Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Integrert fotoakustisk, ultralyd og angiografisk tomografi (PAUSAT) for ikke-invasiv avbildning av hele hjernen av iskemisk hjerneslag

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65319
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Multidisciplinary Brain Protection Program, Department of Anesthesiology, Duke University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Dette arbeidet demonstrerer bruken av en multimodal ultralydbasert bildebehandlingsplattform for ikke-invasiv avbildning av iskemisk slag. Dette systemet muliggjør kvantifisering av oksygenering av blod gjennom fotoakustisk avbildning og nedsatt perfusjon i hjernen gjennom akustisk angiografi.

Abstract

Presentert her er en eksperimentell iskemisk hjerneslagstudie ved hjelp av vårt nyutviklede ikke-invasive bildebehandlingssystem som integrerer tre akustisk-baserte bildebehandlingsteknologier: fotoakustisk, ultralyd og angiografisk tomografi (PAUSAT). Kombinere disse tre modalitetene bidrar til å skaffe multispektral fotoakustisk tomografi (PAT) av hjernens oksygenering av blod, høyfrekvent ultralydavbildning av hjernevevet og akustisk angiografi av cerebral blodperfusjon. Den multimodale bildebehandlingsplattformen gjør det mulig å studere cerebrale perfusjons- og oksygeneringsendringer i hele musehjernen etter hjerneslag. To ofte brukte iskemiske slagmodeller ble evaluert: den permanente midtre cerebrale arterieokklusjonsmodellen (pMCAO) og fototrombotisk (PT) modell. PAUSAT ble brukt til å avbilde de samme musehjernene før og etter et slag og kvantitativt analysere begge slagmodellene. Dette bildesystemet kunne tydelig vise hjernens vaskulære forandringer etter iskemisk hjerneslag, inkludert signifikant redusert blodperfusjon og oksygenering i slaginfarktregionen (ipsilateralt) sammenlignet med det uskadde vevet (kontralateralt). Resultatene ble bekreftet av både laserspeckle kontrastavbildning og trifenyltetrazoliumklorid (TTC) farging. Videre ble slaginfarktvolumet i begge slagmodellene målt og validert med TTC-farging som grunnsannhet. Gjennom denne studien har vi vist at PAUSAT kan være et kraftig verktøy i ikke-invasive og longitudinelle prekliniske studier av iskemisk hjerneslag.

Introduction

Blod transporterer oksygen (via hemoglobinproteinet) og andre viktige næringsstoffer til vev i kroppen vår. Når blodstrømmen gjennom vev avbrytes (iskemi), kan det oppstå alvorlig skade på vevet, hvis mest umiddelbare effekter skyldes mangel på oksygen (hypoksi). Iskemisk slag er resultatet av avbrutt blodstrøm til en bestemt region i hjernen. Hjerneskaden som følge av et iskemisk slag kan oppstå i løpet av minutter etter blokkering av fartøyet, og kan ofte ha svekkende og varige effekter 1,2. En svært verdifull strategi for å evaluere fysiopatologien etter iskemisk hjerneslag og identifisere og teste nye behandlinger er bruken av smådyrmodeller i laboratoriet. Behandlinger oppdaget i laboratoriet tar sikte på å bli oversatt til klinisk bruk og forbedre pasientens liv. Imidlertid må bruken av dyr i biomedisinsk forskning vurderes nøye i henhold til Russell og Burchs 3Rs-prinsipper: erstatning, reduksjon og forfining3. Målet med reduksjonskomponenten er å redusere antall dyr uten at det går på bekostning av datainnsamlingen. Med dette i bakhodet gir det å kunne evaluere lesjonsutviklingen i lengderetningen via ikke-invasiv avbildning en stor fordel når det gjelder å redusere antall dyr som kreves, samt maksimere informasjonen fra hvert dyr4.

Fotoakustisk tomografi (PAT) er en hybrid bildebehandlingsmodalitet som kombinerer optisk absorpsjonskontrast med ultralydavbildning romlig oppløsning5. Bildemekanismen til PAT er som følger. En eksitasjonslaserpuls lyser på målet som avbildes. Forutsatt at målet absorberer lys ved bølgelengden til eksitasjonslaseren, vil den øke i temperatur. Denne raske temperaturøkningen resulterer i en termoelastisk utvidelse av målet. Utvidelsen fører til at en ultralydbølge forplanter seg ut fra målet. Ved å oppdage ultralydbølgen i mange posisjoner, kan tiden det tar for bølgen å forplante seg fra målet til detektorene brukes til å lage et bilde gjennom en rekonstruksjonsalgoritme. Evnen til PAT til å oppdage optisk absorpsjon i dype vevsregioner skiller PAT fra ultralydavbildning, som oppdager grenser for forskjellige akustiske impedanser av vev5. I de synlige og nær-infrarøde spektrene er de primære høyt absorberende biomolekylene som er rikelig i organismer hemoglobin, lipider, melanin og vann7. Av spesiell interesse for studiet av hjerneslag er hemoglobin. Siden oksyhemoglobin og deoksyhemoglobin har forskjellige optiske absorpsjonsspektra, kan PAT brukes med flere eksitasjonslaserbølgelengder for å bestemme den relative konsentrasjonen av de to tilstandene i proteinet. Dette gjør at oksygenmetningen av hemoglobin (sO2), eller oksygenering av blod, kan kvantifiseres i og utenfor infarktområdet 8,9. Dette er et viktig tiltak i iskemisk slag, da det kan indikere nivået av oksygen i det skadede hjernevævet etter iskemi.

Akustisk angiografi (AA) er en kontrastforsterket ultralydavbildningsmetode som er spesielt nyttig for avbildning av morfologien til vaskulatur in vivo10. Metoden er avhengig av bruk av en dobblersvinger (et lavfrekvent element og et høyfrekvent element) i forbindelse med mikrobobler injisert i sirkulasjonssystemet til bildesubjektet. Det lavfrekvente elementet i transduseren brukes til overføring ved resonansfrekvensen til mikroboblene (f.eks. 2 MHz), mens høyfrekvente element brukes til å motta superharmoniske signaler fra mikroboblene (f.eks. 26 MHz). Når de eksiteres ved en resonansfrekvens, har mikroboblene en sterk ikke-lineær respons, noe som resulterer i produksjon av superharmoniske signaler om at omgivende kroppsvev ikke produserer11. Ved å motta med et høyfrekvent element, sikrer dette at bare mikroboblesignalene oppdages. Siden mikroboblene er begrenset til blodkarene, er resultatet et angiografisk bilde av blodkarmorfologi. AA er en kraftig metode for avbildning av iskemisk slag, da mikroboblene som strømmer gjennom sirkulasjonssystemet, ikke kan strømme gjennom blokkerte kar. Dette gjør det mulig for AA å oppdage regioner i hjernen som ikke er perfusert på grunn av iskemisk slag, noe som indikerer infarktområdet.

Preklinisk iskemisk hjerneslagforskning er generelt avhengig av bruk av histologi og atferdstesting for å vurdere plasseringen og alvorlighetsgraden av hjerneslaget. Trifenyltetrazoliumklorid (TTC) farging er en vanlig histologisk analyse som brukes til å bestemme slaginfarktvolumet. Det kan imidlertid bare brukes på et endepunkt, siden det krever at dyret avlives12. Atferdstester kan brukes til å bestemme motorisk funksjonsnedsettelse på flere tidspunkter, men de kan ikke gi kvantitative anatomiske eller fysiologiske verdier13. Biomedisinsk bildebehandling gir en mer kvantitativ tilnærming til å studere effekten av iskemisk hjerneslag ikke-invasivt og langsgående 9,14,15. Imidlertid kan eksisterende bildebehandlingsteknologier (for eksempel smådyrmagnetisk resonansavbildning [MRI]) komme til en høy pris, ikke kunne gi samtidig strukturell og funksjonell informasjon, eller ha begrenset penetrasjonsdybde (som de fleste optiske bildebehandlingsteknikker).

Her kombinerer vi fotoakustisk, ultralyd og angiografisk tomografi (PAUSAT; se systemdiagram i figur 1), som muliggjør komplementær strukturell og funksjonell informasjon om blodperfusjon og oksygenering etter iskemisk hjerneslag16. Dette er to viktige aspekter ved å vurdere alvorlighetsgraden av skade og overvåke gjenoppretting eller respons på behandlinger. Ved hjelp av disse integrerte bildebehandlingsmetodene kan øke mengden informasjon som er oppnådd av hvert dyr, redusere antall dyr som kreves og gi mer informasjon i studiet av potensielle behandlinger for iskemisk slag.

Figure 1
Figur 1: PAUSAT-diagram. (A) Komplett skjematisk fremstilling av PAUSAT-systemet, inkludert laseren og OPO som brukes til PAT. (B) Sett fra innsiden av PAUSAT-systemet, inkludert to ultralydtransdusere. Dual-element wobblertransduseren brukes til både B-modus ultralyd og AA, og lineær-array-transduseren brukes til PAT. Begge transduserne er montert på samme 2D-motoriserte trinn, noe som gjør det mulig for skanning å generere volumetriske data. Dette tallet er endret fra16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Duke University Medical Center Animal Care and Use Committee og ble utført i samsvar med USAs offentlige helsetjenestes policy for human omsorg og bruk av forsøksdyr. Hann- og hunnmus av typen C57BL/6J (se materialfortegnelse) ble brukt i disse studiene. Minst tre dyr ble avbildet per slagmodellgruppe. Se figur 2 for arbeidsflyten som følges i denne protokollen.

Figure 2
Figur 2 Oppsummering av eksperimentell prosedyre for PAUSAT-avbildning anvendt på hjerneslag. Laget med Biorender.com. Figuren viser arbeidsflyten for avbildningsprosedyren med utgangspunkt i (A) de to hovedslagmodellene (pMCAO og PT-hjerneslag). (B) En retroorbital injeksjon av mikroboblene må utføres før dyret plasseres på PAUSAT-membranen. (C) En maske som gir kontinuerlig anestesi og en varmepute for å holde dyrets kroppstemperatur stabil er nødvendig i dette oppsettet. Dyrets kropp er plassert på varmeputen mens hodet hviler på membranen i systemet. (D) Rekkefølgen på bildeopptak vises også i figuren. (E) TTC-farging utføres for å validere resultatene våre i denne studien. DPI: dager etter skaden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

1. Indusere slagmusemodellen

  1. Permanent okklusjon av arteria media (pMCAO) med ligering av arteria carotis communis (CCA).
    MERK: Utfør kort permanent ligering av høyre CCA og posterior elektrokauterisering av høyre arteria cerebri media (MCA)17. Denne prosedyren begrenser den cerebrale blodstrømmen i høyre cortex i hjernen, forårsaker et iskemisk slag18.
    1. Indusere anestesi i et induksjonskammer ved bruk av en inhalasjonsblanding på 5,0 % isofluran i 30 % O2/70 %N2 inntil tap av bevissthet (anerkjent som tap av pedalrefleksen).
    2. Intuber dyret ved hjelp av et 20 G kateter (materialfortegnelse) og koble det til en automatisk ventilator. Still strømningshastigheten basert på dyrets kroppsvekt og hold dyret bedøvet ved bruk av 1,5% -2,0% isofluran i 30% O 2/70% N2.
    3. Bruk en varmelampe og en rektal sonde koblet til en temperaturregulatorenhet, og hold dyrets kroppstemperatur på 37 °C.
    4. Sett en dråpe smøremiddel øyesalve på musens øyne.
    5. Plasser dyret i en liggende stilling og fjern håret fra nakkeområdet ved hjelp av en hårtrimmer.
    6. Rengjør hudområdet ved først å bruke en bomullspinne med povidon-jod, og bruk deretter en steril pute med 70% etanol. Utfør dette tre ganger.
    7. Bekreft dybden av anestesi og fravær av smerte ved å klemme dyrets bakre pote litt.
    8. Lag et 0,8 cm sagittalt snitt på midtlinjen i nakken og avslør høyre CCA.
    9. Forbered en sutur for CCA-ligeringen ved å dissosiere en 4-0 silkesutur i tynnere tråder som komponerer hovedtråden. Bruk en lengde på 1,5 cm av en av undertrådene for å permanent ligere CCA.
      NOTAT: Etter å ha strammet knuten, fjern overflødig gjenge ved å kutte forlengelsen med 1-2 mm avstand til knuten.
    10. Påfør en dråpe bupivakain før du lukker såret.
    11. Lukk snittet ved hjelp av avbrutte 4-0 silke kirurgiske suturer og bruk trippel antibiotisk salve på overflaten for å forhindre infeksjon.
    12. Beveg musen for å eksponere høyre sideside av dyrets kropp.
    13. Fjern håret i området mellom øret og øyet ved hjelp av en hårtrimmer.
    14. Desinfiser operasjonsområdet ved hjelp av en bomullspinne med povidon-jod, etterfulgt av en steril pute med 70% etanol. Gjenta dette trinnet tre ganger.
    15. Plasser en steril drapering for å sikre det kirurgiske området. Deretter gjør du et 0,5 cm snitt mellom dyrets høyre øye og øre, og utsetter leddet mellom skallen og den tidlige muskelen.
    16. Bruk en cautery loop, cauterize muskelen for å skille den fra skallen og avsløre området av MCA.
    17. Bor et 0,2 mm2 vindu for å eksponere MCA ved hjelp av en elektrisk drill, og bruk elektrokauteri på MCA for å okkludere blodstrømmen.
      MERK: En enkelt puls med 80% effektintensitet er nok til å cauterize MCA.
    18. Bruk en 1 ml sprøyte festet til en 27G nål, påfør en dråpe bupivakain (materialfortegnelse) på operasjonsstedet.
    19. Lukk hudsnittet ved å avbryte 6-0 klare monofilamentsuturer og påfør trippel antibiotisk salve på overflaten for å forhindre infeksjon.
    20. Etter å ha fullført operasjonen, overfør dyret til en inkubator med kontrollert temperatur (32 ° C) og la dyret komme seg.
    21. Etter 2 timer, overfør dyret til hjemmeburet og gi mat og vann ad libitum.
  2. Fototrombotisk hjerneslag (PT-slag)
    MERK: Kort fortalt utføres PT-slag ved å belyse Rose Bengal i karene i hjernen. Rose Bengal administreres intraperitonealt, og når den har blitt godt fordelt over hele kroppen (5 min), blir den opplyst av et grønt kaldt lys som aktiverer Rose Bengal for å generere reaktive oksygenarter (ROS). Disse ROS skader membranen til endotelceller, skaper trombi i hele det opplyste området og fører til lokal cerebral blodstrømforstyrrelse19.
    1. Indusere anestesi i et induksjonskammer ved bruk av en inhalasjonsblanding på 5,0 % isofluran i 30 % O2/70 %N2 inntil tap av bevissthet (anerkjent som tap av pedalrefleksen).
    2. Sett dyret til en stereotaktisk ramme, hold dyret bedøvet ved hjelp av en maske og 1,5% -2,0% isofluran i 30% O 2 / 70% N2.
    3. Hold dyret ved 37 °C ved hjelp av en varmtvannsresirkulerende varmeovn og en rektalsonde for å måle dyrets kroppstemperatur.
    4. Sett en dråpe smøremiddel øyesalve på musens øyne.
    5. Barber dyrets hode ved hjelp av en hårtrimmer.
    6. Rengjør det barberte hodebunnsområdet tre ganger, bruk først en bomullspinne med povidon-jod, og bruk deretter en steril pute med 70% etanol.
    7. Bekreft fraværet av smerte ved å klemme dyrets bakre pote litt.
    8. Lag et 1,4 cm sagittalt snitt på midtlinjen i hodebunnen ved hjelp av en skalpell og avslør skallen.
    9. Bruk en skarp blyant til å lage et merke på 1,5 mm fra bregmaen mot høyre side.
    10. Plasser et sirkulært knappenålshull med en diameter på 2,5 mm i midten på 1,5 mm-merket.
      MERK: En firkant som inneholder et sirkulært pinhole kan gjøres ved å bruke dobbeltsidig svart tape og lage en 2,5 mm diameteråpning i midten ved å bruke et hullhullverktøy av nevnte størrelse.
    11. Plasser det grønne kalde lyset på det sirkulære knappenålshullet, og hold gapet mellom lyset og pinhole til et minimum.
    12. Dekk området med aluminiumsfolie for å unngå spredning av lyset.
    13. Når oppsettet er klart, injiser dyret intraperitonealt med 10 mg/kg Rose Bengal (10 mg/ml i 1x fosfatbufret saltvann [PBS]) og vent i 5 minutter.
    14. Etter 5 min, slå på kaldlyskilden (intensitet: 4.25) og oppretthold eksponeringen i 15 minutter.
    15. Deretter slår du av det kalde lyset og kontrollerer slaget enten med det blotte øye (området forventes å være hvitere enn omgivelsene) eller ved hjelp av eksterne enheter for å måle cerebral blodstrøm (for eksempel ved å bruke laserflekkkontrastavbildning (materialfortegnelse; se trinn 5.1).
    16. Bruk en 1 ml sprøyte festet til en 27G nål, påfør en dråpe bupivakain (materialfortegnelse) på operasjonsstedet.
    17. Lukk hudsnittet ved hjelp av avbrutte 6-0 klare monofilamentsuturer, og påfør trippel antibiotikasalve på overflaten for å forhindre infeksjon.
    18. Etter å ha fullført operasjonen, overfør dyret til en inkubator med kontrollert temperatur (32 ° C) og la dyret komme seg.
    19. Etter 2 timer, overfør dyret til hjemmeburet og gi mat og vann ad libitum.

2. Klargjøre PAUSAT for avbildning

  1. Slå på laseren på 532 nm og la den være på i 15 minutter for å varme opp.
  2. Forbered bildebehandlingsplattformen for det bedøvede dyret.
    1. Plasser en tilpasset rampe (figur 2C) festet til det manuelt justerbare trinnet (materialfortegnelse) ved siden av avbildningsmembranen.
    2. Fest en musetannholder med pusterøret koblet til den tilpassede rampen og fest en varmepute på overflaten av rampen.
  3. Etter at laseren har varmet opp, må du kontrollere at laserbanen og koblingen til fiberbunten er godt justert ved hjelp av et nær-infrarødt detektorkort (materialfortegnelse) ved å plassere kortet foran fiberbuntinngangen og sikre at laserlyset kommer inn i bunten.
    MERK: Juster eventuelle laserbanespeil etter behov for å sikre at laserinngangen er sentrert med fiberbuntinngangen.

3. Klargjøre dyret for PAUSAT

MERK: PAUSAT utføres 1 dag etter PT-slagoperasjon eller 3 dager etter pMCAO-kirurgi. Klargjøring av PAUSAT for avbildning (trinn 2) tar ca. 20 minutter og bør gjøres umiddelbart før dyret tilberedes for PAUSAT.

  1. Indusere anestesi i et induksjonskammer ved bruk av en inhalasjonsblanding av 5 % isofluran blandet med 30 % O2/70 %N2 inntil tap av bevissthet (anerkjent som tap av pedalrefleksen).
  2. Overfør dyret til en oppvarmet plattform med en tannholder og en maske, og oppretthold anestesien ved 1,5% -2,0% isofluran i 30% O 2/70% N2.
  3. Bruk en varmelampe og en rektal sonde koblet til en temperaturregulatorenhet for å holde dyrets kroppstemperatur på 37 °C.
  4. Trim håret på toppen av dyrets hode ved å bruke en barbermaskin. Inkluder regionen fra nær øynene til bak ørene.
  5. Barber håret på toppen av dyrets hode ved å bruke en kommersiell hårfjerningskrem for å fjerne det gjenværende korte håret helt. La stå på huden i 5-6 min, og tørk deretter av med en bomullspinne dabbet i vann for å fjerne kremen helt. Gjenta til huden er fri for hår.
    MERK: For avbildning 1 dag etter operasjonen, kan disse trinnene utføres før du starter operasjonen; på 1 dag etter PT-slag, kan de utelates. Når PAUSAT bildeopptak utføres flere dager etter operasjonen, er dette trinnet kritisk nødvendig å bli utført.
  6. Når dyret og systemet er klart for avbildning, og rett før dyret overføres til systemets plattform, injiser en 100 μL-løsning av mikrobobler ved stamkonsentrasjonen (materialtabellen) retro-orbitalt ved hjelp av en 27 G nål.
    MERK: Når boblene er i omløp i blodet, er det begrenset tid til å avbilde uten betydelig tap av signal (~ 10 min).
  7. Sett en dråpe øyevern lotion på musens øyne.
    MERK: Det anbefales ikke å bruke øyesmøremiddel før retro-orbital injeksjon utføres for å unngå at fremmede stoffer når dyrets blodstrøm. Derfor må påføring av hårfjerningskrem utføres sakte og forsiktig for å unngå å komme for nær øynene (men nok til å eksponere interesseområdet der slaget forventes). Hårkremfjerningen utføres med en bomullspinne som tidligere er dabbet i vann, og forhindrer at kremen drypper, noe som kan skade øynene.

4. PAUSAT-avbildning

MERK: Dette gjøres for å avbilde de kontra- og ipsi-laterale områdene i hjernen etter slag

  1. Overfør musen til den integrerte PAUSAT-bildeplattformen (Table of Materials), og plasser musen i liggende posisjon på den tilpassede rampen (figur 2C).
  2. Fyll bildevinduet med nok destillert vann på overflaten for akustisk kobling.
    MERK: En valgfri rampe - trykt med en 3D-skriver - anbefales for å forhindre at dyrets kropp blir våt under bildeopptaket og forbedre dyrets komfort. Det bidrar også til å opprettholde en stabil kroppstemperatur. Videre kan rampen festes til et manuelt trinn (materialfortegnelse) for å justere brennvidden til wobblersvingeren med to elementer i forhold til musehodet. Den tilpassede rampedesignfilen er tilgjengelig på forespørsel til forfatterne.
  3. Fest musehodet i tannholderen og sørg for riktig anestesi og luftstrøm.
  4. Bruk en varmelampe og en rektal sonde koblet til en temperaturregulatorenhet, og hold dyrets kroppstemperatur på 37 °C.
  5. Åpne bildebehandlingsprogrammet (Materialfortegnelse) og naviger til ultralyd i B-modus.
  6. Bruk live ultralydvinduet til å manuelt justere musehodet til ønsket posisjon.
  7. Bruk live ultralydvinduet til å justere høyden på trinnet, slik at brennvidden til transduseren (19 mm) er omtrent midt i området som skal avbildes.
  8. Avbildning med B-modus ultralyd
    1. Juster verdien av ultralydoverføringsfrekvensen i B-modus (for disse studiene, bruk 16 MHz).
    2. Skriv inn lagringskataloginformasjonen i bildebehandlingsprogrammet.
    3. Bruk den flytende boksen til å velge ønsket region for B-modusskanningen av hjernen.
    4. Trykk på Skaff statisk-knappen .
    5. Kontroller resultatene av skanningen i applikasjonen når bildeoppkjøpet er fullført for å sikre at ønsket region er avbildet.
      MERK: Unngå unødvendige forsinkelser i B-modus imaging oppkjøp for å sikre at en høy nok konsentrasjon av mikrobobler forblir i blodet for AA.
  9. Avbildning med AA
    1. Gå tilbake til bildeopptak.
    2. Bytt til akustisk angiografimodus i bildebehandlingsprogrammet (materialfortegnelse).
    3. Skriv inn de ønskede skanneprotokollparametrene (hvorav det viktigste er rammeavstand og antall bilder per posisjon, som ble satt til henholdsvis 0, 2 mm og 10 for disse studiene).
    4. Trykk på Skaff statisk-knappen .
      MERK: AA-oppkjøpet tar lengre tid enn B-modus ultralyd.
    5. Når skanningen er fullført, kontrollerer du resultatene av skanningen under Bildeanalyse for å sikre at bildekvaliteten er som forventet.
      MERK: For AA-modus kan et mer representativt helhjernevolum oppnås ved å gjenta en andre skanning på en annen brennvidde inne i hjernen og senere rekombinere bildene med riktig etterbehandling (se figur 3).
  10. Avbildning med fotoakustisk tomografi
    1. Åpne applikasjonen for optisk parametrisk oscillator (OPO) (materialfortegnelse) og sett den til 756 nm.
      MERK: OPO-er kan enkelt komme seg ut av kalibrering, så før eksperimentet må du sørge for at OPO er kalibrert riktig ved hjelp av et uavhengig spektrometer.
    2. Oversett lineær-array-transduseren manuelt til de tidligere bestemte koordinatene for å sikre at wobblervolumene og lineær-array-volumene automatisk registreres samtidig.
      MERK: Det er avgjørende at et samregistreringseksperiment ved hjelp av et fantomrutenett gjøres på forhånd for å bestemme den nøyaktige avstanden som trengs for å oversette scenen, slik at de resulterende dataene fra begge transduserne blir samregistrert i 3D.
    3. Åpne laserapplikasjonen og slå på laseren på 532 nm.
    4. Ved hjelp av en laserstrømmåler måler du energien til laserutgangen og sørger for at det er ønsket energi (~ 10 mJ per puls ble brukt til disse studiene).
    5. Velg ønskede skanneparametere for PAT (trinnstørrelse på 0,4 mm, 20 mm skannelengde og gjennomsnittlig 10 bilder per posisjon).
    6. Åpne ultralyddatainnsamlingssystemet MATLAB-programmet (Materialfortegnelse) og trykk på Kjør-knappen .
    7. Hent PAT-skanningen ved å trykke på Start-knappen .
    8. Når skanningen er fullført, åpner du lagringsprogrammet MATLAB. Endre lagringsnavnet til ønsket filnavn og trykk på Kjør-knappen .
    9. Endre OPO-bølgelengden til 798 nm og gjenta trinnene fra 4.10.3 til 4.10.8.
      MERK: For en longitudinell studie anbefales det å la dyret gjenopprette ved å plassere det i en inkubator og under observasjon i noen timer (etter trinn 1.1.18 og 1.1.19). Hvis resultatvalidering ønskes, fortsett til avsnitt 5 umiddelbart etter avbildning av PAUSAT.

5. Valgfritt: Validering av resultater

  1. Laser speckle kontrastavbildning (LSCI).
    1. Bedøv dyret med 1,5%-2,0% isofluran i 30% O2/70%N2.
    2. Sett dyret til en stereotaksisk ramme, hold dyret bedøvet ved hjelp av en maske og ovennevnte inhalasjonsbedøvelse.
    3. Hold dyret ved 37 °C ved hjelp av en varmtvannsresirkulerende varmeovn og en rektalsonde for å måle dyrets kroppstemperatur.
    4. Sett en dråpe øyevern lotion på musens øyne.
    5. Bekreft fraværet av smerte ved å klemme dyrets bakre pote litt.
    6. Fjern håret på dyrets hodebunn ved hjelp av en hårtrimmer.
    7. Desinfiser operasjonsområdet ved hjelp av en bomullspinne med povidon-jod, etterfulgt av en steril pute med 70% etanol. Gjenta dette trinnet tre ganger.
    8. Lag et 1,4 mm sagittalt snitt på midtlinjen i hodebunnen og avslør skallen. Bruk tang for å holde hodebunnen og forhindre at den opptar området av hjernen for å skanne.
    9. Påfør noen dråper saltvann på skallen og plasser laserflekkkontrastsystemenheten (materialfortegnelse) over dyrets hode.
    10. Under Fil-menyen setter du enheten i tilkoblet modus, som finnes i undermenyen Arbeidsmodus.
    11. Velg standard bildelagringsmappe på Fil-menyen og undermenyen Lagre innstillinger .
    12. I lyskildemenyen kobler du til den veiledende laseren ("Laser på") og det hvite lyset ("Hvitt lys på") for å plassere bildevinduet i riktig posisjon.
    13. Velg Forstørrelsesinnstillinger på innstillingsmenyen, flytt markøren manuelt til 2.5, og trykk Bruk og OK for å lagre innstillingene.
    14. Juster fokus ved å flytte fokuslinjen manuelt på den øverste undermenyen på hovedsiden.
    15. I innstillingsmenyen velger du Pseudofargeterskelinnstilling, justerer terskelen etter ønske, og trykker på Bruk og OK for å lagre innstillingene.
    16. I Lyskilde-menyen kobler du fra guidelaseren ("Laser av") og det hvite lyset ("Hvitt lys av") før du tar bildet.
    17. Ta bildet ved å velge Spill av-symbolet i den øverste undermenyen på hovedsiden.
  2. Farging av trifenyltetrazoliumklorid (TTC)
    1. Dypt bedøve dyret ved bruk av 5% isofluran i 30%O2/70% N2.
    2. Når dyret har sluttet å puste, halshugg det med skarp saks.
    3. Fjern all huden rundt hodet og musklene i nakkeområdet.
    4. Lag et sagittalt kutt i den occipitale delen av skallen til den når parietalbenet.
    5. Lag et horisontalt kutt (~ 5 mm) i venstre og høyre side under blodkaret. Fjern det occipitale beinet i skallen ved hjelp av rette tang.
    6. Lag et kutt (~ 5 mm) ved frontonasal sutur av skallen.
    7. Lag et sagittalt kutt (~ 10-15 mm) i midtlinjen av skallen - mellom halvkule - og sørg for at de er helt skilt.
    8. Bruk størrelse # 7 buet saks, fjern parietale venstre og høyre bein av skallen fra midten til sidene.
    9. Overfør hjernen til en beholder fylt med 5 ml iskald 1x PBS og hold den på is i 10 minutter.
    10. Overfør hjernen til en hjernematrise i rustfritt stål (1 mm tykke seksjoner).
    11. Seksjon hjernen i 1 mm koronale seksjoner ved hjelp av engangs barberblader (materialfortegnelse).
    12. Hold bladene ved sidene, overfør til en beholder fylt med iskald 1x PBS.
    13. Skill forsiktig seksjonene fra bladene en etter en.
    14. Overfør hjerneskivene til en petriskål med diameter på 70 mm som inneholder 5 ml 2% TTC (materialfortegnelse, 3) i 1x PBS.
    15. Inkuber i 15 minutter i mørket ved romtemperatur (R/T).
    16. Etter 15 min, kast TTC, erstatt den med 3 ml formalin, og rug i mørket i minst 30 minutter ved R / T.
    17. Til slutt overfører du hjerneskivene til en gjennomsiktig plastfilm og skanner prøvene, inkludert en linjal i skannebildet som referanse for fremtidige målinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Avbildning av blodkarmorfologi i hjernen
AA genererer blodkarmorfologibilder ved spennende mikrobobler i sirkulasjonssystemet ved deres resonansfrekvens og mottar den superharmoniske responsen til mikroboblene. Ved å bruke den tilpassede rampen (figur 2C) festet til et manuelt justerbart trinn, kan vi avbilde musehjernen med AA-modus på to forskjellige brennvidder. Når dypere regioner er målrettet, viser mer overfladiske regioner (som hjernebarken) en dårligere oppløsning og signalstyrke (figur 3A), og omvendt (figur 3B). Men ved å anskaffe to brennvidder og kombinere dem, kan AA-bilder gi informasjon om et helt koronalt snitt (figur 3C,D). I tillegg, ved å bruke det motoriserte trinnet til å skanne langs en tredje dimensjon, kan PAUSAT registrere en serie koronale bilder som dekker interesseområdet (ROI) definert av brukeren. Disse seriene av bilder kan justeres og brukes til å visualisere en 3D-representasjon av hele hjernen, eller avkastningen definert av brukeren. Imidlertid er ytterligere resultater som viser at andre kvantitative mål (for eksempel slagvolumet) kan analyseres ved hjelp av 3D-informasjonen fra samlingen av bilder anskaffet av PAUSAT, også gitt her.

Anatomisk og funksjonell evaluering før og etter iskemisk hjerneslag
For å illustrere potensialet til PAUSAT-systemet i prekliniske studier, studerte vi to grupper av dyr utsatt for en av modellene av iskemisk hjerneslag analysert her: pMCAO eller PT-slag. Disse to slagmodellene er forskjellige i prinsippene ved hvilke den iskemiske regionen er opprettet. Kort, i pMCAO-modellen, er den midterste hjernearterien elektrokauterisert, og stopper blodtilførselen fra denne arterien til hjernen. Denne skaden utløser en sekundær skade, hvor omgivende vev blir iskemisk, forstørrer området som er berørt av hjerneslaget. Vi bestemte oss for å avbilde pMCAO-hjerneslaget på dag tre etter hjerneslaget, fordi dette er tidspunktet da det maksimale arealet som forventes å bli påvirket av hjerneslaget, oppnås. Ved PT-hjerneslag oppnås imidlertid det maksimale vevsarealet som er rammet av hjerneslaget etter den første dagen, så vi bestemte oss for å avbilde PT-hjerneslag på dag én etter at hjerneslaget ble utført. Selv om vi valgte disse tidspunktene i vår studie, kan PAUSAT brukes til longitudinell monitorering av hjerneslag på ønsket tidspunkt.

Først ble det anskaffet en B-modus-skanning for å sikre riktig posisjon av dyrets hode og identifisere de romlige grensene mellom skallen og hjernen (figur 4A og figur 5A). Den fremste delen av hjernen som er avbildet, inkluderer den frontonasale suturen av skallen som et referansepunkt. En avkastning på 20 mm (fremre til bakre) x 17,15 mm (lateral) som dekker venstre (kontralateralt; CL) og høyre (ipsilateral; IL) hemisfærer ble definert i følgende studier for å lokalisere slagregionen. AA-bilder ga informasjon om blodkarets strukturer ved å målrette signalet fra de sirkulerende mikroboblene. Våre resultater viser at i den uskadde hjernen (baseline) har begge hemisfærer en lik fordeling av blodkar (figur 4B og figur 5B), som forventet i fravær av skade. Et lignende resultat er observert for vevsoksygeneringskartfordelingen basert på PA-bilder oppnådd ved to forskjellige bølgelengder (figur 4C og figur 5C). Vi bestemte oss for å evaluere to forskjellige bølgelengder basert på den lokale maksimale optiske absorpsjonen for deoksygenert hemoglobin (756 nm) og bølgelengden der det deoksygenerte og oksygenerte hemoglobinet presenterte lik optisk absorpsjon (798 nm) 20. Ved å fange disse to tilstandene av hemoglobin, kan vi nøyaktig estimere oksygenering av vev (figur 4D og figur 5D).

Dagen etter at vi hadde fått utgangsbildet fra hjernen, utførte vi kirurgi på dyret (pMCAO eller PT-slag), som beskrevet i tidligere avsnitt. Et nytt sett med bilder ble tatt på et bestemt tidspunkt etter hjerneslaget (se figur 2A) for å evaluere plasseringen og størrelsen på hjerneslaget. AA-bildene tatt fra mus utsatt for pMCAO viser en merkbar reduksjon i intensiteten av signalet i høyre lateral av cortex (figur 4B). Den samme regionen viser en reduksjon i vevsoksygeneringskartet fra PA-bilder, noe som tyder på et iskemisk område (figur 4D). For å validere resultatene våre bestemte vi oss for å høste hjernen og utføre TTC-farging umiddelbart etter å ha kjøpt bildene fra slagdyret. Våre resultater viser at området identifisert som hjerneslag er likt sammenlignet med våre resultater fra PAUSAT og den veletablerte TTC-fargingen (figur 4B-E). Vi viser også her at PAUSAT kan identifisere slagområder i hjernen ved hjelp av en annen modell for hjerneslag, PT-hjerneslag, evaluert på et tidligere tidspunkt etter hjerneslaginduksjon (1 dag). Som vist i figur 5B kunne vi identifisere et område i øvre del av cortex med redusert blodtilførsel og samtidig reduksjon i oksygenmetning (figur 5D). Resultatene oppnådd fra TTC-farging samsvarer med plasseringen og størrelsen på slaget som tidligere ble identifisert av PAUSAT (figur 5B-E).

Alderen på musen som avbildes, kan ha stor innvirkning på bildekvaliteten. Hodeskallen til en mus blir tykkere med alderen, og siden skallen har en betydelig forskjellig akustisk impedans i forhold til bløtvev, reflekteres en stor prosentandel av ultralydbølgene ved skallegrensen. Fordi disse integrerte bildebehandlingssystemene alle er akustisk-baserte, fører dette til en reduksjon i bildedybden for eldre mus. Dette kan tydelig sees i figur 6, hvor mus i tre forskjellige aldre ble avbildet med AA under de samme forholdene. Lignende lavsignalresultater forventes hvis avbildningsprosedyren ikke følges som tidligere beskrevet.

Kvantitativ analyse av slagvolumet ved hjelp av PAUSAT
Som beskrevet i de ovennevnte resultatene, tar PAUSAT en serie koronale bilder rettet mot en avkastning beskrevet av brukeren. Vi analyserte volumet av hjerneslag ved å beregne strekområdet innenfor de forskjellige koronabildene og avstanden mellom bildene. Slagvolumet beregnet av PAUSAT viser ingen statistisk forskjell (p < 0,05) sammenlignet med slagvolumet beregnet ut fra en lignende tilnærming ved bruk av TTC-fargebilder (figur 7).

Figure 3
Figur 3: Effekt av brennvidde på wobblersvinger på kvaliteten på AA-bilder. Bilder på flere brennvidder kan anskaffes og senere kombineres for å produsere de beste bilderesultatene for hele hjernen. (A) AA koronal seksjon ervervet på en dypere brennvidde. (B) AA koronal seksjon ervervet på en mer overfladisk brennvidde. (C) Resultat av sammensmelting av bilder med dypere fokus (grønn) og mer overfladisk fokuserte (magenta). (D) Resultatet av å kombinere dypere fokus og mer overfladisk fokuserte bilder med en pikselskalaverdi som kan sammenlignes med (A) og (B). Dette tallet er endret fra16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative PAUSAT-resultater fra musehjerne (# 1) før og etter pMCAO-hjerneslag. (A) Baseline og post-stroke B-mode ultralyd koronale bilder. (B) AA-koronabilder ved baseline og etter hjerneslag. (C) Baseline og post-stroke PA koronale bilder ved 756 nm eksitasjon. (D) Oksygenmetningskart basert på eksitasjonsbilder på 756 nm og 798 nm. (E) TTC-fargede deler av en musehjerne, som viser samme hjerneslagområde. Avstanden mellom linjene nederst på bildet representerer 1 mm. Dette tallet er endret fra16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative PAUSAT-resultater fra mus (# 2) før og etter PT-hjerneslag. (A) Baseline og post-stroke B-mode ultralyd koronale bilder. (B) AA-koronabilder ved baseline og etter hjerneslag. (C) Baseline og post-stroke PA koronale bilder ved 756 nm eksitasjon. (D) Oksygenmetningskart basert på eksitasjonsbilder på 756 nm og 798 nm. (E) TTC-fargede deler av en musehjerne, som viser samme hjerneslagområde. Avstanden mellom linjene nederst på bildet representerer 1 mm. Dette tallet er endret fra16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Effekten av museens alder på kvaliteten på AA-bilder. Denne figuren viser forskjellen i AA-signalintensitet og bildedybde når dyr fra forskjellige aldre avbildes under sammenlignbare forhold. Som vist på figuren, produserer eldre mus (18 måneder) bilder av lavere kvalitet på grunn av størrelsen og tykkelsen på skallen sammenlignet med yngre mus (1,5 måneder), mens voksne mus viser et mellomsignal (6 måneder). På grunn av den store akustiske impedansfeilen mellom skallen og hjernevevet, reflekteres ultralydbølger som forplanter seg gjennom skallen og brytes, noe som fører til signaltap og oppløsningsforringelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Analyse av volumet av iskemisk slag. (A) Eksempel på TTC-seksjoner fra PT-slag og tilsvarende TTC-segmenterte bilder, AA-bilder og AA-segmenterte bilder på sammenlignbare koronale steder. (B) Slagvolumet beregnet basert på TTC- og AA-bilder for pMCAO- og PT-slag, og viste ingen signifikante forskjeller (p > 0,05). Grafen viser gjennomsnittet ± standardavvik (S.D.) (n = 3 dyr per gruppe). Dette tallet er endret fra16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er noen viktige aspekter ved denne metoden som, hvis den gjøres feil, kan føre til betydelig redusert bildekvalitet og kvantitativ analyse. Det vanligste resultatet av brukerfeil i PAUSAT-bilder er enten mangel på signal eller svært lav signalstyrke, som begge kan oppstå av en rekke årsaker. En slik grunn er et problem med den akustiske koblingen. Store luftbobler i vannet som omgir musens hode under avbildning kan ofte blokkere ultralydet fra å reise til eller fra transduseren, noe som forårsaker et skyggeområde i det resulterende bildet for alle tre modaliteter i systemet. Dette kan forhindres ved å sørge for at det er nok vann mellom systemmembranen og prøven som skal avbildes. Det kan også forekomme at det mangler AA-signal, men et overraskende høyt PA-signal, uavhengig av bølgelengdene som brukes. Dette kan skyldes tilstedeværelsen av hår - spesielt mørkt hår - som forstyrrer absorpsjonen av lyset. For å unngå dette er det nødvendig å ha barbert dyrets hode tidligere til ingen hår er visuelt identifiserbart.

Når det gjelder AA-bilder, er et annet problem som kan oppstå og vil føre til mangel på eller svært lavt signal, en lav konsentrasjon av mikrobobler som er tilstede i sirkulasjonssystemet. Hvis mikroboblene er for fortynnet eller de ble injisert feil, vil det resulterende signalet være svært svakt. Den retro-orbitale injeksjonen må kun utføres av godt trent personell. En annen årsak kan være lang tid mellom mikrobobleinjeksjon og starten av bildebehandling, noe som kan føre til en reduksjon av mikroboblene i blodet. For å unngå dette anbefales det å klargjøre systemet for avbildning før mikroboblene injiseres, slik at dyret kan overføres til PAUSAT-systemmembranen umiddelbart etter injeksjon. Det er verdt å nevne at alternative intravenøse ruter (som injeksjon i halevene) også kan brukes når dyret allerede er plassert på PAUSAT-systemmembranen, noe som forkorter tiden mellom injeksjon og avbildning. I tillegg, for å opprettholde maksimal konsentrasjon av mikrobobler mulig, anbefales det også å utføre AA-avbildning før PA-avbildning.

PA-signalet kan også påvirkes hvis de nødvendige trinnene ikke utføres riktig. Et av problemene involverer kvaliteten på eksitasjonslaseren. De to hovedkomponentene som beskriver laserkilden er pulsenergien og bølgelengden. Det anbefales sterkt å bruke en uavhengig strømmåler og spektrometer for å måle disse mengdene og sikre at de er satt til de ønskede verdiene. Hvis man antar en feil verdi, vil de funksjonelle beregningene gi misvisende resultater.

Det er også mulig at når AA- og PA-bilder kombineres, er de ute av stilling. Hovedårsaken til dette er at koordinatene som ble etablert mellom transduserne ikke var nøyaktige. For å forhindre dette er det avgjørende å utføre de nødvendige eksperimentene ved hjelp av et fantomrutenett på forhånd for å bestemme de nøyaktige koordinatene for en vellykket samregistrering av AA- og PA-bilder. En annen potensiell kilde til unøyaktighet skyldes feil kalibrering av OPO. For å redusere dette må OPO kalibreres riktig ved hjelp av et uavhengig spektrometer.

Det er fortsatt betydelige forbedringsområder, spesielt når det gjelder bildekvaliteten til PAT-komponenten i dette integrerte systemet. Det nåværende PAT-systemet er basert på en skanning lineær-array-konfigurasjon. Vi er i stand til å observere store forskjeller i oksygenering av infarkt versus sunne regioner i hjernen ved hjelp av flere slagmusemodeller, men den detaljerte vaskulaturen (mikrofartøyene) kan ikke sees. Det er to hovedproblemer som bidrar til denne lave bildekvaliteten. Den første er problemet med begrenset visning. For å lage et fullstendig rekonstruert bilde av en prøve i PAT, må detektoren helt omgi objektet (eller ha en solid vinkel på 4π). Men i den eksperimentelle settingen er dette vanskelig. Dette gir opphav til det begrensede synsproblemet, noe som fører til at blodkar som er ortogonale for transdusermatrisen, ikke kan oppdages21. Løsninger for å redusere effekten av problemet med begrenset visning i lineær-array PAT eksisterer, hvorav den mest lovende er bruken av mikrobobler som virtuelle punktkilder22. Det andre problemet med lineær-array PAT er dårlig høydeoppløsning og følsomhet, på grunn av det svake fokuset på den akustiske linsen. Imidlertid har bruken av enkeltspaltdiffraksjon i maskinvareutformingen av et lineært array-system vist seg å skape isotrop oppløsning og følsomhet for lineær-array PAT23,24. Dyplæringstilnærminger har også vist seg å delvis løse både problemet med begrenset visning og den dårlige høydeoppløsningen til lineær-array PAT25,26,27. Kombinasjonen av disse løsningene vil forbedre bildekvaliteten til PAT-komponenten i vårt integrerte bildesystem betydelig.

Her har vi presentert en ny ikke-invasiv multimodal avbildningsmetode for strukturell og funksjonell kvantifisering av iskemisk hjerneslag i preklinisk setting. Gjennom AA er klar morfologi og perfusjonskartlegging av blodkar i musehjernen mulig. En lokalt definert mangel på signal kan indikere et infarktområde hvor det er nedsatt blodperfusjon, noe som gjør det mulig å estimere infarktvolum ikke-invasivt og langsgående. Gjennom PAT kan oksygenmetningen av hemoglobin måles i og utenfor slagområdet, og viser den hypoksiske tilstanden til hjernevev i infarktområdet. Denne metoden for avbildning av hele hjernen er billig med hensyn til noen alternativer, for eksempel MR av små dyr. Videre tillater det kombinasjonen av funksjonell og strukturell informasjon i dypt vev som andre prekliniske bildebehandlingsenheter ikke klarer å oppnå. Sammenlignet med histologiske analyser tillater denne metoden måling av disse beregningene langsgående og på flere tidspunkter, i motsetning til ved et enkelt endepunkt. Evnen til å gjøre dette vil gi enestående kvantitativ detalj i den prekliniske studien av iskemisk slag. I tillegg kan den strukturelle og funksjonelle bildebehandlingsevnen til dette systemet brukes på mange prekliniske studier utover iskemisk hjerneslag28. Enhver sykdomstilstand eller biologisk fenomen som påvirker det vaskulære systemet, kan studeres i dybden ved hjelp av PAUSAT, noe som gjør det til et kraftig preklinisk bildebehandlingsverktøy som kan oversettes til mange andre prekliniske felt (f.eks. Kreft).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt i dette arbeidet.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne ingeniørteamet hos SonoVol Inc. for deres tekniske støtte. Dette arbeidet ble delvis sponset av American Heart Association Collaborative Sciences Award (18CSA34080277), til J. Yao og W. Yang; USAs National Institutes of Health (NIH) gir R21EB027981, R21 EB027304, RF1 NS115581 (BRAIN Initiative), R01 NS111039, R01 EB028143; USAs National Science Foundation (NSF) KARRIEREPRIS 2144788; Chan Zuckerberg Initiative Grant (2020-226178), til J. Yao; og NIH gir R21NS127163 og R01NS099590 til W. Yang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20 GA catheter BD Insyte Autoguard Winged 381534 For mouse intubation
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Sigma T8877 Necessary for TTC-staining brain for validation
532nm Laser Quantel Q-smart 850 Laser used to pump the OPO for PAT
Automatic Ventilator Rovent Jr. Kent Scientific RV-JR To keep mice under anesthesia during surgical procedure
Black braided silk 4-0 USP Surgical Specialties SP116 Used for sutures on the neck for pMCAO surgery
Bupivacaine Hospira 0409-1159-18 Used prior to closing wounds during surgical procedure
C57BL/6 Mice Jackson Lab #000664 Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female)
Clear suture Ethicon 8606 Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT
Cold Light LED Schott KL 1600 Needed to create PT stroke
Disposable Razor Blade Accutec Blades 74-0002 For sectioning mouse brain
Electric drill JSDA JD-700 Used to expose MCA during pMCAO procedure
Electrocauterization tool Wet-Field Wet-Field Bipolar-RG Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure
Hair removal gel Veet 8282651 Used to remove hair from mouse prior to imaging
High Temperature Cautery Loop Tip BOVIE Medical Corporation REF AA03 Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull
IR Detector Card Thorlabs VRC5 Used to ensure light path is aligned
Laser Power Meter Ophir StarBright, P/N 7Z01580 Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging
Laser Speckle Imaging System RWD Life Science Co. RFLSI-III Can be used to validate stroke surgery success
Lubricant Eye Ointment Soothe AB31336 Can be used to avoid drying of the eyes
Manually adjustable stage Thorlabs L490 Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging
Modified Vega Imaging System Perkin Elmer LLA00061 System containing both B-mode/AA and PAT transducers
Optical Parametric Oscillator Quantel versaScan-L532 Allows for tuning of excitation wavelength in a large range
Programmable Ultrasound System Verasonics Vantage 256 Used for PAT part of system
Rose Bengal Sigma 330000 Necessary to induce PT stroke
Suture LOOK SP116 Used for permanent ligation of CCA
Temperature Contoller Physitemp TCAT-2 Used to maintain stable body temperature of mice during procedures
VesselVue Microbubbles Perkin Elmer P-4007001 Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 87 (1), 179-197 (2007).
  2. Vander Worp, H. B., van Gijn, J. Clinical Practice. Acute ischemic stroke. The New England Journal of Medicine. 357 (6), 572-579 (2007).
  3. Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
  4. Hochrainer, K., Yang, W. Stroke proteomics: from discovery to diagnostic and therapeutic applications. Circulation Research. 130 (8), 1145-1166 (2022).
  5. Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nature Methods. 13 (8), 627-638 (2016).
  6. Aldrich, J. E. Basic physics of ultrasound imaging. Critical Care Medicine. 35 (5), S131-S137 (2007).
  7. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37-R61 (2013).
  8. Li, M., Tang, Y., Yao, J. Photoacoustic tomography of blood oxygenation: a mini review. Photoacoustics. 10, 65-73 (2018).
  9. Menozzi, L., Yang, W., Feng, W., Yao, J. Sound out the impaired perfusion: Photoacoustic imaging in preclinical ischemic stroke. Frontiers in Neuroscience. 16, 1055552 (2022).
  10. Gessner, R. C., Frederick, C. B., Foster, F. S., Dayton, P. A. Acoustic angiography: a new imaging modality for assessing microvasculature architecture. International Journal of Biomedical Imaging. 2013, 936593 (2013).
  11. Dayton, P. A., Rychak, J. J. Molecular ultrasound imaging using microbubble contrast agents. Frontiers in Bioscience. 12, 5124-5142 (2007).
  12. Isayama, K., Pitts, L. H., Nishimura, M. C. Evaluation of 2, 3, 5-triphenyitetrazolium chloride staining to delineate rat brain infarcts. Stroke. 22 (11), 1394-1398 (1991).
  13. Ruan, J., Yao, Y. Behavioral tests in rodent models of stroke. Brain Hemorrhages. 1 (4), 171-184 (2020).
  14. Parthasarathy, A. B., Kazmi, S. M. S., Dunn, A. K. Quantitative imaging of ischemic stroke through thinned skull in mice with Multi Exposure Speckle Imaging. Biomedical Optics Express. 1 (1), 246-259 (2010).
  15. Hingot, V., et al. Early ultrafast ultrasound imaging of cerebral perfusion correlates with ischemic stroke outcomes and responses to treatment in mice. Theranostics. 10 (17), 7480-7491 (2020).
  16. Menozzi, L., et al. Three-dimensional non-invasive brain imaging of ischemic stroke by integrated photoacoustic, ultrasound and angiographic tomography (PAUSAT). Photoacoustics. 29, 100444 (2022).
  17. Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments. (89), e51729 (2014).
  18. Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Disease Models & Mechanisms. 10 (7), 931-938 (2017).
  19. Labat-Gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments. (76), e50370 (2013).
  20. Matsumoto, Y., et al. Visualising peripheral arterioles and venules through high-resolution and large-area photoacoustic imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14930 (2018).
  21. Xu, Y., Wang, L. V., Ambartsoumian, G., Kuchment, P. Reconstructions in limited-view thermoacoustic tomography. Medical Physics. 31 (4), 724-733 (2004).
  22. Yal Tang,, et al. High-fidelity deep functional photoacoustic tomography enhanced by virtual point sources. Photoacoustics. 29, 100450 (2023).
  23. Zheng, W., Huang, C., Zhang, H., Xia, J. Slit-based photoacoustic tomography with co-planar light illumination and acoustic detection for high-resolution vascular imaging in human using a linear transducer array. Biomedical Engineering Letters. 12 (2), 125-133 (2022).
  24. Wang, Y., et al. Slit-enabled linear-array photoacoustic tomography with near isotropic spatial resolution in three dimensions. Optics Letters. 41 (1), 127-130 (2016).
  25. Vu, T., Li, M., Humayun, H., Zhou, Y., Yao, J. A generative adversarial network for artifact removal in photoacoustic computed tomography with a linear-array transducer. Experimental Biology and Medicine. 245 (7), 597-605 (2020).
  26. Zhang, H., et al. Deep-E: A fully-dense neural network for improving the elevation resolution in linear-array-based photoacoustic tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 41 (5), 1279-1288 (2022).
  27. Hauptmann, A., et al. Model-based learning for accelerated, limited-view 3-D photoacoustic tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (6), 1382-1393 (2018).
  28. Li, M., et al. Three-dimensional deep-tissue functional and molecular imaging by integrated photoacoustic, ultrasound, and angiographic tomography (PAUSAT). IEEE Transactions on Medical Imaging. 41 (10), 2704-2714 (2022).

Tags

Nevrovitenskap utgave 196
Integrert fotoakustisk, ultralyd og angiografisk tomografi (PAUSAT) for ikke-invasiv avbildning av hele hjernen av iskemisk hjerneslag
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Menozzi, L., del Águila, Á.,… More

Menozzi, L., del Águila, Á., Vu, T., Ma, C., Yang, W., Yao, J. Integrated Photoacoustic, Ultrasound, and Angiographic Tomography (PAUSAT) for NonInvasive Whole-Brain Imaging of Ischemic Stroke. J. Vis. Exp. (196), e65319, doi:10.3791/65319 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter