Integrerad fotoakustisk, ultraljud och angiografisk tomografi (PAUSAT) för icke-invasiv helhjärnavbildning av ischemisk stroke

Summary

Detta arbete demonstrerar användningen av en multimodal ultraljudsbaserad bildplattform för icke-invasiv avbildning av ischemisk stroke. Detta system möjliggör kvantifiering av blodets syresättning genom fotoakustisk avbildning och nedsatt perfusion i hjärnan genom akustisk angiografi.

Abstract

Här presenteras en experimentell ischemisk strokestudie med vårt nyutvecklade icke-invasiva bildsystem som integrerar tre akustikbaserade bildtekniker: fotoakustisk, ultraljud och angiografisk tomografi (PAUSAT). Att kombinera dessa tre modaliteter hjälper till att förvärva multispektral fotoakustisk tomografi (PAT) av hjärnans blodsyresättning, högfrekvent ultraljudsavbildning av hjärnvävnaden och akustisk angiografi av cerebral blodperfusion. Den multimodala avbildningsplattformen möjliggör studier av cerebral perfusion och syresättningsförändringar i hela mushjärnan efter stroke. Två vanliga ischemiska strokemodeller utvärderades: den permanenta mellersta cerebrala artärocklusionsmodellen (pMCAO) och den fototrombotiska (PT) modellen. PAUSAT användes för att avbilda samma mushjärnor före och efter en stroke och kvantitativt analysera båda strokemodellerna. Detta bildsystem kunde tydligt visa hjärnans vaskulära förändringar efter ischemisk stroke, inklusive signifikant minskad blodperfusion och syresättning i strokeinfarktregionen (ipsilateral) jämfört med den oskadade vävnaden (kontralateral). Resultaten bekräftades av både laserspeckle kontrastavbildning och trifenyltetrazoliumklorid (TTC) färgning. Dessutom mättes och validerades strokeinfarktvolymen i båda slagmodellerna genom TTC-färgning som grundsanning. Genom denna studie har vi visat att PAUSAT kan vara ett kraftfullt verktyg i icke-invasiva och longitudinella prekliniska studier av ischemisk stroke.

Introduction

Blod transporterar syre (via hemoglobinproteinet) och andra viktiga näringsämnen till vävnader i våra kroppar. När blodflödet genom vävnader avbryts (ischemi) kan allvarliga skador på vävnaderna uppstå, vars mest omedelbara effekter beror på brist på syre (hypoxi). Ischemisk stroke är resultatet av avbrutet blodflöde till en viss region i hjärnan. Hjärnskador till följd av en ischemisk stroke kan inträffa inom några minuter efter en kärlblockering och kan ofta ha försvagande och varaktiga effekter ^1,2. En mycket värdefull strategi för att utvärdera fysiopatologin efter ischemisk stroke och identifiera och testa nya behandlingar är användningen av smådjursmodeller i labbet. Behandlingar som upptäcks i labbet syftar till att översättas till klinisk användning och förbättra patienternas liv. Användningen av djur i biomedicinsk forskning måste dock utvärderas noggrant enligt Russell och Burchs 3R-principer: ersättning, minskning och förfining³. Syftet med reduktionskomponenten är att minska antalet djur utan att äventyra datainsamlingen. Med detta i åtanke möjliggör möjligheten att longitudinellt utvärdera lesionsutvecklingen via icke-invasiv avbildning en stor fördel för att minska antalet djur som krävs, samt maximera informationen som erhållits från varje djur⁴.

Fotoakustisk tomografi (PAT) är en hybrid bildmodalitet som kombinerar optisk absorptionskontrast med ultraljudsavbildning rumslig upplösning⁵. Bildmekanismen för PAT är som följer. En excitationslaserpuls tänds på målet som avbildas. Förutsatt att målet absorberar ljus vid excitationslaserns våglängd, kommer det att öka i temperatur. Denna snabba temperaturökning resulterar i en termoelastisk expansion av målet. Expansionen får en ultraljudsvåg att sprida sig ut från målet. Genom att detektera ultraljudsvågen vid många positioner kan den tid som krävs för vågen att sprida sig från målet till detektorerna användas för att skapa en bild genom en rekonstruktionsalgoritm. PAT: s förmåga att detektera optisk absorption i djupa vävnadsregioner skiljer PAT från ultraljudsavbildning, som detekterar gränser för olika akustiska impedanser hos vävnader⁵. I de synliga och nära infraröda spektra är de primära högabsorberande biomolekylerna som är rikliga i organismer hemoglobin, lipider, melanin och vatten⁷. Av särskilt intresse för studien av stroke är hemoglobin. Eftersom oxyhemoglobin och deoxihemoglobin har olika optiska absorptionsspektra kan PAT användas med flera excitationslaservåglängder för att bestämma den relativa koncentrationen av proteinets två tillstånd. Detta gör att syremättnaden av hemoglobin (_sO2) eller syresättning i blodet kan kvantifieras i och utanför infarktregionen ^8,9. Detta är en viktig åtgärd vid ischemisk stroke, eftersom det kan indikera syrehalten i den skadade hjärnvävnaden efter ischemi.

Akustisk angiografi (AA) är en kontrastförstärkt ultraljudsavbildningsmetod som är särskilt användbar för att avbilda morfologin hos vaskulatur in vivo¹⁰. Metoden bygger på användning av en wobblergivare med dubbla element (ett lågfrekvent element och ett högfrekvent element) i kombination med mikrobubblor som injiceras i bildämnets cirkulationssystem. Givarens lågfrekventa element används för sändning vid mikrobubblornas resonansfrekvens (t.ex. 2 MHz), medan högfrekvenselementet används för att ta emot mikrobubblornas superharmoniska signaler (t.ex. 26 MHz). När de exciteras vid en resonansfrekvens har mikrobubblorna ett starkt olinjärt svar, vilket resulterar i produktion av superharmoniska signaler som omgivande kroppsvävnader inte producerar¹¹. Genom att ta emot med ett högfrekvent element säkerställer detta att endast mikrobubbelsignalerna detekteras. Eftersom mikrobubblorna är begränsade till blodkärlen är resultatet en angiografisk bild av blodkärlsmorfologi. AA är en kraftfull metod för att avbilda ischemisk stroke, eftersom mikrobubblorna som strömmar genom cirkulationssystemet inte kan strömma genom blockerade kärl. Detta gör det möjligt för AA att upptäcka regioner i hjärnan som inte perfuseras på grund av ischemisk stroke, vilket indikerar infarktregionen.

Preklinisk ischemisk strokeforskning bygger i allmänhet på användningen av histologi och beteendetestning för att bedöma platsen och svårighetsgraden av stroke. Trifenyltetrazoliumklorid (TTC) färgning är en vanlig histologisk analys som används för att bestämma strokeinfarktvolymen. Det kan dock endast användas vid en slutpunkt, eftersom det kräver att djuret avlivas¹². Beteendetester kan användas för att bestämma nedsatt motorfunktion vid flera tidpunkter, men de kan inte ge kvantitativa anatomiska eller fysiologiska värden¹³. Biomedicinsk avbildning ger ett mer kvantitativt tillvägagångssätt för att studera effekterna av ischemisk stroke icke-invasivt och longitudinellt 9,14,15. Befintliga avbildningstekniker (t.ex. magnetisk resonanstomografi av små djur [MRT]) kan dock komma till en hög kostnad, inte kunna tillhandahålla samtidig strukturell och funktionell information eller ha begränsat penetrationsdjup (som de flesta optiska avbildningstekniker).

Här kombinerar vi fotoakustisk, ultraljud och angiografisk tomografi (PAUSAT; se systemdiagram i figur 1), vilket möjliggör kompletterande strukturell och funktionell information om blodperfusion och syresättning efter ischemisk stroke¹⁶. Dessa är två viktiga aspekter vid bedömning av skadans svårighetsgrad och övervakning av återhämtning eller svar på behandlingar. Med hjälp av dessa integrerade avbildningsmetoder kan öka mängden information som erhålls av varje djur, minska antalet djur som krävs och ge mer information i studien av potentiella behandlingar för ischemisk stroke.

Figur 1: PAUSAT-diagram. (A) Fullständig schematisk bild av PAUSAT-systemet, inklusive laser och OPO som används för PAT. (B) Inifrån av PAUSAT-systemet, inklusive två ultraljudsgivare. Wobbler-givaren med dubbla element används för både B-mode ultraljud och AA, och den linjära matrisgivaren används för PAT. Båda givarna är monterade på samma 2D-motoriserade steg, vilket möjliggör skanning för att generera volymetriska data. Denna siffra har ändrats från¹⁶. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av Duke University Medical Center Animal Care and Use Committee och genomfördes i enlighet med United States Public Health Service's Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals. Möss av hane och hona C57BL/6J (se materialtabell) användes för dessa studier. Minst tre djur avbildades per strokemodellgrupp. Se bild 2 för arbetsflödet som följs i det här protokollet.

Figur 2: Sammanfattning av det experimentella förfarandet för PAUSAT-avbildning tillämpad på stroke. Skapad med Biorender.com. Figuren visar arbetsflödet för avbildningsproceduren med början från (A) de två huvudslagmodellerna (pMCAO och PT-stroke). B) En retroorbital injektion av mikrobubblorna måste utföras innan djuret placeras på PAUSAT-membranet. (C) En mask som ger kontinuerlig anestesi och en värmedyna för att hålla djurets kroppstemperatur stabil krävs i denna inställning. Djurets kropp placeras på värmedynan medan huvudet vilar på systemets membran. (D) Ordningen för bildinsamling visas också i figuren. (E) TTC-färgning utförs för att validera våra resultat i denna studie. DPI: dagar efter skada. Klicka här för att se en större version av denna figur.

1. Inducera strokemusmodellen

1. Permanent mellersta cerebral artärocklusion (pMCAO) med vanlig halspulsåder (CCA) ligering.
   OBS: Kortfattat, utför permanent ligering av höger CCA och bakre elektrocauterization av höger mitten cerebral artär (MCA)¹⁷. Denna procedur begränsar det cerebrala blodflödet i hjärnans högra cortex, vilket orsakar en ischemisk stroke¹⁸.
   1. Inducera anestesi i en induktionskammare med en inhalationsblandning av 5,0% isofluran i 30%_O2/70%_N2 tills medvetslöshet (erkänd som förlust av pedalreflexen).
   2. Intubera djuret med en 20 G kateter (Table of Materials) och anslut den till en automatisk ventilator. Ställ in flödeshastigheten baserat på djurets kroppsvikt och håll djuret bedövat med 1,5% -2,0% isofluran i 30% O 2/70% N₂.
   3. Använd en värmelampa och en rektal sond ansluten till en temperaturregulatoranordning för att hålla djurets kroppstemperatur vid 37 °C.
   4. Sätt en droppe smörjmedel ögonsalva på musens ögon.
   5. Placera djuret i ryggläge och ta bort håret från nackområdet med en hårtrimmer.
   6. Rengör hudområdet genom att först använda en bomullspinne med povidonjod och sedan använda en steril dyna med 70% etanol. Utför detta tre gånger.
   7. Kontrollera djupet av anestesi och frånvaron av smärta genom att klämma djurets bakre tass något.
   8. Gör ett 0,8 cm sagittalt snitt på nackens mittlinje och exponera höger CCA.
   9. Förbered en sutur för CCA-ligeringen genom att dissociera en 4-0 silkesutur i tunnare trådar som komponerar huvudtråden. Använd en längd på 1,5 cm av en av undertrådarna för att permanent ligera CCA.
      OBS: Efter att ha dragit åt knuten, ta bort överflödig tråd genom att klippa förlängningen på ett 1-2 mm avstånd till knuten.
   10. Applicera en droppe bupivakain innan du stänger såret.
   11. Stäng snittet med avbrutna 4-0 silkekirurgiska suturer och applicera trippel antibiotisk salva på ytan för att förhindra infektion.
   12. Flytta musen för att exponera den högra sidan av djurets kropp.
   13. Ta bort håret i området mellan örat och ögonområdet med en hårtrimmer.
   14. Desinficera det kirurgiska området med en bomullspinne med povidonjod, följt av en steril kudde med 70% etanol. Upprepa detta steg tre gånger.
   15. Placera ett sterilt draperi för att säkra operationsområdet. Gör sedan ett 0,5 cm snitt mellan djurets högra öga och öra och exponera leden mellan skallen och den temporala muskeln.
   16. Använd en cautery loop, cauterize muskeln för att separera den från skallen och exponera området för MCA.
   17. Borra ett 0,2 mm² fönster för att exponera MCA med en elektrisk borr och använd elektrocautery på MCA för att täppa till blodflödet.
       OBS: En enda puls vid 80% effektintensitet räcker för att cauterize MCA.
   18. Använd en 1 ml spruta fäst vid en 27G nål, applicera en droppe bupivakain (materialförteckning) på operationsområdet.
   19. Stäng hudsnittet med avbrutna 6-0 klara monofilamentsuturer och applicera trippel antibiotisk salva på ytan för att förhindra infektion.
   20. Efter avslutad operation, överför djuret till en inkubator med kontrollerad temperatur (32 °C) och låt djuret återhämta sig.
   21. Efter 2 timmar, överför djuret till sin hembur och ge mat och vatten ad libitum.
2. Fototrombotisk stroke (PT-stroke)
   OBS: Kortfattat utförs PT-stroke genom att belysa Rose Bengal i kärlen i hjärnan. Rose Bengal administreras intraperitonealt, och när det har fördelats väl i hela kroppen (5 min) belyses det av ett grönt kallt ljus som aktiverar Rose Bengal för att generera reaktiva syrearter (ROS). Dessa ROS skadar membranet i endotelceller, vilket skapar trombi inom hela det upplysta området och leder till lokal cerebral blodflödesstörning¹⁹.
   1. Inducera anestesi i en induktionskammare med en inhalationsblandning av 5,0% isofluran i 30%_O2/70%_N2 tills medvetslöshet (erkänd som förlust av pedalreflexen).
   2. Ställ djuret på en stereotaxisk ram, håll djuret bedövat med en mask och 1,5% -2,0% isofluran i 30% O 2/70% N₂.
   3. Håll djuret vid 37 °C med hjälp av en varmvattencirkulationsvärmare och en rektal sond för att mäta djurets kroppstemperatur.
   4. Sätt en droppe smörjmedel ögonsalva på musens ögon.
   5. Raka djurets huvud med en hårtrimmer.
   6. Rengör det rakade hårbottenområdet tre gånger, först med en bomullspinne med povidonjod och sedan med en steril dyna med 70% etanol.
   7. Kontrollera frånvaron av smärta genom att klämma djurets bakre tass något.
   8. Gör ett 1,4 cm sagittal snitt på hårbottens mittlinje med en skalpell och exponera skallen.
   9. Använd en skarp penna och gör ett märke på 1,5 mm från bregma mot höger sida.
   10. Placera ett cirkulärt nålhål med 2,5 mm diameter centrerat på 1,5 mm-märket.
       OBS: En fyrkant som innehåller ett cirkulärt pinhål kan göras genom att använda dubbelsidig svart tejp och göra en öppning med 2,5 mm diameter i mitten med hjälp av ett hålhålsverktyg av nämnda storlek.
   11. Placera det gröna kalla ljuset på det cirkulära nålhålet och håll gapet mellan ljuset och nålhålet till ett minimum.
   12. Täck området med aluminiumfolie för att undvika spridning av ljuset.
   13. När installationen är klar, injicera djuret intraperitonealt med 10 mg/kg Rose Bengal (10 mg/ml i 1x fosfatbuffrad saltlösning [PBS]) och vänta i 5 minuter.
   14. Efter 5 minuter, slå på den kalla ljuskällan (intensitet: 4,25) och behåll exponeringen i 15 minuter.
   15. Stäng sedan av det kalla ljuset och verifiera stroke antingen med blotta ögat (området förväntas vara vitare än det omgivande området) eller med hjälp av externa enheter för att mäta cerebralt blodflöde (till exempel genom att använda laserspeckle kontrastavbildning (Materialförteckning; se steg 5.1).
   16. Använd en 1 ml spruta fäst vid en 27G nål, applicera en droppe bupivakain (materialförteckning) på operationsområdet.
   17. Stäng hudsnittet med avbrutna 6-0 klara monofilamentsuturer och applicera trippel antibiotisk salva på ytan för att förhindra infektion.
   18. Efter avslutad operation, överför djuret till en inkubator med kontrollerad temperatur (32 °C) och låt djuret återhämta sig.
   19. Efter 2 timmar, överför djuret till sin hembur och ge mat och vatten ad libitum.

2. Förbereda PAUSAT för bildbehandling

1. Slå på 532 nm-lasern och låt den vara på i 15 minuter för att värma upp.
2. Förbered bildplattformen för det bedövade djuret.
   1. Placera en anpassad ramp (figur 2C) fäst vid det manuellt justerbara steget (materialförteckning) bredvid bildmembranet.
   2. Fäst en mustandhållare med andningsröret anslutet till den anpassade rampen och säkra en värmedyna på rampens yta.
3. När lasern har värmts upp, kontrollera att laservägen och kopplingen till fiberbunten är väl inriktad med ett nära infrarött detektorkort (Table of Materials) genom att placera kortet framför fiberbuntingången och se till att laserljuset kommer in i bunten.
   OBS: Justera eventuella laserbanspeglar efter behov för att säkerställa att laseringången är centrerad med fiberbuntingången.

3. Förbereda djuret för PAUSAT

OBS: PAUSAT utförs 1 dag efter PT-strokeoperation eller 3 dagar efter pMCAO-operation. Förberedelse av PAUSAT för bildtagning (steg 2) tar cirka 20 minuter och ska göras omedelbart innan djuret förbereds för PAUSAT.

1. Inducera anestesi i en induktionskammare med en inhalationsblandning av 5% isofluran blandat med 30%_O2/70%_N2 tills medvetslöshet (erkänd som förlust av pedalreflexen).
2. Överför djuret till en uppvärmd plattform med en tandhållare och en mask och håll anestesin vid 1,5% -2,0% isofluran i 30% O 2/70% N_2.
3. Använd en värmelampa och en rektal sond ansluten till en temperaturregulatoranordning för att hålla djurets kroppstemperatur vid 37 °C.
4. Klipp håret på toppen av djurets huvud med hjälp av en elektrisk rakapparat. Inkludera regionen från nära ögonen till bakom öronen.
5. Raka håret på toppen av djurets huvud genom att applicera en kommersiell hårborttagningskräm för att helt ta bort det återstående korta håret. Låt verka på huden i 5-6 minuter och torka sedan av med en bomullspinne som baddats i vatten för att hjälpa till att ta bort krämen helt. Upprepa tills huden är fri från hår.
   OBS: För avbildning 1 dag efter operationen kan dessa steg utföras innan operationen påbörjas; vid 1 dag efter PT-stroke kan de utelämnas. När PAUSAT bildinsamling utförs flera dagar efter operationen är detta steg kritiskt nödvändigt att utföra.
6. När djuret och systemet är redo för avbildning, och precis innan djuret överförs till systemets plattform, injicera en 100 μL lösning av mikrobubblor vid stamkoncentrationen (Table of Materials) retroorbitalt med en 27 G nål.
   OBS: När bubblorna är i omlopp i blodomloppet finns det en begränsad tid att avbilda utan en signifikant signalförlust (~ 10 min).
7. Sätt en droppe ögonskyddslotion på musens ögon.
   OBS: Det rekommenderas inte att applicera ögonsmörjmedel förrän retroorbitalinjektionen utförs för att undvika att främmande ämnen når djurets blodomlopp. Därför måste applicering av hårborttagningskräm utföras långsamt och försiktigt för att undvika att komma för nära ögonen (men tillräckligt för att exponera intresseområdet där stroke förväntas). Hårkrämborttagningen utförs med en bomullspinne som tidigare baddats i vatten, vilket förhindrar att krämen droppar, vilket kan skada ögonen.

4. PAUSAT-bildbehandling

OBS: Detta görs för att avbilda de kontra- och ipsi-laterala regionerna i hjärnan efter stroke

1. Överför musen till den integrerade PAUSAT-bildplattformen (Table of Materials) och placera musen i ryggläge på den anpassade rampen (bild 2C).
2. Fyll bildfönstret med tillräckligt med destillerat vatten på ytan för akustisk koppling.
   OBS: En valfri ramputskrift med en 3D-skrivare rekommenderas för att förhindra att djurets kropp blir våt under bildförvärvet och förbättra djurets komfort. Det hjälper också till att upprätthålla en stabil kroppstemperatur. Dessutom kan rampen fästas på ett manuellt steg (Table of Materials) för att justera brännvidden på wobblergivaren med dubbla element i förhållande till mushuvudet. Den anpassade rampdesignfilen är tillgänglig på begäran för författarna.
3. Säkra mushuvudet i tandhållaren och säkerställ korrekt anestesi och luftflöde.
4. Använd en värmelampa och en rektal sond ansluten till en temperaturregulatoranordning för att hålla djurets kroppstemperatur vid 37 °C.
5. Öppna bildprogrammet (Table of Materials) och navigera till B-mode ultraljud.
6. Använd live ultraljudsfönstret för att manuellt justera mushuvudet till önskad position.
7. Använd det levande ultraljudsfönstret för att justera scenens höjd, så att givarens brännvidd (19 mm) är ungefär i mitten av området som ska avbildas.
8. Bildbehandling med B-mode ultraljud
   1. Justera värdet på ultraljudsöverföringsfrekvensen i B-läge (för dessa studier, använd 16 MHz).
   2. Ange informationen om att spara katalog i avbildningsprogrammet.
   3. Använd den flytande rutan för att välja önskad region för B-lägesskanning av hjärnan.
   4. Tryck på knappen Hämta statisk .
   5. Kontrollera resultaten av skanningen i applikationen när bildförvärvet är klart för att säkerställa att önskad region har avbildats.
      OBS: Undvik onödiga förseningar i B-mode bildinsamling för att säkerställa att en tillräckligt hög koncentration av mikrobubblor kvarstår i blodomloppet för AA.
9. Bildbehandling med AA
   1. Återgå till Bildinsamling.
   2. Ändra till läget Akustisk angiografi i bildåtergivningsprogrammet (Materialförteckning).
   3. Ange önskade skanningsprotokollparametrar (varav den viktigaste är ramavstånd och antalet bilder per position, som sattes till 0, 2 mm respektive 10 för dessa studier).
   4. Tryck på knappen Hämta statisk .
      AA-förvärvet tar längre tid än B-mode ultraljud.
   5. När skanningen är klar kontrollerar du resultatet av skanningen under Bildanalys för att säkerställa att bildkvaliteten är som förväntat.
      OBS: För AA-läge kan en mer representativ volym i hela hjärnan erhållas genom att upprepa en andra skanning på ett annat brännvidd inuti hjärnan och senare rekombinera bilderna med korrekt efterbehandling (se figur 3).
10. Bildbehandling med fotoakustisk tomografi
    1. Öppna OPO-applikationen (optisk parametrisk oscillatorn) (materialförteckning) och ställ in den på 756 nm.
       OBS: OPO: er kan enkelt komma ur kalibrering, så före experimentet, se till att OPO kalibreras korrekt med hjälp av en oberoende spektrometer.
    2. Översätt linjärar-array-givaren manuellt till de tidigare bestämda koordinaterna för att säkerställa att wobblervolymerna och linjärmatrisvolymerna automatiskt samregistreras.
       OBS: Det är viktigt att ett samregistreringsexperiment med hjälp av ett fantomnät görs i förväg för att bestämma det exakta avståndet som behövs för att översätta steget, så att de resulterande data från båda givarna samregistreras i 3D.
    3. Öppna laserapplikationen och slå på 532 nm-lasern.
    4. Använd en lasereffektmätare för att mäta lasereffektens energi och se till att det är den önskade energin (~ 10 mJ per puls användes för dessa studier).
    5. Välj önskade skanningsparametrar för PAT (stegstorlek på 0,4 mm, skanningslängd på 20 mm och genomsnitt på 10 bilder per position).
    6. Öppna ultraljudsdatainsamlingssystemet MATLAB-programmet (Table of Materials) och tryck på knappen Kör .
    7. Hämta PAT-skanningen genom att trycka på Start-knappen .
    8. När skanningen är klar öppnar du MATLAB-sparprogrammet. Ändra sparnamnet till önskat filnamn och tryck på knappen Kör .
    9. Ändra OPO-våglängden till 798 nm och upprepa stegen från 4.10.3 till 4.10.8.
       Anmärkning: Vid en longitudinell undersökning rekommenderas att djuret får återhämta sig genom att placera det i en inkubator och under observation i några timmar (enligt steg 1.1.18 och 1.1.19). Om resultatvalidering önskas, fortsätt till avsnitt 5 omedelbart efter PAUSAT-avbildning.

5. Valfritt: Validering av resultat

1. Laserspeckle kontrastavbildning (LSCI).
   1. Bedöva djuret med 1,5% -2,0% isofluran i 30% O 2/70% N₂.
   2. Ställ djuret på en stereotaxisk ram, håll djuret bedövat med en mask och ovan nämnda inhalationsanestesi.
   3. Håll djuret vid 37 °C med hjälp av en varmvattencirkulationsvärmare och en rektal sond för att mäta djurets kroppstemperatur.
   4. Sätt en droppe ögonskyddslotion på musens ögon.
   5. Kontrollera frånvaron av smärta genom att klämma djurets bakre tass något.
   6. Ta bort håret på djurets hårbotten med en hårtrimmer.
   7. Desinficera det kirurgiska området med en bomullspinne med povidonjod, följt av en steril kudde med 70% etanol. Upprepa detta steg tre gånger.
   8. Gör ett 1,4 mm sagittal snitt på hårbottens mittlinje och exponera skallen. Använd pincett för att hålla hårbotten och förhindra att den upptar hjärnans område för att skanna.
   9. Applicera några droppar saltlösning på skallen och placera laserfläckkontrastsystemenheten (materialförteckning) över djurets huvud.
   10. Under Arkiv-menyn ställer du in enheten i online-läge, som finns i undermenyn Arbetsläge.
   11. Välj standardmapp för bildlagring på Arkiv-menyn och undermenyn Spara inställningar .
   12. I ljuskällans meny ansluter du styrlasern ("Laser på") och det vita ljuset ("Vitt ljus på") för att placera bildfönstret i rätt position.
   13. I menyn Inställning väljer du Förstoringsinställningar, flyttar markören manuellt till 2,5 och trycker på Apply och OK för att spara inställningarna.
   14. Justera fokus genom att manuellt flytta fokusfältet i den övre undermenyn på huvudsidan.
   15. I menyn Inställning väljer du Pseudofärgtröskelinställning, justerar tröskelvärdet efter önskemål och trycker på Apply och OK för att spara inställningarna.
   16. I ljuskällans meny kopplar du bort styrlasern ("Laser av") och det vita ljuset ("Vitt ljus av") innan du tar bilden.
   17. Ta bilden genom att välja Play-symbolen i den övre undermenyn på huvudsidan.
2. Färgning av trifenyltetrazoliumklorid (TTC)
   1. Bedöva djuret djupt med 5% isofluran i 30% O 2/70% N₂.
   2. När djuret har slutat andas, halshugga det med en vass sax.
   3. Ta bort all hud runt huvudet och musklerna i nackområdet.
   4. Gör ett sagittalt snitt i den occipitala delen av skallen tills den når parietalbenet.
   5. Gör ett horisontellt snitt (~5 mm) i vänster och höger sida under blodkärlet. Ta bort skallens occipitala ben med raka pincett.
   6. Gör ett snitt (~ 5 mm) vid skallens frontonasala sutur.
   7. Gör ett sagittalsnitt (~ 10-15 mm) i mitten av skallen - mellan halvklotet - och se till att de är helt separerade.
   8. Använd storlek #7 böjd sax, ta bort parietala vänstra och högra ben i skallen från mitten till sidorna.
   9. Överför hjärnan till en behållare fylld med 5 ml iskall 1x PBS och håll den på is i 10 minuter.
   10. Överför hjärnan till en hjärnmatris av rostfritt stål (1 mm tjocka sektioner).
   11. Dela hjärnan i 1 mm koronala sektioner med hjälp av engångsrakblad (Table of Materials).
   12. Håll knivarna vid deras sidor, överför till en behållare fylld med iskall 1x PBS.
   13. Separera försiktigt sektionerna från knivarna en efter en.
   14. Överför hjärnskivorna till en petriskål med en diameter på 70 mm innehållande 5 ml 2% TTC (Table of Materials, 3) i 1x PBS.
   15. Inkubera i 15 minuter i mörker vid rumstemperatur (R/T).
   16. Efter 15 minuter, kassera TTC, ersätt den med 3 ml formalin och inkubera i mörker i minst 30 minuter vid R/T.
   17. Slutligen överför hjärnskivorna till en transparent plastfilm och skanna proverna, inklusive en linjal i skanningsbilden som referens för framtida mätningar.

Representative Results

Avbildning av blodkärlsmorfologi i hjärnan
AA genererar blodkärlsmorfologiska bilder genom spännande mikrobubblor i cirkulationssystemet vid deras resonansfrekvens och tar emot mikrobubblornas superharmoniska respons. Genom att använda den anpassade rampen (figur 2C) fäst vid ett manuellt justerbart steg kan vi avbilda mushjärnan med AA-läge på två olika brännvidder. När djupare regioner riktas visar mer ytliga regioner (som hjärnbarken) en sämre upplösning och signalstyrka (figur 3A) och vice versa (figur 3B). Men genom att förvärva två brännvidder och kombinera dem kan AA-bilder ge information om en hel koronalsektion (figur 3C, D). Dessutom, genom att använda det motoriserade steget för att skanna längs en tredje dimension, kan PAUSAT registrera en serie koronala bilder som täcker intresseområdet (ROI) definierat av användaren. Dessa bildserier kan anpassas och användas för att visualisera en 3D-representation av hela hjärnan, eller ROI definierad av användaren. Ytterligare resultat som visar att andra kvantitativa mått (såsom slagvolymen) kan analyseras med hjälp av 3D-informationen från sammanställningen av bilder som förvärvats av PAUSAT tillhandahålls också här.

Anatomisk och funktionell utvärdering före och efter ischemisk stroke
För att illustrera potentialen hos PAUSAT-systemet i prekliniska studier studerade vi två grupper av djur som utsattes för en av modellerna för ischemisk stroke som analyseras här: pMCAO eller PT-stroke. Dessa två strokemodeller skiljer sig åt i de principer genom vilka den ischemiska regionen skapas. Kortfattat, i pMCAO-modellen, är den mellersta cerebrala artären elektrokauteriserad, vilket stoppar blodtillförseln från denna artär till hjärnan. Denna skada utlöser en sekundär skada, där omgivande vävnad blir ischemisk, vilket förstorar det område som påverkas av stroke. Vi bestämde oss för att avbilda pMCAO-strokehjärnan vid dag tre efter stroke, eftersom det här är den tid då det maximala området som förväntas påverkas av stroke uppnås. I PT-stroke uppnås dock det maximala området av vävnad som påverkas av stroke efter den första dagen, så vi bestämde oss för att avbilda PT-stroke på dag ett efter att stroke utfördes. Även om vi valde dessa tidpunkter i vår studie kan PAUSAT användas för longitudinell övervakning av stroke vid vilken önskad tidpunkt som helst.

Först förvärvades en B-lägesskanning för att säkerställa korrekt position av djurets huvud och identifiera de rumsliga gränserna mellan skallen och hjärnan (figur 4A och figur 5A). Den mest främre delen av hjärnan som avbildas inkluderar den frontonasala suturen i skallen som referenspunkt. En avkastning på 20 mm (främre till bakre) x 17,15 mm (lateral) som täcker vänster (kontralateral; CL) och höger (ipsilateral; IL) halvklot definierades i följande studier för att lokalisera strokeregionen. AA-bilder gav information om blodkärlsstrukturerna genom att rikta signalen från de cirkulerande mikrobubblorna. Våra resultat visar att i den oskadade hjärnan (baslinjen) uppvisar båda halvkloten en liknande fördelning av blodkärl (figur 4B och figur 5B), som förväntat i frånvaro av skada. Ett liknande resultat observeras för fördelningen av vävnadens syresättningskarta baserat på PA-bilder erhållna vid två olika våglängder (figur 4C och figur 5C). Vi bestämde oss för att utvärdera två olika våglängder baserat på den lokala maximala optiska absorptionen för deoxygenerat hemoglobin (756 nm) och våglängden vid vilken det deoxygenerade och syresatta hemoglobinet uppvisade lika optisk absorption (798 nm)²⁰. Genom att fånga dessa två tillstånd av hemoglobin kan vi exakt uppskatta vävnadens syresättning (figur 4D och figur 5D).

Dagen efter att ha förvärvat baslinjebilden från hjärnan utförde vi operation på djuret (pMCAO eller PT-stroke), som beskrivits i tidigare avsnitt. En ny uppsättning bilder förvärvades vid en viss tidpunkt efter stroke (se figur 2A) för att utvärdera platsen och storleken på stroke. AA-bilderna som förvärvats från möss som utsätts för pMCAO visar en märkbar minskning av signalens intensitet i cortexens högra sida (figur 4B). Samma region visar en minskning av vävnadens syresättningskarta från PA-bilder, vilket tyder på ett ischemiskt område (figur 4D). För att validera våra resultat bestämde vi oss för att skörda hjärnan och utföra TTC-färgning omedelbart efter att ha fått bilderna från strokedjuret. Våra resultat visar att området som identifierats som stroke är liknande jämfört med våra resultat av PAUSAT och den väletablerade TTC-färgningen (figur 4B-E). Vi visar också här att PAUSAT kan identifiera strokeområden i hjärnan med hjälp av en andra modell av stroke, PT-stroke, utvärderad vid en tidigare tidpunkt efter strokeinduktion (1 dag). Som visas i figur 5B kunde vi identifiera en region i den övre delen av cortex med minskad blodflödestillförsel och en samtidig minskning av syremättnad (figur 5D). Resultaten från TTC-färgning matchar platsen och storleken på slaget som tidigare identifierats av PAUSAT (figur 5B-E).

Åldern på musen som avbildas kan kraftigt påverka bildkvaliteten. Musens skalle blir tjockare med åldern, och eftersom skallen har en signifikant annorlunda akustisk impedans i förhållande till mjukvävnad reflekteras en stor andel av ultraljudsvågorna vid skallgränsen. Eftersom dessa integrerade bildsystem alla är akustiskt baserade leder detta till en minskning av bilddjupet för äldre möss. Detta kan tydligt ses i figur 6, där möss i tre olika åldrar avbildades med AA under samma förhållanden. Liknande lågsignalresultat förväntas om avbildningsproceduren inte följs som tidigare beskrivits.

Kvantitativ analys av slagvolymen med PAUSAT
Som beskrivs i ovan nämnda resultat fångar PAUSAT en serie koronalbilder riktade mot en ROI som beskrivs av användaren. Vi analyserade slagvolymen genom att beräkna slagområdet inom de olika koronalbilderna och avståndet mellan bilderna. Den linjevolym som beräknats av PAUSAT visar ingen statistisk skillnad (p < 0,05) jämfört med slagvolymen beräknad utifrån en liknande metod med TTC-färgningsbilder (figur 7).

Figur 3: Effekt av wobblergivarens brännvidd på kvaliteten på AA-bilder. Bilder på flera brännvidd kan förvärvas och senare kombineras för att producera de bästa helhjärnavbildningsresultaten. (A) AA koronalsektion förvärvad på ett djupare brännvidd. (B) AA koronalsnitt förvärvat vid ett mer ytligt brännvidd. (C) Resultat av att smälta djupare fokus (grön) och mer ytligt fokuserade (magenta) bilder. (D) Resultat av att kombinera djupare fokus och mer ytligt fokuserade bilder med ett pixelskalvärde som är jämförbart med (A) och (B). Denna siffra har ändrats från¹⁶. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Representativa PAUSAT-resultat för en mushjärna # 1 före och efter pMCAO-stroke . (A) Baslinje och post-stroke B-mode ultraljud koronala bilder. (B) Baslinje och efter stroke AA koronala bilder. (C) Baslinje och PA koronalbilder efter stroke vid 756 nm excitation. D) Syremättnadskarta baserad på excitationsbilder på 756 nm och 798 nm. (E) TTC-färgade delar av en mushjärna, som visar samma strokeområde. Avståndet mellan linjerna längst ner på bilden representerar 1 mm. Denna siffra har ändrats från¹⁶. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Representativa PAUSAT-resultat för mus före och efter PT-stroke . (A) Baslinje och post-stroke B-mode ultraljud koronala bilder. (B) Baslinje och efter stroke AA koronala bilder. (C) Baslinje och PA koronalbilder efter stroke vid 756 nm excitation. D) Syremättnadskarta baserad på excitationsbilder på 756 nm och 798 nm. (E) TTC-färgade delar av en mushjärna, som visar samma strokeområde. Avståndet mellan linjerna längst ner på bilden representerar 1 mm. Denna siffra har ändrats från¹⁶. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Effekten av musens ålder på kvaliteten på AA-bilder. Denna figur visar skillnaden i AA-signalintensitet och bilddjup när djur från olika åldrar avbildas under jämförbara förhållanden. Som framgår av figuren ger äldre möss (18 månader) bilder av lägre kvalitet på grund av skallens storlek och tjocklek jämfört med yngre möss (1,5 månader), medan vuxna möss visar en mellanliggande signal (6 månader). På grund av den stora akustiska impedansmatchningen mellan skallen och hjärnvävnaden reflekteras och bryts ultraljudsvågor som sprider sig genom skallen, vilket leder till signalförlust och upplösningsförsämring. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7: Analys av volymen av den ischemiska stroken. (A) Exempel på TTC-sektioner från PT-stroke och motsvarande TTC-segmenterade bilder, AA-bilder och AA-segmenterade bilder på jämförbara koronala platser. (B) Slagvolymen beräknad baserat på TTC- och AA-bilder för pMCAO- och PT-slag, som inte visar några signifikanta skillnader (p > 0,05). Diagrammet visar medelvärdet ± standardavvikelsen (S.D.) (n = 3 djur per grupp). Denna siffra har ändrats från¹⁶. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Det finns några viktiga aspekter av denna metod som, om de görs felaktigt, kan leda till avsevärt minskad bildkvalitet och kvantitativ analys. Det vanligaste resultatet av användarfel i PANAT-bilder är antingen brist på signal eller mycket låg signalstyrka, som båda kan uppstå av olika skäl. En sådan anledning är ett problem med den akustiska kopplingen. Stora luftbubblor i vattnet som omger musens huvud under avbildning kan ofta blockera ultraljudet från att resa till eller från givaren, vilket orsakar ett skuggområde i den resulterande bilden för alla tre modaliteterna i systemet. Detta kan förhindras genom att säkerställa att det finns tillräckligt med vatten mellan systemmembranet och provet som ska avbildas. Det kan också inträffa att det saknas AA-signal, men en förvånansvärt hög PA-signal, oberoende av vilka våglängder som används. Detta kan bero på närvaron av hår, särskilt mörkt hår, som stör absorptionen av ljuset. För att undvika detta är det nödvändigt att tidigare ha rakat djurets huvud tills inget hår är visuellt identifierbart.

När det gäller AA-bilder är ett annat problem som kan uppstå och skulle leda till brist på eller mycket låg signal en låg koncentration av mikrobubblor som finns i cirkulationssystemet. Om mikrobubblorna är för utspädda eller de injicerades felaktigt kommer den resulterande signalen att vara mycket svag. Den retroorbitala injektionen får endast utföras av välutbildad personal. En annan orsak kan vara en lång tidsperiod mellan mikrobubbelinjektion och starten av avbildning, vilket kan leda till en minskning av mikrobubblorna i blodet. För att undvika detta rekommenderas att systemet förbereds för avbildning innan mikrobubblorna injiceras, så att djuret kan överföras till PAUSAT-systemets membran omedelbart efter injektionen. Det är värt att nämna att alternativa intravenösa vägar (såsom svansveninjektion) också kan användas när djuret redan är placerat på PAUSAT-systemets membran, vilket förkortar tiden mellan injektion och avbildning. Dessutom, för att upprätthålla en maximal koncentration av mikrobubblor, rekommenderas det också att utföra AA-avbildning före PA-avbildningen.

PA-signalen kan också påverkas om de nödvändiga stegen inte utförs korrekt. En av frågorna handlar om kvaliteten på excitationslasern. De två huvudkomponenterna som beskriver laserkällan är pulsenergin och våglängden. Det rekommenderas starkt att använda en oberoende effektmätare och spektrometer för att mäta dessa kvantiteter och se till att de är inställda på önskade värden. Om ett felaktigt värde antas kommer funktionsberäkningarna att ge vilseledande resultat.

Det är också möjligt att när AA- och PA-bilder kombineras är de inte i linje. Den främsta orsaken till detta är att koordinaterna som fastställdes mellan givarna inte var korrekta. För att förhindra detta är det viktigt att utföra de nödvändiga experimenten med hjälp av ett fantomrutnät i förväg för att bestämma de exakta koordinaterna för en lyckad samregistrering av AA- och PA-bilder. En annan potentiell källa till felaktighet beror på felaktig kalibrering av OPO. För att mildra detta måste OPO kalibreras korrekt med hjälp av en oberoende spektrometer.

Det återstår fortfarande betydande förbättringar, särskilt när det gäller bildkvaliteten på PAT-komponenten i detta integrerade system. Det nuvarande PAT-systemet är baserat på en skanning linjär matriskonfiguration. Vi kan observera storskaliga skillnader i syresättning av infarkt kontra friska regioner i hjärnan med hjälp av flera strokemusmodeller, men den detaljerade vaskulaturen (mikrokärl) kan inte ses. Det finns två huvudproblem som bidrar till denna låga bildkvalitet. Den första är problemet med begränsad syn. För att skapa en fullvy rekonstruerad bild av ett prov i PAT måste detektorn helt omge objektet (eller ha en solid vinkel på 4π). Men i experimentell miljö är detta svårt. Detta ger upphov till det begränsade synproblemet, vilket leder till att blodkärl som är ortogonala mot givarmatrisen, är odetekterbara²¹. Det finns lösningar för att minska effekterna av problemet med begränsad vy i linjär AR-PAT, varav den mest lovande är användningen av mikrobubblor som virtuella punktkällor²². Det andra problemet med linjär PAT är dålig höjdupplösning och känslighet på grund av den akustiska linsens svaga fokus. Användningen av enkelslitddiffraktion i hårdvarudesignen av ett linjärt arraysystem har dock visat sig skapa isotrop upplösning och känslighet för linjär array PAT^23,24. Djupinlärningsmetoder har också visat sig delvis lösa både problemet med begränsad vy och den dåliga höjdupplösningen för linjär array PAT^25,26,27. Kombinationen av dessa lösningar skulle avsevärt förbättra bildkvaliteten på PAT-komponenten i vårt integrerade bildsystem.

Här har vi presenterat en ny icke-invasiv multimodal avbildningsmetod för strukturell och funktionell kvantifiering av ischemisk stroke i preklinisk miljö. Genom AA är tydlig morfologi och perfusionskartläggning av blodkärl i mushjärnan möjlig. En lokalt definierad brist på signal kan indikera en infarktregion där det finns minskad blodperfusion, vilket möjliggör uppskattning av infarktvolymen icke-invasivt och longitudinellt. Genom PAT kan syremättnaden av hemoglobin mätas i- och utanför strokeregionen, vilket visar det hypoxiska tillståndet hos hjärnvävnader i infarktregionen. Denna metod för helhjärnavbildning är billig med avseende på vissa alternativ, såsom smådjur MR. Dessutom möjliggör det kombinationen av funktionell och strukturell information i djup vävnad som andra prekliniska avbildningsanordningar inte kan uppnå. Jämfört med histologiska analyser möjliggör denna metod mätning av dessa mätvärden longitudinellt och vid flera tidpunkter, i motsats till vid en enda slutpunkt. Möjligheten att göra detta kommer att ge oöverträffad kvantitativ detalj i den prekliniska studien av ischemisk stroke. Dessutom kan den strukturella och funktionella avbildningsförmågan hos detta system tillämpas på många prekliniska studier utöver ischemisk stroke²⁸. Alla sjukdomstillstånd eller biologiska fenomen som påverkar kärlsystemet kan studeras på djupet med hjälp av PAUSAT, vilket gör det till ett kraftfullt prekliniskt bildverktyg som kan översättas till många andra prekliniska områden (t.ex. cancer).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20 GA catheter	BD Insyte Autoguard Winged	381534	For mouse intubation
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877	Necessary for TTC-staining brain for validation
532nm Laser	Quantel	Q-smart 850	Laser used to pump the OPO for PAT
Automatic Ventilator Rovent Jr.	Kent Scientific	RV-JR	To keep mice under anesthesia during surgical procedure
Black braided silk 4-0 USP	Surgical Specialties	SP116	Used for sutures on the neck for pMCAO surgery
Bupivacaine	Hospira	0409-1159-18	Used prior to closing wounds during surgical procedure
C57BL/6 Mice	Jackson Lab	#000664	Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female)
Clear suture	Ethicon	8606	Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT
Cold Light LED	Schott	KL 1600	Needed to create PT stroke
Disposable Razor Blade	Accutec Blades	74-0002	For sectioning mouse brain
Electric drill	JSDA	JD-700	Used to expose MCA during pMCAO procedure
Electrocauterization tool	Wet-Field	Wet-Field Bipolar-RG	Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure
Hair removal gel	Veet	8282651	Used to remove hair from mouse prior to imaging
High Temperature Cautery Loop Tip	BOVIE Medical Corporation	REF AA03	Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull
IR Detector Card	Thorlabs	VRC5	Used to ensure light path is aligned
Laser Power Meter	Ophir	StarBright, P/N 7Z01580	Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging
Laser Speckle Imaging System	RWD Life Science Co.	RFLSI-III	Can be used to validate stroke surgery success
Lubricant Eye Ointment	Soothe	AB31336	Can be used to avoid drying of the eyes
Manually adjustable stage	Thorlabs	L490	Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging
Modified Vega Imaging System	Perkin Elmer	LLA00061	System containing both B-mode/AA and PAT transducers
Optical Parametric Oscillator	Quantel	versaScan-L532	Allows for tuning of excitation wavelength in a large range
Programmable Ultrasound System	Verasonics	Vantage 256	Used for PAT part of system
Rose Bengal	Sigma	330000	Necessary to induce PT stroke
Suture	LOOK	SP116	Used for permanent ligation of CCA
Temperature Contoller	Physitemp	TCAT-2	Used to maintain stable body temperature of mice during procedures
VesselVue Microbubbles	Perkin Elmer	P-4007001	Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL)