Summary
Detta protokoll demonstrerar en unik musmodell av hjärtstillestånd vid kvävning som inte kräver bröstkompression för återupplivning. Denna modell är användbar för att övervaka och avbilda dynamiken i hjärnans fysiologi under hjärtstopp och återupplivning.
Abstract
De flesta som överlevt hjärtstopp upplever olika grader av neurologiska brister. För att förstå de mekanismer som ligger till grund för CA-inducerad hjärnskada och därefter utveckla effektiva behandlingar är experimentell CA-forskning avgörande. För detta ändamål har några CA-modeller för möss etablerats. I de flesta av dessa modeller placeras mössen i ryggläge för att utföra bröstkompression för hjärt-lungräddning (HLR). Denna återupplivningsprocedur gör dock realtidsavbildning/övervakning av hjärnans fysiologi under CA och återupplivning utmanande. För att få sådan kritisk kunskap presenterar detta protokoll en CA-modell för asfyxi hos möss som inte kräver HLR-steget för bröstkompression. Denna modell gör det möjligt att studera dynamiska förändringar i blodflöde, vaskulär struktur, elektriska potentialer och syre i hjärnvävnad från baslinjen före CA till tidig reperfusion efter CA. Det är viktigt att denna modell gäller för åldrade möss. Således förväntas denna CA-modell för möss vara ett viktigt verktyg för att dechiffrera effekten av CA på hjärnans fysiologi.
Introduction
Hjärtstillestånd är fortfarande en global folkhälsokris1. Mer än 356 000 fall utanför sjukhus och 290 000 fall på sjukhus rapporteras årligen bara i USA, och de flesta CA-offer är över 60 år gamla. Noterbart är att neurologiska funktionsnedsättningar efter CA är vanliga bland överlevare, och dessa utgör en stor utmaning för CA-hantering 2,3,4,5. För att förstå post-CA hjärnpatologiska förändringar och deras effekter på neurologiska resultat har olika neurofysiologiska övervaknings- och hjärnvävnadsövervakningstekniker tillämpats på patienter 6,7,8,9,10,11,12. Med hjälp av nära-infraröd spektroskopi har hjärnövervakning i realtid också utförts på CA-råttor för att förutsäga neurologiska resultat13.
I murina CA-modeller har dock en sådan avbildningsmetod komplicerats av behovet av bröstkompressioner för att återställa spontan cirkulation, vilket alltid innebär betydande fysisk rörelse och därmed hindrar känsliga avbildningsprocedurer. Dessutom utförs CA-modeller normalt med möss i ryggläge, medan mössen måste vändas till bukläge för många hjärnavbildningsmodaliteter. Således krävs i många fall en musmodell med minimal kroppsrörelse under operationen för att kunna utföra realtidsavbildning/övervakning av hjärnan under hela CA-proceduren, som sträcker sig från pre-CA till post-återupplivning.
Tidigare har Zhang et al. rapporterat en CA-modell för möss som kan vara användbar för hjärnavbildning14. I deras modell inducerades CA genom bolusinjektioner av vekuronium och esmolol följt av upphörande av mekanisk ventilation. De visade att efter 5 minuters CA kunde återupplivning uppnås genom infusion av en återupplivningsblandning. Noterbart är dock att cirkulationsstillestånd i deras modell inträffade endast cirka 10 sekunder efter esmololinjektionen. Således rekapitulerar denna modell inte progressionen av asfyxi-inducerad CA hos patienter, inklusive hyperkapni och vävnadshypoxi under prearresteringsperioden.
Det övergripande målet med det aktuella kirurgiska ingreppet är att modellera klinisk asfyxi CA hos möss följt av återupplivning utan bröstkompressioner. Denna CA-modell gör det därför möjligt att använda komplexa avbildningstekniker för att studera hjärnans fysiologi hos möss15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som beskrivs här utfördes i enlighet med National Institutes of Health (NIH) riktlinjer för vård och användning av djur i forskning, och protokollet godkändes av Duke Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC). C57BL/6 han- och honmöss i åldern 8-10 veckor gamla användes för den aktuella studien.
1. Kirurgisk förberedelse
- Väg en mus på en digital våg och placera den i en 4 i x 4 x 7 i plexiglasanestesiinduktionslåda.
- Justera anestesiförångaren till 5 % isofluran, syreflödesmätaren till 30 och kväveflödesmätaren till 70 (se materialtabell).
- Ta ut djuret ur induktionslådan och lägg det på rygg på operationsbänken när andningsfrekvensen har minskat till 30-40 andetag per minut.
- Dra ut tungan med en trubbig pincett och håll den med den icke-dominanta handen. Använd den dominanta handen för att föra in ett laryngoskop (se Materialtabell) i musens mun och visualisera stämbandet.
- Använd den icke-dominanta handen för att föra in en ledare och 20 G intravenös kateter i munnen. För försiktigt in guidekabeln i luftstrupen.
- Tryck in katetern i luftstrupen tills kateterns vingdel är i jämnhöjd med nässpetsen.
OBS: Intubera inte en mus som inte är helt bedövad eftersom detta kan skada luftstrupen och orsaka luftvägsblödning. - Anslut den intuberade musen till en ventilator för smådjur (se Materialförteckning) och reducera isofluran till 1,5 %.
- Mata in musens kroppsvikt i ventilatorns kontrollpanel för att bestämma tidalvolymen och andningsfrekvensen.
- Håll musen på rygg under en värmelampa och håll rektaltemperaturen på 37 °C med en temperaturregulator.
- Raka ljumskområdena, desinficera operationsområdet minst tre gånger med jod och alkohol (se materialförteckning) och täck området med ett sterilt kirurgiskt skynke.
- Applicera ögonsalva på båda ögonen och administrera 5 mg/kg karprofen subkutant före operationen.
- Öppna den sterila instrumentförpackningen för operation. Gör ett 1 cm hudsnitt med en kirurgisk sax för att komma åt lårbensartärerna på båda sidor. Dissekera och ligera den distala lårbensartären med en enda sträng av 4-0 silkessutur (se materialtabell) och applicera en droppe lidokain.
- Applicera en aneurysmklämma vid den proximala lårbensartären och gör ett litet snitt på artären distalt om klämman. Sätt in en kateter av polyeten 10 (PE-10, se materialförteckning) i vänster och höger lårbensartär.
OBS: Den vänstra artärslangen används för blodtrycksövervakning, medan den högra används för bloduttag och infusion av återupplivningsblandning. - Injicera 50 μL hepariniserad koksaltlösning 1:10 i varje artärslang för att förhindra koagulering i slangen.
- Vrid musen till bukläge och montera den på en stereotaktisk huvudram.
- Anslut tre nålelektroder (röd, grön och svart) till vänster arm, vänster ben och höger arm för elektrokardiogram (EKG, se materialtabell) övervakning.
- Limma fast en flexibel plastfibersond på den intakta temporala skallen genom ett 0,5 cm långt hudsnitt för övervakning av hjärnans blodflöde. Det här steget är valfritt.
- Raka toppen av huvudet, desinficera operationsområdet minst tre gånger med jod och alkohol och täck området med ett sterilt kirurgiskt drapel.
- Skär ett 2,5 cm långt snitt i mitten av huden och använd fyra små upprullningsdon för att exponera hela skallens yta för hjärnavbildning.
- Placera en övervakningskamera (t.ex. en laserspeckelkontrastkamera, se materialtabell) ovanför huvudet.
OBS: Några droppar saltlösning kan tillsättas på skallens yta för att underlätta laserfläckkontrastavbildning.
2. Induktion av hjärtstopp
- Fyll en 1 ml plastspruta med 26 μl av stamlösningen för återupplivningscocktail.
OBS: Varje milliliter av denna lösning innehåller 400 μL 1 mg/ml adrenalin, 500 μL 8.4 % natriumbikarbonat, 50 μL 1 000 E/ml heparin och 50 μL 0.9 % natriumklorid (se Materialförteckning). - Vänta tills kroppstemperaturen når 37 °C. Justera syrgasmätaren till 100 % för att syresätta blodet i 2 minuter.
- Dra upp det syresatta artärblodet upp till 200 μL via höger lårbensartär i den förberedda plastsprutan som innehåller 26 μL återupplivningscocktail stamlösning.
- Stäng av syret och öka kvävet till 100 % för att framkalla syrebrist.
OBS: Efter cirka 45 s kommer hjärtat inte att fungera och hjärtfrekvensen kommer snabbt att minska, vilket indikerar början av CA. Efter cirka 2 minuters syrebrist kommer EKG-övervakningen att indikera en asystoli, och det kommer inte att finnas något mätbart systemiskt blodtryck och försumbart cerebralt blodflöde. - Stäng av ventilatorn, isofluranförångaren, temperaturregulatorn och kväveflödesmätaren. Justera syrgasen till 100 % som förberedelse för återupplivning.
3. Återupplivning
- Slå på ventilatorn 8 minuter efter CA-start.
- Börja omedelbart med att infundera det tillbakadragna syresatta blodet blandat med återupplivningscocktailen i blodcirkulationen via höger lårbensartär på 1 minut.
OBS: Infusionen leder till en gradvis ökning av hjärtfrekvensen och återställande av blodperfusion; så småningom uppnås återkomsten av spontan cirkulation (ROSC).
4. Återställning efter CA
- Placera musen i ryggläge efter att ha tagit bort den från den stereotaktiska ramen och ta bort PE-10-katetrarna från lårbensartärerna.
- Applicera 0,25 % bupivakain på hudsnittet och sy ihop hudsnitten med en 6-0 nylonsutur (se materialförteckning). Applicera antibiotikasalva på ytan av hudsnittet.
- Koppla bort musventilatorn när spontanandningen återställs.
- Överför musen till en återvinningskammare med en kontrollerad temperatur på 32 °C.
- Efter 2 timmars återhämtning extuberar du musen och återgår till hemburen. Injicera 0,5 ml normal koksaltlösning subkutant för att förhindra uttorkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att inducera CA sövdes musen med 1,5 % isofluran och ventilerades med 100 % kväve. Detta tillstånd ledde till svår bradykardi efter 45 sekunder (Figur 1). Efter 2 minuters anoxi minskade hjärtfrekvensen dramatiskt (Figur 2), blodtrycket sjönk under 20 mmHg och det cerebrala blodflödet upphörde helt (Figur 1). När isofluranet stängdes av kunde kroppstemperaturen inte längre kontrolleras och sjönk långsamt till cirka 32 °C i slutet av CA (figur 1).
Omedelbart efter 8 minuters CA slogs ventilatorn på och musen försågs med 100 % syrgas. Blodåterupplivningsblandningen infunderas i cirkulationen via artärkatetern. Kort efter injektionen av blodåterupplivningsblandningen började hjärtfunktionen återhämta sig. Efter ett kort uppehåll återställdes det systemiska och cerebrala blodflödet och ROSC etablerades. Framgångsgraden för ROSC är nästan 100 % i vårt labb. Denna modell har framgångsrikt utförts på unga och åldrade möss.
Med hjälp av denna modell användes två avbildningsmodaliteter i denna studie, inklusive laserfläckkontrastavbildning (LSCI) och fotoakustisk avbildning, för att övervaka det cerebrala blodflödet och blodets syresättning på helhjärnsnivå under CA och återupplivning. LSCI bekräftade fullständig frånvaro av blodflöde i hjärnan under CA (Figur 3). Mer detaljerade förändringar i blodflöde, struktur och syresättning under CA-proceduren kan erhållas från de fotoakustiska bilderna (figur 4).
Figur 1: Fysiologisk registrering under CA och återupplivning. Cerebral blodflöde (% baslinje; mätt med laserdopplerflödesmetri), blodtryck (mmHg), hjärtaktivitet (slag per minut) och kroppstemperatur (°C) förändras före CA, under CA och efter CA. X-axeln visar tiden i minuter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Hjärtaktivitet under CA och återupplivning. Hjärtfrekvensen registrerades kontinuerligt, och panelerna (A), (B) och (C) är representativa för hjärtfrekvensen före CA, under CA respektive efter CA. Y-axeln visar de absoluta spänningsvärdena (mV). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Laserspeckelkontrastbilder under CA och återupplivning. Det globala cerebrala blodflödet övervakades. CA ledde till en fullständig förlust av cerebralt blodflöde (B) jämfört med baslinjen (A). Hyperperfusion förekom i hjärnan omedelbart efter återupplivning (C) och detta följdes sedan av hypoperfusion under den sena fasen (D). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Fotoakustiska bilder under CA och återupplivning. Lokala vaskulära förändringar kunde nås med hjälp av fotoakustisk avbildning. Artärerna och grenarna var inte perfunderade med blod under CA (B) jämfört med baslinjen (A). Alla artärer och grenar perfunderades omedelbart efter återupplivning, inklusive några små broar mellan grenar (C, pilar). Dessa broar försvann dock sent (D) på grund av hypoperfusion. Stapeln visar sO2-nivån . Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I experimentella CA-studier har asfyxi, kaliumkloridinjektioner eller ventrikelflimmer från elektrisk ström använts för att inducera CA 16,17,18,19,20,21,22,23. Normalt krävs HLR för återupplivning i dessa CA-modeller, särskilt hos möss. Vi har formulerat en återupplivningsblandning som möjliggör spontan återupplivning efter kvävning CA hos möss. Att eliminera HLR-steget öppnar fler möjligheter för övervakning av hjärnans fysiologi under CA och återupplivning med hjälp av nuvarande avbildningsmetoder.
Denna återupplivningscocktail innehåller natriumbikarbonat, heparin, syresatt arteriellt blod och adrenalin. Det är välkänt att CA inducerar både metabolisk och respiratorisk acidos. Natriumbikarbonat förväntas normalisera pH-värdet i blodet. Heparin är ett antikoagulerande medel och används för att förhindra skadlig proppbildning under reperfusion. Syresatt blod och adrenalin är de mest kritiska komponenterna för återupplivning i denna modell. Även om de exakta mekanismerna som ligger till grund för denna spontana återupplivning fortfarande är okända, spekuleras det i att när en tillräcklig mängd syresatt blod når kranskärlen, vilket ger syre och adrenalin, kan återställandet av myokardkontraktiliteten och genereringen av hjärtminutvolym uppnås utan bröstkompressioner. I denna process är infusionstrycket, som endast kan uppnås i den icke-kollapsade och tjockväggiga arteriella vaskulaturen, kritisk, eftersom detta underlättar leveransen av syresatt blod till hjärtat. Som stöd för denna uppfattning fann vi att infusion av samma blandning via lårbensvenen inte resulterade i återställande av hjärtfunktionen, och återupplivning kunde inte uppnås. Därför måste denna återupplivningscocktail administreras genom artärlinjen för att uppnå återställande av hjärtfunktionen utan bröstkompressioner.
Doseringen av adrenalin som används i den aktuella modellen liknar den som används i vanliga CA-experiment. Varje milliliter återupplivningscocktail stamlösning innehåller 400 μg adrenalin. Sprutan bereds med 26 μl stamlösning av återupplivningscocktail och arteriellt blod dras upp till 200 μL i sprutan. Eftersom plastsprutan på 1 ml har ett dödutrymme på 60 μL i den främre änden är blodet som finns kvar i sprutan efter återupplivning 60 μL, vilket inkluderar 6 μL återupplivningscocktail stamlösning. Således är den slutliga injicerade återupplivningscocktaillösningen 20 μL i varje mus, vilket motsvarar en dos på 8 μg adrenalin i denna procedur. I detta protokoll justeras inte mängden återupplivningslösning efter kroppsvikten, på samma sätt som i kliniska miljöer. Vi har inte upplevt några återupplivningsproblem hos möss med en kroppsvikt på 20-32 g.
Det är värt att notera att detta återupplivningsprotokoll endast användes framgångsrikt i denna CA-modell för asfyxi. I vår pilotstudie misslyckades detta protokoll med att återuppliva möss efter KCl-inducerad CA. Således är modellen som beskrivs här specifikt användbar för att studera hjärnans fysiologi vid asfyxi CA.
Sammanfattningsvis, eftersom denna modell inte kräver bröstkompressioner under återupplivning, 1) kan musen hållas i bukläge och 2) huvudet kan monteras i en stereotaktisk huvudram, vilket möjliggör avbildning och elektrofysiologiska mätningar utan någon rörelse under hela inspelningsfasen. Detta passar perfekt kraven för avbildning/övervakning av hjärnans fysiologi under CA och återupplivning. Denna modell har framgångsrikt använts i experiment som syftar till att dynamiskt spåra cerebralt blodflöde, vaskulära svar och syre i hjärnvävnad hos CA-möss, och dessa experiment har genererat ovärderliga data om vaskulära förändringar och svar på läkemedelsadministrering i CA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna tackar Kathy Gage för hennes redaktionella stöd. Denna studie stöddes av medel från Department of Anesthesiology (Duke University Medical Center), American Heart Association-anslag (18CSA34080277) och National Institutes of Health (NIH) anslag (NS099590, HL157354, NS117973 och NS127163).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adrenalin | Par Pharmaceutical | NDC 42023-159-01 | |
| Alcohol swabs | BD | 326895 | |
| Animal Bio Amp | ADInstruments | FE232 | |
| BP transducer | ADInstruments | MLT0699 | |
| Bridge Amp | ADInstruments | FE117 | |
| Heparin sodium injection, USP | Fresenius Kabi | NDC 63323-540-05 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| Laser Doppler perfusion monitor | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | |
| Laser speckle imaging system | RWD | RFLSI III | |
| Lubricant eye ointment | Bausch + Lomb | 339081 | |
| Micro clip | Roboz | RS-5431 | |
| Mouse rectal probe | Physitemp | RET-3 | |
| Needle electrode | ADInstruments | MLA1213 | 29 Ga, 1.5 mm socket |
| Nitrogen | Airgas | UN1066 | |
| Optic plastic fibre | Moor Instruments | POF500 | |
| Otoscope | Welchallyn | 728 | 2.5 mm Speculum |
| Oxygen | Airgas | UN1072 | |
| PE-10 tubing | BD | 427401 | Polyethylene tubing |
| Povidone-iodine | CVS | 955338 | |
| PowerLab 8/35 | ADInstruments | ||
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | 6100701 | Injectable 50 mg/ml |
| Small animal ventilator | Kent Scientific | RoVent Jr. | |
| Temperature controller | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Triple antibioric & pain relief | CVS | NDC 59770-823-56 | |
| Vaporizer | RWD | R583S | |
| 0.25% bupivacaine | Hospira | NDC 0409-1159-18 | |
| 0.9% sodium chroride | ICU Medical | NDC 0990-7983-03 | |
| 1 mL plastic syringe | BD | 309659 | |
| 4-0 silk suture | Look | SP116 | Black braided silk |
| 6-0 nylon suture | Ethilon | 1698G | |
| 8.4% sodium bicarbonate Inj., USP | Hospira | NDC 0409-6625-02 | |
| 20 G IV catheter | BD | 381534 | 20GA 1.6 IN |
| 30 G PrecisionGlide needle | BD | 305106 | 30 G X 1/2 |
References
- Smith, A., Masters, S., Ball, S., Finn, J. The incidence and outcomes of out-of-hospital cardiac arrest in metropolitan versus rural locations: A systematic review and meta-analysis. Resuscitation. 185, 109655 (2022).
- Amacher, S. A., et al. Predicting neurological outcome in adult patients with cardiac arrest: systematic review and meta-analysis of prediction model performance. Critical Care. 26 (1), 382 (2022).
- Matsuyama, T., Ohta, B., Kiyohara, K., Kitamura, T. Intra-arrest partial carbon dioxide level and favorable neurological outcome after out-of-hospital cardiac arrest: A nationwide multicenter observational study in Japan (the JAAM-OHCA registry). European Heart Journal of Acute Cardiovascular Care. 12 (1), 14-21 (2023).
- Takahagi, M., Sawano, H., Moriyama, T. Long-term neurological outcome of extracorporeal cardiopulmonary resuscitation for out-of-hospital cardiac arrest patients with nonshockable rhythms: A single-center, consecutive, retrospective observational study. The Journal of Emergency Medicine. 63 (3), 367-375 (2022).
- Mork, S. R., Botker, M. T., Christensen, S., Tang, M., Terkelsen, C. J. Survival and neurological outcome after out-of-hospital cardiac arrest treated with and without mechanical circulatory support. Resuscition Plus. 10, 100230 (2022).
- Koenig, M. A., Kaplan, P. W., Thakor, N. V. Clinical neurophysiologic monitoring and brain injury from cardiac arrest. Neurologic Clinics. 24 (1), 89-106 (2006).
- Cavazzoni, E., Schibler, A. Monitoring of brain tissue oxygen tension and use of vasopressin after cardiac arrest in a child with catecholamine-induced cardiac arrhythmia. Critical Care & Resuscitation. 10 (4), 316-319 (2008).
- Topjian, A. A., et al. Multimodal monitoring including early EEG improves stratification of brain injury severity after pediatric cardiac arrest. Resuscitation. 167, 282-288 (2021).
- Beekman, R., et al. Bedside monitoring of hypoxic ischemic brain injury using low-field, portable brain magnetic resonance imaging after cardiac arrest. Resuscitation. 176, 150-158 (2022).
- Sinha, N., Parnia, S. Monitoring the brain after cardiac arrest: A new era. Current Neurology Neuroscience Report. 17 (8), 62 (2017).
- Reis, C., et al. Pathophysiology and the monitoring methods for cardiac arrest associated brain injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), 129 (2017).
- Zhou, H., Lin, C., Liu, J., Wang, X. Continuous monitoring of brain perfusion by cerebral oximetry after spontaneous return of circulation in cardiac arrest: A case report. BMC Neurology. 22 (1), 365 (2022).
- Takegawa, R., et al. Real-time brain monitoring by near-infrared spectroscopy predicts neurological outcome after cardiac arrest and resuscitation in rats: A proof of concept study of a novel prognostic measure after cardiac arrest. Journal Clinical Medicine. 11 (1), 131 (2021).
- Zhang, C., et al. Invasion of peripheral immune cells into brain parenchyma after cardiac arrest and resuscitation. Aging and Disease. 9 (3), 412-425 (2018).
- Duan, W., et al. Cervical vagus nerve stimulation improves neurologic outcome after cardiac arrest in mice by attenuating oxidative stress and excessive autophagy. Neuromodulation. 25 (3), 414-423 (2022).
- Liu, H., et al. Novel modification of potassium chloride induced cardiac arrest model for aged mice. Aging and Disease. 9 (1), 31-39 (2018).
- Shen, Y., et al. Aging is associated with impaired activation of protein homeostasis-related pathways after cardiac arrest in mice. Journal of American Heart Association. 7 (17), e009634 (2018).
- Wang, P., et al. Manganese porphyrin promotes post cardiac arrest recovery in mice and rats. Biology. 11 (7), 957 (2022).
- Wang, W., et al. Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation. Journal of American Heart Association. 10 (11), e019142 (2021).
- Li, R., et al. Activation of the XBP1s/O-GlcNAcylation pathway improves functional outcome after cardiac arrest and resuscitation in young and aged mice. Shock. 56 (5), 755-761 (2021).
- Shen, Y., et al. Activation of the ATF6 (activating transcription factor 6) signaling pathway in neurons improves outcome after cardiac arrest in mice. Journal American Heart Association. 10 (12), e020216 (2021).
- Jiang, M., et al. MCC950, a selective NLPR3 inflammasome inhibitor, improves neurologic function and survival after cardiac arrest and resuscitation. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 256 (2020).
- Zhao, Q., et al. Cardiac arrest and resuscitation activates the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and results in severe immunosuppression. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 41 (5), 1091-1102 (2021).
