Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Funksjonell stedsrettet fluorometri i innfødte celler for å studere skjelettmuskulaturspenning

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65311
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

Summary

Funksjonell stedsrettet fluorometri er en metode for å studere proteindomenebevegelser i sanntid. Modifikasjon av denne teknikken for anvendelse i innfødte celler tillater nå deteksjon og sporing av enkeltspenningssensorbevegelser fra spenningsstyrte Ca2+ -kanaler i murine isolerte skjelettmuskelfibre.

Abstract

Funksjonell stedsrettet fluorometri har vært den valgte teknikken for å undersøke struktur-funksjonsforholdet til mange membranproteiner, inkludert spenningsstyrte ionkanaler. Denne tilnærmingen har primært blitt brukt i heterologe ekspresjonssystemer for samtidig måling av membranstrømmer, den elektriske manifestasjonen av kanalens aktivitet og fluorescensmålinger, og rapporterer lokale domeneomlegginger. Funksjonell stedsrettet fluorometri kombinerer elektrofysiologi, molekylærbiologi, kjemi og fluorescens i en enkelt omfattende teknikk som tillater studier av sanntids strukturelle omorganiseringer og funksjon gjennom henholdsvis fluorescens og elektrofysiologi. Vanligvis krever denne tilnærmingen en konstruert spenningsstyrt membrankanal som inneholder en cystein som kan testes av et tiolreaktivt fluorescerende fargestoff. Inntil nylig ble den tiolreaktive kjemien som ble brukt til stedsrettet fluorescerende merking av proteiner, utført utelukkende i Xenopus-oocytter og cellelinjer, noe som begrenser omfanget av tilnærmingen til primære ikke-eksitable celler. Denne rapporten beskriver anvendeligheten av funksjonell stedsrettet fluorometri i voksne skjelettmuskelceller for å studere de tidlige trinnene i eksitasjons-kontraksjonskobling, prosessen der muskelfiber elektrisk depolarisering er knyttet til aktivering av muskelkontraksjon. Denne protokollen beskriver metodene for å designe og transfeksjonere cysteinkonstruerte spenningsstyrte Ca2+ kanaler (CaV1.1) til muskelfibre i flexor digitorum brevis av voksne mus ved bruk av in vivo elektroporering og de påfølgende trinnene som kreves for funksjonelle stedsrettede fluorometrimålinger. Denne tilnærmingen kan tilpasses for å studere andre ionkanaler og proteiner. Bruken av funksjonell stedsrettet fluorometri av pattedyrsmuskel er spesielt relevant for å studere grunnleggende eksitabilitetsmekanismer.

Introduction

Evnen til å spore ionkanalkonformasjonelle omlegginger som respons på en kjent elektrisk stimulus i en levende celle er en kilde til verdifull informasjon for molekylær fysiologi1. Spenningsstyrte ionkanaler er membranproteiner som registrerer endringer i transmembranspenning, og deres funksjon påvirkes også av spenningsendringer2. Utviklingen av spenningsklemmeteknikker i forrige århundre tillot fysiologer å studere, i sanntid, ioniske strømmer som bæres av spenningsstyrte ionkanaler som svar på membrandepolarisering3. Bruken av spenningsklemmeteknologi har vært avgjørende for å forstå de elektriske egenskapene til eksiterbare celler som nevroner og muskler. På 1970-tallet tillot spenningsklemmeforfining deteksjon av gatingstrømmer (eller ladningsbevegelse) i spenningsstyrt kalsium (Ca V) og natrium (NaV) kanaler 4,5. Gitterstrømmer er ikke-lineære kapasitive strømmer som oppstår ved bevegelse av spenningssensorer som svar på endringer i det elektriske feltet over cellemembranen6. Gattstrømmer betraktes som en elektrisk manifestasjon av molekylære omlegginger som går foran eller følger med ionkanalåpning7. Selv om disse strømmålingene gir verdifull informasjon om kanalens funksjon, er både ionestrømmer og gatingstrømmer indirekte avlesninger av inter- og intramolekylære konformasjonelle omlegginger av spenningsstyrte kanaler7.

Funksjonell stedsrettet fluorometri (FSDF; også referert til som spenningsklemmefluorometri, VCF) ble utviklet tidlig på 1990-tallet og ga for første gang muligheten til direkte å se lokale konformasjonsendringer og funksjonen til et kanalprotein i sanntid. Ved hjelp av en kombinasjon av kanalmutagenese, elektrofysiologi og heterologe ekspresjonssystemer, er det mulig å fluorescerende merke og spore de bevegelige delene av spesifikke kanaler eller reseptorer som respons på den aktiverende stimulansen 9,10. Denne tilnærmingen har blitt mye brukt til å studere spenningsfølermekanismene i spenningsstyrte ionkanaler 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. For autoritative vurderinger, se 10,20,21,22,23.

Kanalene Ca V og NaV, som er kritiske for initiering og utbredelse av elektriske signaler, består av en hoved α1-underenhet, som har en sentral pore og fire ikke-identiske spenningsfølerdomener2. I tillegg til deres distinkte primære struktur, uttrykkes Ca-, V- og NaV-kanaler som multisubenhetskomplekser med hjelpeunderenheter24. Spenningsavhengige kaliumkanaler (K V) består av fire underenheter som ser ut som et enkelt domene av Na, V eller CaV25. Den poredannende og spenningsfølende α1-underenheten av Ca V- og NaV-kanaler dannes av et enkelt polypeptid som koder for fire individuelle domener med seks unike transmembransegmenter (S1-S6; Figur 1A) 24,26. Regionen som består av S1 til S4 transmembransegmenter danner spenningsfølerdomenet (VSD) og S5 og S6 transmembransegmenter danner poredomenet26. I hver VSD inneholder S4 α-helixen positivt ladet arginin eller lysin (figur 1A,B) som beveger seg som respons på membrandepolarisering7. Flere tiår med forskning og resultatene fra svært varierte eksperimentelle tilnærminger støtter premisset om at S4-segmenter beveger seg utover og genererer gatingstrømmer, som svar på membrandepolarisering6.

FSDF måler fluorescensendringene av et tiolreaktivt fargestoff konjugert til en spesifikk cysteinrest (dvs. S4 α-helixen) på en ionkanal eller annet protein, konstruert via stedsrettet mutagenese, da kanalen fungerer som respons på membrandepolarisering eller andre stimuli10. Faktisk ble FSDF opprinnelig utviklet for å undersøke om S4-segmentet i K V-kanaler, foreslått å være kanalens hovedspenningssensor, beveger seg når gatingladningene beveger seg som svar på endringer i membranpotensial 8,10. Ved spenningsstyrte ionekanaler kan FSDF løse uavhengige konformasjonsomlegginger av de fire VSD-ene (sporing av en VSD til enhver tid), samtidig med kanalfunksjonsmålinger. Ved å bruke denne tilnærmingen har det vist seg at individuelle VSD-er ser ut til å være differensielt involvert i spesifikke aspekter ved kanalaktivering og inaktivering 12,27,28,29,30. Identifisering av bidraget fra hver VSD til kanalenes funksjon er av høy relevans og kan brukes til å ytterligere belyse kanaldrift og potensielt identifisere nye mål for narkotikautvikling.

Bruken av FSDF i heterologe ekspresjonssystemer har vært svært nyttig for å fremme vår forståelse av kanalfunksjon fra et reduksjonistisk perspektiv 10,23. Som mange reduksjonistiske tilnærminger presenterer den fordeler, men har også begrensninger. For eksempel er en stor begrensning den delvise rekonstitueringen av kanalens nanomiljø i det heterologe systemet. Ofte interagerer ionkanaler med mange tilbehørsunderenheter og mange andre proteiner som endrer deres funksjon31. I prinsippet kan forskjellige kanaler og deres tilbehørsunderenheter uttrykkes i heterologe systemer ved bruk av flere proteinkodende konstruksjoner eller polycistronic plasmider, men deres opprinnelige miljø kan ikke fullstendig rekonstitueres30,32.

Vår gruppe publiserte nylig en variant av FSDF i innfødte dissosierte skjelettmuskelfibre for studiet av tidlige trinn av eksitasjon-kontraksjonskobling (ECC) 33,34, prosessen der muskelfiber elektrisk depolarisering er knyttet til aktivering av muskelkontraksjon 35,36. For første gang tillot denne tilnærmingen bevegelsessporing av individuelle S4-spenningssensorer fra den spenningsstyrte L-type Ca2+-kanalen (CaV1.1, også kjent som DHPR) i det opprinnelige miljøet til en voksen differensiert muskelfiber37. Dette ble oppnådd ved å vurdere flere egenskaper av denne celletypen, inkludert den elektriske aktiviteten til cellen som tillater rask stimuleringsindusert selvforplantet depolarisering, evnen til å uttrykke cDNA-plasmid gjennom in vivo-elektroporering, den naturlige høyuttrykks- og kompartmentale organisasjonen av kanalene i cellen, og dens kompatibilitet med høyhastighets bildebehandling og elektrofysiologiske opptaksenheter. Tidligere brukte vi et høyhastighets linjeskanning konfokalmikroskop som detekteringsenhet37. Nå presenteres en variant av teknikken ved hjelp av en fotodiode for signaloppkjøp. Dette fotodiodebaserte deteksjonssystemet kan lette implementeringen av denne teknikken i andre laboratorier.

Her beskrives en trinnvis protokoll for å bruke FSDF i innfødte celler for studier av individuell spenningssensorbevegelse fra CaV1.1. Mens CaV1.1-kanalen har blitt brukt som et eksempel gjennom hele dette manuskriptet, kan denne teknikken brukes på ekstracellulært tilgjengelige domener av andre ionkanaler, reseptorer eller overflateproteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen ble godkjent av University of Maryland Institutional Animal Care and Use Committee. Følgende protokoll er delt inn i flere underavsnitt, bestående av (1) molekylær konstruksjonsdesign og cysteinreagerende fargestoffvalg, (2) in vivo-elektroporering , (3) muskeldisseksjon og fiberisolasjon, (4) beskrivelse av oppkjøpsoppsett, (5) vurdering av forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) positiv fiberelektrisk aktivitet og cysteinfarging, og (6) signalinnsamling og behandling. I tillegg, i begynnelsen av hver seksjon, er noen relevante hensyn detaljert når du bruker FSDF i en skjelettmuskelfiber. Alle protokollseksjoner skal utføres med riktig personlig verneutstyr, inkludert laboratoriefrakk og hansker.

1. Molekylær konstruksjonsdesign og cysteinreagerende fargestoffvalg

  1. Konstruktiv design er en kritisk del av eksperimentets suksess. Først genererer du en villtype, fluorescerende merket CaV1.1 cDNA-konstruksjon og evaluerer uttrykket i riktig celletype. For muskelfibre kan en sterk transfeksjonseffektivitet oppnås ved å bruke et plasmid som bærer en cytomegalovirus (CMV) promotor. I denne protokollen ble en allerede karakterisert kanin EGFP-CaV1.1 plasmid brukt38.
    MERK: Ved konstruksjon av cDNA-konstruksjonen for å introdusere en cysteinrest i en spenningsstyrt ionkanal, er cysteinposisjonen kritisk og bør vurderes nøye. Cysteinen skal være tilgjengelig fra det ekstracellulære rommet for å tillate en tiolkonjugert fargestoffreaksjon (figur 1C, D) og bør være proksimal for S4-regionen for nøyaktig å spore bevegelsen som respons på depolarisering. For å tillate fargestofffluorescensslukking som respons på proteinbevegelse, bør den introduserte cysteinkonjugerte fluoroforen imidlertid være i grensesnittet til to forskjellige miljøer (f.eks. membran og ekstracellulær væske; Figur 1E). I tillegg er det viktig å sikre at den innsatte cysteinen ikke forstyrrer proteinfunksjonen.
  2. For å få en ide om riktig cysteinlokalisering, samle informasjon om kanalstruktur eller fra andre fluorometrieksperimenter av andre relaterte kanalproteiner. For utforming av cystein-konstruerte Ca V 1.1-konstruksjoner, evaluer den løste kryo-elektronmikroskopistrukturen (kryo-EM) til kanalen26 og sammenlign cysteininnsettingen av tidligere arbeid fra relaterte kanaler som CaV1.2 12 eller andre kanaler somShaker11 og NaChBac39.
  3. Når riktig cysteinposisjon er valgt, bruk et kommersielt stedsrettet mutagenesesett for å introdusere cysteinsubstitusjoner. I denne protokollen ble følgende cysteinmodifikasjoner uavhengig konstruert på hver cytosoliske ende av S4-spenningsfølersegmentet av CaV1.1: VSD-I (L159C), VSD-II (L522C), VSD-III (V893C), VSD-IV (S1231C) og UniProtKB: P07293 (figur 1B).
  4. For skjelettmuskulaturfibre, bruk 5-karboksytetrametylrhodamin metanetiosulfonat (MTS-5-TAMRA), som utviser riktig og rask diffusjon i det tverrgående rørmembransystemet, som er en invaginasjon av overflatemembranen og den dominerende plasseringen av CaV1.1-kanaler. MTS-5-TAMRA viser en reduksjon i fluorescens ved overgang fra lipidmembranen til et vandig miljø (figur 1E).
    MERK: Dylight eller Alexa-maleimidderivater flekker overflatemembranen, men ikke det tverrgående tubulisystemet.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av tiol-cystein-reaksjon ved grenseflaten til en transmembran α-helix. (A) L-typeCa V 1.1 membrantopologi. Plusstegnene representerer basisrester i S4 α-helixen, og de oransje stjernene indikerer stedet der cystein ble introdusert via stedsrettet mutagenese. (B) Sekvensjustering av S4I til S4IV av kanin CaV1.1 (UniProtKB: P07293). Positivt ladede arginin- og lysinrester som er kritiske for spenningsføling er uthevet i rødt, mens konstruerte cysteinsubstitusjoner er angitt i oransje. Dette panelet er tilpasset fra referanse37. (C) Cystein-tiol fluorescerende molekylreaksjon. (D) Diagram som illustrerer innsetting av cysteinmutagenese i en transmembran spenningsfølsom α-helix. Cystein bør begraves i membranen i ro og være tilgjengelig ekstracellulært etter depolarisering (ΔV; I). Cysteinsporing er vanligvis usannsynlig å forekomme hvis målcystein allerede er tilgjengelig fra det ekstracellulære rommet før depolarisering (II) eller hvis cysteinen ikke er tilgjengelig fra det ekstracellulære rommet etter depolarisering (III). (E) Etter reaksjonen med tiolfluorescerende molekyl, reduserer α-helix-bevegelsen som respons på depolarisering MTS-5-TAMRA fluorescensutslipp. Det fluorometriske signalet genereres av bevegelsen av S4-helixen og den etterfølgende fargestoffbevegelsen i forhold til membranplanet og det vandige miljøet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. In vivo elektroporering

MERK: Elektroporasjonseksperimenter ble utført som tidligere beskrevet38 med modifikasjoner. I det følgende avsnittet er protokollen designet for elektroporering av en fotpute på musen. Volumene må justeres hvis begge potene er forberedt.

  1. Aliquot 25-100 μL plasmidoppløsning ved 2-5 μg / μL i et 1,5 ml rør plassert på is.
  2. Tilbered en 0,5 ml oppløsning av 2 mg/ml hyaluronidase i steril saltoppløsning og filtrer oppløsningen gjennom et 0,2 μm sterilt filter med lav binding montert på en 1 ml sprøyte. Oppbevares i en 1,5 ml tube ved romtemperatur.
  3. Bruk et kalibrert anestesiapparat til å bedøve en mus med 3%-4,5% isofluran iO2 (1 l/min) ved å plassere musen i anestesikammeret. Bekreft tilstrekkelig anestesi av dyret ved å klemme spissen av halen ved hjelp av en pinsett. Ingen reaksjon bør observeres når optimal anestesi er nådd.
  4. Fjern musen fra anestesikammeret og legg en bedøvelsesnesemaske over musen. Plasser dyret på ryggen på en isotermisk varmepute dekket med en steril benkpute. Fortsett anestesien med gnagermasken med 3 % isofluran iO2 (1 l/min).
  5. For å forhindre øyetørrhet under prosedyren, bruk et fint lag med kunstig tårkrem på øynene til dyret med en steril bomullsspiss. Desinfiser dyrets pote ved hjelp av en steril klut mettet i etylalkohol.
  6. Bruk en 0,5 i lang 29 G steril insulinnål, aspirer 20 mikrol hyaluronidaseoppløsning. Penetrer huden på nivå med hælen og skyv nålen subkutant mot tærne (figur 2A). Injiser oppløsningen langsomt mens kanylen gradvis beveges bakover. En bolus eller støt bør observeres under poten (figur 2B).
    MERK: Avhengig av dyrets alder og størrelsen på poten, er det sannsynlig at hele mengden oppløsning ikke kan injiseres. Ofte kan det oppstå en liten lekkasje gjennom injeksjonspunktet.
  7. Gjenta trinn 2.6 med den andre poten, hvis ønskelig, bruk en annen steril nål etter riktig pote desinfeksjon, som i trinn 2.5.
  8. Koble fra anestesien ved å fjerne dyret fra nesemasken og sett musen tilbake til buret med tilgang til mat og vann ad libitum. Full gjenoppretting fra anestesi bør observeres i ~ 5 min. Plasser røret som inneholder plasmidløsningen på benken for å la den nå romtemperatur.
  9. Etter 1 time, bedøv dyret en gang til, legg det på varmeputen og desinfiser poten som beskrevet i trinn 2.3-2.5.
  10. Injiser 10-20 μL av cDNA-konstruksjonen, ved hjelp av samme teknikk som beskrevet i trinn 2.6. Den totale mengden konstruere injisert er 50-100 μg per pote. Gjenta prosedyren med den kontralaterale poten hvis ønskelig ved hjelp av en annen steril sprøyte.
  11. Hold dyret under anestesi på isotermisk varmepute i 5 minutter for å la cDNA-oppløsningen spre seg jevnt gjennom vevet.
  12. Slå på elektroporasjonsapparatets enhet og koble den til dobbeltelektrodematrisen, som anbefalt av produsenten.
  13. Desinfiser den doble elektrodematrisen ved hjelp av en tørk mettet i etylalkohol. Stabiliser poten med en hånd og sett først en elektrode under huden på baksiden av hælen. Sett deretter den andre elektroden inn ved foten av tærne, slik at orienteringen til begge elektrodene er vinkelrett på fotens akse (figur 2C). Orienter sonden i en posisjon som ikke begrenser foten eller benet i ekstrem vinkelretning.
    MERK: Elektrodeinnsetting kan forenkles ved bruk av pinsett og ved regelmessig å skjerpe tuppene på elektrodene. Avhengig av dyrets alder kan størrelsen på poten variere og elektrodeavstanden bør tilpasses tilsvarende.
  14. Elektroporer musklene ved å bruke 20 pulser, 20 ms i varighet / hver, ved 1 Hz. For elektrode nåler fordelt på 1 cm, sett spenningen til ~ 100 V. Dette bør tilpasses hvis elektrodeavstanden endres for å nå ~ 100 V / cm. Svak fleksjon av sifrene bør observeres under pulslevering hvis elektrodene er riktig plassert.
  15. Gjenta trinn 2.13 og 2.14 med den kontralaterale poten om ønskelig.
  16. Koble fra anestesien og legg dyret i et bur, isolert fra sin ikke-elektriske motkamerat med mat- og vanntilgang ad libitum i 2 timer. Full gjenoppretting fra anestesi bør observeres i ~ 10 min. Plasser dyret tilbake inne i buret.
    MERK: Ekspresjon av cDNA-konstruksjon(er) er svært avhengig av proteinet som er kodet. Proteinomsetning, mengde og kvalitet på cDNA, plasmidpromotor og andre variabler kan påvirke konstruksjonsuttrykk. I dette eksperimentet krever optimal ekspresjon av α1S-underenheten til CaV1.1 med en CMV-promotor 4 til 6 uker, men kan detekteres fra 2 uker i opptil 12-15 måneder.

Figure 2
Figur 2: Diagram over cDNA-injeksjon og elektroporasjonselektrodeposisjonering i en musefotpute for elektroporering . (A) Nåleposisjon for hyaluronidase og cDNA injeksjon under en musefotpute. Pilen indikerer innføringspunktet gjennom huden. (B) Lett misfarging av huden og svak økning av potestørrelsen bør observeres forbigående etter injeksjon. (C) Elektrode array posisjonering for elektroporering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Muskeldisseksjon og fiberisolasjon

MERK: Skjelettmuskelfiberdissosiasjon ble utført som tidligere beskrevet 37,40,41 med modifikasjoner. I det følgende avsnittet er protokollen egnet for to fotputer på musen.

  1. I forkant av fiberdissosiasjonen, klargjør du den sylgard-dekkede platen ved å tilsette en del herdemiddel til 10 deler elastomer (% w / w) i en 60 mm petriskål av plast for å nå en tykkelse på ~ 5 mm. La den elastomerbelagte platen herde over natten før bruk. Dette kan gjenbrukes flere ganger hvis det oppbevares riktig og desinfiseres med 70% etylalkohol før og etter bruk.
  2. Tilbered 4 mg kollagenase type I i 2 ml av spinner minimum essensielt ørnemedium (S-MEM) supplert med 10% føtal bovint serum (FBS; endelig konsentrasjon på 2 mg / ml). Overfør oppløsningen til en 35 mm ikke-belagt plastplate og legg fatet i en inkubator ved 37 °C, 5% CO2.
    MERK: S-MEM er en modifisert MEM-formulering uten glutamin og Ca2+. Fraværet av Ca2+ på dette trinnet reduserer fiberkontraktur under enzymatisk fordøyelse og triturering.
  3. Tilsett 5 ml S-MEM supplert med 10% FBS i en 60 mm ikke-belagt plastplate og oppbevar i inkubatoren ved 37 ° C, 5% CO2.
  4. Avlive dyrene ved kvelning via CO2 etterfulgt av cervikal dislokasjon. For å redusere forurensning under primærcelleisolering, senk dyrekroppen i 70% etylalkohol i ~ 10 s. Fjern og tørk med absorberende papir og klipp føttene med en saks mellom ankelen og kneet (figur 3A).
  5. Pin ned den ene foten av dyret, med poten vendt oppover, med disseksjonspinner på den elastomerbelagte platen under et disseksjonsmikroskop ved 10x forstørrelse.
  6. Med disseksjonssaks og fin pinsett fjerner du huden fra poten for å eksponere muskelen flexor digitorum brevis (FDB) (figur 3B). For å forhindre tørrhet i vev, tilsett en dråpe S-MEM 10% FBS til muskelen ved hjelp av en 1000 μL pipette.
  7. På hælnivå snitter du senen og dissekerer FDB-muskelen forsiktig fra hæl til tå (figur 3B). Unngå spenning på muskelen så mye som mulig mens du utfører disseksjonen. For mye kraft påført vevet vil resultere i muskelfiberskader. Plasser muskelen umiddelbart i kollagenaseoppløsningen.
  8. Gjenta trinn 3,5-3,7 med den kontralaterale foten. Plasser dissekert muskel i kollagenaseoppløsningen i en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator i2 t 45 min til 3 t 15 min. Tilpass inkubasjonstiden avhengig av kollagenasens enzymatiske aktivitet og dyrets alder.
  9. Mens muskelvevet inkuberer, tilsett 300 μL kald MEM uten serum eller antibiotika i midten av en 35 mm glassbunnskål. Tilsett 2 mikrol kald laminin ved 1,20 mg/ml direkte til MEM. Gjenta prosessen for ønsket antall retter. Legg oppvasken i cellekulturinkubatoren ved 37 ° C, 5% CO2 i minst 1 time for å tillate lamininpolymerisasjon.
  10. Når den enzymatiske fordøyelsen er fullført, overfør muskelen til 60 mm cellekulturfat som inneholder S-MEM 10% FBS ved bruk av en stor boring (5 mm) brannpolert glass Pasteur-pipette og en latexpære.
  11. Bruk en mindre 2 mm brannpolert Pasteur-pipette og en latexpære til å triturere muskelen forsiktig under et disseksjonsmikroskop (figur 3C). Dissocierte muskelfibre bør begynne å løsne fra vevet og frigjøres i løsningen.
    MERK: Som en tommelfingerregel er mindre triturering (15-30 pipettepassasjer) alltid å foretrekke, da for mye forlenget triturering kan stresse eller til og med skade fibrene.
  12. Bruk en fin pinsett til å fjerne alt ikke-muskelvev, som nerver, sener eller blodårer (figur 3D).
  13. Tilsett 2 ml varm MEM 2% FBS til hver 35 mm lamininbelagt glassfatbunn. Bruk en 200 μL pipette og en steril plastpipettespiss til å overføre de dissosierte muskelfibrene til bunnfatet i 35 mm lamininbelagt glass (figur 3E).
    MERK: Å oppnå en lav fibertetthet og la fibrene være godt skilt fra hverandre er viktig for å forhindre fiberoverlapping.
  14. Plasser 35 mm glassbunnfat i inkubatoren ved 37 °C, 5% CO2. Fibre kan brukes i en tidsramme på 2-20 timer.

Figure 3
Figur 3; Muskel FDB fiber disseksjon og dissosiasjon. (A) Etter fotdisseksjon over ankelartikulasjonen (stiplet linje) fjernes huden under fotpoten, etter den stiplede linjen for å eksponere FDB-muskelen (B). Muskelen dissekeres og plasseres i kollagenaseoppløsning. (C) Etter inkubasjon tritureres muskelen for å dissosiere og oppnå individuelle muskelfibre. (D) Finpinsett brukes til å fjerne ikke-muskelvev og rusk før muskelfibre overføres til lamininbelagt glassbunnkulturskål. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Beskrivelse av anskaffelsesoppsett

MERK: Anskaffelsesoppsettet er sammenlignbart med det som er beskrevet før42 med modifikasjoner (figur 4A).

  1. Slå på alle komponentene: datamaskin, AD / DA-omformer og baneklemmeforsterker, mikroskop, motorisert stadium, manipulator (er), strømforsyning for fotodioden, lyskilde, lyslukker, pulsgenerator og protokollredigerer.
  2. Aktiver transistor-transistorlogikken (TTL) som utløser OUT-signalet fra AD/DA for å kontrollere pulsgeneratoren, lyslukkeren og protokollredigereren.
  3. Bruk TTL-utgangssignalet fra pulsgeneratoren og koble til en AD-kanal på forsterkeren for å verifisere presis temporal utløsning. Tilstrekkelig kontroll av utløsende konsistens bør evalueres nøye i forkant av forsøket for å sikre tilstrekkelig apparatsynkronisering.
    MERK: Når det gjelder CaV1.1, forvent å se maksimalt signal på mindre enn 4-10 ms etter stimulering (tid til å utvikle maksimal ladningsbevegelse5). Signalet er raskt og presist tidsoppløsning er avgjørende for å sammenligne med andre mål, for eksempel kalsiumtransient eller ladningsbevegelse målt via spenningsklemme.
  4. For å fokusere eksitasjonslyset i et bestemt område eller sted på fiberen (figur 4B), bruk en membran plassert i eksitasjonslysbanen. Dette muliggjør signalinnsamling bare i et område der EGFP-CaV1.1-signalet er maksimalt (figur 4B).

Figure 4
Figur 4: Beskrivelse av opptakssystemet . (A) Diagram som illustrerer forbindelsen mellom de forskjellige komponentene i opptakssystemet. Oppsettet består av et invertert mikroskop med et motorisert stadium, en lysdiode (LED) lyskilde, en lyslukker, en skreddersydd fotodiodebasert lysovervåkingskrets med en spor- og holdfunksjon43, en AD / DA-omformer (fra en patchklemmeforsterker), en analog pulsgenerator, en ekstern feltstimuleringsenhet koblet til feltstimuleringselektroder, motoriserte manipulatorer og kommersiell programvare for anskaffelse, synkronisering og generering av protokoller. Elektroden for feltstimulering er laget av to platinatråder sveiset til kobberkabler koblet til pulsgeneratoren via en BMC-kontakt. Spesifikke eksitasjons- og utslippsfiltre brukes til å oppdage både EGFP- og MTS-5-TAMRA-signaler. For å opphisse EGFP brukes en xenonlampe med et 488 nm (± 20 nm) eksitasjonsfilter (Ex) og et LP510 nm Em-filter. For MTS-5-TAMARA brukes en 530 nm LED-lyskilde og et LP550 nm Em-filter. (B) Utsikt over en fiber som uttrykker en EGFP-CaV1.1-cys konstruksjon med tofeltstimuleringselektrodene (svarte sirkler) orientert riktig (venstre) og feil (høyre) i fibrenes hovedakse (stiplet linje). Den svarte ufylte sirkelen representerer oppkjøpsområdet med en diameter styrt av membranåpningen, plassert foran lyskilden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Vurdering av EGFP-positiv fiberelektrisk aktivitet og cysteinfarging

MERK: Feltstimulering av skjelettmuskulatur utføres som beskrevet før41 med modifikasjoner. Denne tilnærmingen brukes til å (1) identifisere sunne, funksjonelle og elektrisk responsive fibre, (2) flekke fibrene med cysteinreaktivt fluorescerende fargestoff, og (3) registrere det fluorescerende signalet som svar på det forplantede handlingspotensialet. Hvert trinn i denne delen og den følgende bør utføres i et miljø med lite lys for å redusere fluorescerende fargebleking.

  1. Plasser 35 mm glassfat som inneholder dissosierte muskelfibre på mikroskopets scene. Fjern dyrkningsmediet forsiktig med en 1000 mikrol pipette og erstatt med 2 ml romtemperatur Ringers oppløsning (se tabell 1 for sammensetning). Flere runder med medieutskifting kan være nødvendig for å fjerne det opprinnelige cellekulturmediet som inneholder frie cysteiner.
  2. Bruk en mekanisk eller motorisert manipulator til å plassere de to platinatrådene vinkelrett på bunnen av fatet. Sørg for at elektrodeterminalene er justert i forhold til fiberens lengdeakse og noen få millimeter fra fiberens ender, og at separasjonen mellom elektrodene er 5 mm (figur 4B). Juster elektrodeplasseringen ytterligere ved enten å rotere parabolen eller montere hver elektrode på en uavhengig mikromanipulator (figur 4B).
  3. Slå på det overførte lyset og finn fibrene i synsfeltet ved hjelp av et 20x objektiv. Flytt EGFP-filterkuben inn i lysbanen.
    MERK: Ved hjelp av et mikroskop utstyrt med epifluorescens og et lavt forstørrelse (2x) mål, er det mulig å vurdere konstruksjonstransfeksjonseffektiviteten i hele muskelen før fiberdissosiasjon ved å vurdere EGFP-uttrykk (figur 5A).
  4. Bruk en fjernstyrt lyslukker til å aktivere eksitasjonslyset på 488 nm for å identifisere de EGFP-positive fibrene. Oppbevar fiber x-y-plasseringen på parabolen ved hjelp av et motorisert mikroskoptrinn. EGFP-signalet er ofte heterogent i fiberen (figur 4B). Sentrer den lagrede posisjonen til det lyseste EGFP-signalet.
  5. Etter å ha identifisert EGFP-positive fibre, gå tilbake til den første lagrede lokaliseringen. Ved hjelp av en manuell utløserbryter lever du to sekvensielle stimuleringspulser med en varighet på 1 ms og en amplitude på 20 V. Sett polariteten til pulser til vekslende.
  6. Etter stimuleringen, observer to konsentriske homogene fiberkontraksjoner som svar på de to pulser av motsatt polaritet. En lokal sammentrekning eller fravær av sammentrekning i responser på pulser av alternativ polaritet indikerer lokale ikke-forplantede passive responser eller unexcitabilty41. Ekskluder disse fibrene for resten av eksperimentet.
  7. Tilsett 2 μL 10 mM MTS-5-TAMRA-oppløsning direkte i parabolen og bland forsiktig med en 1000 μL pipette (10 μM endelig konsentrasjon). Pass på at du ikke flytter parabolen, ellers vil de lagrede fiberposisjonene gå tapt. Inkuber i 4-5 minutter for å tillate diffusjon av det fluorescerende tiolmolekylet i det tverrgående tubulisystemet lumen.
  8. Påfør bipolare repeterende stimuleringer for å fremkalle suksessive handlingspotensielle tog med en hastighet på 50 Hz i 300 ms hver 1 s i 5 minutter.
    MERK: Pulstogene gir tilgang til cysteinene som er satt inn i S4 i EGFP-CaV1.1 for å reagere med MTS-5-TAMRA. Fiberens evne til mekanisk å trekke seg sammen som respons på stimulering er viktig for at tverrgående tubuli lumeninnhold skal sykle med det ekstracellulære miljøet.
  9. Fjern fargeløsningen fra fatet med en 1,000 μL pipette og erstatt med 2 ml romtemperatur Ringers løsning. To eller tre runder kan være nødvendig for å fjerne ukonjugert MTS-5-TAMRA. La den fargede fiberen komme seg fra fargeprotokollen i minst 10 minutter.
  10. Som i trinn 5.6, revurder fiberhelsen og elektrisk aktivitet ved å observere symmetrisk fiberkontraksjon som respons på vekslende polaritet. Ekskluder fibre som ikke reagerer på begge stimuleringene fra resten av eksperimentet.
  11. Flytt MTS-5-TAMRA filterkuben inn i lysbanen. Bruk en fjernstyrt lyslukker til å aktivere 533 nm eksitasjonslyset for å bekrefte homogen MTS-5-TAMRA-farging på fibrene.
    MERK: Ved farging med MTS-5-TAMRA reagerer både konstruerte og endogene cysteiner med maleimidderivatet (figur 5B). Dermed er det vanskelig å evaluere riktig reaksjon med cystein av interesse. CaV1.1 uttrykkes hovedsakelig i tverrrøret, og danner et gjenkjennelig dobbeltbåndmønster. Ved hjelp av et konfokal- eller epifluorescensmikroskop kan et xy-bilde brukes til å bekrefte riktig farging og tverrgående tubuliinngang og diffusjon av MTS-5-TAMRA (figur 5C).

6. Signalinnsamling og behandling

MERK: Før fluorometriske målinger utføres, må signalinnsamlingen utformes nøye for å oppnå det optimale signal/støyforholdet. Langsommere prøvetakingshastigheter tillater mer lysdeteksjon samtidig som antall punkter som vil bli anskaffet under proteinkonformasjonell omorganisering. Når det gjelder EGFP-CaV1.1-cys, forekommer ladningsbevegelse indusert av en aksjonspotensiell bølgeform i ~ 1-10 ms37. For å oppnå flere punkter for å spore utviklingen av bevegelsen over tid, ble oppkjøpet satt til 50 μs per punkt.

  1. Plasser fiberen midt i synsfeltet med et riktig forstørrelsessystem. For disse eksperimentene ble det brukt et 60x olje 1.4 numerisk blenderåpning (NA) omvendt mål. Optimaliser belysningen og fiberposisjonen med det motoriserte trinnet og membranen for å belyse et sirkulært område av fiberens diameter, hvor EGFP-signalet er maksimalt (figur 4B).
  2. Når fiberen er plassert for oppkjøp, orienter de to uavhengig monterte feltstimulerende platinatrådene i hver ende av fiberen. Juster ledningene på fibrenes hovedakse i en rett linje og plasser dem 5 mm fra hverandre med fiberen i midten (figur 4B).
  3. Still inn eksitasjons- og utslippsfiltrene for innsamling til de riktige innstillingene for MTS-5-TAMRA. Start eksperimentet ved å utføre protokollen som er skrevet i anskaffelsesprogramvaren. Dette trinnet utløser alle nedstrømsenhetene (dvs. protokollredigerer, lyslukker, pulsgenerator).
    MERK: Denne protokollen tillater en kort periode (dvs. 10 ms) av baseline oppkjøp før levering av feltstimulus for å tillate påfølgende målinger av hvilende fluorescens.
  4. Start et enkelt eller et tog av handlingspotensialer med en 0,5 eller 1 ms, 20 V kvadratpuls. Minimer den totale anskaffelsestiden så mye som mulig for å unngå signalbleking.
    MERK: Selv om opptak i midten av fiberen, kan et bevegelsesrelatert fluorescenssignal oppstå og kan forveksles med det fluorescerende signalet på grunn av protein-fluoroforkonformasjonsendring (figur 5D). Det sammentrekningsinduserte signalet bør forsinkes i forhold til forventet tid for ladningsbevegelse etter stimulering37.
  5. For ytterligere å skille signalet som oppstår fra S4-bevegelser fra det på grunn av fiberkontraksjon, tilsett 1 μL 100 mM N-benzyl-p-toluensulfonamid (BTS; 50 μM endelig konsentrasjon) til opptaksløsningen for å minimere kontraktile responser og gjenta trinn 6.4. Signaler oppdaget for andre gang etter fiberfarmakologisk immobilisering tilsvarer molekylær bevegelse av den merkede S4-helixen (figur 5D).
    MERK: Ingen signaler skal oppdages i kontrollen EGFP-CaV1.1 uten konstruert cystein etter bevegelsesundertrykkelse med BTS.
  6. Bruk de samme innstillingene, skaff deg et lignende signal på et sted i parabolen der ingen muskelfiber eller rusk er til stede for å oppnå en verdi av bakgrunnsfluorescens.
  7. Importer filene som inneholder tidsforløpet til råfluorescensen [Fr(t)] fra fiber- og bakgrunnsfluorescensen [Fb(t)] til dataanalyseprogramvaren. Beregne gjennomsnittet av kolonnen som inneholder Fb(t), for å få en homogen Facebook-verdi. Trekk Fb fra Fr(t) for å oppnå de absolutte fluorescensverdiene [F(t)]. Glatt det resulterende signalet med en utjevningsfunksjon om nødvendig.
    MERK: Med dette deteksjonssystemet og oppkjøpsfrekvensen bestemte vi oss for å bruke en tilstøtende gjennomsnittsfunksjon med et vindu på 50 punkter for utjevning.
  8. Gjennomsnitt av baseline F(t)-verdiene i et tidsintervall på 10 ms før stimuleringen for å oppnå en hvilende fluorescensverdi (F0). Trekk F0 fra den glatte F (t) for å oppnå den absolutte endringen i fluorescens [ΔF (t)]. Deretter, for å uttrykke fluorescensendring over tid i forhold til hvilende fluorescens (ΔF / F0), del ΔF (t) med F0.
  9. For å evaluere omfanget av signalbleking, definer to punkter fra ΔF / F0 over tidssignal, før og etter stimuleringen og bort fra det fluorometriske signalet. Tilpass en lineær funksjon til disse to punktene for å få en grunnlinjesporing. Trekk grunnlinjen til ΔF/F0 over tid for å korrigere for signalbleking.
  10. Trekk fra tidskolonnen forsinkelsen mellom oppkjøpsinitiering og tilbakemeldingssignalet fra stimuleringen, for å ha t = 0 som tilsvarer starten av den elektriske stimulansen.
    MERK: For å tillate flere signalsammenligninger, er det ofte nødvendig å normalisere signalets amplitude. Ulike tilnærminger kan brukes avhengig av formålet med eksperimentet. I den følgende resultatdelen var vi interessert i signalkinetikk, så vi brukte en enkel metode som består av å normalisere hvert signal med den minimale nådde verdien (dvs. den negative toppen).

Figure 5
Figur 5: Avbildning av muskelfiber som uttrykker EGFP-CaV1.1-cys uten og med MTS-5-TAMRA-farging og representativ rå fluorometrisk rekord. (A) Eksempler på overførte (venstre) og fluorescerende (høyre) bilder av den dissekerte, ikke dissosierte muskelen som uttrykker en EGFP-CaV1.1 VSD-III-konstruksjon. Skala bar: 100 μm. (B) Representativt bilde av en muskelfiber som uttrykker en EGFP-CaV1.1 VSD-III-konstruksjon før (venstre) og etter (høyre) MTS-5-TAMRA-farging. Endogene cysteiner av ikke-transfekterte fibre er også farget av fargestoffet. Skala bar: 30 μm. (C) Konfokalbilde av en EGFP-Ca V 1.1 VSD-III-konstruksjon (venstre) og MTS-5-TAMRA-farging (høyre) viser et klassisk dobbeltbåndsmønster som er karakteristisk for CaV1.1-lokalisering på dettverrgående rørsystemet i muskelfiberen (nederst). Skalastang: 25 μm. (D) Representativt fluorometrisk opptak som respons på to stimuli og målt med en fotodiode før (blått spor) og etter (rødt spor) fiberimmobilisering med N-benzyl-p-toluensulfonamid (BTS). Den øverste svarte linjen indikerer protokollen for fiberdepolarisering via ekstern feltstimulering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når forplantning av aksjonspotensialer utløses som respons på repeterende feltstimulering, er det mulig å spore spesifikk spenningssensorbevegelse som svar på en bestemt depolariseringsfrekvens. Som vist i figur 6A, kan bevegelsen til VSD-II-merkede helikser spores som svar på hver av to påfølgende depolariseringer påført ved 10 Hz (dvs. fordelt på 100 ms). Signalbleking kan korrigeres ved å trekke baseline til sporet (figur 6B). Videre tidsforstørrelse på første og andre respons (figur 6C) muliggjør presis observasjon av disse raskt utviklende VSD-II heliksbevegelsene. Tidsmarkøren fra feltstimuleringsutløseren tillater relativ tidsmessig justering av første og andre respons med en presisjon på 10 μs. Begge signalene kan normaliseres med deres respektive minimumsverdi (dvs. minimumstopp) for å tillate en kinetisk sammenligning mellom de to responsene (figur 6D). Fra disse opptakene av relativ fluorescens kan det observeres at tiden til topp er sammenlignbar mellom suksessive depolariseringer for denne spenningssensoren.

Denne tilnærmingen kan brukes til å spore individuelle spenningssensorers bevegelse med forskjellige frekvenser av depolarisering og flere handlingspotensialer for å studere deres aktivering og forhold til ladningsbevegelse, kalsiumstrøm eller kalsiumtransienter, som kan studeres parallelt i et annet sett med fibre, som tidligere rapportert37.

Figure 6
Figur 6: Representativt fluorometrisk opptak fra EGFP-CaV1.1 VSD-II utløst av to påfølgende depolariseringer ved 10 Hz. (A) ΔF/F0 fluorometrisk signal i en fiber som uttrykker EGFP-Cav1.1 VSD-II stimulert to ganger ved 10 Hz og en baseline korreksjonskurve (lilla). Den øverste svarte linjen indikerer indusert depolarisering. (B) ΔF/F0 baseline korrigert signal av de to uavhengige responsene (C). Verdiene på tomten tilsvarer minimumsrekkevidden på toppen. (D) Signaljustering i forhold til depolarisering og normalisering ved deres respektive minimumstopp viser VSD-II domenebevegelse med sammenlignbar kinetikk for begge stimuli. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Reagenser Endelig konsentrasjon (mM) Molekulær vekt g/L
NaCl 150 58.44 8.766
KCl 4 74.55 0.298
CaCl2 2 110.9 0.222
MgCl2 1 95.22 0.095
D-glukose 5 180.2 0.901
HEPES 10 238.3 2.383
pH justert til 7,4 med 1 M NaOH

Tabell 1: Modifisert Ringers løsningssammensetning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskrives en trinnvis protokoll for å utføre FSDF i muskelfibre for studier av individuelle spenningssensorbevegelser fra CaV1.1-kanalen. Selv om antall trinn og mangfoldet av tilnærminger som kombineres i denne teknikken kan virke komplisert, er de fleste av disse teknikkene ofte rutinemessig brukt i biofysiker / cellebiolog laboratorier. Dermed ligger den tilsynelatende kompleksiteten hovedsakelig i kombinasjonen av alle de forskjellige tilnærmingene i en enkelt integrert teknikk. Ofte når du utfører en flertrinnsmetode, kan virkningen av små modifikasjoner utført i begynnelsen bare påvises senere i de følgende trinnene. Med strenghet i utviklingen av hvert trinn, og presise inklusjons- og eksklusjonskriterier, er det mulig å oppnå flere opptak fra samme preparat eller til og med samme fiber.

Tilnærmingene beskrevet her kan tilpasses andre celletyper, inkludert hjerteceller og nevroner. I tillegg kan forskjellige deteksjonssystemer, for eksempel høyhastighetskameraer, brukes. For tiden er bruken av spenningsklemme (patchklemme eller to-elektrode spenningsklemme) begrenset på grunn av det ekstra kompleksitetsnivået som er iboende for disse teknikkene44. Forbedringer av metoden som presenteres her (for eksempel lysere og mer fotostabile sonder) vil lette samtidig bruk av FSDF med spenningsklemmemetoder.

Feltstimulering i innfødte dissosierte skjelettmuskelfibre har fordelen av å ha en høyere gjennomstrømning enn spenningsklemme og kan brukes til studier av andre signaler, for eksempel aksjonspotensialforplantning45 eller aksjonspotensialfremkalte kalsiumtransienter41.

Den største fordelen med denne innfødte cellen FSDF sammenlignet med det heterologe ekspresjonssystemet er evnen til å oppdage proteinkonformasjonsendringer som respons på indusert depolarisering i sitt fysiologiske miljø og ved dets endogene stimulus. Det er spesielt relevant for studiet av CaV1.1, som fungerer som spenningssensor for en annen kalsiumkanal, ryanodinreseptor type 1 (RyR1), satt inn i det distinkte sarkoplasmatiske retikulummembrandomenet 5,33,35. I praksis kan det være mulig å studere samtidig måling av fluorescerende signaler fra en spenningssensor med kalsiumfrigjøring fra sarkoplasmatisk retikulum ved hjelp av en egnet kalsiumfluorescerende indikator. Dessuten, siden det har vist seg at mange proteiner fra det triadiske miljøet kan påvirke CaV1.1 på 46,47,48,49,50, er studien av spenningssensorbevegelsen i en muskelfiber av høy fysiologisk relevans. To store ulemper ved tilnærmingen er: 1) liten amplitude av de målte signalene, og 2) fotobleking, som utelukker bruk av repeterende og / eller langvarige stimuli. Forbedringer av denne teknikken er nødvendig og vil tillate å kombinere FSDF med spenningsklemmeeksperimenter i voksne muskelfibre.

Anvendelsen av FSDF til andre kanaler (eller reseptorer) i muskelfibre er mulig, forutsatt at: (1) de uttrykkes på et tilstrekkelig nivå, (2) de er tilgjengelige (fra ekstracellulært eller intracellulært rom), og (3) cysteinmodifikasjonen via mutagenese svekker ikke kanalfunksjonen. Den komplementære bruken av FSDF i både heterologe og innfødte muskelfibre er nødvendig og vil være kritisk for å ta opp ubesvarte spørsmål angående spenningsavhengige CaV1.1-overganger som er kritiske for muskelfunksjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Dr. J. Vergara (University of California, Los Angeles) for å dele EGFP-CaV1.1 (kanin) villtype plasmid. Vi takker Yale Department of Physiology Electronics Laboratory og spesielt Henrik Abildgaard for design og konstruksjon av fotodioden med track and hold-krets. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd R01-AR075726 og R01-NS103777

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase SIGMA ALDRICH H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube Millipore Sigma EP022363719-500EA
1 mL syringe Millipore Sigma Z683531-100EA tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe Becton Dikinson 324702
35 mm non coated plastic plate Falcon, Corning 353001
60 mm non coated plastic plate Falcon, Corning 351007
Alcoholic whip PDI B60307
Alexa-533 cube LP Chroma 49907 Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp Sutter Instrumets LB-LS 672
Artificial tears cream Akorn NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" VWR 14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) SIGMA ALDRICH 203895
collagenase type I SIGMA ALDRICH C0130-1g
Cotton tip VWR VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation) BTX harvard apparatus 45-0120 10mm 2 needle array tips
EGFP cube Chroma 39002AT Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device BTX harvard apparatus ECM 830
EPC10 HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience) 895000
FBS Biotechne,  R&D Systems RND-S11150H Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish MatTek Life Science P35G-1.5-14-C
Isoflurane Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation 502017-250ml
Isothermal heating pad Braintree scientific inc 39DP
Laminin Thermo Fisher INV-23017015 Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb VWR 82024-554
LED 530 nm Sutter Instrumets 5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter Pall FG4579 acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM Invitrogen INV-11380037
MTS-5-TAMRA Biotium 89410-784 MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software OriginLab Corporation OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode Custom Made NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17 Olympus BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis SIGMA 267228-1G To manufacture field stimulation electrode
Pulse Generator WPI Pulsemaster A300
Shutter drive controller Uniblitz 100-2B
Shuttter Uniblitz VS2582T0-100
S-MEM Invitrogen INV-11380037
Sterile bench pad VWR DSI-B1623
Sterile saline SIGMA ALDRICH S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit Dow Corning 1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia Parkland Scientific V3000PK
Voltage generator Custom Made NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Catterall, W. A., Wisedchaisri, G., Zheng, N. The chemical basis for electrical signaling. Nature Chemical Biology. 13 (5), 455-463 (2017).
  2. Armstrong, C. M., Hille, B. Voltage-gated ion channels and electrical excitability. Neuron. 20 (3), 371-380 (1998).
  3. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  4. Armstrong, C. M., Bezanilla, F. Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels. Nature. 242 (5398), 459-461 (1973).
  5. Schneider, M. F., Chandler, W. K. Voltage dependent charge movement of skeletal muscle: a possible step in excitation-contraction coupling. Nature. 242 (5395), 244-246 (1973).
  6. Bezanilla, F. Gating currents. The Journal of General Physiology. 150 (7), 911-932 (2018).
  7. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiological Reviews. 80 (2), 555-592 (2000).
  8. Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
  9. Akabas, M. H. Cysteine modification: probing channel structure, function and conformational change. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 25-54 (2015).
  10. Priest, M., Bezanilla, F. Functional site-directed fluorometry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 55-76 (2015).
  11. Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
  12. Pantazis, A., Savalli, N., Sigg, D., Neely, A., Olcese, R. Functional heterogeneity of the four voltage sensors of a human L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 18381-18386 (2014).
  13. Savalli, N., Kondratiev, A., Toro, L., Olcese, R. Voltage-dependent conformational changes in human Ca(2+)- and voltage-activated K(+) channel, revealed by voltage-clamp fluorometry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (33), 12619-12624 (2006).
  14. Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
  15. Bannister, J. P. A., Chanda, B., Bezanilla, F., Papazian, D. M. Optical detection of rate-determining ion-modulated conformational changes of the ether-à-go-go K+ channel voltage sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (51), 18718-18723 (2005).
  16. Bruening-Wright, A., Elinder, F., Larsson, H. P. Kinetic relationship between the voltage sensor and the activation gate in spHCN channels. The Journal of General Physiology. 130 (1), 71-81 (2007).
  17. Osteen, J. D., et al. KCNE1 alters the voltage sensor movements necessary to open the KCNQ1 channel gate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22710-22715 (2010).
  18. Smith, P. L., Yellen, G. Fast and slow voltage sensor movements in HERG potassium channels. The Journal of General Physiology. 119 (3), 275-293 (2002).
  19. Gonzalez, C., Koch, H. P., Drum, B. M., Larsson, H. P. Strong cooperativity between subunits in voltage-gated proton channels. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 51-56 (2010).
  20. Gandhi, C. S., Olcese, R. The voltage-clamp fluorometry technique. Methods in Molecular Biology. 491, 213-231 (2008).
  21. Horne, A. J., Fedida, D. Use of voltage clamp fluorimetry in understanding potassium channel gating: a review of Shaker fluorescence data. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 87 (6), 411-418 (2009).
  22. Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
  23. Cowgill, J., Chanda, B. The contribution of voltage clamp fluorometry to the understanding of channel and transporter mechanisms. The Journal of General Physiology. 151 (10), 1163-1172 (2019).
  24. Catterall, W. A., Lenaeus, M. J., Gamal El-Din, T. M. Structure and pharmacology of voltage-gated sodium and calcium channels. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 60, 133-154 (2020).
  25. MacKinnon, R. Determination of the subunit stoichiometry of a voltage-activated potassium channel. Nature. 350 (6315), 232-235 (1991).
  26. Wu, J., et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Ca(v)1.1 at 3.6 Å resolution. Nature. 537 (7619), 191-196 (2016).
  27. Capes, D. L., Goldschen-Ohm, M. P., Arcisio-Miranda, M., Bezanilla, F., Chanda, B. Domain IV voltage-sensor movement is both sufficient and rate limiting for fast inactivation in sodium channels. The Journal of General Physiology. 142 (2), 101-112 (2013).
  28. Cha, A., Ruben, P. C., George, A. L., Fujimoto, E., Bezanilla, F. Voltage sensors in domains III and IV, but not I and II, are immobilized by Na+ channel fast inactivation. Neuron. 22 (1), 73-87 (1999).
  29. Muroi, Y., Arcisio-Miranda, M., Chowdhury, S., Chanda, B. Molecular determinants of coupling between the domain III voltage sensor and pore of a sodium channel. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (2), 230-237 (2010).
  30. Savalli, N., et al. The distinct role of the four voltage sensors of the skeletal CaV1.1 channel in voltage-dependent activation. The Journal of General Physiology. 153 (11), e202112915 (2021).
  31. Muller, C. S., et al. Quantitative proteomics of the Cav2 channel nano-environments in the mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (34), 14950-14957 (2010).
  32. Perni, S., Lavorato, M., Beam, K. G. De novo reconstitution reveals the proteins required for skeletal muscle voltage-induced Ca2+ release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (52), 13822-13827 (2017).
  33. Beam, K. G., Horowicz, P. Excitation-Contraction Coupling in Skeletal Muscle. , McGraw-Hill. New York. (2004).
  34. Schneider, M. F., Hernandez-Ochoa, E. O. Muscle: Fundamental Biology and Mechanisms of Disease. , Academic Press, Elsevier. 811-822 (2012).
  35. Rios, E., Pizarro, G. Voltage sensor of excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Physiological Reviews. 71 (3), 849-908 (1991).
  36. Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage sensing mechanism in skeletal muscle excitation-contraction coupling: coming of age or midlife crisis. Skeletal Muscle. 8 (1), 22 (2018).
  37. Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of CaV1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (40), e2026116118 (2021).
  38. DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1520 (2009).
  39. Blunck, R., Starace, D. M., Correa, A. M., Bezanilla, F. Detecting rearrangements of shaker and NaChBac in real-time with fluorescence spectroscopy in patch-clamped mammalian cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3966-3980 (2004).
  40. Liu, Y., Carroll, S. L., Klein, M. G., Schneider, M. F. Calcium transients and calcium homeostasis in adult mouse fast-twitch skeletal muscle fibers in culture. The American Journal of Physiology. 272 (6), C1919-C1927 (1997).
  41. Hernandez-Ochoa, E. O., Vanegas, C., Iyer, S. R., Lovering, R. M., Schneider, M. F. Alternating bipolar field stimulation identifies muscle fibers with defective excitability but maintained local Ca(2+) signals and contraction. Skeletal Muscle. 6, 6 (2016).
  42. Klein, M. G., Simon, B. J., Szucs, G., Schneider, M. F. Simultaneous recording of calcium transients in skeletal muscle using high- and low-affinity calcium indicators. Biophysical Journal. 53 (6), 971-988 (1988).
  43. Irving, M., Maylie, J., Sizto, N. L., Chandler, W. K. Intrinsic optical and passive electrical properties of cut frog twitch fibers. The Journal of General Physiology. 89 (1), 1-40 (1987).
  44. Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage clamp methods for the study of membrane currents and SR Ca(2+) release in adult skeletal muscle fibres. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 108 (3), 98-118 (2012).
  45. Banks, Q., et al. Optical recording of action potential initiation and propagation in mouse skeletal muscle fibers. Biophysical Journal. 115 (11), 2127-2140 (2018).
  46. Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap II: more recent advances in skeletal muscle excitation-contraction coupling. The Journal of Experimental Biology. 219, 175-182 (2016).
  47. Bannister, R. A., Beam, K. G. Ca(V)1.1: The atypical prototypical voltage-gated Ca2+ channel. Biochimica et Biophysica Acta. 1828 (7), 1587-1597 (2013).
  48. Beard, N. A., Wei, L., Dulhunty, A. F. Ca(2+) signaling in striated muscle: the elusive roles of triadin, junctin, and calsequestrin. European Biophysics Journal. 39 (1), 27-36 (2009).
  49. Polster, A., Perni, S., Bichraoui, H., Beam, K. G. Stac adaptor proteins regulate trafficking and function of muscle and neuronal L-type Ca2+ channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 602-606 (2015).
  50. Perni, S. The builders of the junction: roles of Junctophilin1 and Junctophilin2 in the assembly of the sarcoplasmic reticulum-plasma membrane junctions in striated muscle. Biomolecules. 12 (1), 109 (2022).

Tags

Biologi utgave 196
Funksjonell stedsrettet fluorometri i innfødte celler for å studere skjelettmuskulaturspenning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bibollet, H., Bennett, D. F.,… More

Bibollet, H., Bennett, D. F., Schneider, M. F., Hernández-Ochoa, E. O. Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability. J. Vis. Exp. (196), e65311, doi:10.3791/65311 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter