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Biology

कंकाल की मांसपेशी उत्तेजना का अध्ययन करने के लिए मूल कोशिकाओं में कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65311
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

Summary

कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री वास्तविक समय में प्रोटीन डोमेन गति का अध्ययन करने की एक विधि है। देशी कोशिकाओं में इसके आवेदन के लिए इस तकनीक का संशोधन अब मुराइन पृथक कंकाल मांसपेशी फाइबर में वोल्टेज-गेटेड सीए2 + चैनलों से एकल वोल्टेज-सेंसर गति का पता लगाने और ट्रैकिंग की अनुमति देता है।

Abstract

कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री वोल्टेज-गेटेड आयन चैनलों सहित कई झिल्ली प्रोटीनों की संरचना-कार्य संबंध की जांच करने के लिए पसंद की तकनीक रही है। इस दृष्टिकोण का उपयोग मुख्य रूप से हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणालियों में झिल्ली धाराओं को एक साथ मापने, चैनलों की गतिविधि की विद्युत अभिव्यक्ति और प्रतिदीप्ति माप, स्थानीय डोमेन पुनर्व्यवस्था की रिपोर्ट करने के लिए किया गया है। कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, आणविक जीव विज्ञान, रसायन विज्ञान और प्रतिदीप्ति को एक विस्तृत तकनीक में जोड़ती है जो क्रमशः प्रतिदीप्ति और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के माध्यम से वास्तविक समय संरचनात्मक पुनर्व्यवस्था और कार्य के अध्ययन की अनुमति देती है। आमतौर पर, इस दृष्टिकोण के लिए एक इंजीनियर वोल्टेज-गेटेड झिल्ली चैनल की आवश्यकता होती है जिसमें एक सिस्टीन होता है जिसे थिओल-प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट डाई द्वारा परीक्षण किया जा सकता है। हाल तक, प्रोटीन के साइट-निर्देशित फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले थिओल-प्रतिक्रियाशील रसायन विज्ञान को विशेष रूप से जेनोपस अंडाणुओं और सेल लाइनों में किया गया था, जो प्राथमिक गैर-उत्तेजक कोशिकाओं के दृष्टिकोण के दायरे को सीमित करता है। यह रिपोर्ट उत्तेजना-संकुचन युग्मन के शुरुआती चरणों का अध्ययन करने के लिए वयस्क कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं में कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री की प्रयोज्यता का वर्णन करती है, जिस प्रक्रिया द्वारा मांसपेशी फाइबर विद्युत विध्रुवण मांसपेशियों के संकुचन के सक्रियण से जुड़ा होता है। वर्तमान प्रोटोकॉल विवो इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके वयस्क चूहों के फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस के मांसपेशी फाइबर में सिस्टीन-इंजीनियर ्ड वोल्टेज-गेटेड सीए2 + चैनलों (सीएवी1.1) को डिजाइन और स्थानांतरित करने के तरीकों का वर्णन करता है और कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री माप के लिए आवश्यक बाद के चरणों का वर्णन करता है। इस दृष्टिकोण को अन्य आयन चैनलों और प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। स्तनधारी मांसपेशियों के कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री का उपयोग उत्तेजना के बुनियादी तंत्र का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है।

Introduction

एक जीवित कोशिका में एक ज्ञात विद्युत उत्तेजना के जवाब में आयन चैनल विरूपण पुनर्व्यवस्था को ट्रैक करने की क्षमता आणविक शरीर विज्ञान1 के लिए मूल्यवान जानकारी का एक स्रोत है। वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल झिल्ली प्रोटीन होते हैं जो ट्रांसमेम्ब्रेन वोल्टेज में परिवर्तन को महसूस करते हैं, और उनका कार्य वोल्टेज परिवर्तन2 से भी प्रभावित होता है। पिछली शताब्दी में वोल्टेज क्लैंप तकनीकों के विकास ने फिजियोलॉजिस्ट को वास्तविक समय में, झिल्ली विध्रुवण 3 के जवाब में वोल्टेज-गेटेड आयन चैनलों द्वारा किए गए आयनिक धाराओं का अध्ययन करने की अनुमतिदी। वोल्टेज क्लैंप तकनीक का उपयोग न्यूरॉन्स और मांसपेशियों जैसे उत्तेजक कोशिकाओं के विद्युत गुणों को समझने में महत्वपूर्ण रहा है। 1970 के दशक में, वोल्टेज क्लैंप शोधन ने वोल्टेज-गेटेड कैल्शियम (सीएवी) और सोडियम (एनएवी) चैनलों 4,5 में गेटिंग धाराओं (या चार्ज मूवमेंट) का पता लगाने की अनुमति दी। गेटिंग धाराएं गैर-रैखिक कैपेसिटिव धाराएं हैं जो कोशिका झिल्ली6 में विद्युत क्षेत्र में परिवर्तन के जवाब में वोल्टेज सेंसर की गति से उत्पन्न होती हैं। गेटिंग धाराओं को आणविक पुनर्व्यवस्था का एक विद्युत अभिव्यक्ति माना जाता है जो आयन चैनल खोलने से पहले या उसके साथहोता है। जबकि ये वर्तमान माप चैनल के कार्य के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करते हैं, आयनिक धाराएं और गेटिंग धाराएं दोनों वोल्टेज-गेटेडचैनलों के अंतर-और अंतर-आणविक विरूपण पुनर्व्यवस्था के अप्रत्यक्ष रीडआउट हैं।

कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री (एफएसडीएफ; जिसे वोल्टेज क्लैंप फ्लोरोमेट्री, वीसीएफ के रूप में भी जाना जाता है) 1990के दशक की शुरुआत में विकसित किया गया था और पहली बार, स्थानीय विरूपण परिवर्तनों और वास्तविक समय में एक चैनल प्रोटीन के कार्य को सीधे देखने की क्षमता प्रदान की गई थी। चैनल म्यूटेनेसिस, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणालियों के संयोजन का उपयोग करके, सक्रिय उत्तेजना 9,10 के जवाब में विशिष्ट चैनलों या रिसेप्टर्स के चलती भागों को फ्लोरोसेंटली टैग और ट्रैक करना संभव है। वोल्टेज-गेटेडआयन चैनलों 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 में वोल्टेज-सेंसिंग तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस दृष्टिकोण का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। आधिकारिक समीक्षाओं के लिए, 10,20,21,22,23 देखें।

विद्युत संकेतों की शुरुआत और प्रसार के लिए महत्वपूर्ण सीए वी और एनएवी चैनल एक मुख्य ए 1 सबयूनिट से बने होते हैं, जिसमें एक केंद्रीय छिद्र और चार गैर-समान वोल्टेज सेंसिंग डोमेनहोते हैं। उनकी विशिष्ट प्राथमिक संरचना के अलावा, सीए वी और एनएवी चैनलों को सहायक सबयूनिट्स24 के साथ मल्टीसबयूनिट कॉम्प्लेक्स के रूप में व्यक्त किया जाता है। वोल्टेज-निर्भर पोटेशियम चैनल (के वी) में चार सबयूनिट होते हैं जो एनए वी या सीएवी25 के एकल डोमेन की तरह दिखते हैं। सीएवी और एनएवी चैनलों के छिद्र बनाने और वोल्टेज-सेंसिंग ए 1 सबयूनिट का गठन छह अद्वितीय ट्रांसमेम्ब्रेन खंडों (एस 1-एस 6) के चार अलग-अलग डोमेन के लिए एक एकल पॉलीपेप्टाइड कोडिंग द्वारा किया जाता है। चित्र 1ए)। 24,26. एस 1 से एस 4 ट्रांसमेम्ब्रेन खंडों से युक्त क्षेत्र वोल्टेज सेंसिंग डोमेन (वीएसडी) बनाते हैं और एस 5 और एस 6 ट्रांसमेम्ब्रेन सेगमेंट पोर डोमेन26 बनाते हैं। प्रत्येक वीएसडी में, एस 4 α-हेलिक्स में सकारात्मक रूप से चार्ज आर्जिनिन या लाइसिन (चित्रा 1 ए, बी) होता है जो झिल्ली विध्रुवण7 के जवाब में चलता है। कई दशकों के शोध और अत्यधिक विविध प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों के परिणाम इस आधार का समर्थन करते हैं कि झिल्ली विध्रुवण6 के जवाब में एस 4 खंड बाहर की ओर बढ़ते हैं, गेटिंग धाराएं उत्पन्न करते हैं।

एफएसडीएफ एक आयन चैनल या अन्य प्रोटीन पर एक विशिष्ट सिस्टीन अवशेष (यानी, एस 4 α-हेलिक्स) से संयुग्मित थिओल-प्रतिक्रियाशील डाई के प्रतिदीप्ति परिवर्तनों को मापता है, जिसे साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस के माध्यम से इंजीनियर किया जाता है, क्योंकि चैनल झिल्ली विध्रुवण या अन्य उत्तेजनाओं के जवाब में कार्य करताहै। वास्तव में, एफएसडीएफ को मूल रूप से यह जांचने के लिए विकसित किया गया था कि क्याकेवी चैनलों में एस 4 खंड, जिसे चैनल का मुख्य वोल्टेज सेंसर होने का प्रस्ताव है, तब चलता है जब झिल्ली क्षमता 8,10 में परिवर्तन के जवाब में गेटिंग चार्ज चलते हैं। वोल्टेज-गेटेड आयन चैनलों के मामले में, एफएसडीएफ चैनल फ़ंक्शन माप के साथ समवर्ती रूप से चार वीएसडी (किसी भी समय एक वीएसडी को ट्रैक करना) के स्वतंत्र विरूपण पुनर्व्यवस्था को हल कर सकता है। दरअसल, इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, यह दिखाया गया है कि व्यक्तिगत वीएसडी चैनल सक्रियण और निष्क्रियता 12,27,28,29,30 के विशिष्ट पहलुओं में अलग-अलग शामिल दिखाई देते हैं। चैनलों के कार्य में प्रत्येक वीएसडी के योगदान की पहचान करना उच्च प्रासंगिकता का है और इसका उपयोग चैनल संचालन को और स्पष्ट करने और संभावित रूप से दवा विकास के लिए नए लक्ष्यों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।

हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणालियों में एफएसडीएफ का उपयोग एक न्यूनीकरणवादी परिप्रेक्ष्य10,23 से चैनल फ़ंक्शन की हमारी समझ को आगे बढ़ाने में बेहद सहायक रहा है। कई न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोणों की तरह, यह फायदे प्रस्तुत करता है लेकिन इसकी सीमाएं भी हैं। उदाहरण के लिए, एक प्रमुख सीमा हेटरोलॉगस सिस्टम में चैनल नैनो पर्यावरण का आंशिक पुनर्गठन है। अक्सर, आयन चैनल कई सहायक सबयूनिट्स और कई अन्य प्रोटीनों के साथ बातचीत करते हैं जो उनके फ़ंक्शनको संशोधित करते हैं। सिद्धांत रूप में, विभिन्न चैनलों और उनके सहायक सबयूनिट्स को कई प्रोटीन कोडिंग संरचनाओं या पॉलीसिस्ट्रोनिक प्लास्मिड के उपयोग के साथ हेटरोलॉगस सिस्टम में व्यक्त किया जा सकता है, लेकिन उनके मूल वातावरण को पूरी तरहसे पुनर्गठित नहीं किया जा सकता है।

हमारे समूह ने हाल ही में उत्तेजना-संकुचन युग्मन (ईसीसी) 33,34 के शुरुआती चरणों के अध्ययन के लिए देशी विघटित कंकाल की मांसपेशी फाइबर में एफएसडीएफ का एक संस्करण प्रकाशित किया, जिस प्रक्रिया द्वारा मांसपेशी फाइबर विद्युत विध्रुवण मांसपेशियों के संकुचन35,36 के सक्रियण से जुड़ा हुआ है। पहली बार, इस दृष्टिकोण ने एक वयस्क विभेदित मांसपेशी फाइबर37 के मूल वातावरण में वोल्टेज-गेटेड एल-टाइप सीए2 + चैनल (सीएवी1.1, जिसे डीएचपीआर भी कहा जाता है) से व्यक्तिगत एस 4 वोल्टेज-सेंसर की गति ट्रैकिंग की अनुमति दी। यह इस सेल प्रकार की कई विशेषताओं पर विचार करके पूरा किया गया था, जिसमें सेल की विद्युत गतिविधि तेजी से उत्तेजना-प्रेरित स्व-प्रचारित विध्रुवण की अनुमति देती है, विवो इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से सीडीएनए प्लास्मिड को व्यक्त करने की क्षमता, सेल के भीतर चैनलों की प्राकृतिक उच्च अभिव्यक्ति और कंपार्टमेंटल संगठन, और उच्च गति इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग उपकरणों के साथ इसकी संगतता शामिल है। पहले, हमने एक पता लगाने वाले डिवाइस37 के रूप में एक हाई-स्पीड लाइन स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग किया था। अब, सिग्नल अधिग्रहण के लिए फोटोडायोड का उपयोग करके तकनीक की एक भिन्नता प्रस्तुत की जाती है। यह फोटोडायोड-आधारित पहचान प्रणाली अन्य प्रयोगशालाओं में इस तकनीक के कार्यान्वयन की सुविधा प्रदान कर सकती है।

यहां, सीएवी1.1 से व्यक्तिगत वोल्टेज-सेंसर आंदोलन के अध्ययन के लिए देशी कोशिकाओं में एफएसडीएफ का उपयोग करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल वर्णित है। जबकि सीएवी1.1 चैनल का उपयोग इस पांडुलिपि में एक उदाहरण के रूप में किया गया है, इस तकनीक को अन्य आयन चैनलों, रिसेप्टर्स या सतह प्रोटीन के बाह्य रूप से सुलभ डोमेन पर लागू किया जा सकता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल को मैरीलैंड संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। निम्नलिखित प्रोटोकॉल को कई उपखंडों में विभाजित किया गया है, जिसमें (1) आणविक निर्माण डिजाइन और सिस्टीन प्रतिक्रिया डाई चयन, (2) विवो इलेक्ट्रोपोरेशन में , (3) मांसपेशी विच्छेदन और फाइबर अलगाव, (4) अधिग्रहण सेटअप विवरण, (5) एन्हांस्ड ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) सकारात्मक फाइबर विद्युत गतिविधि और सिस्टीन धुंधला का मूल्यांकन, और (6) सिग्नल अधिग्रहण और प्रसंस्करण शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक खंड की शुरुआत में, कंकाल की मांसपेशी फाइबर में एफएसडीएफ लागू करते समय कुछ प्रासंगिक विचार विस्तृत होते हैं। सभी प्रोटोकॉल अनुभागों को उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के साथ किया जाना चाहिए, जिसमें एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने शामिल हैं।

1. आणविक निर्माण डिजाइन और सिस्टीन प्रतिक्रिया डाई चयन।

  1. निर्माण डिजाइन प्रयोग की सफलता का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। सबसे पहले, एक जंगली-प्रकार, फ्लोरोसेंटली टैग किए गए सीएवी1.1 सीडीएनए निर्माण उत्पन्न करें और उपयुक्त सेल प्रकार में इसकी अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करें। मांसपेशियों के तंतुओं के लिए, साइटोमेगालोवायरस (सीएमवी) प्रमोटर को ले जाने वाले प्लास्मिड का उपयोग करके एक मजबूत अभिकर्मक दक्षता प्राप्त की जा सकती है। इस प्रोटोकॉल में, पहले से ही विशेषता वाले खरगोश ईजीएफपी-सीएवी1.1 प्लास्मिडका उपयोग किया गया था।
    नोट: वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल में सिस्टीन अवशेष पेश करने के लिए सीडीएनए निर्माण को इंजीनियरिंग करते समय, सिस्टीन की स्थिति महत्वपूर्ण है और इसे ध्यान से माना जाना चाहिए। सिस्टीन को थिओल-संयुग्मित डाई प्रतिक्रिया (चित्रा 1 सी, डी) की अनुमति देने के लिए बाह्य अंतरिक्ष से सुलभ होना चाहिए और विध्रुवण के जवाब में इसकी गति को ठीक से ट्रैक करने के लिए एस 4 क्षेत्र के समीपस्थ होना चाहिए। हालांकि, प्रोटीन गति के जवाब में डाई फ्लोरेसेंस शमन की अनुमति देने के लिए, पेश किए गए सिस्टीन संयुग्मित फ्लोरोफोरे को दो अलग-अलग वातावरणों (जैसे, झिल्ली और बाह्य तरल पदार्थ) के इंटरफ़ेस पर होना चाहिए; चित्रा 1 ई)। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि डाला गया सिस्टीन प्रोटीन फ़ंक्शन में हस्तक्षेप नहीं करता है।
  2. उचित सिस्टीन स्थानीयकरण के बारे में एक विचार प्राप्त करने के लिए, चैनल संरचना या अन्य संबंधित चैनल प्रोटीन के अन्य फ्लोरोमेट्री प्रयोगों से जानकारी एकत्र करें। सिस्टीन-इंजीनियर सीए वी 1.1 संरचनाओं के डिजाइनके लिए, चैनल26 की हल की गई क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) संरचना का मूल्यांकन करें और संबंधित चैनलों जैसे सीएवी1.2 12, या अन्य चैनलों जैसे शेकर11, और एनएसीएचबैक39 से पिछले काम के सिस्टीन सम्मिलन की तुलना करें।
  3. एक बार उचित सिस्टीन स्थिति चुने जाने के बाद, सिस्टीन प्रतिस्थापन पेश करने के लिए एक वाणिज्यिक साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस किट का उपयोग करें। वर्तमान प्रोटोकॉल में, सीए वी 1.1 के एस 4 वोल्टेज-सेंसिंग सेगमेंट के प्रत्येक साइटोसोलिक छोर पर निम्नलिखित सिस्टीन संशोधनों को स्वतंत्र रूप से इंजीनियर किया गया था: वीएसडी-1 (एल 159 सी), वीएसडी -2 (एल 522 सी), वीएसडी -3 (वी893 सी), वीएसडी -4 (एस 1231 सी), और यूनिप्रोटकेबी: पी 07293 (चित्रा 1 बी)।
  4. कंकाल की मांसपेशी फाइबर के लिए, 5-कार्बोक्सीटेट्रामेथिलरोडामाइन मीथेनथियोसल्फोनेट (एमटीएस -5-टीएएमआरए) का उपयोग करें, जो अनुप्रस्थ नलिका झिल्ली प्रणाली में उचित और तेजी से प्रसार प्रदर्शित करता है, जो सतह झिल्ली का एक इनवेजाइनेशन है और सीएवी1.1 चैनलों का प्रमुख स्थान है। एमटीएस -5-टीएएमआरए लिपिड झिल्ली से जलीय वातावरण में संक्रमण करते समय प्रतिदीप्ति में कमी प्रदर्शित करता है (चित्रा 1 ई)।
    नोट: डायलाइट या एलेक्सा-मैलिमाइड डेरिवेटिव सतह झिल्ली को दागते हैं लेकिन अनुप्रस्थ नलिका प्रणाली को नहीं।

Figure 1
चित्र 1: ट्रांसमेम्ब्रेन α-हेलिक्स के इंटरफ़ेस पर थिओल-सिस्टीन प्रतिक्रिया का योजनाबद्ध। (ए) एल-टाइप सीएवी 1.1 झिल्ली टोपोलॉजी। प्लस संकेत एस 4 α-हेलिक्स के भीतर बुनियादी अवशेषों का प्रतिनिधित्व करते हैं और नारंगी सितारे उस स्थान को इंगित करते हैं जहां साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस के माध्यम से सिस्टीन पेश किया गया था। (बी) खरगोश सीएवी1.1 के एस 4आई से एस 4IV का अनुक्रम संरेखण (यूनिप्रोटकेबी: पी 07293)। वोल्टेज सेंसिंग के लिए महत्वपूर्ण सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए आर्गिनिन और लाइसिन अवशेषों को लाल रंग में हाइलाइट किया जाता है, जबकि इंजीनियर सिस्टीन प्रतिस्थापन नारंगी में इंगित किए जाते हैं। इस पैनल को संदर्भ37 से अनुकूलित किया गया है। (सी) सिस्टीन-थिओल फ्लोरोसेंट अणु प्रतिक्रिया। (डी) ट्रांसमेम्ब्रेन वोल्टेज-संवेदनशील α-हेलिक्स के भीतर सिस्टीन म्यूटेनेसिस सम्मिलन को दर्शाने वाला आरेख। सिस्टीन को आराम से झिल्ली में दफन किया जाना चाहिए और विध्रुवण के बाद बाह्य रूप से सुलभ होना चाहिए (त्रिभुज; सिस्टीन ट्रैकिंग आमतौर पर होने की संभावना नहीं है यदि लक्ष्य सिस्टीन पहले से ही विध्रुवण (II) से पहले बाह्य अंतरिक्ष से सुलभ है या यदि सिस्टीन विध्रुवण (III) के बाद बाह्य अंतरिक्ष से सुलभ नहीं है। (ई) थिओल फ्लोरोसेंट अणु के साथ प्रतिक्रिया के बाद, विध्रुवण के जवाब में α-हेलिक्स गति एमटीएस -5-टीएएमआरए प्रतिदीप्ति उत्सर्जन को कम करती है। फ्लोरोमेट्रिक संकेत एस 4 हेलिक्स की गति और झिल्ली के तल और जलीय वातावरण के सापेक्ष बाद के डाई आंदोलन से उत्पन्न होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. विवो इलेक्ट्रोपोरेशन में।

नोट: इलेक्ट्रोपोरेशन प्रयोग ों को पहले वर्णित38 संशोधनों के साथ आयोजित किया गया था। निम्नलिखित अनुभाग में, प्रोटोकॉल माउस के एक फुट पैड के इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए डिज़ाइन किया गया है। यदि दोनों पंजे तैयार किए जाते हैं तो वॉल्यूम को समायोजित करने की आवश्यकता होती है।

  1. बर्फ पर रखी 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 2-5 μg/μL पर प्लास्मिड घोल के 25-100 μL का एलिकोट करें।
  2. बाँझ खारा में 2 मिलीग्राम / एमएल हाइलूरोनिडेज़ का 0.5 एमएल घोल तैयार करें और 1 एमएल सिरिंज पर लगाए गए कम बाध्यकारी प्रोटीन 0.2 μm बाँझ फिल्टर के माध्यम से घोल को फ़िल्टर करें। कमरे के तापमान पर 1.5 एमएल ट्यूब में स्टोर करें।
  3. कैलिब्रेटेड एनेस्थीसिया उपकरण का उपयोग करके, माउस को संज्ञाहरण कक्ष में रखकर ओ2 (1 एल / मिनट) में 3% -4.5% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके माउस को एनेस्थेटाइज करें। चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके पूंछ की नोक को चुटकी मारकर जानवर के पर्याप्त संज्ञाहरण की पुष्टि करें। इष्टतम संज्ञाहरण तक पहुंचने पर कोई प्रतिक्रिया नहीं देखी जानी चाहिए।
  4. एनेस्थीसिया कक्ष से माउस निकालें और माउस के ऊपर एनेस्थीसिया नाक मास्क रखें। जानवर को उसकी पीठ पर एक इज़ोटेर्मल हीटिंग पैड पर रखें जो बाँझ बेंच पैड से ढका हुआ है। ओ2 (1 एल / मिनट) में 3% आइसोफ्लुरेन के साथ कृंतक मास्क का उपयोग करके संज्ञाहरण जारी रखें।
  5. प्रक्रिया के दौरान आंखों के सूखेपन को रोकने के लिए, बाँझ कपास की नोक के साथ जानवर की आंखों पर कृत्रिम आंसू क्रीम की एक महीन परत लागू करें। एथिल अल्कोहल में संतृप्त बाँझ पोंछे का उपयोग करके जानवर के पंजे को कीटाणुरहित करें।
  6. लंबी 29 ग्राम बाँझ इंसुलिन सुई में 0.5 का उपयोग करके, हाइलूरोनिडेज़ समाधान के 20 μL को एस्पिरेट करें। एड़ी के स्तर पर त्वचा में प्रवेश करें और सुई को पैर की उंगलियों के आधार की ओर चमड़े के नीचे स्लाइड करें (चित्रा 2 ए)। धीरे-धीरे सुई को पीछे की ओर ले जाते हुए घोल को इंजेक्ट करें। पंजे के नीचे एक बोलस या टक्कर देखी जानी चाहिए (चित्रा 2 बी)।
    नोट: जानवर की उम्र और पंजे के आकार के आधार पर, यह संभावना है कि समाधान की पूरी मात्रा को इंजेक्शन नहीं दिया जा सकता है। अक्सर, इंजेक्शन के बिंदु के माध्यम से एक छोटा रिसाव हो सकता है।
  7. चरण 2.6 को दूसरे पंजे के साथ दोहराएं, यदि वांछित हो, तो उचित पंजे कीटाणुशोधन के बाद एक और बाँझ सुई का उपयोग करें, जैसा कि चरण 2.5 में है।
  8. नाक के मुखौटे से जानवर को हटाकर संज्ञाहरण को डिस्कनेक्ट करें और माउस को भोजन और पानी तक पहुंच के साथ पिंजरे में वापस कर दें। संज्ञाहरण से पूर्ण वसूली ~ 5 मिनट में देखी जानी चाहिए। प्लास्मिड समाधान युक्त ट्यूब को बेंच पर रखें ताकि इसे कमरे के तापमान तक पहुंचने की अनुमति मिल सके।
  9. 1 घंटे के बाद, जानवर को दूसरी बार एनेस्थेटाइज करें, इसे हीटिंग पैड पर रखें, और चरण 2.3-2.5 में वर्णित पंजे को कीटाणुरहित करें।
  10. चरण 2.6 में वर्णित एक ही तकनीक का उपयोग करके, सीडीएनए निर्माण के 10-20 μL इंजेक्ट करें। इंजेक्ट किए गए निर्माण की कुल मात्रा 50-100 μg प्रति पंजा है। यदि वांछित हो तो एक और बाँझ सिरिंज का उपयोग करके विपरीत पंजे के साथ प्रक्रिया को दोहराएं।
  11. सीडीएनए समाधान को ऊतक के माध्यम से समान रूप से फैलाने की अनुमति देने के लिए 5 मिनट के लिए इज़ोटेर्मल हीटिंग पैड पर एनेस्थीसिया के तहत जानवर को रखें।
  12. इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरण डिवाइस चालू करें और इसे निर्माता द्वारा अनुशंसित डबल इलेक्ट्रोड सरणी से कनेक्ट करें।
  13. एथिल अल्कोहल में संतृप्त पोंछे का उपयोग करके डबल इलेक्ट्रोड सरणी को कीटाणुरहित करें। एक हाथ से पंजे को स्थिर करें और पहले एड़ी के पीछे त्वचा के नीचे एक इलेक्ट्रोड डालें। फिर, पैर की उंगलियों के आधार पर दूसरा इलेक्ट्रोड डालें, यह सुनिश्चित करते हुए कि दोनों इलेक्ट्रोड के झुकाव पैर की धुरी के लंबवत हैं (चित्रा 2 सी)। जांच को ऐसी स्थिति में उन्मुख करें जो पैर या पैर को चरम कोणीय अभिविन्यास में बाधित न करे।
    नोट: इलेक्ट्रोड सम्मिलन को चिमटी के उपयोग के साथ और इलेक्ट्रोड की युक्तियों को नियमित रूप से तेज करके सुविधाजनक बनाया जा सकता है। जानवर की उम्र के आधार पर, पंजे का आकार भिन्न हो सकता है और इलेक्ट्रोड स्पेसिंग को तदनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  14. 1 हर्ट्ज पर 20 एमएस, 20 एमएस अवधि/प्रत्येक को लगाकर मांसपेशियों को इलेक्ट्रोपोरेट करें। 1 सेमी पर लगाए गए इलेक्ट्रोड सुइयों के लिए, वोल्टेज को ~ 100 वी पर सेट करें। इसे अनुकूलित किया जाना चाहिए यदि इलेक्ट्रोड स्पेसिंग को ~ 100 वी / सेमी तक पहुंचने के लिए संशोधित किया जाता है। पल्स डिलीवरी के दौरान अंकों का थोड़ा सा फ्लेक्सन देखा जाना चाहिए यदि इलेक्ट्रोड ठीक से स्थित हैं।
  15. यदि वांछित हो तो विपरीत पंजे के साथ चरण 2.13 और 2.14 दोहराएं।
  16. एनेस्थीसिया को डिस्कनेक्ट करें और जानवर को एक पिंजरे में रखें, जो 2 घंटे के लिए भोजन और पानी की पहुंच के साथ अपने गैर-इलेक्ट्रोपोरेटेड काउंटर मेट से अलग है। संज्ञाहरण से पूर्ण वसूली ~ 10 मिनट में देखी जानी चाहिए। जानवर को पिंजरे के अंदर वापस रखें।
    नोट: सीडीएनए निर्माण (ओं) की अभिव्यक्ति एन्कोडेड प्रोटीन पर अत्यधिक निर्भर है। प्रोटीन टर्नओवर, सीडीएनए की मात्रा और गुणवत्ता, प्लास्मिड प्रमोटर और अन्य चर निर्माण अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रयोग में, सीएमवी प्रमोटर के साथ सीएवी1.1 के ए 1 एस सबयूनिट की इष्टतम अभिव्यक्ति के लिए 4 से 6 सप्ताह की आवश्यकता होती है, लेकिन 2 सप्ताह से 12-15 महीने तक पता लगाया जा सकता है।

Figure 2
चित्र 2: इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए माउस फुट पैड में सीडीएनए इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन इलेक्ट्रोपोरेशन इलेक्ट्रोड पोजिशनिंग का आरेख। (ए) माउस फुट पैड के नीचे हाइलूरोनिडेज़ और सीडीएनए इंजेक्शन के लिए सुई की स्थिति। तीर त्वचा के माध्यम से सम्मिलन के बिंदु को इंगित करता है। (बी) इंजेक्शन के बाद त्वचा का मामूली मलिनकिरण और पंजे के आकार में मामूली वृद्धि क्षणिक रूप से देखी जानी चाहिए। (सी) इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए इलेक्ट्रोड सरणी पोजिशनिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. मांसपेशियों के विच्छेदन और फाइबर अलगाव

नोट: कंकाल की मांसपेशी फाइबर पृथक्करण पहले वर्णित 37,40,41 संशोधनों के साथ किया गया था। निम्नलिखित अनुभाग में, प्रोटोकॉल माउस के दो पैर पैड के लिए अनुकूल है।

  1. फाइबर पृथक्करण से पहले, ~ 5 मिमी की मोटाई तक पहुंचने के लिए 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में इलास्टोमेर (% डब्ल्यू / डब्ल्यू) के 10 भागों में इलाज एजेंट के एक हिस्से को जोड़कर सिल्गार्ड-कवर प्लेट तैयार करें। इलास्टोमेर कवर प्लेट को उपयोग से पहले रात भर ठीक होने दें। उपयोग से पहले और बाद में 70% एथिल अल्कोहल के साथ ठीक से संग्रहीत और कीटाणुरहित होने पर इसे कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  2. स्पिनर न्यूनतम आवश्यक ईगल के माध्यम (एस-एमईएम) के 2 मिलीलीटर में 4 मिलीग्राम कोलेजनेस टाइप 1 तैयार करें, जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस; 2 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता) के साथ पूरक है। घोल को 35 मिमी गैर-लेपित प्लास्टिक प्लेट में स्थानांतरित करें और पकवान को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: एस-एमईएम ग्लूटामाइन और सीए2 + के बिना एक संशोधित एमईएम फॉर्मूलेशन है। इस चरण में सीए2 + की अनुपस्थिति एंजाइमेटिक पाचन और ट्रिट्यूरेशन के दौरान फाइबर संकुचन को कम करती है।
  3. 60 मिमी गैर-लेपित प्लास्टिक प्लेट में 10% एफबीएस के साथ पूरक एस-एमईएम के 5 एमएल जोड़ें और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर स्टोर करें।
  4. सीओ2 के माध्यम से श्वासावरोध द्वारा जानवरों को इच्छामृत्यु करें और उसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था। प्राथमिक सेल अलगाव के दौरान संदूषण को कम करने के लिए, पशु शव को ~ 10 सेकंड के लिए 70% एथिल अल्कोहल में डुबोएं। कागज को अवशोषित करने के साथ शव को निकालें और सुखाएं और टखने और घुटने के बीच कैंची की एक जोड़ी से पैरों को काटें (चित्रा 3 ए)।
  5. 10x आवर्धन पर विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत इलास्टोमेर कवर प्लेट पर विच्छेदन पिन के साथ, पंजे के साथ जानवर के एक पैर को नीचे रखें।
  6. विच्छेदन कैंची और महीन चिमटी के साथ, फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस (एफडीबी) मांसपेशी (चित्रा 3 बी) को उजागर करने के लिए पंजे से त्वचा को हटा दें। ऊतक सूखापन को रोकने के लिए, 1,000 μL पिपेट का उपयोग करके मांसपेशियों में S-MEM 10% FBS की एक बूंद जोड़ें।
  7. एड़ी के स्तर पर, कण्डरा को इंजेक्ट करें और एड़ी से पैर तक एफडीबी मांसपेशियों को सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें (चित्रा 3 बी)। विच्छेदन करते समय जितना संभव हो सके मांसपेशियों पर तनाव से बचें। ऊतकों पर बहुत अधिक बल लगाने से मांसपेशियों के फाइबर को नुकसान होगा। मांसपेशियों को तुरंत कोलेजनेस समाधान में रखें।
  8. विपरीत पैर के साथ चरण 3.5-3.7 दोहराएं। 2 घंटे 45 मिनट से 3 घंटे 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में कोलेजनेज समाधान में विच्छेदित मांसपेशियों को रखें। कोलेजनेस एंजाइमेटिक गतिविधि और जानवर की उम्र के आधार पर इनक्यूबेशन समय को अनुकूलित करें।
  9. जबकि मांसपेशियों के ऊतक ों को इंक्यूबेटिंग किया जाता है, 35 मिमी ग्लास बॉटम डिश के केंद्र में सीरम या एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 300 μL ठंडा एमईएम जोड़ें। एमईएम में सीधे 1.20 मिलीग्राम / एमएल पर 2 μL ठंडा लैमिनिन जोड़ें। वांछित व्यंजनों की संख्या के लिए प्रक्रिया को दोहराएं। लैमिनिन पोलीमराइजेशन की अनुमति देने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में व्यंजन रखें।
  10. जब एंजाइमेटिक पाचन पूरा हो जाता है, तो मांसपेशियों को 60 मिमी सेल कल्चर डिश में स्थानांतरित करें जिसमें एस-एमईएम 10% एफबीएस होता है, जिसमें एक बड़े बोर (5 मिमी) अग्नि-पॉलिश ग्लास पाश्चर पिपेट और एक लेटेक्स बल्ब का उपयोग होता है।
  11. एक छोटे बोर (2 मिमी) फायर-पॉलिश ग्लास पाश्चर पिपेट और एक लेटेक्स बल्ब का उपयोग करके, धीरे-धीरे विच्छेदन माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 सी) के तहत मांसपेशियों को ट्रिट्यूरेट करें। विघटित मांसपेशी फाइबर को ऊतक से अलग करना शुरू करना चाहिए और समाधान में जारी किया जाना चाहिए।
    नोट: अंगूठे के एक नियम के रूप में, कम ट्रिट्यूरेशन (15-30 पिपेट मार्ग) को हमेशा पसंद किया जाता है, क्योंकि बहुत अधिक लंबे समय तक ट्राइट्यूरेशन फाइबर को तनाव या नुकसान पहुंचा सकता है।
  12. ठीक चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके, किसी भी गैर-मांसपेशी ऊतक को हटा दें, जैसे कि तंत्रिकाएं, कण्डरा या रक्त वाहिकाएं (चित्रा 3 डी)।
  13. प्रत्येक 35 मिमी लैमिनिन-लेपित ग्लास बॉटम डिश में 2 मिलीलीटर गर्म एमईएम 2% एफबीएस जोड़ें। 200 μL पिपेट और एक बाँझ प्लास्टिक पिपेट टिप का उपयोग करके, विघटित मांसपेशी फाइबर को 35 मिमी लैमिनिन-लेपित ग्लास बॉटम डिश (चित्रा 3 ई) में स्थानांतरित करें।
    नोट: कम फाइबर घनत्व प्राप्त करना और फाइबर को एक दूसरे से अच्छी तरह से अलग करने की अनुमति देना फाइबर ओवरलैपिंग को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।
  14. इनक्यूबेटर में 35 मिमी ग्लास बॉटम डिश को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर रखें। फाइबर का उपयोग 2-20 घंटे की समय सीमा में किया जा सकता है।

Figure 3
चित्र 3; मांसपेशी एफडीबी फाइबर विच्छेदन और पृथक्करण। (ए) टखने की अभिव्यक्ति (डैश्ड लाइन) के ऊपर पैर विच्छेदन के बाद, एफडीबी मांसपेशी (बी) को उजागर करने के लिए डैश लाइन के बाद पैर के पंजे के नीचे की त्वचा को हटा दिया जाता है। मांसपेशियों को विच्छेदित किया जाता है और कोलेजनेस समाधान में रखा जाता है। (सी) इनक्यूबेशन के बाद, मांसपेशियों को अलग-अलग मांसपेशी फाइबर को अलग करने और प्राप्त करने के लिए त्रिगुणित किया जाता है। (डी) फाइन ट्वीज़र्स का उपयोग मांसपेशियों के तंतुओं को लैमिनिन-लेपित ग्लास बॉटम कल्चर डिश में स्थानांतरित करने से पहले गैर-मांसपेशी ऊतक और मलबे को हटाने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. अधिग्रहण सेटअप विवरण

नोट: अधिग्रहण सेटअप संशोधनों के साथ42 से पहले वर्णित एक के बराबर है (चित्रा 4 ए)।

  1. डीए कनवर्टर और पथ-क्लैंप एम्पलीफायर, माइक्रोस्कोप, मोटराइज्ड स्टेज, मैनिपुलेटर (एस), फोटोडायोड के लिए बिजली की आपूर्ति, प्रकाश स्रोत, प्रकाश शटर, पल्स जनरेटर, और प्रोटोकॉल संपादक।
  2. पल्स जनरेटर, लाइट शटर और प्रोटोकॉल संपादक को नियंत्रित करने के लिए एडी/डीए से आउट सिग्नल ट्रिगर करने वाले ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर लॉजिक (टीटीएल) को सक्रिय करें।
  3. पल्स जनरेटर से टीटीएल आउटपुट सिग्नल का उपयोग करें और सटीक अस्थायी ट्रिगरिंग को सत्यापित करने के लिए एम्पलीफायर के एडी चैनल से कनेक्ट करें। पर्याप्त उपकरण सिंक्रनाइज़ेशन सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग से पहले ट्रिगरिंग स्थिरता के पर्याप्त नियंत्रण का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
    नोट: सीएवी1.1 के मामले में, उत्तेजना के बाद 4-10 एमएस से कम में अधिकतम संकेत देखने की उम्मीद करें (अधिकतम चार्ज आंदोलन विकसित करने का समय5)। सिग्नल तेज है और सटीक अस्थायी रिज़ॉल्यूशन अन्य उपायों के साथ तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे कि कैल्शियम क्षणिक या चार्ज आंदोलन वोल्टेज क्लैंप के माध्यम से मापा जाता है।
  4. फाइबर के एक विशिष्ट क्षेत्र या स्थान (चित्रा 4 बी) में उत्तेजना प्रकाश पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, उत्तेजना प्रकाश पथ में स्थित डायाफ्राम का उपयोग करें। यह केवल उस क्षेत्र में सिग्नल अधिग्रहण को सक्षम करता है जहां ईजीएफपी-सीएवी1.1 सिग्नल अधिकतम है (चित्रा 4 बी)।

Figure 4
चित्र 4: रिकॉर्डिंग सिस्टम का विवरण. (A) रिकॉर्डिंग सिस्टम के विभिन्न घटकों के बीच संबंध को दर्शाने वाला आरेख. सेटअप में एक मोटरचालित चरण के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप, एक प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) प्रकाश स्रोत, एक प्रकाश शटर, एक ट्रैक और होल्ड फ़ंक्शन43 के साथ एक कस्टम-निर्मित फोटोडायोड-आधारित प्रकाश निगरानी सर्किट, एक एडी / डीए कनवर्टर (पैच क्लैंप एम्पलीफायर से), एक एनालॉग पल्स जनरेटर, एक बाहरी क्षेत्र उत्तेजना इकाई शामिल है जो क्षेत्र उत्तेजना इलेक्ट्रोड के साथ युग्मित है। प्रोटोकॉल के अधिग्रहण, सिंक्रनाइज़ेशन और पीढ़ी के लिए मोटरचालित मैनिपुलेटर्स, और वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर। फील्ड उत्तेजना के लिए इलेक्ट्रोड दो प्लैटिनम तारों से बना होता है जो बीएमसी कनेक्टर के माध्यम से पल्स जनरेटर से जुड़े तांबे के केबलों से जुड़े होते हैं। ईजीएफपी और एमटीएस -5-टीएएमआरए सिग्नल दोनों का पता लगाने के लिए विशिष्ट उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग किया जाता है। ईजीएफपी को उत्तेजित करने के लिए, 488 एनएम (± 20 एनएम) उत्तेजना (एक्स) फिल्टर और एलपी 510 एनएम ईएम फिल्टर के साथ एक क्सीनन लैंप का उपयोग किया जाता है। एमटीएस -5-टैमरा के लिए, एक 530 एनएम एलईडी प्रकाश स्रोत और एक एलपी 550 एनएम ईएम फिल्टर का उपयोग किया जाता है। (बी) फाइबर (डैश लाइन) के मुख्य अक्ष में दो-क्षेत्र उत्तेजना इलेक्ट्रोड (काले घेरे) के साथ ईजीएफपी-सीएवी1.1-सिस निर्माण को व्यक्त करने वाले फाइबर का दृश्य, ठीक से (बाएं) और अनुचित रूप से (दाएं)। ब्लैक अनफिल्ड सर्कल डायाफ्राम खोलने द्वारा नियंत्रित व्यास के साथ अधिग्रहण के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है, जिसे प्रकाश स्रोत के सामने रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

5. ईजीएफपी-पॉजिटिव फाइबर विद्युत गतिविधि और सिस्टीन धुंधला होने का आकलन

नोट: कंकाल की मांसपेशी फाइबर क्षेत्र उत्तेजना संशोधनों के साथ41 से पहले वर्णित के रूप में की जाती है। इस दृष्टिकोण का उपयोग (1) स्वस्थ, कार्यात्मक और विद्युत रूप से उत्तरदायी तंतुओं की पहचान करने के लिए किया जाता है, (2) सिस्टीन-प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट डाई के साथ तंतुओं को दाग दिया जाता है, और (3) प्रचारित कार्रवाई क्षमता के जवाब में फ्लोरोसेंट सिग्नल रिकॉर्ड किया जाता है। फ्लोरोसेंट डाई ब्लीचिंग को कम करने के लिए इस खंड के हर चरण और निम्नलिखित को कम रोशनी वाले वातावरण में आयोजित किया जाना चाहिए।

  1. माइक्रोस्कोप के चरण पर अलग मांसपेशी फाइबर युक्त 35 मिमी ग्लास बॉटम डिश रखें। 1,000 μL पिपेट के साथ संस्कृति मीडिया को सावधानीपूर्वक निकालें और कमरे के तापमान रिंगर के समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें (संरचना के लिए तालिका 1 देखें)। मुक्त सिस्टीन युक्त मूल सेल कल्चर मीडिया को पूरी तरह से हटाने के लिए मीडिया प्रतिस्थापन के कई दौर की आवश्यकता हो सकती है।
  2. एक यांत्रिक या मोटरचालित मैनिपुलेटर का उपयोग करके, डिश के तल के लंबवत दो प्लैटिनम तारों को रखें। सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड टर्मिनल फाइबर के अनुदैर्ध्य अक्ष के सापेक्ष और फाइबर के सिरों से कुछ मिलीमीटर दूर संरेखित हैं, और इलेक्ट्रोड के बीच पृथक्करण 5 मिमी है (चित्रा 4 बी)। इसके अलावा डिश को घुमाकर या प्रत्येक इलेक्ट्रोड को एक स्वतंत्र माइक्रोमैनिपुलेटर (चित्रा 4 बी) पर माउंट करके इलेक्ट्रोड पोजिशनिंग को समायोजित करें।
  3. प्रेषित प्रकाश को चालू करें और 20x उद्देश्य का उपयोग करके दृश्य के क्षेत्र में फाइबर ढूंढें। ईजीएफपी फिल्टर क्यूब को प्रकाश मार्ग में ले जाएं।
    नोट: एपिफ्लोरेसेंस और कम-आवर्धन (2x) उद्देश्य से लैस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, ईजीएफपी अभिव्यक्ति (चित्रा 5 ए) का आकलन करके फाइबर पृथक्करण से पहले पूरी मांसपेशी में निर्माण अभिकर्मक दक्षता का आकलन करना संभव है।
  4. रिमोट-नियंत्रित लाइट शटर का उपयोग करके, ईजीएफपी-पॉजिटिव फाइबर की पहचान करने के लिए 488 एनएम उत्तेजना प्रकाश को सक्रिय करें। मोटरचालित माइक्रोस्कोप चरण का उपयोग करके डिश पर फाइबर एक्स-वाई स्थान स्टोर करें। ईजीएफपी सिग्नल अक्सर फाइबर के भीतर विषम होता है (चित्रा 4 बी)। सहेजी गई स्थिति को सबसे चमकीले ईजीएफपी सिग्नल पर केंद्रित करें।
  5. ईजीएफपी-पॉजिटिव फाइबर की पहचान करने के बाद, पहले सहेजे गए स्थानीयकरण पर लौटें। मैन्युअल ट्रिगर स्विच का उपयोग करके, 1 एमएस अवधि और 20 वी आयाम के साथ दो अनुक्रमिक उत्तेजना दालें वितरित करें। दालों की ध्रुवीयता को बारी-बारी से सेट करें।
  6. उत्तेजना के बाद, विपरीत ध्रुवीयता की दो दालों के जवाब में दो संकेंद्रित समरूप फाइबर संकुचन का निरीक्षण करें। एक स्थानीय संकुचन या वैकल्पिक ध्रुवीयता की दालों की प्रतिक्रियाओं में संकुचन की अनुपस्थिति स्थानीय गैर-प्रचारित निष्क्रिय प्रतिक्रियाओं या उत्तेजनाकी कमी का संकेत देती है। शेष प्रयोग के लिए इन तंतुओं को बाहर रखें।
  7. 10 mM MTS-5-TAMRA घोल के 2 μL सीधे डिश में जोड़ें और धीरे से 1,000 μL पिपेट (10 μM अंतिम एकाग्रता) के साथ मिलाएं। पकवान को स्थानांतरित न करने का ध्यान रखें, अन्यथा संग्रहीत फाइबर की स्थिति खो जाएगी। फ्लोरोसेंट थिओल अणु को अनुप्रस्थ नलिका प्रणाली लुमेन में प्रसार की अनुमति देने के लिए 4-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. 5 मिनट के लिए हर 1 सेकंड में 300 एमएस के लिए 50 हर्ट्ज की दर से लगातार एक्शन पोटेंशिअल ट्रेनों को जगाने के लिए द्विध्रुवीय दोहराव वाली उत्तेजनाओं को लागू करें।
    नोट: पल्स ट्रेनें एमटीएस -5-टीएएमआरए के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए ईजीएफपी-सीएवी1.1 के एस 4 में डाले गए सिस्टीन तक पहुंच प्रदान करती हैं। उत्तेजना के जवाब में यांत्रिक रूप से अनुबंध करने की फाइबर की क्षमता अनुप्रस्थ नलिका लुमेन सामग्री के लिए बाह्य वातावरण के साथ चक्र करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  9. 1,000 μL पिपेट के साथ डिश से धुंधला घोल निकालें और कमरे के तापमान रिंगर के 2 मिलीलीटर समाधान के साथ बदलें। असंगत एमटीएस -5-टीएएमआरए को पूरी तरह से हटाने के लिए दो या तीन राउंड की आवश्यकता हो सकती है। दाग वाले फाइबर को कम से कम 10 मिनट के लिए धुंधला प्रोटोकॉल से ठीक होने दें।
  10. चरण 5.6 के रूप में, वैकल्पिक ध्रुवीयता के जवाब में सममित फाइबर संकुचन को देखकर फाइबर स्वास्थ्य और विद्युत गतिविधि का फिर से आकलन करें। उन तंतुओं को बाहर करें जो शेष प्रयोग से दोनों उत्तेजनाओं का जवाब नहीं देते हैं।
  11. एमटीएस -5-टीएएमआरए फिल्टर क्यूब को प्रकाश मार्ग में ले जाएं। रिमोट-नियंत्रित लाइट शटर का उपयोग करके, फाइबर पर समरूप एमटीएस -5-टीएएमआरए धुंधला होने की पुष्टि करने के लिए 533 एनएम उत्तेजना प्रकाश को सक्रिय करें।
    नोट: एमटीएस -5-टीएएमआरए के साथ धुंधला होने पर, इंजीनियर और अंतर्जात सिस्टीन दोनों मैलिमाइड व्युत्पन्न (चित्रा 5 बी) के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। इस प्रकार, रुचि के सिस्टीन के साथ उचित प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करना मुश्किल है। सीएवी1.1 मुख्य रूप से अनुप्रस्थ नलिका में व्यक्त किया जाता है, जो एक अलग डबल बैंड पैटर्न बनाता है। एक कॉन्फोकल या एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, एमटीएस -5-टीएएमआरए (चित्रा 5 सी) के उचित धुंधला और अनुप्रस्थ नलिका प्रवेश और प्रसार की पुष्टि करने के लिए एक एक्स-वाई छवि का उपयोग किया जा सकता है।

6. सिग्नल अधिग्रहण और प्रसंस्करण

नोट: फ्लोरोमेट्रिक माप करने से पहले, सिग्नल अधिग्रहण को इष्टतम सिग्नल / शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए सावधानीपूर्वक डिज़ाइन किया जाना चाहिए। धीमी नमूना दर प्रोटीन विरूपण पुनर्व्यवस्था के दौरान प्राप्त होने वाले बिंदुओं की संख्या को कम करते हुए अधिक प्रकाश का पता लगाने की अनुमति देती है। ईजीएफपी-सीएवी1.1-सिस के मामले में, एक एक्शन पोटेंशियल वेवफॉर्म द्वारा प्रेरित चार्ज मूवमेंट ~ 1-10 एमएस37 में होता है। समय के साथ गति के विकास को ट्रैक करने के लिए कई बिंदु प्राप्त करने के लिए, अधिग्रहण को 50 μs प्रति बिंदु पर सेट किया गया था।

  1. फाइबर को उचित आवर्धन प्रणाली के साथ दृश्य के क्षेत्र के बीच में रखें। इन प्रयोगों के लिए, एक 60x तेल 1.4 संख्यात्मक एपर्चर (NA) उल्टे उद्देश्य का उपयोग किया गया था। फाइबर के व्यास के एक गोलाकार क्षेत्र को रोशन करने के लिए मोटराइज्ड स्टेज और डायाफ्राम के साथ रोशनी और फाइबर की स्थिति का अनुकूलन करें, जहां ईजीएफपी सिग्नल अधिकतम है (चित्रा 4 बी)।
  2. एक बार जब फाइबर अधिग्रहण के लिए तैनात हो जाता है, तो फाइबर के प्रत्येक छोर पर दो स्वतंत्र रूप से माउंटेड फील्ड उत्तेजना प्लैटिनम तारों को उन्मुख करें। तंतुओं की मुख्य धुरी पर तारों को एक सीधी रेखा में संरेखित करें और उन्हें केंद्र में फाइबर के साथ 5 मिमी अलग रखें (चित्रा 4 बी)।
  3. एमटीएस -5-टीएएमआरए के लिए उचित सेटिंग्स पर अधिग्रहण उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर सेट करें। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में लिखे प्रोटोकॉल को निष्पादित करके प्रयोग शुरू करें। यह चरण सभी डाउनस्ट्रीम उपकरणों (यानी, प्रोटोकॉल संपादक, लाइट शटर, पल्स जनरेटर) को ट्रिगर करता है।
    नोट: यह प्रोटोकॉल क्षेत्र उत्तेजना के वितरण से पहले बेसलाइन अधिग्रहण की एक संक्षिप्त अवधि (यानी, 10 एमएस) की अनुमति देता है ताकि आराम करने वाली प्रतिदीप्ति के बाद के माप की अनुमति मिल सके।
  4. 0.5 या 1 एमएस, 20 वी वर्ग पल्स के साथ एक्शन पोटेंशिअल की एकल या ट्रेन शुरू करें। सिग्नल ब्लीचिंग से बचने के लिए जितना संभव हो सके कुल अधिग्रहण समय को कम करें।
    नोट: भले ही फाइबर के केंद्र में रिकॉर्डिंग हो, एक आंदोलन से संबंधित प्रतिदीप्ति संकेत हो सकता है और प्रोटीन-फ्लोरोफोर विरूपण परिवर्तन (चित्रा 5 डी) के कारण फ्लोरोसेंट सिग्नल के साथ भ्रमित हो सकता है। संकुचन-प्रेरित संकेत को उत्तेजना के बाद चार्ज आंदोलनके अपेक्षित समय की तुलना में विलंबित किया जाना चाहिए।
  5. फाइबर संकुचन के कारण एस 4 गतियों से उत्पन्न होने वाले संकेत को अलग करने के लिए, सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रियाओं को कम करने और चरण 6.4 को दोहराने के लिए रिकॉर्डिंग समाधान में 100 एमएम एन-बेंजाइल-पी-टोल्यूनि सल्फोनामाइड (बीटीएस; 50 μM अंतिम एकाग्रता) के 1 μL जोड़ें। फाइबर फार्माकोलॉजिकल स्थिरीकरण के बाद दूसरी बार पता लगाए गए संकेत टैग किए गए एस 4 हेलिक्स (चित्रा 5 डी) की आणविक गति के अनुरूप हैं।
    नोट: बीटीएस के साथ आंदोलन दमन के बाद इंजीनियर सिस्टीन के बिना नियंत्रण ईजीएफपी-सीएवी1.1 में कोई संकेत नहीं पाया जाना चाहिए।
  6. एक ही सेटिंग्स का उपयोग करके, डिश के भीतर एक स्थान पर एक समान संकेत प्राप्त करें जहां पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का मूल्य प्राप्त करने के लिए कोई मांसपेशी फाइबर या मलबा मौजूद नहीं है।
  7. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में फाइबर और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति [एफबी (टी)] से कच्चे प्रतिदीप्ति [एफआर (टी)] के समय पाठ्यक्रम वाली फ़ाइलों को आयात करें। एक सजातीय FB मान प्राप्त करने के लिए उस स्तंभ को औसत करें जिसमें Fb(t) है. पूर्ण प्रतिदीप्ति [एफ (टी)] मान प्राप्त करने के लिए एफआर (टी) से एफबी घटाएं। यदि आवश्यक हो तो परिणामी सिग्नल को स्मूथिंग फ़ंक्शन के साथ चिकना करें।
    नोट: इस डिटेक्शन सिस्टम और अधिग्रहण की आवृत्ति के साथ, हमने स्मूथिंग के लिए 50 अंकों की खिड़की के साथ एक आसन्न-औसत फ़ंक्शन का उपयोग करने का निर्णय लिया।
  8. आराम करने वाले प्रतिदीप्ति मान (एफ 0) प्राप्त करने के लिए उत्तेजना से पहले 10 एमएस के समय अंतराल में बेसलाइन एफ (टी) मूल्यों का औसत निकालें। प्रतिदीप्ति में पूर्ण परिवर्तन प्राप्त करने के लिए चिकनी एफ (टी) से एफ 0 घटाएं [ फिर, आराम करने वाले प्रतिदीप्ति (त्रिभुज / एफ 0) के सापेक्ष समय के साथ प्रतिदीप्ति परिवर्तन को व्यक्त करने के लिए, एफ (टी) को एफ 0 से विभाजित करें।
  9. सिग्नल ब्लीचिंग की सीमा का मूल्यांकन करने के लिए, उत्तेजना से पहले और बाद में और फ्लोरोमेट्रिक सिग्नल से दूर, समय के साथ संकेत के साथ दो बिंदुओं को परिभाषित करें। बेसलाइन ट्रेस प्राप्त करने के लिए इन दो बिंदुओं पर एक रैखिक फ़ंक्शन फिट करें। सिग्नल ब्लीचिंग को सही करने के लिए समय के साथ बेसलाइन को त्रिभुज /एफ0 में घटाएं।
  10. समय स्तंभ से उत्तेजना से अधिग्रहण दीक्षा और प्रतिक्रिया संकेत के बीच की देरी को घटाएं, ताकि विद्युत उत्तेजना की शुरुआत के अनुरूप टी = 0 हो।
    नोट: कई सिग्नल तुलना ओं की अनुमति देने के लिए, अक्सर सिग्नल के आयाम को सामान्य करना आवश्यक होता है। प्रयोग के उद्देश्य के आधार पर विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा सकता है। निम्नलिखित परिणाम अनुभाग में, हम सिग्नल कैनेटीक्स में रुचि रखते थे, इसलिए हमने न्यूनतम पहुंच मूल्य (यानी, नकारात्मक गोइंग पीक) द्वारा प्रत्येक सिग्नल को सामान्य करने से युक्त एक सरल विधि का उपयोग किया।

Figure 5
चित्रा 5: एमटीएस -5-टीएएमआरए धुंधला और प्रतिनिधि कच्चे फ्लोरोमेट्रिक रिकॉर्ड के बिना और उसके साथ ईजीएफपी-सीएवी1.1-सिस को व्यक्त करने वाले इमेजिंग मांसपेशी फाइबर। (ए) ईजीएफपी-सीएवी1.1 वीएसडी-III निर्माण को व्यक्त करने वाली विच्छेदित, अलग मांसपेशी की संचारित (बाएं) और फ्लोरोसेंट (दाएं) छवियों के उदाहरण। स्केल बार: 100 μm. (B) एक मांसपेशी फाइबर की प्रतिनिधि छवि जो EGFP-CaV1.1 VSD-III निर्माण को पहले (बाएं) और बाद में (दाएं) एमटीएस -5-टीएएमआरए धुंधला करती है। गैर-संक्रमित तंतुओं के अंतर्जात सिस्टीन भी डाई से दागदार होते हैं। (सी) ईजीएफपी-सीए वी 1.1 वीएसडी-III निर्माण (बाएं) और एमटीएस -5-टीएएमआरए स्टेनिंग (दाएं) की कॉन्फोकल छवि मांसपेशी फाइबर (नीचे) के अनुप्रस्थ नलिका प्रणाली पर सीएवी1.1 स्थानीयकरण की क्लासिकडबल बैंड पैटर्न विशेषता दिखाती है। (डी) दो उत्तेजनाओं के जवाब में प्रतिनिधि फ्लोरोमेट्रिक रिकॉर्डिंग और एन-बेंजाइल-पी-टोल्यूनि सल्फोनामाइड (बीटीएस) के साथ पहले (ब्लू ट्रेस) और बाद में (रेड ट्रेस) फाइबर स्थिरीकरण के बाद एक फोटोडायोड के साथ मापा जाता है। शीर्ष काली रेखा बाहरी क्षेत्र उत्तेजना के माध्यम से फाइबर विध्रुवण के लिए प्रोटोकॉल को इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

जब दोहराए जाने वाले क्षेत्र उत्तेजना के जवाब में कार्रवाई क्षमता का प्रचार किया जाता है, तो विध्रुवण की एक विशिष्ट आवृत्ति के जवाब में विशिष्ट वोल्टेज सेंसर गति को ट्रैक करना संभव है। जैसा कि चित्र 6 ए में दिखाया गया है, वीएसडी-द्वितीय-टैग किए गए हेलिकॉप्टरों की गति को 10 हर्ट्ज (यानी, 100 एमएस द्वारा स्थानित) पर लागू दो क्रमिक विध्रुवणों में से प्रत्येक के जवाब में ट्रैक किया जा सकता है। सिग्नल ब्लीचिंग को ट्रेस के लिए बेसलाइन घटाकर सही किया जा सकता है (चित्रा 6 बी)। पहली और दूसरी प्रतिक्रियाओं (चित्रा 6 सी) पर आगे समय आवर्धन इन तेजी से विकसित वीएसडी-द्वितीय हेलिक्स आंदोलनों के सटीक अवलोकन को सक्षम बनाता है। फील्ड-उत्तेजना ट्रिगर से समय मार्कर 10 μs की सटीकता पर पहली और दूसरी प्रतिक्रियाओं के सापेक्ष अस्थायी संरेखण की अनुमति देता है। दोनों संकेतों को उनके संबंधित न्यूनतम मान (यानी, न्यूनतम शिखर) द्वारा सामान्यीकृत किया जा सकता है ताकि दो प्रतिक्रियाओं (चित्रा 6 डी) के बीच गतिज तुलना की अनुमति मिल सके। सापेक्ष प्रतिदीप्ति की इन रिकॉर्डिंग से, यह देखा जा सकता है कि शिखर पर पहुंचने का समय इस वोल्टेज सेंसर के लिए क्रमिक विध्रुवण के बीच तुलनीय है।

इस दृष्टिकोण का उपयोग विध्रुवण की विभिन्न आवृत्तियों और कई कार्रवाई क्षमताओं के साथ व्यक्तिगत वोल्टेज सेंसर की गति को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है ताकि उनके सक्रियण और चार्ज आंदोलन, कैल्शियम वर्तमान, या कैल्शियम क्षणिकके साथ संबंधों का अध्ययन किया जा सके, जिसे फाइबर के एक अलग सेट में समानांतर में अध्ययन किया जा सकता है, जैसा किपहले बताया गया था।

Figure 6
चित्र 6: ईजीएफपी-सीएवी1.1 वीएसडी-II से प्रतिनिधि फ्लोरोमेट्रिक रिकॉर्डिंग 10 हर्ट्ज पर दो लगातार विध्रुवण द्वारा ट्रिगर की गई। (ए) ईजीएफपी-कैव 1.1 वीएसडी-II को व्यक्त करने वाले फाइबर में 10 हर्ट्ज और बेसलाइन सुधार वक्र (बैंगनी) को व्यक्त करने वाले फाइबर में त्रिभुज /एफ0 फ्लोरोमेट्रिक सिग्नल दो बार उत्तेजित होता है। शीर्ष काली रेखा प्रेरित विध्रुवण को इंगित करती है। (बी) दो स्वतंत्र प्रतिक्रियाओं (सी) के त्रिभुज /एफ 0 बेसलाइन सही संकेत। प्लॉट पर मूल्य शिखर पर न्यूनतम पहुंच के अनुरूप हैं। (डी) विध्रुवण और सामान्यीकरण के सापेक्ष सिग्नल संरेखण उनके संबंधित न्यूनतम शिखर द्वारा दोनों उत्तेजनाओं के लिए तुलनीय कैनेटीक्स के साथ वीएसडी-II डोमेन गति को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अभिकर्मकों अंतिम एकाग्रता (mM) आणविक भार g/L
NaCl 150 58.44 8.766
KCl 4 74.55 0.298
CaCl2 2 110.9 0.222
MgCl2 1 95.22 0.095
डी-ग्लूकोज 5 180.2 0.901
HEPES 10 238.3 2.383
पीएच 1 M NaOH के साथ 7.4 पर समायोजित किया गया

तालिका 1: संशोधित रिंगर की समाधान संरचना।

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Discussion

यहां, सीएवी1.1 चैनल से व्यक्तिगत वोल्टेज सेंसर गति के अध्ययन के लिए मांसपेशी फाइबर में एफएसडीएफ का संचालन करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। भले ही इस तकनीक में संयुक्त चरणों की संख्या और दृष्टिकोणों की विविधता जटिल दिखाई दे सकती है, इनमें से अधिकांश तकनीकों का उपयोग अक्सर बायोफिजिसिस्ट / सेल जीवविज्ञानी प्रयोगशालाओं में नियमित रूप से किया जाता है। इस प्रकार, स्पष्ट जटिलता मुख्य रूप से एक एकीकृत तकनीक में सभी विभिन्न दृष्टिकोणों के संयोजन में रहती है। अक्सर एक बहु-चरण विधि को पूरा करते समय, शुरुआत में किए गए छोटे संशोधनों का प्रभाव केवल निम्नलिखित चरणों में बाद में पता लगाया जा सकता है। प्रत्येक चरण के विकास में कठोरता के साथ, और सटीक समावेश और बहिष्करण मानदंड, एक ही तैयारी या यहां तक कि एक ही फाइबर से कई रिकॉर्डिंग प्राप्त करना संभव है।

यहां वर्णित दृष्टिकोण को हृदय कोशिकाओं और न्यूरॉन्स सहित अन्य सेल प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, विभिन्न डिटेक्शन सिस्टम, जैसे कि हाई-स्पीड कैमरों का उपयोग किया जा सकता है। वर्तमान में, वोल्टेज क्लैंप (पैच क्लैंप या दो-इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप) का उपयोगइन तकनीकों के लिए आंतरिक जटिलता के अतिरिक्त स्तर के कारण सीमित है। यहां प्रस्तुत विधि पर सुधार (जैसे उज्जवल और अधिक फोटोटेबल जांच) वोल्टेज-क्लैंप विधियों के साथ एफएसडीएफ के समवर्ती उपयोग की सुविधा प्रदान करेगा।

देशी विघटित कंकाल की मांसपेशी फाइबर में क्षेत्र उत्तेजना में वोल्टेज-क्लैंप की तुलना में उच्च थ्रूपुट होने का लाभ होता है और इसे अन्य संकेतों के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे कि कार्रवाई संभावित प्रसार45 या कार्रवाई क्षमता-उत्पन्न कैल्शियम क्षणिक41।

हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणाली की तुलना में इस मूल सेल एफएसडीएफ का मुख्य लाभ अपने शारीरिक वातावरण में प्रेरित विध्रुवण के जवाब में और इसके अंतर्जात उत्तेजना द्वारा प्रोटीन विरूपण परिवर्तनों का पता लगाने की क्षमता है। यह सीएवी1.1 के अध्ययन के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है, जो एक अन्य कैल्शियम चैनल, रयानोडाइन रिसेप्टर टाइप 1 (आरवाईआर 1) के लिए वोल्टेज सेंसर के रूप में कार्य करता है, जो विशिष्ट सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम झिल्ली डोमेन 5,33,35 में डाला गया है। व्यवहार में, एक उपयुक्त कैल्शियम फ्लोरोसेंट संकेतक का उपयोग करके सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम से कैल्शियम रिलीज के साथ वोल्टेज सेंसर से फ्लोरोसेंट संकेतों के एक साथ माप का अध्ययन करना संभव हो सकता है। इसके अलावा, चूंकि यह दिखाया गया है कि त्रिआयामी वातावरण से कई प्रोटीन सीएवी1.1 को 46,47,48,49,50 को प्रभावित कर सकते हैं, मांसपेशी फाइबर में वोल्टेज सेंसर गति का अध्ययन उच्च शारीरिक प्रासंगिकता का है। दृष्टिकोण के दो प्रमुख नुकसान हैं: 1) मापा संकेतों का छोटा आयाम, और 2) फोटोब्लीचिंग, जो दोहराए जाने वाले और / या लंबे समय तक उत्तेजनाओं के उपयोग को रोकता है। इस तकनीक में सुधार की आवश्यकता है और वयस्क मांसपेशी फाइबर में वोल्टेज क्लैंप प्रयोगों के साथ एफएसडीएफ को गठबंधन करने की अनुमति देगा।

मांसपेशी फाइबर में अन्य चैनलों (या रिसेप्टर्स) के लिए एफएसडीएफ का आवेदन संभव है, बशर्ते कि: (1) वे पर्याप्त स्तर पर व्यक्त किए जाते हैं, (2) वे सुलभ हैं (बाह्य या इंट्रासेल्युलर स्थान से), और (3) म्यूटेनेसिस के माध्यम से सिस्टीन संशोधन चैनल फ़ंक्शन को खराब नहीं करता है। हेटरोलॉगस और देशी मांसपेशी फाइबर दोनों में एफएसडीएफ का पूरक उपयोग आवश्यक है और वोल्टेज पर निर्भर सीएवी1.1 संक्रमण के बारे में अनुत्तरित प्रश्नों को संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण होगा जो मांसपेशियों के कार्य के लिए महत्वपूर्ण हैं।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की कोई रिपोर्ट नहीं दी है।

Acknowledgments

वेरगारा (कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स) को ईजीएफपी-सीएवी1.1 (खरगोश) जंगली प्रकार के प्लास्मिड को साझा करने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम ट्रैक और होल्ड सर्किट के साथ फोटोडायोड के डिजाइन और निर्माण के लिए फिजियोलॉजी इलेक्ट्रॉनिक्स प्रयोगशाला के येल विभाग और विशेष रूप से हेनरिक एबिल्डगार्ड को धन्यवाद देते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान आर01-AR075726 और आर01-NS103777 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase SIGMA ALDRICH H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube Millipore Sigma EP022363719-500EA
1 mL syringe Millipore Sigma Z683531-100EA tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe Becton Dikinson 324702
35 mm non coated plastic plate Falcon, Corning 353001
60 mm non coated plastic plate Falcon, Corning 351007
Alcoholic whip PDI B60307
Alexa-533 cube LP Chroma 49907 Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp Sutter Instrumets LB-LS 672
Artificial tears cream Akorn NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" VWR 14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) SIGMA ALDRICH 203895
collagenase type I SIGMA ALDRICH C0130-1g
Cotton tip VWR VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation) BTX harvard apparatus 45-0120 10mm 2 needle array tips
EGFP cube Chroma 39002AT Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device BTX harvard apparatus ECM 830
EPC10 HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience) 895000
FBS Biotechne,  R&D Systems RND-S11150H Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish MatTek Life Science P35G-1.5-14-C
Isoflurane Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation 502017-250ml
Isothermal heating pad Braintree scientific inc 39DP
Laminin Thermo Fisher INV-23017015 Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb VWR 82024-554
LED 530 nm Sutter Instrumets 5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter Pall FG4579 acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM Invitrogen INV-11380037
MTS-5-TAMRA Biotium 89410-784 MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software OriginLab Corporation OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode Custom Made NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17 Olympus BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis SIGMA 267228-1G To manufacture field stimulation electrode
Pulse Generator WPI Pulsemaster A300
Shutter drive controller Uniblitz 100-2B
Shuttter Uniblitz VS2582T0-100
S-MEM Invitrogen INV-11380037
Sterile bench pad VWR DSI-B1623
Sterile saline SIGMA ALDRICH S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit Dow Corning 1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia Parkland Scientific V3000PK
Voltage generator Custom Made NA

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References

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जीव विज्ञान अंक 196
कंकाल की मांसपेशी उत्तेजना का अध्ययन करने के लिए मूल कोशिकाओं में कार्यात्मक साइट-निर्देशित फ्लोरोमेट्री
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Bibollet, H., Bennett, D. F., Schneider, M. F., Hernández-Ochoa, E. O. Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability. J. Vis. Exp. (196), e65311, doi:10.3791/65311 (2023).

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