Summary
Funktionell platsstyrd fluorometri är en metod för att studera proteindomänrörelser i realtid. Modifiering av denna teknik för dess tillämpning i inhemska celler möjliggör nu detektering och spårning av enstaka spänningssensorrörelser från spänningsstyrda Ca2+ kanaler i murina isolerade skelettmuskelfibrer.
Abstract
Funktionell platsriktad fluorometri har varit den valda tekniken för att undersöka struktur-funktionsförhållandet mellan många membranproteiner, inklusive spänningsstyrda jonkanaler. Detta tillvägagångssätt har främst använts i heterologa expressionssystem för att samtidigt mäta membranströmmar, den elektriska manifestationen av kanalernas aktivitet och fluorescensmätningar, rapportera lokala domänomarrangemang. Funktionell platsriktad fluorometri kombinerar elektrofysiologi, molekylärbiologi, kemi och fluorescens till en enda omfattande teknik som möjliggör studier av strukturella omarrangemang och funktion i realtid genom fluorescens respektive elektrofysiologi. Vanligtvis kräver detta tillvägagångssätt en konstruerad spänningsstyrd membrankanal som innehåller ett cystein som kan testas med ett tiolreaktivt fluorescerande färgämne. Fram till nyligen utfördes den tiolreaktiva kemin som användes för den platsriktade fluorescerande märkningen av proteiner uteslutande i Xenopus-oocyter och cellinjer, vilket begränsade omfattningen av tillvägagångssättet till primära icke-exciterbara celler. Denna rapport beskriver tillämpligheten av funktionell platsriktad fluorometri i vuxna skelettmuskelceller för att studera de tidiga stegen i excitations-kontraktionskoppling, processen genom vilken muskelfiberelektrisk depolarisering är kopplad till aktiveringen av muskelkontraktion. Detta protokoll beskriver metoderna för att designa och transfektera cysteinkonstruerade spänningsstyrda Ca2+ kanaler (CaV1.1) till muskelfibrer i flexor digitorum brevis hos vuxna möss med hjälp av in vivo-elektroporering och de efterföljande stegen som krävs för funktionella platsriktade fluorometrimätningar. Detta tillvägagångssätt kan anpassas för att studera andra jonkanaler och proteiner. Användningen av funktionell platsriktad fluorometri av däggdjursmuskler är särskilt relevant för att studera grundläggande mekanismer för excitabilitet.
Introduction
Förmågan att spåra jonkanalskonformationella omarrangemang som svar på en känd elektrisk stimulans i en levande cell är en källa till värdefull information för molekylär fysiologi1. Spänningsstyrda jonkanaler är membranproteiner som känner av förändringar i transmembranspänning, och deras funktion påverkas också av spänningsförändringar2. Utvecklingen av spänningsklämtekniker under det senaste århundradet gjorde det möjligt för fysiologer att i realtid studera jonströmmar som bärs av spänningsstyrda jonkanaler som svar på membrandepolarisering3. Användningen av spänningsklämteknik har varit avgörande för att förstå de elektriska egenskaperna hos retbara celler som neuroner och muskler. På 1970-talet möjliggjorde spänningsklämförfining detektering av grindströmmar (eller laddningsrörelse) i spänningsstyrda kalcium (Ca V) och natrium (NaV) kanaler 4,5. Grindströmmar är icke-linjära kapacitiva strömmar som uppstår från spänningssensorernas rörelse som svar på förändringar i det elektriska fältet över cellmembranet6. Grindströmmar anses vara en elektrisk manifestation av molekylära omarrangemang som föregår eller åtföljer jonkanalöppning7. Medan dessa strömmätningar ger värdefull information om kanalens funktion, är både jonströmmar och grindströmmar indirekta avläsningar av inter- och intramolekylära konformationsomarrangemang av spänningsstyrda kanaler7.
Funktionell platsriktad fluorometri (FSDF; även kallad spänningsklämfluorometri, VCF) utvecklades i början av 1990-talet8 och gav för första gången möjlighet att direkt se lokala konformationsförändringar och funktionen hos ett kanalprotein i realtid. Med hjälp av en kombination av kanalmutagenes, elektrofysiologi och heterologa expressionssystem är det möjligt att fluorescerande märka och spåra de rörliga delarna av specifika kanaler eller receptorer som svar på den aktiverande stimulansen 9,10. Detta tillvägagångssätt har använts i stor utsträckning för att studera spänningsavkänningsmekanismerna i spänningsstyrda jonkanaler 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. För auktoritativa recensioner, se 10,20,21,22,23.
Ca V- och NaV-kanalerna, som är kritiska för initiering och utbredning av elektriska signaler, består av en huvud α1-underenhet, som har en central por och fyra icke-identiska spänningsavkänningsdomäner 2. Förutom sin distinkta primära struktur uttrycks Ca V- och NaV-kanaler som multisubenhetskomplex med hjälpunderenheter24. Spänningsberoende kaliumkanaler (K V) består av fyra underenheter som ser ut som en enda domän av Na V eller CaV25. Den porbildande och spänningsavkännande α1-underenheten i Ca V- och NaV-kanaler bildas av en enda polypeptid som kodar för fyra individuella domäner med sex unika transmembransegment (S1-S6; Figur 1A) 24,26. Regionen som består av S1 till S4 transmembransegment bildar spänningsavkänningsdomänen (VSD) och S5- och S6-transmembransegmenten bildar pordomänen26. I varje VSD innehåller S4 α-helixen positivt laddat arginin eller lysin (figur 1A,B) som rör sig som svar på membrandepolarisering7. Flera decennier av forskning och resultaten från mycket olika experimentella metoder stöder förutsättningen att S4-segment rör sig utåt och genererar grindströmmar som svar på membrandepolarisering6.
FSDF mäter fluorescensförändringarna hos ett tiolreaktivt färgämne konjugerat till en specifik cysteinrest (dvs. S4 α-helixen) på en jonkanal eller annat protein, konstruerat via platsriktad mutagenes, eftersom kanalen fungerar som svar på membrandepolarisering eller andra stimuli10. Faktum är att FSDF ursprungligen utvecklades för att undersöka om S4-segmentet i KV-kanaler, som föreslås vara kanalens huvudspänningssensor, rör sig när grindladdningarna rör sig som svar på förändringar i membranpotentialen 8,10. Vid spänningsstyrda jonkanaler kan FSDF lösa oberoende konformationsomarrangemang av de fyra VSD:erna (spåra en VSD vid varje given tidpunkt), samtidigt med kanalfunktionsmätningar. Med hjälp av detta tillvägagångssätt har det faktiskt visat sig att enskilda varvtalsreglerare verkar vara olika involverade i specifika aspekter av kanalaktivering och inaktivering 12,27,28,29,30. Att identifiera varje VSD:s bidrag till kanalernas funktion är av hög relevans och kan användas för att ytterligare belysa kanaldriften och potentiellt identifiera nya mål för läkemedelsutveckling.
Användningen av FSDF i heterologa uttryckssystem har varit till stor hjälp för att främja vår förståelse av kanalfunktion ur ett reduktionistiskt perspektiv10,23. Liksom många reduktionistiska tillvägagångssätt presenterar den fördelar men har också begränsningar. Till exempel är en stor begränsning den partiella rekonstitueringen av kanalnanomiljön i det heterologa systemet. Ofta interagerar jonkanaler med många tillbehörsunderenheter och många andra proteiner som modifierar deras funktion31. I princip kan olika kanaler och deras tillbehörsunderenheter uttryckas i heterologa system med användning av flera proteinkodande konstruktioner eller polycistroniska plasmider, men deras ursprungliga miljö kan inte rekonstitueras fullständigt30,32.
Vår grupp publicerade nyligen en variant av FSDF i inhemska dissocierade skelettmuskelfibrer för studier av tidiga steg av excitationskontraktionskoppling (ECC) 33,34, processen genom vilken muskelfiberelektrisk depolarisering är kopplad till aktiveringen av muskelkontraktion 35,36. För första gången tillät detta tillvägagångssätt rörelsespårning av enskilda S4-spänningssensorer från den spänningsstyrda L-typ Ca2+ -kanalen (CaV1.1, även känd som DHPR) i den ursprungliga miljön hos en vuxen differentierad muskelfiber37. Detta uppnåddes genom att beakta flera egenskaper hos denna celltyp, inklusive cellens elektriska aktivitet som möjliggör snabb stimuleringsinducerad självförökad depolarisering, förmågan att uttrycka cDNA-plasmid genom in vivo-elektroporering, det naturliga höga uttrycket och kompartmentorganisationen av kanalerna i cellen och dess kompatibilitet med höghastighetsavbildning och elektrofysiologiska inspelningsenheter. Tidigare använde vi ett höghastighetslinjeskanningskonfokalmikroskop som detekteringsenhet37. Nu presenteras en variant av tekniken med hjälp av en fotodiod för signalinhämtning. Detta fotodiodbaserade detektionssystem kan underlätta implementeringen av denna teknik i andra laboratorier.
Här beskrivs ett steg-för-steg-protokoll för att använda FSDF i nativa celler för studier av individuell spänningssensorrörelse från CaV1.1. Medan CaV1.1-kanalen har använts som ett exempel i hela detta manuskript, kan denna teknik tillämpas på extracellulärt tillgängliga domäner av andra jonkanaler, receptorer eller ytproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll godkändes av University of Maryland Institutional Animal Care and Use Committee. Följande protokoll har delats in i flera underavsnitt, bestående av (1) molekylär konstruktionsdesign och cysteinreagerande färgval, (2) in vivo-elektroporering, (3) muskeldissektion och fiberisolering, (4) beskrivning av förvärvsinställning, (5) bedömning av förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP) positiv fiberelektrisk aktivitet och cysteinfärgning, och (6) signalförvärv och bearbetning. Dessutom, i början av varje avsnitt, beskrivs några relevanta överväganden när man applicerar FSDF i en skelettmuskelfiber. Alla protokollavsnitt ska utföras med lämplig personlig skyddsutrustning, inklusive laboratorierock och handskar.
1. Molekylär konstruktion design och cystein reagerar färgämne urval
- Konstruktionsdesign är en kritisk del av experimentets framgång. Generera först en vildtyp, fluorescerande märkt CaV1.1 cDNA-konstruktion och utvärdera dess uttryck i lämplig celltyp. För muskelfibrer kan en stark transfektionseffektivitet uppnås genom att använda en plasmid som bär en cytomegalovirus (CMV) promotor. I detta protokoll användes en redan karakteriserad kanin EGFP-CaV1.1 plasmid38.
OBS: Vid konstruktion av cDNA-konstruktionen för att införa en cysteinrest i en spänningsstyrd jonkanal är cysteinpositionen kritisk och bör övervägas noggrant. Cysteinet bör vara tillgängligt från det extracellulära utrymmet för att möjliggöra en tiolkonjugerad färgreaktion (figur 1C, D) och bör vara proximalt mot S4-regionen för att exakt spåra dess rörelse som svar på depolarisering. För att tillåta färgfluorescenssläckning som svar på proteinrörelse bör emellertid den införda cysteinkonjugerade fluoroforen vara vid gränssnittet mellan två olika miljöer (t.ex. membran och extracellulär vätska; Figur 1E). Dessutom är det viktigt att se till att det införda cysteinet inte stör proteinfunktionen. - För att få en uppfattning om korrekt cystein lokalisering, samla information om kanalstruktur eller från andra fluorometri experiment av andra relaterade kanalproteiner. För design av cysteinkonstruerade Ca V 1.1-konstruktioner, utvärdera den upplösta kryoelektronmikroskopistrukturen (kryo-EM) i kanalen26 och jämföra cysteininsättningen av tidigare arbete från relaterade kanaler såsom CaV1.2 12 eller andra kanaler såsomShaker11 och NaChBac 39.
- När rätt cystein position väljs, använda en kommersiell plats-riktad mutagenes kit för att införa cystein substitutioner. I det nuvarande protokollet konstruerades följande cysteinmodifieringar oberoende på varje cytosolisk ände av S4-spänningsavkännande segmentet av CaV1.1: VSD-I (L159C), VSD-II (L522C), VSD-III (V893C), VSD-IV (S1231C) och UniProtKB: P07293 (figur 1B).
- För skelettmuskelfibrer, använd 5-karboxitetrametylrhodaminmetantiosulfonat (MTS-5-TAMRA), som uppvisar korrekt och snabb diffusion i det tvärgående tubulimembransystemet, vilket är en invagination av ytmembranet och den dominerande placeringen av CaV1.1-kanaler. MTS-5-TAMRA visar en minskning av fluorescens vid övergång från lipidmembranet till en vattenhaltig miljö (figur 1E).
OBS: Dylight eller Alexa-maleimidderivat fläckar ytmembranet men inte det tvärgående tubulisystemet.
Figur 1: Schematisk bild av tiolcysteinreaktionen vid gränssnittet mellan en transmembran α-helix. (A) Membrantopologi av L-typ CaV1.1. Plustecknen representerar basiska rester i S4-α-helixen och de orange stjärnorna indikerar platsen där cystein introducerades via platsriktad mutagenes. (B) Sekvensanpassning av S4I till S4IV av kanin CaV1.1 (UniProtKB: P07293). Positivt laddade arginin- och lysinrester som är kritiska för spänningsavkänning markeras med rött, medan konstruerade cysteinsubstitutioner indikeras med orange. Denna panel har anpassats från referens37. c) Cystein-tiolfluorescerande molekylreaktion. (D) Diagram som illustrerar insättning av cysteinmutagenes i en transmembranspänningskänslig α-helix. Cystein bör begravas i membranet i vila och vara tillgängligt extracellulärt efter depolarisering (ΔV; I). Cystein spårning är vanligtvis osannolikt att inträffa om målet cystein är redan tillgänglig från det extracellulära utrymmet före depolarisering (II) eller om cystein inte är tillgänglig från det extracellulära utrymmet efter depolarisering (III). (E) Efter reaktionen med den tiolfluorescerande molekylen minskar α-helixrörelse som svar på depolarisering MTS-5-TAMRA fluorescensemission. Den fluorometriska signalen genereras av rörelsen av S4-spiralen och den efterföljande färgrörelsen i förhållande till membranets plan och den vattenhaltiga miljön. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Elektroporering in vivo
OBS: Elektroporeringsexperiment utfördes som tidigare beskrivits38 med modifieringar. I följande avsnitt är protokollet utformat för elektroporering av en fotplatta på musen. Volymerna måste justeras om båda tassarna är förberedda.
- Alikvot 25–100 μl plasmidlösning vid 2–5 μg/μl i ett 1,5 ml rör placerat på is.
- Bered en 0,5 ml lösning av 2 mg/ml hyaluronidas i steril saltlösning och filtrera lösningen genom ett 0,2 μm sterilfilter med lågt bindande protein monterat på en 1 ml spruta. Förvaras i ett 1,5 ml rör vid rumstemperatur.
- Använd en kalibrerad anestesiapparat och bedöva en mus med 3%-4,5% isofluran iO2 (1 L/min) genom att placera musen i anestesikammaren. Bekräfta adekvat anestesi hos djuret genom att klämma fast svansspetsen med en pincett. Ingen reaktion bör observeras när optimal anestesi uppnås.
- Ta bort musen från anestesikammaren och placera en anestesinäsmask över musen. Placera djuret på ryggen på en isotermisk värmedyna täckt med en steril bänkplatta. Fortsätt anestesin med gnagarmasken med 3% isofluran iO2 (1 l/min).
- För att förhindra ögontorrhet under proceduren, applicera ett fint lager konstgjord tårkräm på djurets ögon med en steril bomullsspets. Desinficera djurets tass med en steril torka mättad i etylalkohol.
- Använd en 0,5-tums 29 G steril insulinnål och aspirera 20 μl hyaluronidaslösning. Penetrera huden i hälens höjd och skjut nålen subkutant mot tårna (figur 2A). Injicera långsamt lösningen medan nålen gradvis flyttas bakåt. En bolus eller bula bör observeras under tassen (figur 2B).
OBS: Beroende på djurets ålder och tassens storlek är det troligt att hela mängden lösning inte injiceras. Ofta kan en liten läcka genom injektionspunkten uppstå. - Upprepa steg 2.6 med den andra tassen, om så önskas, med en annan steril nål efter korrekt tassdesinfektion, som i steg 2.5.
- Koppla bort anestesin genom att ta bort djuret från näsmasken och sätt tillbaka musen i buret med tillgång till mat och vatten ad libitum. Full återhämtning från anestesi bör observeras i ~ 5 min. Placera röret som innehåller plasmidlösningen på bänken så att den når rumstemperatur.
- Efter 1 timme, bedöva djuret en andra gång, placera det på värmedynan och desinficera tassen enligt beskrivningen i steg 2.3-2.5.
- Injicera 10-20 μL av cDNA-konstruktionen med samma teknik som beskrivs i steg 2.6. Den totala mängden konstruktion som injiceras är 50-100 μg per tass. Upprepa proceduren med den kontralaterala tassen om så önskas med en annan steril spruta.
- Håll djuret under anestesi på den isotermiska värmedynan i 5 minuter så att cDNA-lösningen kan spridas jämnt genom vävnaden.
- Slå på elektroporeringsapparatenheten och anslut den till dubbelelektrodmatrisen, enligt tillverkarens rekommendationer.
- Desinficera dubbelelektroduppsättningen med en torka mättad i etylalkohol. Stabilisera tassen med en hand och sätt först in en elektrod under huden på baksidan av hälen. Sätt sedan in den andra elektroden vid tårnas bas och se till att båda elektrodernas orientering är vinkelrät mot fotens axel (figur 2C). Rikta sonden i en position som inte begränsar foten eller benet i en extrem vinkelorientering.
OBS: Elektrodinsättning kan underlättas med hjälp av pincett och genom att regelbundet skärpa elektrodernas spetsar. Beroende på djurets ålder kan tassens storlek variera och elektrodavståndet bör anpassas därefter. - Elektroporera musklerna genom att applicera 20 pulser, 20 ms i varaktighet / vardera, vid 1 Hz. För elektrodnålar med 1 cm mellanrum, ställ in spänningen på ~ 100 V. Detta bör anpassas om elektrodavståndet modifieras för att nå ~ 100 V / cm. Lätt flexion av siffrorna bör observeras under pulstillförsel om elektroderna är korrekt placerade.
- Upprepa steg 2.13 och 2.14 med den kontralaterala tassen om så önskas.
- Koppla bort anestesin och placera djuret i en bur, isolerad från sin icke-elektroporerade motkompis med tillgång till mat och vatten ad libitum i 2 timmar. Full återhämtning från anestesi bör observeras i ~ 10 min. Placera djuret tillbaka inuti buret.
OBS: Uttryck av cDNA-konstruktioner är starkt beroende av det protein som kodas. Proteinomsättning, kvantitet och kvalitet på cDNA, plasmidpromotor och andra variabler kan påverka konstruktionsuttrycket. I detta experiment kräver optimalt uttryck av α1S-subenheten i CaV1.1 med en CMV-promotor 4 till 6 veckor men kan detekteras från 2 veckor i upp till 12-15 månader.
Figur 2: Diagram över cDNA-injektion och elektroporeringselektroporeringselektrodpositionering i en musfotmatta för elektroporering. (A) Nålposition för hyaluronidas och cDNA-injektion under en musfotmatta. Pilen anger insättningspunkten genom huden. (B) Lätt missfärgning av huden och lätt ökning av tassstorleken ska observeras tillfälligt efter injektionen. (C) Elektrodmatrispositionering för elektroporering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Muskeldissektion och fiberisolering
OBS: Skelettmuskelfiberdissociation utfördes som tidigare beskrivits 37,40,41 med modifieringar. I följande avsnitt är protokollet lämpligt för musens två fotkuddar.
- Före fiberdissociationen, förbered den sylgardtäckta plattan genom att tillsätta en del härdningsmedel till 10 delar elastomer (% vikt/vikt) i en 60 mm petriskål av plast för att nå en tjocklek av ~ 5 mm. Låt den elastomertäckta plattan härda över natten före användning. Detta kan återanvändas flera gånger om det förvaras korrekt och desinficeras med 70% etylalkohol före och efter användning.
- Bered 4 mg kollagenas typ I i 2 ml spinner minimum essentiell örn medium (S-MEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS; slutlig koncentration av 2 mg / ml). Överför lösningen till en 35 mm obelagd plastplatta och placera skålen i en inkubator vid 37 °C, 5 %CO2.
OBS: S-MEM är en modifierad MEM-formulering utan glutamin och Ca2+. Frånvaron av Ca2+ i detta steg minskar fiberkontrakturen under enzymatisk matsmältning och trituration. - Tillsätt 5 ml S-MEM kompletterat med 10% FBS i en 60 mm obelagd plastplatta och förvara i inkubatorn vid 37 °C, 5% CO2.
- Avliva djuren genom kvävning via CO2 följt av cervikal dislokation. För att minska kontaminering under primär cellisolering, sänk ner djurkroppen i 70% etylalkohol i ~ 10 s. Ta bort och torka slaktkroppen med absorberande papper och skär fötterna med en sax mellan fotleden och knäet (figur 3A).
- Fäst ner ena foten av djuret, med tassen uppåt, med dissektionsstift på den elastomertäckta plattan under ett dissektionsmikroskop vid 10x förstoring.
- Med dissektionssax och finpincett, ta bort huden från tassen för att exponera flexor digitorum brevis (FDB) muskeln (figur 3B). För att förhindra vävnadstorrhet, tillsätt en droppe S-MEM 10% FBS till muskeln med en 1000 μL pipett.
- På hälens nivå skär senan och dissekera försiktigt FDB-muskeln från häl till tå (figur 3B). Undvik spänningar på muskeln så mycket som möjligt när du utför dissektionen. För mycket kraft som appliceras på vävnaderna kommer att resultera i muskelfiberskador. Placera muskeln omedelbart i kollagenaslösningen.
- Upprepa steg 3.5-3.7 med den kontralaterala foten. Placera den dissekerade muskeln i kollagenaslösningen i en 37 °C, 5% CO 2-inkubator i2 h 45 min till 3 h 15 min. Anpassa inkubationstiden beroende på kollagenasenzymatisk aktivitet och djurets ålder.
- Medan muskelvävnaden inkuberar, tillsätt 300 μL kall MEM utan serum eller antibiotika i mitten av en 35 mm glasbottenskål. Tillsätt 2 μL kallt laminin vid 1,20 mg / ml direkt till MEM. Upprepa processen för önskat antal rätter. Placera diskarna i cellodlingsinkubatorn vid 37 °C, 5%CO2 i minst 1 timme för att möjliggöra lamininpolymerisation.
- När den enzymatiska nedbrytningen är klar, överför muskeln till 60 mm cellodlingsskålen innehållande S-MEM 10% FBS med användning av en stor borrning (5 mm) eldpolerat glas Pasteurpipett och en latexlampa.
- Använd en mindre borrning (2 mm) eldpolerat glas Pasteurpipett och en latexlampa, triturera försiktigt muskeln under ett dissektionsmikroskop (figur 3C). Dissocierade muskelfibrer bör börja lossna från vävnaden och släppas i lösningen.
OBS: Som en tumregel är mindre trituration (15-30 pipettpassager) alltid att föredra, eftersom för mycket långvarig trituration kan stressa eller till och med skada fibrerna. - Använd en fin pincett, ta bort all icke-muskelvävnad, såsom nerver, senor eller blodkärl (figur 3D).
- Tillsätt 2 ml varm MEM 2% FBS till varje 35 mm lamininbelagd glasbottenskål. Överför de dissocierade muskelfibrerna med hjälp av en 200 μl pipett och en steril plastpipettspets till den 35 mm lamininbelagda glasbottenskålen (figur 3E).
OBS: Att uppnå en låg fiberdensitet och låta fibrerna vara väl separerade från varandra är viktigt för att förhindra fiberöverlappning. - Placera 35 mm bottenskålen i inkubatorn vid 37 °C, 5%CO2. Fibrer kan användas inom en tidsram på 2-20 h.
Figur 3; Muskel FDB fiber dissektion och dissociation. (A) Efter fotdissektion ovanför fotledsleden (streckad linje) avlägsnas huden under fottassen och följer den streckade linjen för att exponera FDB-muskeln (B). Muskeln dissekeras och placeras i kollagenaslösning. (C) Efter inkubation tritureras muskeln för att dissociera och erhålla individuella muskelfibrer. (D) Finpincett används för att avlägsna icke-muskelvävnad och skräp innan muskelfibrer överförs till den lamininbelagda odlingsskålen med glasbotten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Beskrivning av förvärvsinställningar
OBS: Förvärvsupplägget är jämförbart med det som beskrivits före42 med modifikationer (figur 4A).
- Slå på alla komponenter: dator, AD / DA-omvandlare och banklämförstärkare, mikroskop, motoriserat steg, manipulator (er), strömförsörjning för fotodioden, ljuskälla, ljusslutare, pulsgenerator och protokollredigerare.
- Aktivera transistor-transistorlogiken (TTL) som utlöser OUT-signalen från AD / DA för att styra pulsgeneratorn, ljusslutaren och protokollredigeraren.
- Använd TTL-utsignalen från pulsgeneratorn och anslut till en AD-kanal på förstärkaren för att verifiera exakt tidsutlösning. Adekvat kontroll av den utlösande konsistensen bör utvärderas noggrant före experimentet för att säkerställa adekvat apparatsynkronisering.
OBS: När det gäller CaV1.1, förvänta dig att se maximal signal på mindre än 4-10 ms efter stimulering (tid för att utveckla maximal laddningsrörelse5). Signalen är snabb och exakt tidsupplösning är avgörande att jämföra med andra mått, såsom kalciumtransient eller laddningsrörelse mätt via spänningsklämma. - För att fokusera excitationsljuset i ett specifikt område eller en plats på fibern (figur 4B), använd ett membran placerat i excitationsljusbanan. Detta möjliggör signalinsamling endast i ett område där EGFP-CaV1.1-signalen är maximal (figur 4B).
Figur 4: Beskrivning av färdskrivarsystemet . a) Diagram som illustrerar sambandet mellan de olika komponenterna i registreringssystemet. Installationen består av ett inverterat mikroskop med ett motoriserat steg, en ljusdiod (LED) ljuskälla, en ljuslucka, en skräddarsydd fotodiodbaserad ljusövervakningskrets med en spår- och hållfunktion43, en AD / DA-omvandlare (från en patchklämförstärkare), en analog pulsgenerator, en extern fältstimuleringsenhet kopplad till fältstimuleringselektroder, Motoriserade manipulatorer och kommersiell programvara för förvärv, synkronisering och generering av protokoll. Elektroden för fältstimulering är tillverkad av två platinatrådar svetsade till kopparkablar kopplade till pulsgeneratorn via en BMC-kontakt. Specifika excitations- och emissionsfilter används för att detektera både EGFP- och MTS-5-TAMRA-signaler. För att excitera EGFP används en xenonlampa med ett 488 nm (± 20 nm) excitationsfilter (Ex) och ett LP510 nm Em-filter. För MTS-5-TAMRA används en 530 nm LED-ljuskälla och ett LP550 nm Em-filter. (B) Vy av en fiber som uttrycker en EGFP-CaV1.1-cys-konstruktion med tvåfältsstimuleringselektroderna (svarta cirklar) orienterade korrekt (vänster) och felaktigt (höger) i fibrernas huvudaxel (streckad linje). Den svarta ofyllda cirkeln representerar förvärvsområdet med en diameter som styrs av membranöppningen, placerad framför ljuskällan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Bedömning av EGFP-positiv fiberelektrisk aktivitet och cysteinfärgning
OBS: Skelettmuskelfiberfältstimulering utförs som beskrivits före41 med modifieringar. Detta tillvägagångssätt används för att (1) identifiera friska, funktionella och elektriskt responsiva fibrer, (2) färga fibrerna med det cysteinreaktiva fluorescerande färgämnet och (3) registrera den fluorescerande signalen som svar på den förökade åtgärdspotentialen. Varje steg i detta avsnitt och följande bör utföras i en miljö med svagt ljus för att minska fluorescerande färgblekning.
- Placera 35 mm glasbottenskålen som innehåller dissocierade muskelfibrer på mikroskopets scen. Ta försiktigt bort odlingsmediet med en 1 000 μl pipett och ersätt Ringers lösning med 2 ml rumstemperatur (se tabell 1 för sammansättning). Flera omgångar av mediebyte kan krävas för att helt avlägsna det ursprungliga cellodlingsmediet som innehåller fria cysteiner.
- Använd en mekanisk eller motoriserad manipulator och placera de två platinatrådarna vinkelrätt mot botten av skålen. Se till att elektrodterminalerna är inriktade i förhållande till fiberns längdaxel och några millimeter från fiberns ändar och att separationen mellan elektroderna är 5 mm (figur 4B). Justera elektrodpositionen ytterligare genom att antingen rotera skålen eller montera varje elektrod på en oberoende mikromanipulator (figur 4B).
- Slå på det överförda ljuset och hitta fibrerna i synfältet med ett 20x mål. Flytta EGFP-filterkuben till ljusvägen.
OBS: Med hjälp av ett mikroskop utrustat med epifluorescens och ett mål med låg förstoring (2x) är det möjligt att bedöma konstruktionstransfektionseffektiviteten i hela muskeln före fiberdissociation genom att bedöma EGFP-uttryck (figur 5A). - Använd en fjärrstyrd ljuslucka och aktivera 488 nm excitationsljuset för att identifiera de EGFP-positiva fibrerna. Förvara fiberns x-y-plats på skålen med hjälp av ett motoriserat mikroskopsteg. EGFP-signalen är ofta heterogen i fibern (figur 4B). Centrera den sparade positionen till den ljusaste EGFP-signalen.
- Efter att ha identifierat EGFP-positiva fibrer, återgå till den första sparade lokaliseringen. Använd en manuell triggeromkopplare och leverera två sekventiella stimuleringspulser med en varaktighet på 1 ms och 20 V amplitud. Ställ in polariteten på pulserna till växlande.
- Efter stimuleringen, observera två koncentriska homogena fiberkontraktioner som svar på de två pulserna med motsatt polaritet. En lokal sammandragning eller frånvaro av sammandragning i svar på pulser med alternativ polaritet indikerar lokala icke-förökade passiva svar eller oexcitabilty41. Uteslut dessa fibrer för resten av experimentet.
- Tillsätt 2 μl 10 mM MTS-5-TAMRA-lösning direkt i skålen och blanda försiktigt med en 1 000 μL pipett (10 μM slutlig koncentration). Var försiktig så att du inte flyttar skålen, annars kommer de lagrade fiberpositionerna att gå förlorade. Inkubera i 4-5 minuter för att tillåta diffusion av den fluorescerande tiolmolekylen i det tvärgående tubulisystemets lumen.
- Applicera bipolär repetitiv stimulering för att framkalla successiva åtgärdspotentialtåg med en hastighet av 50 Hz i 300 ms var 1: e sekund i 5 minuter.
OBS: Pulstågen ger tillgänglighet till cysteinerna som sätts in i S4 i EGFP-CaV1.1 för att reagera med MTS-5-TAMRA. Fiberns förmåga att mekaniskt dra ihop sig som svar på stimulering är viktig för att transversell tubuli lumeninnehåll ska cykla med den extracellulära miljön. - Ta bort färgningslösningen från skålen med en 1 000 μL pipett och ersätt Ringers lösning med 2 ml rumstemperatur. Två eller tre omgångar kan krävas för att helt ta bort okonjugerad MTS-5-TAMRA. Låt den färgade fibern återhämta sig från färgningsprotokollet i minst 10 minuter.
- Som i steg 5.6, ompröva fiberhälsan och den elektriska aktiviteten genom att observera symmetrisk fiberkontraktion som svar på alternerande polaritet. Uteslut fibrer som inte svarar på båda stimuleringarna från resten av experimentet.
- Flytta MTS-5-TAMRA-filterkuben till ljusvägen. Aktivera 533 nm excitationsljuset med hjälp av en fjärrstyrd ljuslucka för att bekräfta homogen MTS-5-TAMRA-färgning på fibrerna.
OBS: Vid färgning med MTS-5-TAMRA reagerar både konstruerade och endogena cysteiner med maleimidderivatet (figur 5B). Således är det svårt att utvärdera den korrekta reaktionen med cystein av intresse. CaV1.1 uttrycks huvudsakligen i den tvärgående tubuli och bildar ett urskiljbart dubbelbandmönster. Med hjälp av ett konfokalt eller epifluorescensmikroskop kan en xy-bild användas för att bekräfta korrekt färgning och tvärgående tubuli inträde och diffusion av MTS-5-TAMRA (figur 5C).
6. Insamling och behandling av signaler
OBS: Innan fluorometriska mätningar utförs måste signalinsamlingen utformas noggrant för att uppnå det optimala signal/brusförhållandet. Långsammare samplingsfrekvenser möjliggör mer ljusdetektering samtidigt som antalet punkter som skulle förvärvas under proteinkonformationsomläggning minskas. I fallet med EGFP-CaV1.1-cys sker laddningsrörelse inducerad av en aktionspotentialvågform i ~ 1-10 ms37. För att få flera punkter för att spåra rörelsens utveckling över tid sattes förvärvet till 50 μs per punkt.
- Placera fibern mitt i synfältet med ett ordentligt förstoringssystem. För dessa experiment användes ett 60x olja 1,4 numerisk bländare (NA) inverterat objektiv. Optimera belysningen och fiberpositionen med det motoriserade steget och membranet för att belysa ett cirkulärt område av fiberns diameter, där EGFP-signalen är maximal (figur 4B).
- När fibern är placerad för förvärv, orientera de två oberoende monterade fältstimuleringsplatinatrådarna i vardera änden av fibern. Rikta in trådarna på fibrernas huvudaxel i en rak linje och placera dem 5 mm från varandra med fibern i mitten (figur 4B).
- Ställ in förvärvsexcitations- och emissionsfiltren på rätt inställningar för MTS-5-TAMRA. Starta experimentet genom att köra protokollet som skrivits i förvärvsprogramvaran. Detta steg utlöser alla nedströmsenheter (dvs. protokollredigerare, ljusslutare, pulsgenerator).
OBS: Detta protokoll möjliggör en kort period (dvs. 10 ms) av baslinjeförvärv före leverans av fältstimulans för att möjliggöra efterföljande mätningar av vilande fluorescens. - Initiera en enda eller ett tåg av åtgärdspotentialer med en 0,5 eller 1 ms, 20 V kvadratpuls. Minimera den totala förvärvstiden så mycket som möjligt för att undvika signalblekning.
OBS: Även om inspelning i mitten av fibern kan en rörelserelaterad fluorescenssignal uppstå och kan förväxlas med den fluorescerande signalen på grund av protein-fluoroforkonformationsförändring (figur 5D). Den kontraktionsinducerade signalen bör fördröjas jämfört med den förväntade tiden för laddningsrörelsen efter stimulering37. - För att ytterligare skilja signalen från S4-rörelser från den som beror på fiberkontraktion, tillsätt 1 μL 100 mM N-bensyl-p-toluensulfonamid (BTS; 50 μM slutlig koncentration) till registreringslösningen för att minimera kontraktila svar och upprepa steg 6.4. Signaler som detekteras för andra gången efter fiberfarmakologisk immobilisering motsvarar molekylrörelsen hos den märkta S4-spiralen (figur 5D).
OBS: Ingen signal bör detekteras i kontrollen EGFP-CaV1.1 utan konstruerat cystein efter rörelsedämpning med BTS. - Använd samma inställningar, skaffa en liknande signal på en plats i skålen där inga muskelfibrer eller skräp är närvarande för att få ett värde av bakgrundsfluorescens.
- Importera filerna som innehåller tidsförloppet för råfluorescensen [Fr(t)] från fibern och bakgrundsfluorescensen [Fb(t)] till dataanalysprogrammet. Medelvärdet av kolumnen som innehåller Fb(t) för att få ett homogent Fb-värde. Subtrahera Fb från Fr(t) för att erhålla de absoluta fluorescensvärdena [F(t)]. Jämna ut den resulterande signalen med en utjämningsfunktion om det behövs.
OBS: Med detta detekteringssystem och förvärvsfrekvensen bestämde vi oss för att använda en intilliggande medelvärdesfunktion med ett fönster på 50 punkter för utjämning. - Medelvärdet av utgångsvärdena F(t) under ett tidsintervall på 10 ms före stimuleringen för att erhålla ett vilofluorescensvärde (F0). Subtrahera F0 från den utjämnade F(t) för att erhålla den absoluta förändringen i fluorescens [ΔF(t)]. För att uttrycka fluorescensförändring över tid i förhållande till vilofluorescens (ΔF/F0), dividera ΔF(t) med F0.
- För att utvärdera omfattningen av signalblekning, definiera två punkter från ΔF / F0 över tidssignalen, före och efter stimuleringen och bort från den fluorometriska signalen. Anpassa en linjär funktion till dessa två punkter för att få en baslinjespårning. Subtrahera baslinjen till ΔF/F0 över tid för att korrigera för signalblekning.
- Subtrahera från tidskolumnen fördröjningen mellan förvärvsinitiering och återkopplingssignalen från stimuleringen, så att t = 0 motsvarar starten av den elektriska stimulansen.
OBS: För att tillåta flera signaljämförelser krävs det ofta att normalisera signalens amplitud. Olika tillvägagångssätt kan användas beroende på syftet med experimentet. I följande resultatavsnitt var vi intresserade av signalkinetik, så vi använde en enkel metod som bestod av att normalisera varje signal med det minsta uppnådda värdet (dvs den negativa going peak).
Figur 5: Avbildning av muskelfiber som uttrycker EGFP-CaV1.1-cys utan och med MTS-5-TAMRA-färgning och representativ råfluorometrisk post. (A) Exempel på överförda (vänster) och fluorescerande (höger) bilder av den dissekerade, inte dissocierade muskeln som uttrycker en EGFP-CaV1.1 VSD-III-konstruktion. Skalstång: 100 μm. (B) Representativ bild av en muskelfiber som uttrycker en EGFP-CaV1.1 VSD-III-konstruktion före (vänster) och efter (höger) MTS-5-TAMRA-färgning. Endogena cysteiner av icke-transfekterade fibrer färgas också av färgämnet. Skalstapel: 30 μm. (C) Konfokal bild av en EGFP-Ca V 1.1 VSD-III-konstruktion (vänster) och MTS-5-TAMRA-färgning (höger) visar ett klassiskt dubbelbandsmönster som är karakteristiskt för CaV1.1-lokalisering på muskelfiberns tvärgående tubulsystem (botten). Skalstapel: 25 μm. (D) Representativ fluorometrisk registrering som svar på två stimuli och uppmätt med en fotodiod före (blått spår) och efter (rött spår) fiberimmobilisering med N-bensyl-p-toluensulfonamid (BTS). Den övre svarta linjen indikerar protokollet för fiberdepolarisering via extern fältstimulering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När förökningspotentialer utlöses som svar på repetitiv fältstimulering är det möjligt att spåra specifik spänningssensorrörelse som svar på en specifik frekvens av depolarisering. Som visas i figur 6A kan rörelsen hos VSD-II-märkta helixer spåras som svar på var och en av två på varandra följande depolarisationer applicerade vid 10 Hz (dvs. med 100 ms mellanrum). Signalblekning kan korrigeras genom att subtrahera baslinjen till spåret (figur 6B). Ytterligare tidsförstoring på den första och andra responsen (figur 6C) möjliggör exakt observation av dessa snabbt utvecklande VSD-II-spiralrörelser. Tidsmarkören från fältstimuleringsutlösaren möjliggör relativ tidsmässig inriktning av det första och andra svaret med en precision av 10 μs. Båda signalerna kan normaliseras med respektive minimivärde (dvs. minsta topp) för att möjliggöra en kinetisk jämförelse mellan de två svaren (figur 6D). Från dessa registreringar av relativ fluorescens kan det observeras att tiden till topp är jämförbar mellan successiva depolarisationer för denna spänningssensor.
Detta tillvägagångssätt kan användas för att spåra enskilda spänningssensorers rörelse med olika frekvenser av depolarisering och flera åtgärdspotentialer för att studera deras aktivering och förhållande till laddningsrörelse, kalciumström eller kalciumtransienter, som kan studeras parallellt i en annan uppsättning fibrer, som tidigare rapporterats37.
Figur 6: Representativ fluorometrisk registrering från EGFP-CaV1.1 VSD-II utlöst av två på varandra följande depolarisationer vid 10 Hz. (A) ΔF/F0 fluorometrisk signal i en fiber som uttrycker EGFP-Cav1.1 VSD-II stimulerad två gånger vid 10 Hz och en baslinjekorrigeringskurva (lila). Den övre svarta linjen indikerar inducerad depolarisering. (B) Referenssignal från baslinjen ΔF/F0 för de två oberoende svaren (C). Värdena i diagrammet motsvarar minsta räckvidd vid toppen. (D) Signaljustering i förhållande till depolarisering och normalisering med deras respektive minsta topp visar VSD-II-domänrörelse med jämförbar kinetik för båda stimuli. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Reagenser | Slutlig koncentration (mM) | Molekylvikt | g/L |
| NaCl | 150 | 58.44 | 8.766 |
| KCl | 4 | 74.55 | 0.298 |
| CaCl2 | 2 | 110.9 | 0.222 |
| MgCl2 | 1 | 95.22 | 0.095 |
| D-glukos | 5 | 180.2 | 0.901 |
| HEPES | 10 | 238.3 | 2.383 |
| pH justerat till 7,4 med 1 M NaOH | |||
Tabell 1: Modifierad Ringers lösningssammansättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrivs ett steg-för-steg-protokoll för att genomföra FSDF i muskelfibrer för studier av individuella spänningssensorrörelser från CaV1.1-kanalen. Även om antalet steg och mångfalden av tillvägagångssätt som kombineras i denna teknik kan verka komplexa, används de flesta av dessa tekniker ofta rutinmässigt i biofysiker / cellbiologlaboratorier. Således ligger den uppenbara komplexiteten huvudsakligen i kombinationen av alla olika tillvägagångssätt i en enda integrerad teknik. Ofta när man utför en flerstegsmetod kan effekten av små modifieringar som utförs i början detekteras först senare i följande steg. Med noggrannhet i utvecklingen av varje steg och exakta inklusions- och uteslutningskriterier är det möjligt att erhålla flera inspelningar från samma preparat eller till och med samma fiber.
De tillvägagångssätt som beskrivs här kan anpassas till andra celltyper, inklusive hjärtceller och neuroner. Dessutom kan olika detekteringssystem, såsom höghastighetskameror, användas. För närvarande är användningen av spänningsklämma (patchklämma eller tvåelektrodspänningsklämma) begränsad på grund av den ytterligare komplexitetsnivån som är inneboende i dessa tekniker44. Förbättringar av metoden som presenteras här (t.ex. ljusare och mer fotostabila prober) kommer att underlätta samtidig användning av FSDF med spänningsklämmetoder.
Fältstimulering i inhemska dissocierade skelettmuskelfibrer har fördelen att ha en högre genomströmning än spänningsklämma och kan tillämpas för studier av andra signaler, såsom aktionspotentialutbredning45 eller aktionspotentialframkallade kalciumtransienter41.
Den största fördelen med denna inhemska cell FSDF jämfört med det heterologa uttryckssystemet är förmågan att detektera proteinkonformationsförändringar som svar på inducerad depolarisering i dess fysiologiska miljö och genom dess endogena stimulans. Det är särskilt relevant för studien av CaV1.1, som fungerar som spänningssensor för en annan kalciumkanal, ryanodinreceptorn typ 1 (RyR1), införd i den distinkta sarkoplasmatiska retikulummembrandomänen 5,33,35. I praktiken kan det vara möjligt att studera samtidig mätning av fluorescerande signaler från en spänningssensor med kalciumfrisättning från sarkoplasmatisk retikulum med hjälp av en lämplig kalciumfluorescerande indikator. Dessutom, eftersom det har visats att många proteiner från den triadiska miljön kan påverka CaV1.1 gating 46,47,48,49,50, är studien av spänningssensorns rörelse i en muskelfiber av hög fysiologisk relevans. Två stora nackdelar med tillvägagångssättet är: 1) liten amplitud hos de uppmätta signalerna och 2) fotoblekning, vilket utesluter användning av repetitiva och / eller långvariga stimuli. Förbättringar av denna teknik behövs och gör det möjligt att kombinera FSDF med spänningsklämma experiment i vuxna muskelfibrer.
Applicering av FSDF på andra kanaler (eller receptorer) i muskelfibrer är möjlig, förutsatt att: (1) de uttrycks på en tillräcklig nivå, (2) de är tillgängliga (från extracellulärt eller intracellulärt utrymme) och (3) cysteinmodifieringen via mutagenes inte försämrar kanalfunktionen. Den kompletterande användningen av FSDF i både heterologa och naturliga muskelfibrer är nödvändig och kommer att vara avgörande för att ta itu med obesvarade frågor om spänningsberoende CaV1.1-övergångar som är kritiska för muskelfunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. J. Vergara (University of California, Los Angeles) för att ha delat EGFP-CaV1.1 (kanin) vildtypsplasmid. Vi tackar Yale Department of Physiology Electronics Laboratory och särskilt Henrik Abildgaard för designen och konstruktionen av fotodioden med track and hold circuit. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidragen R01-AR075726 och R01-NS103777
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronidase | SIGMA ALDRICH | H3884-50mg | |
| 0.5 mL Eppendorf tube | Millipore Sigma | EP022363719-500EA | |
| 1 mL syringe | Millipore Sigma | Z683531-100EA | tuberculine slip tip |
| 1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe | Becton Dikinson | 324702 | |
| 35 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 353001 | |
| 60 mm non coated plastic plate | Falcon, Corning | 351007 | |
| Alcoholic whip | PDI | B60307 | |
| Alexa-533 cube LP | Chroma | 49907 | Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp |
| Arc lamp | Sutter Instrumets | LB-LS 672 | |
| Artificial tears cream | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" | VWR | 14672-200 | |
| BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) | SIGMA ALDRICH | 203895 | |
| collagenase type I | SIGMA ALDRICH | C0130-1g | |
| Cotton tip | VWR | VWR-76048-960-BG | |
| Double electrode array (for electroporation) | BTX harvard apparatus | 45-0120 | 10mm 2 needle array tips |
| EGFP cube | Chroma | 39002AT | Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m |
| Electroporation apparatus device | BTX harvard apparatus | ECM 830 | |
| EPC10 | HEKA Elektronik GmbH (Harvard Bioscience) | 895000 | |
| FBS | Biotechne, R&D Systems | RND-S11150H | Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated |
| glass coverslip 35 mm dish | MatTek Life Science | P35G-1.5-14-C | |
| Isoflurane | Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation | 502017-250ml | |
| Isothermal heating pad | Braintree scientific inc | 39DP | |
| Laminin | Thermo Fisher | INV-23017015 | Laminin Mouse Protein, Natural |
| Latex bulb | VWR | 82024-554 | |
| LED 530 nm | Sutter Instrumets | 5A-530 | |
| Low binding protein 0.2 μm sterile filter | Pall | FG4579 | acrodisk syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic |
| MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| MTS-5-TAMRA | Biotium | 89410-784 | MTS-5-TAMRA |
| OriginPro Analysis Software | OriginLab Corporation | OriginPro 2022 (64-bit) SR1 | |
| Photodiode | Custom Made | NA | |
| PlanApo 60x oil 1.4 N.A/∞/0.17 | Olympus | BFPC2 | |
| Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis | SIGMA | 267228-1G | To manufacture field stimulation electrode |
| Pulse Generator | WPI | Pulsemaster A300 | |
| Shutter drive controller | Uniblitz | 100-2B | |
| Shuttter | Uniblitz | VS2582T0-100 | |
| S-MEM | Invitrogen | INV-11380037 | |
| Sterile bench pad | VWR | DSI-B1623 | |
| Sterile saline | SIGMA ALDRICH | S8776 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer kit | Dow Corning | 1419447-1198 | |
| Vaporizer for Anesthesia | Parkland Scientific | V3000PK | |
| Voltage generator | Custom Made | NA |
References
- Catterall, W. A., Wisedchaisri, G., Zheng, N. The chemical basis for electrical signaling. Nature Chemical Biology. 13 (5), 455-463 (2017).
- Armstrong, C. M., Hille, B. Voltage-gated ion channels and electrical excitability. Neuron. 20 (3), 371-380 (1998).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Armstrong, C. M., Bezanilla, F. Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels. Nature. 242 (5398), 459-461 (1973).
- Schneider, M. F., Chandler, W. K. Voltage dependent charge movement of skeletal muscle: a possible step in excitation-contraction coupling. Nature. 242 (5395), 244-246 (1973).
- Bezanilla, F.
- Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiological Reviews. 80 (2), 555-592 (2000).
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Akabas, M. H. Cysteine modification: probing channel structure, function and conformational change. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 25-54 (2015).
- Priest, M., Bezanilla, F.
- Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
- Pantazis, A., Savalli, N., Sigg, D., Neely, A., Olcese, R. Functional heterogeneity of the four voltage sensors of a human L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 18381-18386 (2014).
- Savalli, N., Kondratiev, A., Toro, L., Olcese, R. Voltage-dependent conformational changes in human Ca(2+)- and voltage-activated K(+) channel, revealed by voltage-clamp fluorometry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (33), 12619-12624 (2006).
- Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
- Bannister, J. P. A., Chanda, B., Bezanilla, F., Papazian, D. M. Optical detection of rate-determining ion-modulated conformational changes of the ether-à-go-go K+ channel voltage sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (51), 18718-18723 (2005).
- Bruening-Wright, A., Elinder, F., Larsson, H. P. Kinetic relationship between the voltage sensor and the activation gate in spHCN channels. The Journal of General Physiology. 130 (1), 71-81 (2007).
- Osteen, J. D., et al. KCNE1 alters the voltage sensor movements necessary to open the KCNQ1 channel gate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22710-22715 (2010).
- Smith, P. L., Yellen, G. Fast and slow voltage sensor movements in HERG potassium channels. The Journal of General Physiology. 119 (3), 275-293 (2002).
- Gonzalez, C., Koch, H. P., Drum, B. M., Larsson, H. P. Strong cooperativity between subunits in voltage-gated proton channels. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 51-56 (2010).
- Gandhi, C. S., Olcese, R.
- Horne, A. J., Fedida, D. Use of voltage clamp fluorimetry in understanding potassium channel gating: a review of Shaker fluorescence data. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 87 (6), 411-418 (2009).
- Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
- Cowgill, J., Chanda, B. The contribution of voltage clamp fluorometry to the understanding of channel and transporter mechanisms. The Journal of General Physiology. 151 (10), 1163-1172 (2019).
- Catterall, W. A., Lenaeus, M. J., Gamal El-Din, T. M. Structure and pharmacology of voltage-gated sodium and calcium channels. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 60, 133-154 (2020).
- MacKinnon, R. Determination of the subunit stoichiometry of a voltage-activated potassium channel. Nature. 350 (6315), 232-235 (1991).
- Wu, J., et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Ca(v)1.1 at 3.6 Å resolution. Nature. 537 (7619), 191-196 (2016).
- Capes, D. L., Goldschen-Ohm, M. P., Arcisio-Miranda, M., Bezanilla, F., Chanda, B. Domain IV voltage-sensor movement is both sufficient and rate limiting for fast inactivation in sodium channels. The Journal of General Physiology. 142 (2), 101-112 (2013).
- Cha, A., Ruben, P. C., George, A. L., Fujimoto, E., Bezanilla, F. Voltage sensors in domains III and IV, but not I and II, are immobilized by Na+ channel fast inactivation. Neuron. 22 (1), 73-87 (1999).
- Muroi, Y., Arcisio-Miranda, M., Chowdhury, S., Chanda, B. Molecular determinants of coupling between the domain III voltage sensor and pore of a sodium channel. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (2), 230-237 (2010).
- Savalli, N., et al. The distinct role of the four voltage sensors of the skeletal CaV1.1 channel in voltage-dependent activation. The Journal of General Physiology. 153 (11), e202112915 (2021).
- Muller, C. S., et al. Quantitative proteomics of the Cav2 channel nano-environments in the mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (34), 14950-14957 (2010).
- Perni, S., Lavorato, M., Beam, K. G. De novo reconstitution reveals the proteins required for skeletal muscle voltage-induced Ca2+ release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (52), 13822-13827 (2017).
- Beam, K. G., Horowicz, P. Excitation-Contraction Coupling in Skeletal Muscle. , McGraw-Hill. New York. (2004).
- Schneider, M. F., Hernandez-Ochoa, E. O. Muscle: Fundamental Biology and Mechanisms of Disease. , Academic Press, Elsevier. 811-822 (2012).
- Rios, E., Pizarro, G. Voltage sensor of excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Physiological Reviews. 71 (3), 849-908 (1991).
- Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage sensing mechanism in skeletal muscle excitation-contraction coupling: coming of age or midlife crisis. Skeletal Muscle. 8 (1), 22 (2018).
- Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of CaV1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (40), e2026116118 (2021).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1520 (2009).
- Blunck, R., Starace, D. M., Correa, A. M., Bezanilla, F. Detecting rearrangements of shaker and NaChBac in real-time with fluorescence spectroscopy in patch-clamped mammalian cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3966-3980 (2004).
- Liu, Y., Carroll, S. L., Klein, M. G., Schneider, M. F. Calcium transients and calcium homeostasis in adult mouse fast-twitch skeletal muscle fibers in culture. The American Journal of Physiology. 272 (6), C1919-C1927 (1997).
- Hernandez-Ochoa, E. O., Vanegas, C., Iyer, S. R., Lovering, R. M., Schneider, M. F. Alternating bipolar field stimulation identifies muscle fibers with defective excitability but maintained local Ca(2+) signals and contraction. Skeletal Muscle. 6, 6 (2016).
- Klein, M. G., Simon, B. J., Szucs, G., Schneider, M. F. Simultaneous recording of calcium transients in skeletal muscle using high- and low-affinity calcium indicators. Biophysical Journal. 53 (6), 971-988 (1988).
- Irving, M., Maylie, J., Sizto, N. L., Chandler, W. K. Intrinsic optical and passive electrical properties of cut frog twitch fibers. The Journal of General Physiology. 89 (1), 1-40 (1987).
- Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage clamp methods for the study of membrane currents and SR Ca(2+) release in adult skeletal muscle fibres. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 108 (3), 98-118 (2012).
- Banks, Q., et al. Optical recording of action potential initiation and propagation in mouse skeletal muscle fibers. Biophysical Journal. 115 (11), 2127-2140 (2018).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap II: more recent advances in skeletal muscle excitation-contraction coupling. The Journal of Experimental Biology. 219, 175-182 (2016).
- Bannister, R. A., Beam, K. G. Ca(V)1.1: The atypical prototypical voltage-gated Ca2+ channel. Biochimica et Biophysica Acta. 1828 (7), 1587-1597 (2013).
- Beard, N. A., Wei, L., Dulhunty, A. F. Ca(2+) signaling in striated muscle: the elusive roles of triadin, junctin, and calsequestrin. European Biophysics Journal. 39 (1), 27-36 (2009).
- Polster, A., Perni, S., Bichraoui, H., Beam, K. G. Stac adaptor proteins regulate trafficking and function of muscle and neuronal L-type Ca2+ channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 602-606 (2015).
- Perni, S. The builders of the junction: roles of Junctophilin1 and Junctophilin2 in the assembly of the sarcoplasmic reticulum-plasma membrane junctions in striated muscle. Biomolecules. 12 (1), 109 (2022).
