Integreret fotoakustisk, ultralyd og angiografisk tomografi (PAUSAT) til ikke-invasiv helhjernebilleddannelse af iskæmisk slagtilfælde

Summary

Dette arbejde demonstrerer brugen af en multimodal ultralydsbaseret billeddannelsesplatform til ikke-invasiv billeddannelse af iskæmisk slagtilfælde. Dette system muliggør kvantificering af iltning af blodet gennem fotoakustisk billeddannelse og nedsat perfusion i hjernen gennem akustisk angiografi.

Abstract

Præsenteret her er en eksperimentel iskæmisk slagtilfælde undersøgelse ved hjælp af vores nyudviklede noninvasive billeddannelsessystem, der integrerer tre akustisk baserede billeddannelsesteknologier: fotoakustisk, ultralyd og angiografisk tomografi (PAUSAT). Kombination af disse tre modaliteter hjælper med at erhverve multispektral fotoakustisk tomografi (PAT) af hjernens blodiltning, højfrekvent ultralydsbilleddannelse af hjernevævet og akustisk angiografi af cerebral blodperfusion. Den multimodale billeddannelsesplatform gør det muligt at studere cerebral perfusion og iltningsændringer i hele musehjernen efter slagtilfælde. To almindeligt anvendte iskæmiske slagtilfælde modeller blev evalueret: den permanente midterste cerebrale arterieokklusion (pMCAO) model og den fototrombotiske (PT) model. PAUSAT blev brugt til at afbilde de samme musehjerner før og efter et slagtilfælde og kvantitativt analysere begge slagtilfældemodeller. Dette billeddannelsessystem var i stand til tydeligt at vise hjernens vaskulære ændringer efter iskæmisk slagtilfælde, herunder signifikant reduceret blodperfusion og iltning i slagtilfældeinfarktområdet (ipsilateralt) sammenlignet med det uskadte væv (kontralateralt). Resultaterne blev bekræftet af både laser speckle kontrast billeddannelse og triphenyltetrazolium chlorid (TTC) farvning. Desuden blev slaginfarktvolumen i begge slagmodeller målt og valideret ved TTC-farvning som grundsandheden. Gennem denne undersøgelse har vi vist, at PAUSAT kan være et kraftfuldt værktøj i ikke-invasive og langsgående prækliniske studier af iskæmisk slagtilfælde.

Introduction

Blod transporterer ilt (via hæmoglobinproteinet) og andre vigtige næringsstoffer til væv i vores kroppe. Når blodstrømmen gennem væv afbrydes (iskæmi), kan der opstå alvorlig skade på vævene, hvis mest umiddelbare virkninger skyldes mangel på ilt (hypoxi). Iskæmisk slagtilfælde er resultatet af afbrudt blodgennemstrømning til en bestemt region af hjernen. Hjerneskaden som følge af et iskæmisk slagtilfælde kan forekomme inden for få minutter efter en karblokering og kan ofte have invaliderende og varige virkninger ^1,2. En meget værdifuld strategi til at evaluere fysiopatologien efter iskæmisk slagtilfælde og identificere og teste nye behandlinger er brugen af smådyrsmodeller i laboratoriet. Behandlinger opdaget i laboratoriet sigter mod at blive oversat til klinisk brug og forbedre patienternes liv. Imidlertid skal brugen af dyr i biomedicinsk forskning evalueres nøje i henhold til Russell og Burchs 3R-principper: udskiftning, reduktion og forfining³. Formålet med reduktionskomponenten er at reducere antallet af dyr uden at gå på kompromis med dataindsamlingen. Med dette i tankerne giver det at være i stand til i længderetningen at evaluere læsionsudviklingen via ikke-invasiv billeddannelse en stor fordel ved at reducere antallet af krævede dyr samt maksimere informationen opnået fra hvert dyr⁴.

Fotoakustisk tomografi (PAT) er en hybrid billeddannelsesmodalitet, der kombinerer optisk absorptionskontrast med ultralydsbilleddannelse^{rumlig opløsning 5}. Billeddannelsesmekanismen for PAT er som følger. En excitationslaserpuls lyser på målet, der afbildes. Forudsat at målet absorberer lys ved excitationslaserens bølgelængde, vil det stige i temperatur. Denne hurtige temperaturstigning resulterer i en termoelastisk udvidelse af målet. Udvidelsen får en ultralydbølge til at sprede sig ud fra målet. Ved at detektere ultralydbølgen på mange positioner kan den tid, der kræves for bølgen at forplante sig fra målet til detektorerne, bruges til at skabe et billede gennem en rekonstruktionsalgoritme. PAT's evne til at detektere optisk absorption i dybe vævsområder adskiller PAT fra ultralydsbilleddannelse, som registrerer grænser for forskellige akustiske impedanser af væv⁵. I de synlige og nær-infrarøde spektre er de primære stærkt absorberende biomolekyler, der er rigelige i organismer, hæmoglobin, lipider, melanin og vand⁷. Af særlig interesse i undersøgelsen af slagtilfælde er hæmoglobin. Da oxyhemoglobin og deoxyhemoglobin har forskellige optiske absorptionsspektre, kan PAT anvendes med flere excitationslaserbølgelængder for at bestemme den relative koncentration af proteinets to tilstande. Dette gør det muligt at kvantificere iltmætningen af hæmoglobin (_sO2) eller iltning i blodet i og uden for infarktområdet ^8,9. Dette er en vigtig foranstaltning i iskæmisk slagtilfælde, da det kan indikere niveauet af ilt i det beskadigede hjernevæv efter iskæmi.

Akustisk angiografi (AA) er en kontrastforstærket ultralydsbilleddannelsesmetode, der er særlig nyttig til billeddannelse af vaskulaturens morfologi in vivo¹⁰. Metoden er afhængig af brugen af en wobblertransducer med dobbelt element (et lavfrekvent element og et højfrekvent element) i forbindelse med mikrobobler injiceret i billeddannelsesemnets kredsløbssystem. Transducerens lavfrekvente element bruges til transmission ved mikroboblernes resonansfrekvens (f.eks. 2 MHz), mens højfrekvenselementet bruges til at modtage mikroboblernes superharmoniske signaler (f.eks. 26 MHz). Når de exciteres ved en resonansfrekvens, har mikroboblerne et stærkt ikke-lineært respons, hvilket resulterer i produktion af superharmoniske signaler, der omgivende kropsvæv ikke producerer¹¹. Ved at modtage med et højfrekvent element sikrer dette, at kun mikroboblesignalerne detekteres. Da mikroboblerne er begrænset til blodkarrene, er resultatet et angiografisk billede af blodkarmorfologi. AA er en kraftfuld metode til billeddannelse af iskæmisk slagtilfælde, da mikroboblerne, der strømmer gennem kredsløbssystemet, ikke er i stand til at strømme gennem blokerede kar. Dette gør det muligt for AA at detektere områder i hjernen, der ikke er perfuserede på grund af iskæmisk slagtilfælde, hvilket indikerer infarktområdet.

Præklinisk iskæmisk slagtilfælde forskning generelt er afhængig af brugen af histologi og adfærdsmæssige test for at vurdere placeringen og sværhedsgraden af slagtilfælde. Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) farvning er en almindelig histologisk analyse, der anvendes til at bestemme slaginfarktvolumenet. Det kan dog kun bruges ved et endepunkt, da det kræver, at dyret aflives¹². Adfærdstest kan bruges til at bestemme nedsat motorfunktion på flere tidspunkter, men de kan ikke give kvantitative anatomiske eller fysiologiske værdier¹³. Biomedicinsk billeddannelse giver en mere kvantitativ tilgang til at studere virkningerne af iskæmisk slagtilfælde ikke-invasivt og langsgående 9,14,15. Imidlertid kan eksisterende billeddannelsesteknologier (såsom magnetisk resonansbilleddannelse [MRI]) til små dyr komme til en høj pris, være ude af stand til at levere samtidig strukturel og funktionel information eller have begrænset penetrationsdybde (som de fleste optiske billeddannelsesteknikker).

Her kombinerer vi fotoakustisk, ultralyd og angiografisk tomografi (PAUSAT; se systemdiagram i figur 1), som giver mulighed for komplementær strukturel og funktionel information om blodperfusion og iltning efter iskæmisk slagtilfælde¹⁶. Dette er to vigtige aspekter ved vurderingen af skadens alvor og overvågningen af helbredelsen eller responsen på behandlingerne. Brug af disse integrerede billeddannelsesmetoder kan øge mængden af information opnået af hvert dyr, reducere antallet af dyr, der kræves, og give mere information i undersøgelsen af potentielle behandlinger for iskæmisk slagtilfælde.

Figur 1: PAUSAT diagram . (A) Komplet skematisk oversigt over PAUSAT systemet, herunder laser og OPO, der anvendes til PAT. (B) Indvendig visning af PAUSAT systemet, herunder to ultralydstransducere. Dual-element wobblertransduceren bruges til både B-mode ultralyd og AA, og lineær array-transduceren bruges til PAT. Begge transducere er monteret på det samme 2D-motoriserede trin, hvilket gør det muligt at scanne for at generere volumetriske data. Dette tal er ændret fra¹⁶. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Duke University Medical Center Animal Care and Use Committee og blev udført i overensstemmelse med United States Public Health Service's Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals. C57BL/6J-han- og hunmus (se materialetabel) blev anvendt til disse undersøgelser. Mindst tre dyr blev afbildet pr. Stroke modelgruppe. Se figur 2 for den arbejdsgang, der følges i denne protokol.

Figur 2: Resumé af den eksperimentelle procedure for PAUSAT billeddannelse anvendt på slagtilfælde. Oprettet med Biorender.com. Figuren viser arbejdsgangen for billeddannelsesproceduren startende fra (A) de to hovedslagmodeller (pMCAO og PT-slagtilfælde). B) Der skal foretages en retroorbital injektion af mikroboblerne, inden dyret anbringes på PAUSAT membranen. (C) En maske, der giver kontinuerlig bedøvelse og en varmepude for at holde dyrets kropstemperatur stabil, er påkrævet i denne opsætning. Dyrets krop placeres på varmepuden, mens hovedet hviler på systemets membran. (D) Rækkefølgen af billedoptagelse vises også i figuren. (E) TTC-farvning udføres for at validere vores resultater i denne undersøgelse. DPI: dage efter skade. Klik her for at se en større version af denne figur.

1. Inducering af slagmusmodellen

1. Permanent midterste cerebral arterieokklusion (pMCAO) med fælles carotisarterie (CCA) ligation.
   BEMÆRK: Udfør kort permanent ligering af højre CCA og posterior elektrokauterisering af højre midterste cerebrale arterie (MCA)¹⁷. Denne procedure begrænser cerebral blodgennemstrømning i højre cortex i hjernen, hvilket forårsager et iskæmisk slagtilfælde¹⁸.
   1. Inducer anæstesi i et induktionskammer ved hjælp af en inhalationsblanding af 5,0% isofluran i 30% O2/70%_N2 indtil bevidsthedstab (anerkendt som et tab af pedalrefleksen).
   2. Intubere dyret ved hjælp af et 20 G kateter (materialebord) og tilslut det til en automatisk ventilator. Indstil strømningshastigheden baseret på dyrets kropsvægt og hold dyret bedøvet ved hjælp af 1,5% -2,0% isofluran i 30% O 2/70% N₂.
   3. Ved hjælp af en varmelampe og en rektalsonde, der er tilsluttet en temperaturregulator, holdes dyrets kropstemperatur på 37 °C.
   4. Sæt en dråbe smøremiddel øjensalve på musens øjne.
   5. Placer dyret i liggende stilling og fjern håret fra nakkeområdet ved hjælp af en hårtrimmer.
   6. Rens hudområdet ved først at bruge en vatpind med povidon-jod og derefter bruge en steril pude med 70% ethanol. Udfør dette tre gange.
   7. Kontroller dybden af anæstesi og fraværet af smerte ved let at klemme dyrets bageste pote.
   8. Lav et 0,8 cm sagittal snit på halsens midterlinje og udsæt den rigtige CCA.
   9. Forbered en sutur til CCA-ligationen ved at adskille en 4-0 silkesutur i tyndere tråde, der komponerer hovedtråden. Brug en længde på 1,5 cm af en af undertrådene til permanent at ligere CCA'en.
      BEMÆRK: Når knuden er strammet, fjernes overskydende gevind ved at skære forlængelsen i en afstand af 1-2 mm til knuden.
   10. Påfør en dråbe bupivacain, før du lukker såret.
   11. Luk snittet ved hjælp af afbrudte 4-0 silkekirurgiske suturer og påfør tredobbelt antibiotikasalve på overfladen for at forhindre infektion.
   12. Flyt musen for at udsætte højre laterale side af dyrets krop.
   13. Fjern håret i området mellem øret og øjenområdet ved hjælp af en hårtrimmer.
   14. Desinficer det kirurgiske område ved hjælp af en vatpind med povidon-jod, efterfulgt af en steril pude med 70% ethanol. Gentag dette trin tre gange.
   15. Placer et sterilt drapering for at sikre det kirurgiske område. Lav derefter et 0,5 cm snit mellem dyrets højre øje og øre, og udsæt leddet mellem kraniet og den tidlige muskel.
   16. Brug en cautery loop, cauterize musklen for at adskille den fra kraniet og udsætte området af MCA.
   17. Bor et 0,2 mm² vindue for at udsætte MCA ved hjælp af en elektrisk boremaskine, og brug elektrokauteri på MCA for at blokere blodgennemstrømningen.
       BEMÆRK: En enkelt puls ved 80% effektintensitet er nok til at cauterize MCA.
   18. Brug en 1 ml sprøjte fastgjort til en 27G nål, påfør en dråbe bupivacain (Tabel over materialer) på det kirurgiske sted.
   19. Luk hudsnittet ved hjælp af afbrudte 6-0 klare monofilamentsuturer og påfør tredobbelt antibiotikasalve på overfladen for at forhindre infektion.
   20. Når operationen er afsluttet, overføres dyret til en rugemaskine med kontrolleret temperatur (32 °C), og dyret får lov til at komme sig.
   21. Efter 2 timer overføres dyret til sit hjemmebur og giver mad og vand ad libitum.
2. Fototrombotisk slagtilfælde (PT-slagtilfælde)
   BEMÆRK: Kort fortalt udføres PT-slagtilfælde ved at belyse Rose Bengal i karrene i hjernen. Rose Bengal administreres intraperitonealt, og når den er blevet godt fordelt i hele kroppen (5 min), lyser den af et grønt koldt lys, som aktiverer Rose Bengal til at generere reaktive iltarter (ROS). Disse ROS beskadiger membranen i endotelceller, skaber trombi i hele det oplyste område og fører til lokal cerebral blodgennemstrømningsforstyrrelse¹⁹.
   1. Inducer anæstesi i et induktionskammer ved hjælp af en inhalationsblanding af 5,0% isofluran i 30% O2/70%_N2 indtil bevidsthedstab (anerkendt som et tab af pedalrefleksen).
   2. Indstil dyret til en stereotaksisk ramme, og hold dyret bedøvet ved hjælp af en maske og 1,5% -2,0% isofluran i 30% O 2/70% N₂.
   3. Dyret holdes på 37 °C ved hjælp af et varmtvandsrecirkulerende varmelegeme og en rektalsonde til måling af dyrets kropstemperatur.
   4. Sæt en dråbe smøremiddel øjensalve på musens øjne.
   5. Barber dyrets hoved ved hjælp af en hårtrimmer.
   6. Rengør det barberede hovedbundsområde tre gange, først ved hjælp af en vatpind med povidon-jod og derefter ved hjælp af en steril pude med 70% ethanol.
   7. Kontroller fraværet af smerte ved let at klemme dyrets bageste pote.
   8. Lav et 1,4 cm sagittal snit på hovedbundens midterlinje ved hjælp af en skalpel og udsæt kraniet.
   9. Brug en skarp blyant til at markere 1,5 mm fra bregma mod højre side.
   10. Placer et cirkulært pinhole med en diameter på 2,5 mm centreret på 1,5 mm-mærket.
       BEMÆRK: En firkant, der indeholder et cirkulært pinhole, kan laves ved hjælp af dobbeltsidet sort tape og lave en åbning på 2,5 mm i diameter i midten ved hjælp af et enkelthulsværktøj af den nævnte størrelse.
   11. Placer det grønne kolde lys på det cirkulære pinhole, og hold afstanden mellem lyset og pinhole på et minimum.
   12. Dæk området med aluminiumsfolie for at undgå spredning af lyset.
   13. Når opsætningen er klar, injiceres dyret intraperitonealt med 10 mg/kg Rose Bengal (10 mg/ml i 1x fosfatbufret saltvand [PBS]) og vent i 5 min.
   14. Efter 5 minutter tændes den kolde lyskilde (intensitet: 4,25), og eksponeringen opretholdes i 15 minutter.
   15. Sluk derefter for det kolde lys og kontroller slagtilfældet enten med det blotte øje (området forventes at være hvidere end det omgivende område) eller ved hjælp af eksterne enheder til at måle cerebral blodgennemstrømning (for eksempel ved hjælp af laserspeckle kontrastbilleddannelse (Materialetabel; se trin 5.1).
   16. Brug en 1 ml sprøjte fastgjort til en 27G nål, påfør en dråbe bupivacain (Tabel over materialer) på det kirurgiske sted.
   17. Luk hudsnittet ved hjælp af afbrudte 6-0 klare monofilamentsuturer, og påfør tredobbelt antibiotikasalve på overfladen for at forhindre infektion.
   18. Når operationen er afsluttet, overføres dyret til en rugemaskine med kontrolleret temperatur (32 °C), og dyret får lov til at komme sig.
   19. Efter 2 timer overføres dyret til sit hjemmebur og giver mad og vand ad libitum.

2. Forberedelse af PAUSAT til billeddannelse

1. Tænd for 532 nm-laseren, og lad den være tændt i 15 minutter for at varme op.
2. Forbered billeddannelsesplatformen til det bedøvede dyr.
   1. Placer en tilpasset rampe (figur 2C), der er fastgjort til det manuelt justerbare trin (materialetabel) ved siden af billedmembranen.
   2. Fastgør en musetandholder med åndedrætsrøret forbundet til den tilpassede rampe, og fastgør en varmepude på rampens overflade.
3. Når laseren er varmet op, skal du kontrollere, at laserbanen og koblingen til fiberbundtet er godt justeret ved hjælp af et nær-infrarødt detektorkort (materialetabel) ved at placere kortet foran fiberbundtindgangen og sikre, at laserlyset kommer ind i bundtet.
   BEMÆRK: Juster eventuelle laserstispejle efter behov for at sikre, at laserindgangen er centreret med fiberbundtindgangen.

3. Klargøring af dyret til PAUSAT

BEMÆRK: PAUSAT udføres 1 dag efter PT-apopleksioperation eller 3 dage efter pMCAO-operation. Klargøring af PAUSAT til billeddannelse (trin 2) tager ca. 20 minutter og skal gøres umiddelbart før dyret klargøres til PAUSAT.

1. Inducer anæstesi i et induktionskammer ved hjælp af en inhalationsblanding af 5% isofluran blandet med 30% O2/70%_N2 indtil bevidsthedstab (anerkendt som et tab af pedalrefleksen).
2. Overfør dyret til en opvarmet platform med en tandholder og en maske, og hold bedøvelsen ved 1,5% -2,0% isofluran i 30% O 2/70% N_2.
3. Brug en varmelampe og en rektalsonde, der er tilsluttet en temperaturregulator, til at holde dyrets kropstemperatur på 37 °C.
4. Trim håret på toppen af dyrets hoved ved hjælp af en elektrisk barbermaskine. Inkluder regionen fra nær øjnene til bag ørerne.
5. Barber håret på toppen af dyrets hoved ved at anvende en kommerciel hårfjerningscreme for helt at fjerne de resterende korte hår. Lad det sidde på huden i 5-6 minutter, og tør derefter af med en vatpind duppet i vand for at hjælpe med at fjerne cremen helt. Gentag indtil huden er fri for hår.
   BEMÆRK: For billeddannelse 1 dag efter operationen kan disse trin udføres, før operationen påbegyndes; 1 dag efter PT-slagtilfælde kan de udelades. Når PAUSAT billedoptagelse udføres flere dage efter operationen, er dette trin kritisk påkrævet at blive udført.
6. Når dyret og systemet er klar til billeddannelse, og lige før dyret overføres til systemets platform, injiceres en 100 μL opløsning af mikrobobler ved stamkoncentrationen (materialetabellen) retroorbitalt ved hjælp af en 27 G nål.
   BEMÆRK: Når boblerne er i omløb i blodbanen, er der en begrænset tid til billede uden et betydeligt tab af signal (~ 10 min).
7. Sæt en dråbe øjenbeskyttelseslotion på musens øjne.
   BEMÆRK: Det anbefales ikke at anvende øjensmøremiddel, før retro-orbital injektionen udføres for at undgå, at fremmede stoffer når dyrets blodbanen. Derfor skal hårfjerningscreme udføres langsomt og omhyggeligt for at undgå at komme for tæt på øjnene (men nok til at afsløre det interesseområde, hvor slagtilfældet forventes). Hårcremefjerningen udføres med en vatpind, der tidligere er duppet i vand, hvilket forhindrer cremen i at dryppe, hvilket kan beskadige øjnene.

4. PAUSAT-billeddannelse

BEMÆRK: Dette gøres for at afbilde de kontra- og ipsi-laterale områder i hjernen efter slagtilfælde

1. Overfør musen til den integrerede PAUSAT (Table of Materials) billedplatform, og placer musen i liggende position på den tilpassede rampe (figur 2C).
2. Fyld billedbehandlingsvinduet med nok destilleret vand på overfladen til akustisk kobling.
   BEMÆRK: En valgfri rampe - printet ved hjælp af en 3D-printer - anbefales for at forhindre dyrets krop i at blive våd under billedoptagelsen og forbedre dyrets komfort. Det hjælper også med at opretholde en stabil kropstemperatur. Desuden kan rampen fastgøres til et manuelt trin (materialetabel) for at justere brændvidden af wobblertransduceren med to elementer i forhold til musehovedet. Den brugerdefinerede rampedesignfil er tilgængelig efter anmodning til forfatterne.
3. Fastgør musehovedet i tandholderen og sørg for korrekt anæstesi og luftstrøm.
4. Ved hjælp af en varmelampe og en rektalsonde, der er tilsluttet en temperaturregulator, holdes dyrets kropstemperatur på 37 °C.
5. Åbn billedbehandlingsprogrammet (materialefortegnelse), og naviger til ultralyd i B-tilstand.
6. Brug live ultralydsvinduet til manuelt at justere musehovedet til den ønskede position.
7. Brug det levende ultralydsvindue til at justere scenens højde, så transducerens brændvidde (19 mm) er omtrent midt i det område, der skal afbildes.
8. Billeddannelse med B-mode ultralyd
   1. Juster værdien af ultralydstransmissionsfrekvensen i B-tilstand (til disse undersøgelser skal du bruge 16 MHz).
   2. Indtast oplysningerne om gemte mapper i billedbehandlingsprogrammet.
   3. Brug den flydende boks til at vælge det ønskede område til B-mode scanning af hjernen.
   4. Tryk på knappen Hent statisk .
   5. Kontroller resultaterne af scanningen i applikationen, når billedoptagelsen er afsluttet for at sikre, at det ønskede område er blevet afbildet.
      BEMÆRK: Undgå unødvendige forsinkelser i B-mode billeddannelse erhvervelse for at sikre, at en høj nok koncentration af mikrobobler forbliver i blodbanen for AA.
9. Billedbehandling med AA
   1. Gå tilbage til Billedoptagelse.
   2. Skift til akustisk angiografi i billedbehandlingsprogrammet (Materialetabel).
   3. Indtast de ønskede scanningsprotokolparametre (hvoraf den vigtigste er rammeafstand og antallet af billeder pr. Position, som blev indstillet til henholdsvis 0, 2 mm og 10 for disse undersøgelser).
   4. Tryk på knappen Hent statisk .
      BEMÆRK: AA-optagelsen tager længere tid end B-mode ultralyd.
   5. Når scanningen er fuldført, skal du kontrollere resultaterne af scanningen under Billedanalyse for at sikre, at billedkvaliteten er som forventet.
      BEMÆRK: For AA-tilstand kan et mere repræsentativt helhjernevolumen opnås ved at gentage en anden scanning i en anden brændvidde inde i hjernen og senere kombinere billederne med korrekt efterbehandling (se figur 3).
10. Billeddannelse med fotoakustisk tomografi
    1. Åbn OPO-applikationen (optisk parametrisk oscillator) (materialetabel), og indstil den til 756 nm.
       BEMÆRK: OPO'er kan let komme ud af kalibrering, så før eksperimentet skal du sikre dig, at OPO'en kalibreres korrekt ved hjælp af et uafhængigt spektrometer.
    2. Oversæt manuelt linearray-transduceren til de tidligere bestemte koordinater for at sikre, at wobblervolumenerne og de lineære array-volumener automatisk registreres sammen.
       BEMÆRK: Det er afgørende, at et medregistreringseksperiment ved hjælp af et fantomgitter udføres på forhånd for at bestemme den nøjagtige afstand, der er nødvendig for at oversætte scenen, således at de resulterende data fra begge transducere registreres sammen i 3D.
    3. Åbn laserapplikationen, og tænd 532 nm-laseren.
    4. Ved hjælp af en lasereffektmåler måles laseroutputtets energi og sikres, at det er den ønskede energi (~ 10 mJ pr. Puls blev brugt til disse undersøgelser).
    5. Vælg de ønskede scanningsparametre for PAT (0,4 mm trinstørrelse, 20 mm scanningslængde og 10 billeder i gennemsnit pr. position).
    6. Åbn ultralydsdataindsamlingssystemet MATLAB-programmet (Materialefortegnelse), og tryk på knappen Kør .
    7. Hent PAT-scanningen ved at trykke på Start-knappen .
    8. Når scanningen er fuldført, skal du åbne MATLAB-gemmeprogrammet. Skift gemnavnet til det ønskede filnavn, og tryk på knappen Kør .
    9. Skift OPO-bølgelængden til 798 nm, og gentag trinene fra 4.10.3 til 4.10.8.
       BEMÆRK: Ved en longitudinel undersøgelse anbefales det at lade dyret komme sig ved at anbringe det i en inkubator og under observation i nogle få timer (følg trin 1.1.18 og 1.1.19). Hvis resultatvalidering ønskes, fortsættes til afsnit 5 umiddelbart efter PAUSAT billeddannelse.

5. Valgfrit: Validering af resultater

1. Laserspeckle kontrastbilleddannelse (LSCI).
   1. Bedøv dyret med 1,5% -2,0% isofluran i 30% O 2/70% N₂.
   2. Indstil dyret til en stereotaxisk ramme, og hold dyret bedøvet ved hjælp af en maske og ovennævnte inhalationsbedøvelse.
   3. Dyret holdes på 37 °C ved hjælp af et varmtvandsrecirkulerende varmelegeme og en rektalsonde til måling af dyrets kropstemperatur.
   4. Sæt en dråbe øjenbeskyttelseslotion på musens øjne.
   5. Kontroller fraværet af smerte ved let at klemme dyrets bageste pote.
   6. Fjern håret på dyrets hovedbund ved hjælp af en hårtrimmer.
   7. Desinficer det kirurgiske område ved hjælp af en vatpind med povidon-jod, efterfulgt af en steril pude med 70% ethanol. Gentag dette trin tre gange.
   8. Lav et 1,4 mm sagittal snit på hovedbundens midterlinje og udsæt kraniet. Brug tang til at holde hovedbunden og forhindre det i at optage det område af hjernen til at scanne.
   9. Påfør nogle dråber saltvand på kraniet og placer laserpletkontrastsystemenheden (materialetabel) over dyrets hoved.
   10. Under menuen Filer skal du indstille enheden i online-tilstand, der er indeholdt i undermenuen Arbejdstilstand.
   11. Vælg standardmappen til lagring af billeder i menuen Filer og undermenuen Gem indstillinger .
   12. I menuen Lyskilde skal du tilslutte styrelaseren ("Laser tændt") og det hvide lys ("Hvidt lys tændt") for at placere billedvinduet i den rigtige position.
   13. Vælg Forstørrelsesindstillinger i menuen Indstillinger, flyt markøren manuelt til 2,5, og tryk på Anvend og OK for at gemme indstillingerne.
   14. Juster fokus ved manuelt at flytte fokusbjælken i den øverste undermenu på hovedsiden.
   15. I menuen Indstilling skal du vælge Indstilling for pseudofarvetærskel, justere tærsklen efter behov og trykke på Anvend og OK for at gemme indstillingerne.
   16. I menuen Lyskilde skal du frakoble styrelaseren ("Laser slukket") og det hvide lys ("Hvidt lys slukket"), før du tager billedet.
   17. Tag billedet ved at vælge symbolet Afspil i den øverste undermenu på hovedsiden.
2. Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) farvning
   1. Bedøvelse af dyret dybt ved hjælp af 5% isofluran i 30% O2/70%_N2.
   2. Når dyret er holdt op med at trække vejret, skal du halshugge det ved hjælp af en skarp saks.
   3. Fjern al huden omkring hovedet og musklerne i nakkeområdet.
   4. Lav et sagittalt snit i den occipitale del af kraniet, indtil den når parietalbenet.
   5. Lav et vandret snit (~ 5 mm) i venstre og højre side under blodkarret. Fjern kraniets occipitale knogle ved hjælp af lige tang.
   6. Lav et snit (~ 5 mm) ved kraniets frontosale sutur.
   7. Lav et sagittalt snit (~ 10-15 mm) i midterlinjen af kraniet - mellem halvkugler - og sørg for, at de er helt adskilt.
   8. Brug størrelse #7 buet saks til at fjerne kraniets parietale venstre og højre knogler fra midten til siderne.
   9. Overfør hjernen til en beholder fyldt med 5 ml iskold 1x PBS og hold den på is i 10 min.
   10. Overfør hjernen til en hjernematrix i rustfrit stål (1 mm tykke sektioner).
   11. Sektion hjernen i 1 mm koronale sektioner ved hjælp af engangsbarberblade (Materialetabel).
   12. Hold knivene ved deres sider, overfør til en beholder fyldt med iskold 1x PBS.
   13. Adskil forsigtigt sektionerne fra knivene en efter en.
   14. Overfør hjerneskiverne til en petriskål med en diameter på 70 mm, der indeholder 5 ml 2% TTC (materialetabel, 3) i 1x PBS.
   15. Inkuber i 15 minutter i mørke ved stuetemperatur (R/T).
   16. Efter 15 minutter kasseres TTC'en, udskiftes med 3 ml formalin og inkuberes i mørke i mindst 30 minutter ved R/T.
   17. Til sidst overføres hjerneskiverne til en gennemsigtig plastfilm og prøverne scannes, herunder en lineal i scanningsbilledet som reference for fremtidige målinger.

Representative Results

Billeddannelse af blodkarmorfologi i hjernen
AA genererer blodkarmorfologibilleder ved at spændende mikrobobler i kredsløbssystemet ved deres resonansfrekvens og modtage mikroboblernes superharmoniske respons. Ved at bruge den tilpassede rampe (figur 2C), der er fastgjort til et manuelt justerbart trin, kan vi afbilde musehjernen med AA-tilstand i to forskellige brændvidder. Når dybere regioner målrettes, viser mere overfladiske regioner (såsom hjernebarken) en dårligere opløsning og signalstyrke (figur 3A) og omvendt (figur 3B). Men ved at erhverve to brændvidder og kombinere dem kan AA-billeder give information om et helt koronalt afsnit (figur 3C, D). Derudover kan PAUSAT ved at bruge det motoriserede trin til at scanne langs en tredje dimension registrere en række koronale billeder, der dækker interesseområdet (ROI), der er defineret af brugeren. Disse serier af billeder kan justeres og bruges til at visualisere en 3D-repræsentation af hele hjernen eller ROI defineret af brugeren. Imidlertid gives der også yderligere resultater, der viser, at andre kvantitative mål (såsom slagvolumen) kan analyseres ved hjælp af 3D-information fra kompilering af billeder erhvervet af PAUSAT her.

Anatomisk og funktionel evaluering før og efter iskæmisk slagtilfælde
For at illustrere PAUSAT-systemets potentiale i prækliniske studier studerede vi to grupper af dyr, der blev udsat for en af modellerne for iskæmisk slagtilfælde, der analyseres her: pMCAO eller PT-slagtilfælde. Disse to stregmodeller adskiller sig i de principper, hvormed den iskæmiske region oprettes. Kort sagt, i pMCAO-modellen er den midterste cerebrale arterie elektro-cauterized, hvilket stopper blodforsyningen fra denne arterie til hjernen. Denne skade udløser en sekundær skade, hvor omgivende væv bliver iskæmisk, hvilket forstørrer det område, der er ramt af slagtilfælde. Vi besluttede at afbilde pMCAO-slagtilfældehjernen på dag tre efter slagtilfældet, fordi dette er det tidspunkt, hvor det maksimale areal, der forventes at blive påvirket af slagtilfældet, opnås. I PT-slagtilfældet opnås det maksimale areal af væv, der er påvirket af slagtilfældet, imidlertid efter den første dag, så vi besluttede at afbilde PT-slagtilfælde på dag et efter slagtilfældet blev udført. Selvom vi valgte disse tidspunkter i vores undersøgelse, kan PAUSAT bruges til langsgående overvågning af slagtilfælde på ethvert ønsket tidspunkt.

Først blev der opnået en B-mode scanning for at sikre den korrekte position af dyrets hoved og identificere de rumlige grænser mellem kraniet og hjernen (figur 4A og figur 5A). Den mest forreste del af hjernen, der er afbildet, inkluderer kraniets frontosale sutur som referencepunkt. En ROI på 20 mm (forreste til bageste) x 17,15 mm (lateral), der dækker venstre (kontralateral; CL) og højre (ipsilateral; IL) halvkugler blev defineret i følgende undersøgelser for at lokalisere slagtilfældeområdet. AA-billeder gav information om blodkarstrukturerne ved at målrette signalet fra de cirkulerende mikrobobler. Vores resultater viser, at i den uskadte hjerne (baseline) har begge halvkugler en lignende fordeling af blodkar (figur 4B og figur 5B), som forventet i fravær af skade. Et lignende resultat observeres for fordelingen af vævets iltningskort baseret på PA-billeder opnået ved to forskellige bølgelængder (figur 4C og figur 5C). Vi besluttede at evaluere to forskellige bølgelængder baseret på den lokale maksimale optiske absorption for deoxygeneret hæmoglobin (756 nm) og bølgelængden, hvor det deoxygenerede og iltede hæmoglobin præsenterede lige optisk absorption (798 nm)²⁰. Ved at fange disse to tilstande af hæmoglobin kan vi nøjagtigt estimere vævets iltning (figur 4D og figur 5D).

Dagen efter at have erhvervet baselinebilledet fra hjernen, udførte vi operation på dyret (pMCAO eller PT slagtilfælde), som beskrevet i tidligere afsnit. Et nyt sæt billeder blev taget på et bestemt tidspunkt efter slagtilfældet (se figur 2A) for at evaluere stregens placering og størrelse. AA-billederne fra mus udsat for pMCAO viser en bemærkelsesværdig reduktion i intensiteten af signalet i højre laterale af cortex (figur 4B). Det samme område viser en reduktion i vævets iltningskort fra PA-billeder, hvilket tyder på et iskæmisk område (figur 4D). For at validere vores resultater besluttede vi at høste hjernen og udføre TTC-farvning umiddelbart efter at have erhvervet billederne fra slagtilfældedyret. Vores resultater viser, at det område, der er identificeret som slagtilfælde, er ens sammenlignet med vores resultater ved PAUSAT og den veletablerede TTC-farvning (figur 4B-E). Vi demonstrerer også her, at PAUSAT kan identificere slagtilfældeområder i hjernen ved hjælp af en anden model af slagtilfælde, PT-slagtilfælde, evalueret på et tidligere tidspunkt efter slagtilfældeinduktion (1 dag). Som vist i figur 5B var vi i stand til at identificere et område i den øverste del af cortex med en reduceret blodgennemstrømningsforsyning og et samtidig fald i iltmætning (figur 5D). Resultaterne opnået ved TTC-farvning matcher placeringen og størrelsen af slagtilfældet, der tidligere er identificeret af PAUSAT (figur 5B-E).

Alderen på musen, der afbildes, kan i høj grad påvirke billedkvaliteten. Musens kranium bliver tykkere med alderen, og da kraniet har en signifikant anderledes akustisk impedans i forhold til blødt væv, reflekteres en stor procentdel af ultralydbølgerne ved kraniegrænsen. Fordi disse integrerede billeddannelsessystemer alle er akustisk baserede, fører dette til et fald i billeddybden for ældre mus. Dette kan tydeligt ses i figur 6, hvor mus i tre forskellige aldre blev afbildet med AA under de samme betingelser. Lignende resultater med lavt signal forventes, hvis billeddannelsesproceduren ikke følges som tidligere beskrevet.

Kvantitativ analyse af slagvolumen af PAUSAT
Som beskrevet i ovennævnte resultater tager PAUSAT en række koronale billeder rettet mod et investeringsafkast beskrevet af brugeren. Vi analyserede slagvolumen ved at beregne slagområdet inden for de forskellige koronale billeder og afstanden mellem billederne. Slagvolumen beregnet af PAUSAT viser ingen statistisk forskel (p < 0,05) sammenlignet med slagvolumen beregnet ud fra en lignende tilgang ved hjælp af TTC-farvningsbilleder (figur 7).

Figur 3: Effekt af wobblertransducerens brændvidde på kvaliteten af AA-billeder. Billeder på flere brændvidder kan erhverves og senere kombineres for at producere de bedste billeddannelsesresultater for hele hjernen. (A) AA koronal sektion erhvervet ved en dybere brændvidde. (B) AA koronal sektion erhvervet ved en mere overfladisk brændvidde. (C) Resultat af sammensmeltning af dybere fokus (grøn) og mere overfladisk fokuserede (magenta) billeder. (D) Resultatet af at kombinere dybere fokus og mere overfladisk fokuserede billeder med en pixelskalaværdi, der kan sammenlignes med (A) og (B). Dette tal er ændret fra¹⁶. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Repræsentative PAUSAT resultater af en musehjerne # 1 før og efter pMCAO slagtilfælde . (A) Baseline og post-stroke B-mode ultralyd koronale billeder. (B) AA koronale billeder ved baseline og poststroke. C) Grundlinje- og posttaktsbilleder af PA koronal ved 756 nm excitation. (D) Iltmætningskort baseret på 756 nm og 798 nm excitationsbilleder. (E) TTC-farvede sektioner af en musehjerne, der viser det samme område af slagtilfælde. Afstanden mellem linjerne i bunden af billedet repræsenterer 1 mm. Dette tal er ændret fra¹⁶. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Repræsentative PAUSAT-resultater af en mus (# 2) før og efter PT-slagtilfælde. (A) Baseline og post-stroke B-mode ultralyd koronale billeder. (B) AA koronale billeder ved baseline og poststroke. C) Grundlinje- og posttaktsbilleder af PA koronal ved 756 nm excitation. (D) Iltmætningskort baseret på 756 nm og 798 nm excitationsbilleder. (E) TTC-farvede sektioner af en musehjerne, der viser det samme område af slagtilfælde. Afstanden mellem linjerne i bunden af billedet repræsenterer 1 mm. Dette tal er ændret fra¹⁶. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Effekt af musealder på kvaliteten af AA-billeder. Denne figur viser forskellen i AA-signalintensitet og billeddybde, når dyr fra forskellige aldre afbildes under sammenlignelige forhold. Som det ses i figuren, producerer ældre mus (18 måneder) billeddannelse billeder af lavere kvalitet på grund af kraniets størrelse og tykkelse sammenlignet med yngre mus (1,5 måneder), mens voksne mus viser et mellemliggende signal (6 måneder). På grund af den store akustiske impedans mismatch mellem kraniet og hjernevævet reflekteres og brydes ultralydbølger, der formerer sig gennem kraniet, hvilket fører til signaltab og opløsningsforringelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Analyse af volumenet af det iskæmiske slagtilfælde. (A) Eksempel på TTC-sektioner fra PT-streg og tilsvarende TTC-segmenterede billeder, AA-billeder og AA-segmenterede billeder på sammenlignelige koronale steder. (B) Slagvolumen beregnet ud fra TTC- og AA-billeder for pMCAO- og PT-slaglængde, der ikke viser signifikante forskelle (p > 0,05). Grafen viser middelværdien ± standardafvigelsen (S.D.) (n = 3 dyr pr. gruppe). Dette tal er ændret fra¹⁶. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Der er et par vitale aspekter af denne metode, der, hvis den gøres forkert, kan føre til betydeligt nedsat billedkvalitet og kvantitativ analyse. Det mest almindeligt forekommende resultat af brugerfejl i PAUSAT-billeder er enten mangel på signal eller meget lav signalstyrke, som begge kan forekomme af forskellige årsager. En sådan grund er et problem med den akustiske kobling. Store luftbobler i vandet, der omgiver musens hoved under billeddannelse, kan ofte blokere ultralydet fra at rejse til eller fra transduceren, hvilket forårsager et skyggeområde i det resulterende billede for alle tre modaliteter i systemet. Dette kan forhindres ved at sikre, at der er nok vand til stede mellem systemmembranen og prøven, der skal afbildes. Det kan også forekomme, at der mangler AA-signal, men et overraskende højt PA-signal, uafhængigt af de anvendte bølgelængder. Dette kan skyldes tilstedeværelsen af hår - især mørkt hår - der forstyrrer absorptionen af lyset. For at undgå dette er det nødvendigt at have barberet dyrets hoved tidligere, indtil intet hår er visuelt identificerbart.

Med hensyn til AA-billeder er et andet problem, der kan opstå og vil føre til manglende eller meget lavt signal, en lav koncentration af mikrobobler, der er til stede i kredsløbssystemet. Hvis mikroboblerne er for fortyndede, eller de blev injiceret forkert, vil det resulterende signal være meget svagt. Den retro-orbitale injektion må kun udføres af veluddannet personale. En anden årsag kan være en lang periode mellem mikrobobleinjektion og starten af billeddannelsen, hvilket kan føre til en reduktion af mikroboblerne i blodbanen. For at undgå dette anbefales det at forberede systemet til billeddannelse, før mikroboblerne injiceres, så dyret kan overføres til PAUSAT systemmembranen umiddelbart efter injektion. Det er værd at nævne, at alternative intravenøse ruter (såsom haleveneinjektion) også kan bruges, når dyret allerede er placeret på PAUSAT-systemmembranen, hvilket forkorter tiden mellem injektion og billeddannelse. For at opretholde den maksimale koncentration af mikrobobler anbefales det også at udføre AA-billeddannelse før PA-billeddannelsen.

PA-signalet kan også blive påvirket, hvis de nødvendige trin ikke udføres korrekt. Et af problemerne involverer kvaliteten af excitationslaseren. De to hovedkomponenter, der beskriver laserkilden, er pulsenergien og bølgelængden. Det anbefales stærkt at bruge en uafhængig effektmåler og spektrometer til at måle disse mængder og sikre, at de er indstillet til de ønskede værdier. Hvis der antages en forkert værdi, vil de funktionelle beregninger give vildledende resultater.

Det er også muligt, at når AA- og PA-billeder kombineres, er de ude af justering. Hovedårsagen til dette er, at koordinaterne mellem transducere ikke var nøjagtige. For at forhindre dette er det afgørende at udføre de nødvendige eksperimenter ved hjælp af et fantomgitter på forhånd for at bestemme de nøjagtige koordinater for en vellykket samregistrering af AA- og PA-billeder. En anden potentiel kilde til unøjagtighed skyldes forkert kalibrering af OPO. For at afbøde dette skal OPO'en kalibreres korrekt ved hjælp af et uafhængigt spektrometer.

Der er stadig betydelige forbedringer, især med hensyn til billedkvaliteten af PAT-komponenten i dette integrerede system. Det nuværende PAT-system er baseret på en lineær array-scanningskonfiguration. Vi er i stand til at observere store forskelle i iltningen af infarkt versus sunde områder af hjernen ved hjælp af flere slagmusemodeller, men den detaljerede vaskulatur (mikrokar) kan ikke ses. Der er to hovedproblemer, der bidrager til denne lave billedkvalitet. Det første er problemet med begrænset udsyn. For at skabe et rekonstrueret billede i fuld visning af en prøve i PAT skal detektoren helt omgive objektet (eller have en solid vinkel på 4π). Men i den eksperimentelle indstilling er dette vanskeligt. Dette giver anledning til det begrænsede synsproblem, hvilket fører til, at blodkar, der er ortogonale til transducerarrayet, ikke kan detekteres²¹. Der findes løsninger til at reducere virkningerne af problemet med begrænset visning i lineær array-PAT, hvoraf den mest lovende er brugen af mikrobobler som virtuelle punktkilder²². Det andet problem med lineær array-PAT er dårlig højdeopløsning og følsomhed på grund af det akustiske objektivs svage fokus. Imidlertid har brugen af enkeltspaltediffraktion i hardwaredesignet af et lineært array-system vist sig at skabe isotrop opløsning og følsomhed for lineær array PAT^23,24. Deep learning-tilgange har også vist sig delvist at løse både problemet med begrænset visning og den dårlige elevationsopløsning af lineær array PAT^25,26,27. Kombinationen af disse løsninger vil forbedre billedkvaliteten af PAT-komponenten i vores integrerede billedbehandlingssystem betydeligt.

Her har vi præsenteret en ny ikke-invasiv multimodal billeddannelsesmetode til strukturel og funktionel kvantificering af iskæmisk slagtilfælde i den prækliniske indstilling. Gennem AA er klar morfologi og perfusionskortlægning af blodkar i musehjernen mulig. En lokalt defineret mangel på signal kan indikere et infarktområde, hvor der er nedsat blodperfusion, hvilket muliggør estimering af infarktvolumen ikke-invasivt og langsgående. Gennem PAT kan iltmætningen af hæmoglobin måles i og uden for slagtilfældeområdet, hvilket viser den hypoxiske tilstand af hjernevæv i infarktområdet. Denne metode til helhjernebilleddannelse er billig med hensyn til nogle alternativer, såsom MR for små dyr. Desuden giver det mulighed for kombination af funktionel og strukturel information i dybt væv, som andre prækliniske billeddannelsesenheder ikke er i stand til at opnå. Sammenlignet med histologiske analyser giver denne metode mulighed for måling af disse målinger i længderetningen og på flere tidspunkter i modsætning til ved et enkelt endepunkt. Evnen til at gøre det vil give hidtil usete kvantitative detaljer i den prækliniske undersøgelse af iskæmisk slagtilfælde. Derudover kan dette systems strukturelle og funktionelle billeddannelsesevne anvendes til mange prækliniske undersøgelser ud over iskæmisk slagtilfælde²⁸. Enhver sygdomstilstand eller biologisk fænomen, der påvirker det vaskulære system, kan undersøges i dybden ved hjælp af PAUSAT, hvilket gør det til et kraftfuldt præklinisk billeddannelsesværktøj, der kan oversættes til mange andre prækliniske områder (f.eks. Kræft).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 GA catheter	BD Insyte Autoguard Winged	381534	For mouse intubation
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877	Necessary for TTC-staining brain for validation
532nm Laser	Quantel	Q-smart 850	Laser used to pump the OPO for PAT
Automatic Ventilator Rovent Jr.	Kent Scientific	RV-JR	To keep mice under anesthesia during surgical procedure
Black braided silk 4-0 USP	Surgical Specialties	SP116	Used for sutures on the neck for pMCAO surgery
Bupivacaine	Hospira	0409-1159-18	Used prior to closing wounds during surgical procedure
C57BL/6 Mice	Jackson Lab	#000664	Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female)
Clear suture	Ethicon	8606	Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT
Cold Light LED	Schott	KL 1600	Needed to create PT stroke
Disposable Razor Blade	Accutec Blades	74-0002	For sectioning mouse brain
Electric drill	JSDA	JD-700	Used to expose MCA during pMCAO procedure
Electrocauterization tool	Wet-Field	Wet-Field Bipolar-RG	Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure
Hair removal gel	Veet	8282651	Used to remove hair from mouse prior to imaging
High Temperature Cautery Loop Tip	BOVIE Medical Corporation	REF AA03	Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull
IR Detector Card	Thorlabs	VRC5	Used to ensure light path is aligned
Laser Power Meter	Ophir	StarBright, P/N 7Z01580	Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging
Laser Speckle Imaging System	RWD Life Science Co.	RFLSI-III	Can be used to validate stroke surgery success
Lubricant Eye Ointment	Soothe	AB31336	Can be used to avoid drying of the eyes
Manually adjustable stage	Thorlabs	L490	Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging
Modified Vega Imaging System	Perkin Elmer	LLA00061	System containing both B-mode/AA and PAT transducers
Optical Parametric Oscillator	Quantel	versaScan-L532	Allows for tuning of excitation wavelength in a large range
Programmable Ultrasound System	Verasonics	Vantage 256	Used for PAT part of system
Rose Bengal	Sigma	330000	Necessary to induce PT stroke
Suture	LOOK	SP116	Used for permanent ligation of CCA
Temperature Contoller	Physitemp	TCAT-2	Used to maintain stable body temperature of mice during procedures
VesselVue Microbubbles	Perkin Elmer	P-4007001	Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL)