Summary
פרוטוקול זה נועד להדגים מסלול מתן ורידי הניתן לשחזור שניתן להשתמש בו בחולדות ובעכברים לאורך תקופת היילוד. הליך זה חשוב למחקרי מכרסמים פרה-קליניים המעוניינים לשקף מתן תרופתי ביחידות לטיפול בילודים בעיקר באמצעות מתן תוך ורידי.
Abstract
הזרקה תוך ורידית (iv) היא הדרך הנפוצה ביותר של מתן תרופות בילודים בסביבה הקלינית. לכן, הזרקת ורידים רטרואורביטלית היא שיטה חשובה למתן תרכובות במחקר, שבו מחקרי הוכחת היתכנות מוצלחים יכולים להתקדם לניסויים קליניים בילודים נחוצים מאוד. רוב המחקרים תוך ורידיים במכרסמים בילודים משתמשים בווריד הרקתי/פנים שטחי. עם זאת, הזרקה רטרואורביטלית הופכת לבלתי אמינה במכרסמים בילודים מעל יומיים לאחר שהעור מתכהה והווריד אינו נראה עוד. בפרוטוקול הנוכחי אנו מתארים הזרקה רטרואורביטלית של הסינוס הוורידי הן בעכבר היילוד והן בחולדה בגילאים שבהם הווריד הרקתי השטחי כבר אינו נראה לעין, אך העיניים עדיין לא נפתחו. פקיחת עיניים מאפשרת הזרקה רטרו-אורביטלית בכך שהיא מאפשרת לחוקר לראות בבירור שהם אינם מנקבים את העין בעת החדרת המחט. אנו מראים כי טכניקה זו יכולה להתבצע בצורה אמינה וניתנת לשחזור ללא תופעות לוואי. נוסף על כך, אנו מראים כי ניתן להשתמש בו במחקרים רבים, כגון מתן תרכובות לחקר פגיעה מוחית בילוד.
Introduction
מחקר בבעלי חיים הוא צעד חיוני המוביל לניסויים קליניים, וככזה, חשוב שמחקרים בבעלי חיים יחקו באופן הדוק הליכים וטיפולים המבוצעים במסגרת הקלינית. עם זאת, ישנם מספר אתגרים בתרגום פרקטיקות קליניות למחקרי מכרסמים בילודים. אלה כוללים את גודלו הקטן של המכרסם בילוד ואת הפער במחקר ובידע של יילודים בהשוואה למחקר מבוגרים, בין היתר 1,2.
מתן חומרים שונים כמו תרופות או תאים יכול להתבצע במספר מסלולים, כולל זריקות תוך צפקיות (IP), תת עוריות (SC) ותוך ורידי (IV). הזרקה על ידי IV היא הדרך המועדפת של מתן תרכובות בילודים אנושיים. בילודים, נתיב מתן העירוי הוא יתרון בהשוואה למסלולים אחרים מכיוון שהוא ממקסם את ההפצה המערכתית של תרופות ויש לו זמינות ביולוגית גבוהה 3,4. ניתן להשתמש בקווי עירוי מתוחזקים היטב למתן תרופות חוזר. במחקרי מכרסמים יש לבצע הזרקות IV בזנב, בוורידי הפנים/הרקה, או בסינוס הרטרואורביטלי5. הזרקת ורידים זנב משמשת באופן שגרתי מכרסמים בוגרים, שכן היא מספקת שני ורידים מקבילים קאודליים לרוחב לבחירהמתוך 5. עם זאת, ורידים אלה יש קוטר קטן, אשר אינו כולל את השימוש שלהם יילודים. רוב זריקות העירוי בילוד בוצעו בווריד הפנים / הרקתי השטחי, כפי שהוא נראה מהיום שלאחר הלידה 0 (P0)-P2 ומאפשר מתן נפח גדול יחסית5. עם זאת, מסלול זה הופך להיות לא אמין סביב P36 ברגע שהחיה מקבלת צבע עור, ובכך הופכת את וריד הפנים / הרקתי השטחי קשה לראות בעין ללא סיוע. מתן IV דרך הסינוס הרוחבי בילוד תואר במחקר אחד7; עם זאת, זה דורש פתיחת העור מעל הסינוס הרוחבי והזרקת AAV9 ב P0-P1 עם סיוע של מיקרוסקופ.
כאשר חוקרים טיפול פוטנציאלי או מבססים מודל פגיעה רלוונטי בילוד, חשוב לקחת בחשבון שלמכרסמים בילודים יכול להיות תזמון התפתחות איברים שונה בהשוואה לבני אדם. הפרוטוקול שלנו מבוסס על ההבדלים בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית בילוד בין בני אדם למכרסמים. לדוגמה, המונח מוח אנושי שזה עתה נולד מתאים בערך לחולדה P7 ולמוח עכבר P108. מכיוון שפיזור החומרים המוזרקים רטרואורביטלית דומה לזה של אתרי העירוי האחרים, כאשר רמות גבוהות בדם מושגות במהירות, אנו רואים בכך מסלול מתאים. טכניקה זו תוארה היטב על ידי ירדני ועמיתיו, שהזריקו תרכובות לסינוס ורידי העיניים בעכברי P1-P29. בפרוטוקול הנוכחי אנו מראים שיטה פשוטה וישימה לביצוע זריקות רטרואורביטליות במכרסמים ילודים מבוגרים שטרם פקחו את עיניהם.
Protocol
כל ההליכים המפורטים בפרוטוקול זה תאמו את מועצת החקלאות השבדית ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים בגטבורג (825-2017 ו-2195-19). עכברי C57BL/6 וחולדות Wistar גודלו בבית עם מחזור אור/חושך של 12 שעות וגישה חופשית למזון ומים. כל הליכי הניסוי פעלו בהתאם להנחיות ARRIVE10.
1. הגדרת סביבת עבודה
- במשך הליך זה, לאסוף את חיות הניסוי מכלוב הסכר ולהניח אותם בכלוב נפרד על כרית מחוממת (35-37 מעלות צלזיוס).
הערה: אם משתמשים במקור אור (בעלי חיים לבקנים), יש להשתמש במקור אור שאינו חום שניתן למקם מתחת לראשו של בעל החיים.
2. מחט ותמיסה
- השתמש מחט עם 29-31 גרם (סביב 0.30 מ"מ).
- לקבלת נפחים מדויקים, להכין את הפתרון להיות מוזרק מתוך נפח pipetted.
הערה: יש להזריק משקל גוף מרבי של 5 μL / g בכל סינוס רטרואורביטלי.
3. הגדרה
- הניחו את החיות על משטח שטוח (איור 1A) בשכיבה צידית (איור 1C).
- השראת הרדמה איזופלורנית לכל הגוף (5% אינדוקציה, 3% תחזוקה).
הערה: יש להניח את בעלי החיים תחת הרדמה באמצעות פייה. אין לכסות את אזור העפעף וצינור הדמעות (איור 1D). - בדוק את עומק ההרדמה באמצעות שיטת רפלקס נסיגה כפות.
הערה: אין צורך בשיכוך כאבים לפני הניתוח מכיוון שהליך זה אינו נחשב להליך פולשני11.
4. הליך הזרקה
הערה: אם אפשר, השתמשו במקור אור מתחת לראש של החיה (איור 1C), כדי להקל על הראייה של הסינוס הוורידי (איור 1E). אין צורך בעיקור של האזור המוזרק, מכיוון שהעפעף עדיין סגור.
- כשראשו פונה ימינה, יש לבצע את הזריקה לסינוס הרטרואורביטלי הימני (דוגמה לאופרטור ימני).
- מחדירים את המחט, משופעת, בקדמת ארובת העין - המקבילה לקנטוס המדיאלי, בזווית של כ-40 מעלות. זווית זו מאפשרת לכוון את המחט לחלק האחורי של מסלול העין.
- התקדמות של 1/3 מהמחט (כ-2 מ"מ) לאזור הסינוס הרטרואורביטלי הממוקם מאחורי מסלול העין.
- יש להזריק בתנועה עדינה, חלקה וזורמת.
- המתן רגע, לפני משיכת המחט לאט כדי למנוע זרימה חוזרת.
זהירות: אל תשאפו. - השתמש מזרק סטרילי חדש עבור כל חיה כדי למנוע זיהום.
הערה: בעת הזרקת תמיסה ברורה, הווריד צריך להפוך לרגע צלול.
5. טיפול לאחר הזרקה
- הניחו את הגור בקופסת ההתאוששות, נחו על מכשיר חימום מוגן (35-37 מעלות צלזיוס).
- המתינו להחלמה ובדקו אם יש סימני מצוקה לפני שתחזירו את הגור לסכר.
הערה: יש להרדים באופן מיידי חיות תרגול המוזרקות בצבע בהתאם לפרוטוקולים המאושרים על ידי IACUC.
זהירות: אם העין מתנפחת במהלך ההזרקה, משמעות הדבר היא שהמחט אינה מוחדרת למקבץ הוורידי ונמצאת במקום זאת במסלול העין. גולגולת היילוד רכה מאוד, אם המחט מנקבת אותה, אז הזריקה תיכנס לקרומי המוח או אפילו לפרנכימה במוח.
Representative Results
הטכניקה הנוכחית בוצעה על משטח שטוח, עם פיה להרדמה גלובלית (איור 1A). השופר לא אמור לחסום את הגישה לקנטוס המדיאלי (איור 1B). אצל חיות לבקניות, מקור אור של סיב אופטי הוצב מתחת לחיה, כדי לסייע בהדמיה של הוורידים (איור 1B). המחט הונחה בזווית של כ-40°, והתקדמה כ-2 מ"מ לתוך הקנטוס המדיאלי (איור 1C). הזרקה של צבע כחול טריפאן בחולדה לבקנית P5 אפשרה הדמיה ברורה של הצבע בסינוס הרטרואורביטלי (איור 1C).
טכניקת ההזרקה הרטרואורביטלית המתוארת בפרוטוקול זה שימשה בהצלחה למתן ביוטין-דקסטרן נותב (BDA, 10,000 Da)12. השימוש בעוקבים גלויים במחקר כלי הדם יכול, למשל, לספק חלופה לשימוש באקסטרווסציה רדיואקטיבית של סוכרוז מכלי הדם, ולאפשר שימוש באותם מוחות למדידות היסטולוגיות אחרות12.
לאחרונה ביססנו מודל של חולדה ילודית של דימום מטריצת הנבט (GMH)13. בקצרה, חולדות P5 Wistar קיבלו זריקה תוך גולגולתית יחידה של 0.3 U של collagenase VII לתוך הסטריאטום המדיאלי. GMH גורם לקרע של כלי הדם במטריצת הנבט והוא אחד הגורמים השכיחים לפגיעה מוחית מוקדמת ולתמותה14. כדי לאפיין עוד יותר את מודל GMH השתמשנו בהזרקה רטרואורביטלית של נותב BDA (איור 2) כדי לחקור את ההשפעות של GMH על תפקוד מחסום הדם-מוח ותקינותו14.
בהשוואה לבקרות עם הזרקת מי מלח (איור 2A), הזרקה רטרואורביטלית מוצלחת של נותב BDA14 אפשרה להעריך את נוכחות הנותב בכלי הדם במוח 10 דקות לאחר הזרקת BDA (איור 2B). לאחר מכן השתמשו בשיטה זו כדי לזהות דליפת כלי דם של BDA ברמת כלי הדם הבודדים בחיות פגועות GMH (איור 2C, חיצים אדומים), אשר לאחר מכן ניתן לכמת10.
איור 1: מערך ניסויי עם תצוגת דיאגרמה של כלי הדם לאחר מתן צבע כחול טריפאן. (A) מערך הרדמה (B) ללא ו-(C) עם מקור אור סיב אופטי. (D) הזרקה רטרואורביטלית של צבע כחול טריפאן בעכבר P10 C5BL/6. (E) תרשים של כלי הדם בחולדת P5 Wistar לאחר הזרקת צבע כחול טריפאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מיקרוגרפים מייצגים במוח שמראים את ההתפלגות של נותב BDA. (A) אין כתם חיובי בחיות ביקורת שהזריקו מי מלח. (B) נותב BDA מומס במי מלח, במינון של 2.0 - 2.5 מ"ג לחיה נראה בכלי הדם של המוח (קליפת המוח). (C) נותב BDA דולף לתוך פרנכימה במוח בעקבות GMH (חיצים אדומים). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. עובד מתוך Andersson et al., 202114. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
פרוטוקול זה מספק שיטה ברורה ומדויקת להזרקת חומרים לסינוס הרטרואורביטלי של עכברים וחולדות בילודים. זה חשוב כי זה מראה כי הזרקות רטרואורביטליות יכולות להתבצע באופן אמין ומשכפל במכרסמים מעל P2, שם כבר לא ניתן להבחין בווריד הרקתי/פנים השטחי, ובבעלי חיים מתחת ל-P12, שבהם העפעפיים עדיין לא נפתחו, וגלגל העין אינו חשוף. יתר על כן, הזרקת רטרואורביטל בילוד נסבלת היטב הן על ידי הגורים והן על ידי הסכרים, עם סיכונים מינימליים של תופעות לוואי לאחר שליטה בטכניקה.
להזרקות דרך עירוי יש יתרון על פני נתיבי מתן אחרים מכיוון שהן מאפשרות הזרקה בריכוז גבוה, כמו גם pH נמוך וגבוה, בתנאי שקצב ההזרקה נשמר קבוע ונמוך כדי למנוע קרע של כלי השיט. יתר על כן, הזרקות IV מאפשרות פיזור מהיר יותר של תרכובות כאשר הן נכנסות ישירות למחזור הדם המערכתי ובכך עוקפות עיכובים פוטנציאליים מספיגה לקויה שנצפתה בנתיבי מתן אחרים. זה מאפשר גישה מיידית וכמעט 100% זמינות ביולוגית של תרכובות.
מבחינה קלינית IV הוא מסלול הטיפול המועדף בילודים (< 28 ימים). זה נכון במיוחד במסגרות טיפול נמרץ יילודים מכיוון שקנולציה IV מאפשרת גישה קלה לספק תרופות / נוזלים. זריקות דרך מסלול sc שימשו במידה מסוימת בילודים, במיוחד עבור מתן אריתרופויאטין15. עם זאת, הועלו חששות, כאשר מחקר הציע עירוי IV כחלופה עדיפה16. מתן אוראלי אינו לעתים קרובות אפשרות מעשית כאשר יילודים נמצאים במסגרת יחידה לטיפול נמרץ בבית החולים. נוסף על כך, בהשוואה למבוגרים, בילודים יש הבדלים במערכת העיכול שלהם, כולל עיכוב בריקון הקיבה וירידה בתנועתיות המעי, מה שעלול להשפיע על ספיגת התרופות. זריקות תוך שריריות קשות לניהול כתוצאה מהמסה השרירית הקטנה של יילודים 3,4.
במחקר מכרסמים, אחת השיטות הנפוצות ביותר של הזרקות IV היא הזרקת ורידים זנב. עם זאת, שיטה זו היא בלתי ישימה כאשר עובדים עם יילודים. אתרי עירוי אחרים כגון וריד טמפורלי / פנים שטחי6 הופכים בלתי נראים ב- P3. סינוס רוחבי בילוד תואר במחקר אחד ובוצע ב-P0-P1 ובסיוע מיקרוסקופ פותח את העור ומקדם מחט נימית דרך הגולגולת לתוך הסינוס הרוחבי, המאפשר הזרקות בנפח 2-4 μl7. מחקרים מעטים תיעדו את השימוש בווריד הצוואר החיצוני ב-P7 בחולדות17. עם זאת, מדובר בטכניקה פולשנית הדורשת פתיחה כירורגית של העור וחשיפת הווריד הצווארי החיצוני18. במחקרים במכרסמים בוגרים, מתן רטרואורביטלי הוכח כיעיל כמו הזרקת וריד זנב5 ובכך מחזק את הכדאיות והרלוונטיות של המסלול הרטרואורביטלי. ההזרקה הרטרואורביטלית גורמת למצוקה מינימלית ולאחר ההשתלטות יכולה להתבצע על ידי אדם בודד עם ציוד מינימלי ומאפשרת הזרקות מרובות (מה שמבטיח שהעיניים יהיו לסירוגין). מחקרים קודמים הראו כי הזרקה רטרואורביטלית שימשה למתן וירוס 9 הקשור באדנו בעכברים ב P0-P1 או ב P14-P2111 או FITC-dextran ב P1719 דבר המצביע על קבלה גוברת של שיטה זו.
ישנן כמה מגבלות הקשורות הזרקה רטרואורביטלית בילודים. כמו בכל זריקות העירוי, נפח ההזרקה מוגבל, ואנו ממליצים על 5 μL / g עבור הליך זה. בנוסף, ההזרקה הרטרואורביטלית דורשת הרדמה מלאה של הגוף. כדי למזער את הסיבוכים, מומלץ להשתמש בחומרי הרדמה בשאיפה כגון isoflurane, שכן אלה מהירים יותר בהשראת הרדמה, יש חילוף חומרים מהיר ויש להם קצב התאוששות מהיר. נדרש אימון, רצוי להשתמש בצבע צבעוני בבעלי חיים מורדמים סופניים, כדי למנוע נפיחות פוטנציאלית סביב אתר ההזרקה או טראומה בעין עקב מיקום שגוי של שיפוע המחט. בשל גודלם הקטן של בעלי חיים אלה, נדרשים מחטים עדינות יותר, עם מד מחט קטן. הזרקת תאים חייבת להתבצע בתרחיף חד-תאי, כדי למנוע חסימה של כלי הדם, וכדי להבטיח את קיום התא. באופן מעודד, מחקר שנערך על ידי עאמר ועמיתיו הראה כי הזרקה של תאי יונקים באמצעות מזרקים של 30 G עדיין מספקת כדאיות תאים אמינה גם בפליטת צפיפות תאים גבוהה20.
לסיכום, להקמת מסלול עירוי אמין בילודים יש משמעות קלינית, שכן זהו מסלול מתן מועדף בבני אדם. ניתן לשלוט בקלות בהזרקה הרטרואורביטלית, היא ניתנת לשחזור ומספקת חלופה רלוונטית לאתרי הזרקה בעירוי אחרים, כגון זנב ווריד טמפורלי/פנים שלא ניתן להשתמש בהם באופן אמין לאורך כל תקופת היילוד של המכרסם. לפיכך, הזריקה הרטרואורביטלית של היילוד מאפשרת מתן תרופות, תאים ותרכובות אחרות בגילאים המתאימים ליילוד.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים ביחס למחקר, למחבר או לפרסום של פרוטוקול זה.
Acknowledgments
העבודה שבוצעה בפרוטוקול זה מומנה על ידי קרן Hasselblad (2020-2021, ERF), קרן אקה ויברגס (M19-0660, ERF), מועצת המחקר השבדית (2019-01320, HH; 2021-01872, CM), שירות בריאות הציבור בבית החולים האוניברסיטאי סאלגרנסקה (ALFGBG-965174, HH ; ALFGBG-966107, CM), קרן המוח השבדית (FO2022-0110, CM), קרן אהלן (223005, CM) ותוכנית המסגרת Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק מס' 87472/PREMSTEM, HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
References
- Laughon, M. M., et al. Drug labeling and exposure in neonates. JAMA Pediatr. 168 (2), 130-136 (2014).
- Das, A., et al. Methodological issues in the design and analyses of neonatal research studies: Experience of the nichd neonatal research network. Semin Perinatol. 40 (6), 374-384 (2016).
- Ku, L. C., Smith, P. B. Dosing in neonates: Special considerations in physiology and trial design. Pediatr Res. 77 (1-1), 2-9 (2015).
- Linakis, M. W., et al. Challenges associated with route of administration in neonatal drug delivery. Clin Pharmacokinet. 55 (2), 185-196 (2016).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D.
- Hamodi, A. S., Martinez Sabino, A., Fitzgerald, N. D., Moschou, D., Crair, M. C. Transverse sinus injections drive robust whole-brain expression of transgenes. Elife. 9, 53639 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Kilkenny, C., et al. Animal research: Reporting in vivo experiments: The arrive guidelines). Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).
- Ek, C. J., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M., Potter, A., Saunders, N. R. Permeability and route of entry for lipid-insoluble molecules across brain barriers in developing monodelphis domestica. J Physiol. 536, 841-853 (2001).
- Jinnai, M., et al. A model of germinal matrix hemorrhage in preterm rat pups). Front Cell Neurosci. 14, 535320 (2020).
- Andersson, E. A., Rocha-Ferreira, E., Hagberg, H., Mallard, C., Ek, C. J. Function and biomarkers of the blood-brain barrier in a neonatal germinal matrix haemorrhage model. Cells. 10 (7), (2021).
- Ohls, R. K., et al. Effects of early erythropoietin therapy on the transfusion requirements of preterm infants below 1250 grams birth weight: A multicenter, randomized, controlled trial. Pediatrics. 108 (4), 934-942 (2001).
- Costa, S., et al. How to administrate erythropoietin, intravenous or subcutaneous. Acta Paediatr. 102 (6), 579-583 (2013).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Sugiyama, Y., et al. Intravenous administration of bone marrow-derived mesenchymal stem cell, but not adipose tissue-derived stem cell, ameliorated the neonatal hypoxic-ischemic brain injury by changing cerebral inflammatory state in rat. Front Neurol. 9, 757 (2018).
- Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. J Pharm Pharmacol. 67 (5), 640-650 (2015).
