistiske analyser.
Introduction
Fedtvævsbiologi har tiltrukket sig stadig stigende opmærksomhed på grund af den voksende forekomst af fedme og type 2-diabetes globalt1. Adipocytter opbevarer overskydende energi i form af lipiddråber, som frigives ved sult. Desuden opretholder fedtvæv systemisk energihomeostase ved at tjene som et endokrin organ og kommunikere med andre væv 2,3. Interessant nok er både overskydende fedtvæv (fedme) og fedttab (lipodystrofi) forbundet med insulinresistens og diabetes1. Adipocytter er opdelt i tre typer: hvid, brun og beige1. Hvide adipocytter lagrer hovedsageligt overskydende energi som lipider, mens brune og beige adipocytter spreder energi i form af varme via mitokondrieafkoblingsprotein-1 (Ucp1)1,4. Især beige adipocytter (også kaldet "inducerbare" brune adipocytter) forekommer i hvidt fedtvæv som reaktion på kold eller sympatisk stimulering og udviser genekspressionsmønstre, der overlapper med, men adskiller sig fra dem af "klassiske" brune adipocytter5. For nylig er brune og beige adipocytter blevet forventet som potentielle mål for behandlinger mod fedme og diabetes, der sigter mod at "øge energiafledningen" snarere end at "undertrykke energiindtag"4. Støttende, risikoallelen for FTO fedme variant rs1421085 hos mennesker, som udviser den stærkeste association med højere body mass index (BMI) blandt almindelige varianter 6,7 og udviser forskellige gen-miljø interaktioner8,9, rapporteres at negativt regulere beige adipocytdifferentiering og funktion10. Peroxisom proliferator-aktiveret receptor γ (PPARγ) er kendt som en master transkriptionel regulator af adipogenese og er nødvendig og tilstrækkelig til adipocytdifferentiering11. Transskriptionelle regulatorer, såsom PRD1-BF1-RIZ1 homologt domæne indeholdende 16 (PRDM16), tidlig b-cellefaktor 2 (EBF2) og nuklear faktor I-A (NFIA), er afgørende for brun og beige adipocytdifferentiering og funktion 12,13,14,15,16,17,18. På den anden side kræver hvid adipocyt-genprogrammering transkriptionelle regulatorer, såsom transducinlignende forstærkerprotein 3 (TLE3) og zinkfingerprotein 423 (ZFP423)19,20,21.
In vitro-modelsystemer gør det muligt at udføre molekylære undersøgelser, der har til formål at forbedre forståelsen af den eller de mekanismer, der ligger til grund for adipocytters funktioner og dysfunktioner. Selvom offentligt tilgængelige og udødeliggjorte preadipocytcellelinjer såsom 3T3-L1 og 3T3-F442A eksisterer22,23,24, ville kulturen af primære preadipocytter og differentiering i adipocytter være en mere egnet model til undersøgelse af in vivo adipogenese. Isolering af den stromale vaskulære fraktion (SVF) fra murine fedtvæv er en velkendt metode til opnåelse af primære preadipocytter25,26. Imidlertid kan kollagenasefordøjelse af fedtvæv, som almindeligvis udføres ved hjælp af en bakteriel ryster med et rørstativ, resultere i eksperimentel variation og er tilbøjelig til forurening27,28. Her beskriver vi en alternativ protokol, der bruger en blid magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) vævsdissociator til kollagenasefordøjelse for at opnå lettere isolering af SVF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg beskrevet i denne protokol blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Tokyo og udført i henhold til de institutionelle retningslinjer fra University of Tokyo.
1. Fremstilling af enzymopløsning og substrat
- Sæt begge sider af inguinal hvidt fedtvæv (højre og venstre side, ca. 150 mg) fra en 7-8 uger gammel mus og 2,5 ml enzymopløsning i rør C i dissociatoren.
- Rekonstituer enzym D med 3 ml Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM)/F12 uden føtalt bovint serum (FBS) eller antibiotika, enzym R med 2,7 ml DMEM/F12 uden FBS eller antibiotika og enzym A med 1 ml buffer A.
- Forbered 2,5 ml enzymopløsning ved at tilsætte 100 μL enzym D, 50 μL enzym R, 12,5 μL enzym A og 2,35 ml DMEM / F12 uden FBS eller antibiotika i rør C. Sæt rør C med enzymopløsning på is.
2. Isolering af fedtvæv
- Aflive 7-8 uger gamle C57BL/6J-hanmus (ca. 20 g) ved cervikal dislokation.
- På en ren bænk, for at isolere lyskehvidt fedtvæv, skal du klippe huden med stump / skarp saks ved maven og mod underekstremiteterne. Isoler fedtvævet fra indersiden af lårene ved hjælp af skarp / skarp saks. Den ene side af lyskefedtvæv wieghs ~ 75 mg.
- Sæt det isolerede fedtvæv i rør C med enzymopløsning på is, og hold røret inden for den rene bænk for at opretholde sterilitet.
3. Hakning og fordøjelse af fedtvæv
- Ved den rene bænk tilsættes 2,5 ml enzymopløsning til rør C.
- Hak fedtvævet i små stykker ved at klippe med skarp/skarp saks 50 gange. Skær fedtvævet i ~ 2 mm2 stykker.
- Luk hætten på rør C tæt, vend røret på hovedet, og fastgør det til ærmet på vævsdissociatoren med hætten på. Derefter fordøjes prøven i ~40 minutter ved 37 °C.
BEMÆRK: Denne undersøgelse brugte gentleMACS Octo Dissociator with Heaters (Miltenyi Biotec 130-096-427), og det forudinstallerede program "37C_mr_ATDK_1" blev fulgt.
4. Filtrering af cellesuspension
- Forvarm DMEM/F12 indeholdende 10 % FBS og 1 % penicillin-streptomycin til 37 °C.
- Fjern rør C fra vævsdissociatoren og stop fordøjelsen ved at tilsætte 5 ml DMEM / F12 indeholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin og forsigtigt pipettere fire gange.
- Der centrifugeres ved 700 x g i 10 minutter ved 20 °C.
- Supernatanten suges forsigtigt til uden at forstyrre cellepellet.
- Resuspender pellet ved at tilsætte 10 ml DMEM / F12 indeholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin og forsigtigt pipettere fem gange.
- Filtrer cellesuspensionen gennem en cellesi med en diameter på 70 μm placeret på et nyt 50 ml rør.
- Der centrifugeres ved 250 x g i 5 minutter, og pelletsen resuspenderes i 10 ml fosfatbufret saltvand (PBS).
5. Cellebelægning
- Der centrifugeres ved 500 x g i 5 min.
- Supernatanten fjernes og pellets resuspenderes ved at tilsætte 10 ml DMEM/F12 indeholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin og pipettere ti gange.
- Plade cellesuspensionen på en 10 cm kollagenbelagt skål og anbring skålene i en cellekulturkuvøse (37 °C, 5% CO 2) i1-2 timer.
BEMÆRK: Kollagenbelagte retter er ikke absolut påkrævet. Baseret på erfaring hjælper kollagenbelagte retter imidlertid vedhæftningen af preadipocytter og øger dermed cellernes overlevelse. - Opsug mediet og vask cellerne to gange med 3 ml PBS pr. vask.
- Der tilsættes 10 ml DMEM/F12 indeholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin, og skålene hældes tilbage i cellekulturkuvøsen (37 °C, 5% CO2).
6. Overførsel af preadipocytter
- Næste dag aspireres mediet (cellerne klæber, og dermed kan mediet aspireres), cellerne vaskes to gange med 3 ml PBS pr. vask, og der tilsættes 10 ml DMEM/F12 indeholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
- Når cellerne når 80% sammenløb (normalt 4 dage efter SVF-isolering), opdeles cellerne i fire 10 cm kollagenbelagte retter.
- Specifikt aspireres mediet, vaskes cellerne med PBS (stuetemperatur [RT]), tilsættes 1 ml forvarmet 0,05% trypsin og inkuberes i 5 minutter i cellekulturinkubatoren.
- Tilsæt 10 ml DMEM / F12 indeholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin for at slukke trypsinaktiviteten. Efter pipettering centrifugeres ved 440 x g i 5 min.
- Opsug supernatanten, resuspender cellerne ved tilsætning af 40 ml DMEM/F12 indeholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin, og behandl cellerne i fire 10 cm kollagenbelagte skåle.
- Passage cellerne igen, når de når 80% sammenløb.
7. Fremstilling af retrovirus, der udtrykker SV40 stort T-antigen til udødeliggørelse af preadipocytter (valgfrit)
- Mindst 3 dage før udødeliggørelse, plade Platinum-E (Plat-E) emballageceller29 ved en densitet på 3,0 x 105 celler / ml i 2 ml DMEM med 10% FBS uden antibiotika. Brug et hæmacytometer til at tælle cellerne.
- Den næste dag transfekteres 4 μg pBABE-neo largeTcDNA (tilføj genplasmid #1780) ved hjælp af Lipofectamine 2000 i henhold til producentens anvisninger.
- Efter 24 timer aspireres mediet og tilsættes 2 ml DMEM med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
- Næste dag høstes den retrovirale supernatant. Retrovirussen kan anvendes til udødeliggørelse med det samme eller opbevares ved -80 °C.
8. Udødeliggørelse af preadipocytter med SV40 stort T-antigen (valgfrit)
- Passage og udvidelse af preadipocytterne to gange efter SVF-isolering.
- Plade cellerne i 6-brønds plader med en densitet på 0,5-1,0 x 104 celler / ml i 2 ml DMEM / F12 med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Brug et hæmacytometer til at tælle cellerne.
- Den næste dag fremstilles 250 μL frisk eller optøet retrovirus, der udtrykker SV40 stort T-antigen pr. hul på pladerne med 6 huller. Supernatanten centrifugeres ved 440 x g i 5 minutter og anbringes i et nyt glas.
- Der tilsættes 750 μl DMEM/F12 indeholdende 10 % FBS og 1 % penicillinstreptomycin og 1 μ liter polybren pr. 250 μl retroviral supernatant for at fremstille det virkende virus.
- Opsug mediet og tilsæt 1.000 μL af det fungerende retrovirus til hvert hul, der indeholder preadipocytter.
- Tilsæt 1 ml DMEM / F12 med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin 4 timer senere.
- Den næste dag adskilles de inficerede preadipocytter i en 10 cm skål og vælges de inficerede celler med DMEM / F12 indeholdende 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin og 500 μg / ml neomycin. For at overvåge antibiotikavalget skal du forberede en skål med uinficerede celler med neomycin.
- Fortsæt med at passere de inficerede celler med neomycin, indtil alle uinficerede celler i monitorskålen er døde.
9. Adipocyt differentiering
- Plade cellerne. For plader med 12 brønde plades cellerne med en densitet på 4,0 x 104 celler / ml i 1 ml DMEM / F12 indeholdende 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
- Når preadipocytterne flyder sammen (48-72 timer efter plettering), aspireres mediet og erstattes med differentieringsmedium (se tabel 1 for sammensætning).
- På dag 2 i differentieringen (dvs. 48 timer efter inducering af differentiering) udskiftes substratet med vedligeholdelsessubstratet (se tabel 1 for sammensætning). Skift derefter vedligeholdelsesmediet hver 2. dag. Terminal differentiering opnås på dag 7 af differentiering.
- Olie rød o farvning
- Til olierød o farvning aspireres mediet og skylles cellerne med 1 ml PBS pr. Brønd. Fastgør cellerne ved at tilsætte 1 ml 4% formaldehyd pr. Brønd, og inkuber cellerne i 15 minutter ved RT.
- Under inkubationen fortyndes 0,5% olie rød stamopløsning (i isopropylalkohol) til 0,3% ved anvendelse af ddH2O og filtreres arbejdsløsningen ved hjælp af et filterpapir.
- Efter 15 minutters inkubation fjernes formaldehydet, skylles cellerne med 60% isopropylalkohol, tilsættes 1 ml filtreret olie rød o arbejdsopløsning og inkuberes i 1 time ved RT.
- Efter inkubationen vaskes cellerne med rindende vand. Derefter observeres lipidbelastede adipocytter under et omvendt mikroskop (forstørrelse: 20x objektiv og 10x okular).
- mRNA-ekspressionsanalyse
BEMÆRK: Se tabel 2 for listen over primere, der anvendes i denne undersøgelse.- Opsug mediet og tilsæt 1 ml / hul trizol til brønden.
- Inkuber i 15 minutter ved RT, løsn cellerne ved pipettering, og saml prøverne i 1,5 ml rør. Prøverne kan opbevares ved -80 °C indtil RNA-ekstraktion.
- Den frosne prøve optøs til RT, der tilsættes 200 μL chloroform til prøven, og der rystes kraftigt i 15 sekunder.
- Prøven inkuberes ved RT i 3 minutter og centrifugeres derefter ved 20.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- Fjern forsigtigt den vandige fase (top, farveløs) og overfør til nye rør. Overfør aldrig proteinfasen (midterste, hvid) eller phenol/chloroformfasen (nederst, lyserød).
- Tilsæt langsomt et lige stort volumen på 70% EtOH og bland forsigtigt. Må ikke hvirvel.
- Prøven (op til 700 μL) lægges i en RNA-spinsøjle, der sidder i et opsamlingsrør. Sørg for at medtage ethvert bundfald, der kan være dannet.
- Spin ved 9.000 x g i 30 s ved 4 °C, og kassér derefter gennemstrømningen.
- Der tilsættes 700 μL buffer RW1, centrifugeres ved 9.000 x g i 30 s ved 4 °C, hvorefter gennemstrømningen kasseres.
- Overfør kolonnen til et nyt opsamlingsrør, og tilsæt 500 μL buffer-RPE.
- Spin ved 9.000 x g i 30 s ved 4 °C, og kassér derefter gennemstrømningen.
- Der tilsættes 500 μL buffer-RPE, centrifugeres ved 9.000 x g i 2 minutter ved 4 °C, og gennemstrømningen kasseres derefter.
- Søjlen overføres til et nyt opsamlingsrør, og centrifugeres (kolonner uden buffer) ved 9.000 x g i 1-2 minutter ved 4 °C.
- Overfør søjlen til et nyt 1,5 ml opsamlingsrør, og tilsæt 30 μL RNasefrit vand direkte på søjlemembranen.
- Inkuber prøven ved RT i 1-2 min. Derefter drejes ved 9.000 x g i 1 min ved 4 °C for at eluere RNA'et.
- Kontroller RNA-koncentrationen ved hjælp af et fluorspektrometer.
BEMÆRK: Det anbefales at justere koncentrationen her. - Udfør revers transkription ved hjælp af ~ 200 ng RNA-skabelon. Brug et kommercielt kvantitativt realtidspolymerasekædereaktionssæt (qPCR-RT), og følg producentens protokol. Efter reaktionen fortyndes cDNA'et 20 gange til 200 μL.
- Tilsæt 2,0 μL cDNA, 3,0 μL Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μL 100 μM qPCR forward primer, 0,018 μL 100 μM qPCR reverse primer og 0,96 μL ddH2O til hver brønd i en 384-brøndplade.
- Kør en qPCR (hold trin: 50 ° C i 2 minutter og 95 ° C i 2 minutter; PCR-trin: 40 cyklusser på 95 °C i 15 s og 60 °C i 1 min; smeltekurvetrin: 95 °C i 15 s, 60 °C i 1 min og 95 °C i 15 s). Brug standardkurvemetoden til kvantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol giver fuldt differentierede, lipidbelastede adipocytter 7 dage efter inducering af adipocytdifferentiering. Graden af adipocytdifferentiering kan evalueres ved olierød o-farvning af triglycerider og lipider (figur 1A) eller mRNA-ekspressionsanalyse ved anvendelse af qPCR-RT af adipocytgener, såsom masterregulatoren for adipogenese Pparg og dens mål Fabp4 (figur 1B). For at inducere beige adipocytdifferentiering in vitro kan en thiazolidindionklasse af PPARγ-agonist, såsom rosiglitazon anvendes. I forsøg med rosiglitazon observerer vi faktisk en dosisafhængig effekt af koncentrationer op til 1 μM på ekspressionsniveauerne af de brune fedtspecifikke gener, såsom Ucp1 og Ppargc1a. På den anden side er virkningen af rosiglitazon på Fabp4 mættet i en koncentration på 0,1 μM (figur 1C).
Differentierede adipocytter opnået ved denne protokol kan anvendes til forskellige funktionelle og mekanistiske analyser, såsom iltforbrugshastighed (OCR) analyse16,30 (figur 2A) og kromatinimmunudfældning 31 (ChIP; Figur 2B). Udødeliggjorte preadipocytter kan opbevares i et flydende nitrogencellelagringssystem uden tab af levedygtighed og kan til enhver tid optøes til brug i forsøg.
Figur 1: Differentiering af preadipocytter i lipidbelastede adipocytter. (A) SVF'er fra inguinalt hvidt fedtvæv (iWAT) fra vildtypemus blev farvet med olierødt o på dag 0 eller 7 af adipocytdifferentiering. B) mRNA-ekspressionsniveauer for Pparg og Fabp4 på dag 0 og dag 7 for adipocytdifferentiering (gennemsnitlig ± standardfejl for den gennemsnitlige [S.E.M.] N = 3). (C) mRNA-ekspression af den generelle adipocytmarkør Fabp4 og de brune fedtspecifikke gener Ucp1 og Ppargc1a i SVF-afledte adipocytter behandlet med 0,1, 0,2, 0,5 og 1,0 μM rosiglitazon sammen med differentierings- og vedligeholdelsesmediet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempler på funktionelle og mekanistiske analyser med differentierede adipocytter. (A) OCR-analyse af iWAT SVF-afledte adipocytter (N = 10). B) ChIP-qPCR for H3K27Ac i Nfia flox/flox iWAT SVF-afledte adipocytter på dag 0 og 7 i differentieringen. Ins-0.4 kb og Fabp4-13 kb site vises som baggrundssteder (gennemsnit ± S.E.M.; N = 2). Til begge eksperimenter blev 1,0 μM rosiglitazon tilsat sammen med differentierings- og vedligeholdelsesmediet for at inducere beige adipocytdifferentiering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Sammensætning af differentierings- og vedligeholdelsesmedium. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: Listen over primere, der anvendes i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi en protokol til isolering af SVF fra murine fedtvæv for at opnå preadipocytter og udføre adipocytdifferentiering in vitro. Brugen af en vævsdissociator til kollagenasefordøjelse reducerede eksperimentel variation, reducerede risikoen for kontaminering og øgede reproducerbarheden. Selvom denne procedure er et kritisk trin inden for den præsenterede protokol, er processen meget automatiseret, og optimering er ikke nødvendig. Afhængigt af musens alder og fedtvævsdepot kan det dog være nødvendigt at optimere hakkekødet, f.eks. størrelsesstykker eller skæretid.
SVF er kendt som en heterogen population bestående af preadipocytter, immunceller såsom makrofager, endotelceller og andre celler. Fordi preadipocytter klæber til kulturretter og er tolerante over for vask og medieændringer, beriges de i cellepopulationen under passagerne. Det er imidlertid rimeligt at antage, at de "preadipocytter", der opnås ved denne protokol, stadig er heterogene. Fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS) ved hjælp af antistoffer mod tidligere rapporterede overflademarkører for preadipocytter såsom PDGFRα32 ville være påkrævet for at opnå en renere preadipocytpopulation.
Sammenfattende beskrev vi her en protokol for SVF-isolering ved hjælp af en vævsdissociator til kollagenasefordøjelse. Denne protokol giver lettere isolering af SVF sammenlignet med den konventionelle protokol ved hjælp af en bakteriel ryster med et rørstativ og giver reduceret eksperimentel variation, reduceret kontaminering og øget reproducerbarhed16,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har en konkurrerende økonomisk interesse i forbindelse med dette arbejde.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Takahito Wada og Saiko Yoshida (University of Tokyo, Tokyo, Japan) for deres eksperimentelle bistand. Dette arbejde blev finansieret af følgende tilskud til Y.H.: forskningsstipendium fra University of Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant-in-Aid for Early-Career Scientists, bevillingsnummer 19K17976; bevilling til Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) fra Japan Foundation for Applied Enzymology, bevillingsnummer 17F005; bevilling fra Pharmacological Research Foundation; tilskud fra Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research; bevilling fra MSD Life Science Foundation; tilskud fra Daiwa Securities Health Foundation; bevilling fra Tokyo Biochemical Research Foundation; Life Science Research bevilling fra Takeda Science Foundation; og bevilling fra SENSHIN Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
