Summary
Dieses Protokoll zielt darauf ab, einen reproduzierbaren venösen Verabreichungsweg zu demonstrieren, der bei Ratten und Mäusen während der gesamten Neugeborenenperiode angewendet werden kann. Dieses Verfahren ist wichtig für präklinische Studien an Nagetieren, die die Verabreichung von Medikamenten auf Neugeborenenstationen in erster Linie durch intravenöse Verabreichung widerspiegeln möchten.
Abstract
Die intravenöse (i.v.) Injektion ist der am häufigsten verwendete Weg der Arzneimittelverabreichung bei Neugeborenen im klinischen Umfeld. Daher ist die retroorbitale Veneninjektion eine wichtige Methode für die Verabreichung von Wirkstoffen in der Forschung, bei der erfolgreiche Proof-of-Concept-Studien zu dringend benötigten klinischen Studien bei Neugeborenen führen können. Die meisten intravenösen Studien an neonatalen Nagetieren verwenden die oberflächliche Schläfen-/Gesichtsvene. Die retroorbitale Injektion wird jedoch bei neonatalen Nagetieren, die älter als 2 Tage sind, unzuverlässig, nachdem sich die Haut verdunkelt hat und die Vene nicht mehr sichtbar ist. Im vorliegenden Protokoll beschreiben wir die retroorbitale Injektion des venösen Sinus sowohl bei der neonatalen Maus als auch bei der Ratte in einem Alter, in dem die oberflächliche Schläfenvene nicht mehr sichtbar ist, die Augen aber noch nicht geöffnet sind. Die Augenöffnung erleichtert die retroorbitale Injektion, indem sie es dem Forscher ermöglicht, beim Einführen der Nadel deutlich zu sehen, dass er das Auge nicht perforiert. Wir zeigen, dass diese Technik zuverlässig und reproduzierbar ohne nachteilige Auswirkungen durchgeführt werden kann. Darüber hinaus zeigen wir, dass es in vielen Studien eingesetzt werden kann, z. B. bei der Verabreichung von Substanzen zur Untersuchung von Hirnverletzungen bei Neugeborenen.
Introduction
Tierversuche sind ein wesentlicher Schritt, der zu klinischen Studien führt, und daher ist es wichtig, dass Tierversuche Verfahren und Behandlungen, die im klinischen Umfeld durchgeführt werden, genau nachahmen. Es gibt jedoch mehrere Herausforderungen bei der Übertragung klinischer Praktiken auf neonatale Nagetierstudien. Dazu gehören unter anderem die geringe Größe des neonatalen Nagetieres und die Lücke in der Neugeborenenforschung und im Vergleich zur Erwachsenenforschung 1,2.
Die Verabreichung verschiedener Substanzen wie Medikamente oder Zellen kann auf mehreren Wegen erfolgen, einschließlich intraperitonealer (IP), subkutaner (SC) und intravenöser (IV) Injektionen. Die intravenöse Injektion ist der bevorzugte Verabreichungsweg von Verbindungen bei menschlichen Neugeborenen. Bei Neugeborenen ist der intravenöse Verabreichungsweg im Vergleich zu anderen Verabreichungswegen vorteilhaft, da er die systemische Verteilung von Arzneimitteln maximiert und eine hohe Bioverfügbarkeit aufweist 3,4. Ein gut gepflegter Infusionsschlauch kann für die wiederholte Verabreichung von Medikamenten verwendet werden. Bei Studien an Nagetieren müssen intravenöse Injektionen in den Schwanz, in die Gesichts-/Schläfenvenen oder in den Sinus retroorbitalisdurchgeführt werden 5. Die Schwanzveneninjektion wird routinemäßig bei erwachsenen Nagetieren eingesetzt, da sie zwei seitliche kaudale parallele Venen zurAuswahl bietet. Diese Venen haben jedoch einen kleinen Durchmesser, was ihre Verwendung bei Neugeborenen ausschließt. Die meisten intravenösen Injektionen bei Neugeborenen wurden in der oberflächlichen Gesichts-/Schläfenvene durchgeführt, da sie ab dem postnatalen Tag 0 (P0)-P2 sichtbar ist und eine relativ große Verabreichung ermöglicht5. Dieser Weg wird jedoch um P36 herum unzuverlässig, sobald das Tier eine Hautfärbung annimmt, wodurch die oberflächliche Gesichts-/Schläfenvene mit dem ungestützten Auge schwer zu erkennen ist. Die intravenöse Verabreichung über den Sinus transversum des Neugeborenen wurde in einer Studie beschrieben7; Dazu muss jedoch die Haut oberhalb des Sinus transversum geöffnet und AAV9 mit Hilfe eines Mikroskops an P0-P1 injiziert werden.
Bei der Untersuchung einer möglichen Behandlung oder der Etablierung eines relevanten neonatalen Verletzungsmodells ist es wichtig zu berücksichtigen, dass neonatale Nagetiere im Vergleich zum Menschen einen anderen Zeitpunkt der Organentwicklung haben können. Unser Protokoll basiert auf den Unterschieden in der Entwicklung des neonatalen Zentralnervensystems zwischen Menschen und Nagetieren. Beispielsweise entspricht der Begriff neugeborenes menschliches Gehirn in etwa einer P7-Ratte und einem P10-Mäusegehirn8. Da die Verteilung der retroorbital injizierten Substanzen ähnlich ist wie an den anderen Infusionsstellen, wobei schnell hohe Blutspiegel erreicht werden, halten wir dies für einen geeigneten Weg. Diese Technik wurde von Yardeni und Kollegen gut beschrieben, als sie bei P1-P2-Mäusen Verbindungen in den Sinus ophthalmic venosum injizierten9. Im aktuellen Protokoll zeigen wir eine einfache und praktikable Methode zur Durchführung retroorbitaler Injektionen bei älteren neonatalen Nagetieren, die ihre Augen noch nicht geöffnet haben.
Protocol
Alle in diesem Protokoll aufgeführten Verfahren entsprachen den Bestimmungen des schwedischen Landwirtschaftsamtes und wurden von der Göteborger Tierethikkommission genehmigt (825-2017 und 2195-19). C57BL/6-Mäuse und Wistar-Ratten wurden im eigenen Haus mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu Futter und Wasser gezüchtet. Alle experimentellen Verfahren folgten den ARRIVE-Richtlinien10.
1. Workspace einrichten
- Für die Dauer dieses Verfahrens werden die Versuchstiere aus dem Käfig entnommen und in einem separaten Käfig auf einem beheizten Pad (35-37 °C) platziert.
HINWEIS: Wenn Sie eine Lichtquelle (Albino-Tiere) verwenden, sollte eine nicht erhitzende Lichtquelle verwendet werden, die unter dem Kopf des Tieres positioniert werden kann.
2. Nadel und Lösung
- Verwenden Sie eine Nadel mit 29-31 g (ca. 0,30 mm).
- Um genaue Volumina zu erhalten, ziehen Sie die zu injizierende Lösung aus einem pipettierten Volumen auf.
HINWEIS: In jeden Sinus retroorbitalis sollten maximal 5 μl/g Körpergewicht injiziert werden.
3. Einrichtung
- Legen Sie die Tiere auf eine ebene Fläche (Abbildung 1A) in seitlicher Liegeposition (Abbildung 1C).
- Ganzkörper-Isofluran-Anästhesie einleiten (5 % Induktion, 3 % Erhaltung).
HINWEIS: Die Tiere sollten mit einem Mundstück in Narkose versetzt werden. Der Bereich des Augenlids und des Tränenkanals sollte nicht abgedeckt werden (Abbildung 1D). - Überprüfen Sie die Narkosetiefe mit der Pfotenrückzugsreflexmethode.
HINWEIS: Es ist keine präoperative Analgesie erforderlich, da dies nicht als invasives Verfahren gilt11.
4. Ablauf der Injektion
HINWEIS: Verwenden Sie, wenn möglich, eine Lichtquelle unter dem Kopf des Tieres (Abbildung 1C), um die Sicht auf die venöse Nebenhöhle zu erleichtern (Abbildung 1E). Eine Sterilisation des zu injizierenden Bereichs ist nicht erforderlich, da das Augenlid noch geschlossen ist.
- Verabreichen Sie die Injektion mit dem Kopf nach rechts in den rechten Sinus retroorbitalis (Beispiel für einen rechtshändigen Bediener).
- Führen Sie die Nadel mit einer Abschrägung nach unten an der Vorderseite der Augenhöhle - dem Äquivalent des medialen Kanthus - in einem Winkel von ca. 40° ein. Dieser Winkel ermöglicht es, die Nadel auf den hinteren Teil der Augenhöhle zu richten.
- Schieben Sie 1/3 der Nadel (ca. 2 mm) in den Bereich des Sinus retroorbitalis hinter der Augenhöhle.
- Injizieren Sie in einer sanften, glatten und flüssigen Bewegung.
- Warten Sie einen Moment, bevor Sie die Nadel langsam zurückziehen, um einen Rückfluss zu vermeiden.
VORSICHT: Nicht ansaugen. - Verwenden Sie für jedes Tier eine neue sterile Spritze, um eine Kontamination zu vermeiden.
HINWEIS: Wenn Sie eine klare Lösung injizieren, sollte die Vene vorübergehend frei werden.
5. Nachsorge nach der Injektion
- Legen Sie den Welpen in die Auffangbox, die auf einer geschützten Wärmevorrichtung (35-37 °C) ruht.
- Warten Sie, bis sich der Welpe erholt hat, und prüfen Sie, ob es Anzeichen von Stress gibt, bevor Sie den Welpen zur Mutter zurückbringen.
HINWEIS: Mit Farbstoff injizierte Übungstiere sollten gemäß den von der IACUC genehmigten Protokollen sofort eingeschläfert werden.
ACHTUNG: Wenn das Auge während der Injektion anschwillt, bedeutet dies, dass die Nadel nicht in das venöse Plex eingeführt wird, sondern sich in der Augenhöhle befindet. Der Schädel des Neugeborenen ist sehr weich, wenn die Nadel ihn perforiert, dann geht die Injektion in die Hirnhäute oder sogar in das Gehirnparenchym.
Representative Results
Die vorliegende Technik wurde auf einer flachen Oberfläche mit einem Mundstück für die Globalanästhesie durchgeführt (Abbildung 1A). Das Mundstück sollte den Zugang zum medialen Kanthus nicht blockieren (Abbildung 1B). Bei Albino-Tieren wurde eine faseroptische Lichtquelle unter dem Tier platziert, um die Visualisierung der Venen zu unterstützen (Abbildung 1B). Die Nadel wurde in einem Winkel von ca. 40° platziert und um ca. 2 mm in den medialen Kanthus vorgeschoben (Abbildung 1C). Die Injektion von Trypanblau-Farbstoff in eine P5-Albino-Ratte ermöglichte eine klare Visualisierung des Farbstoffs im Sinus retroorbitalis (Abbildung 1C).
Die in diesem Protokoll beschriebene retroorbitale Injektionstechnik wurde erfolgreich zur Verabreichung des Tracers Biotin-Dextran (BDA, 10.000 Da) eingesetzt12. Die Verwendung von sichtbaren Tracern in der Gefäßforschung kann beispielsweise eine Alternative zur Extravasation radioaktiver Saccharose aus den Blutgefäßen darstellen und die Verwendung derselben Gehirne für andere histologische Messungen ermöglichen12.
Kürzlich haben wir ein neonatales Rattenmodell für Keimmatrixblutungen (GMH) etabliert13. Kurz gesagt, P5-Wistar-Ratten erhielten eine einmalige intrakranielle Injektion von 0,3 E Kollagenase VII in das mediale Striatum. GMH führt zu einem Riss der Gefäße in der Keimmatrix und ist eine der häufigsten Ursachen für vorzeitige Hirnverletzungen und Mortalität14. Um das GMH-Modell weiter zu charakterisieren, haben wir eine retroorbitale Injektion des BDA-Tracers (Abbildung 2) verwendet, um die Auswirkungen von GMH auf die Funktion und Integrität der Blut-Hirn-Schranke zu untersuchen14.
Im Vergleich zu mit Kochsalzlösung injizierten Kontrollen (Abbildung 2A) ermöglichte die erfolgreiche retroorbitale Injektion des BDA-Tracers14 die Beurteilung des Vorhandenseins des Tracers im Gehirngefäßsystem 10 Minuten nach der BDA-Injektion (Abbildung 2B). Diese Technik wurde dann verwendet, um eine Penumbra-Gefäßleckage von BDA auf der Ebene einzelner Blutgefäße bei GMH-geschädigten Tieren zu erkennen (Abbildung 2C, rote Pfeile), die dann quantifiziert werden kann10.
Abbildung 1: Versuchsaufbau mit schematischer Darstellung der Blutgefäße nach Verabreichung des Farbstoffs Trypanblau. (A) Anästhesieaufbau, (B) ohne und (C) mit faseroptischer Lichtquelle. (D) Retroorbitale Injektion des Farbstoffs Trypanblau in die P10 C5BL/6-Maus. (E) Schematische Darstellung der Blutgefäße in der P5 Wistar-Ratte nach Injektion des Farbstoffs Trypanblau. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative hirnmikroskopische Aufnahmen, die die Verteilung des BDA-Tracers zeigen. (A) Keine positive Färbung bei Kontrolltieren mit Kochsalzlösung. (B) In Kochsalzlösung gelöster BDA-Tracer war in einer Dosiskonzentration von 2,0 - 2,5 mg pro Tier in den Blutgefäßen des Gehirns (Kortex) sichtbar. (C) BDA-Tracer, der nach GMH in das Gehirnparenchym austritt (rote Pfeile). Maßstabsleiste = 200 μm. Adaptiert von Andersson et al., 202114. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Dieses Protokoll bietet eine klare und präzise Methode für die Injektion von Substanzen in den retroorbitalen Sinus von neugeborenen Mäusen und Ratten. Dies ist wichtig, weil es zeigt, dass retroorbitale Injektionen bei Nagetieren, die älter als P2 sind, bei denen die oberflächliche Schläfen-/Gesichtsvene nicht mehr erkennbar ist, und bei Tieren, die jünger als P12 sind, bei denen sich die Augenlider noch nicht geöffnet haben und der Augapfel nicht freiliegt, zuverlässig und reproduzierbar durchgeführt werden können. Darüber hinaus wird die retroorbitale Injektion bei Neugeborenen sowohl von den Jungtieren als auch von den Müttern gut vertragen, wobei das Risiko von Nebenwirkungen minimal ist, sobald die Technik beherrscht wurde.
IV-Injektionen haben einen Vorteil gegenüber anderen Verabreichungswegen, da sie eine Injektion hoher Konzentrationen sowie eines niedrigen und hohen pH-Werts ermöglichen, vorausgesetzt, dass die Injektionsrate konstant und niedrig gehalten wird, um einen Riss des Gefäßes zu vermeiden. Darüber hinaus ermöglichen intravenöse Injektionen eine schnellere Verteilung von Verbindungen, da sie direkt in den systemischen Kreislauf gelangen, wodurch mögliche Verzögerungen durch schlechte Resorption, die bei anderen Verabreichungswegen beobachtet werden, umgangen werden. Dies ermöglicht einen sofortigen Zugang und eine nahezu 100%ige Bioverfügbarkeit der Verbindungen.
Klinisch IV ist der bevorzugte Verabreichungsweg bei Neugeborenen (< Alter von 28 Tagen). Dies gilt insbesondere für die Intensivpflege von Neugeborenen, da die intravenöse Kanülierung einen einfachen Zugang zur Bereitstellung von Medikamenten/Flüssigkeiten ermöglicht. Injektionen über den sc-Weg wurden bei Neugeborenen in gewisser Weise eingesetzt, insbesondere zur Verabreichung von Erythropoetin15. Es wurden jedoch Bedenken geäußert, wobei eine Studie die intravenöse Infusion als überlegene Alternative vorschlug16. Die orale Verabreichung ist oft keine praktikable Option, wenn sich Neugeborene auf einer Intensivstation im Krankenhaus befinden. Darüber hinaus weisen Neugeborene im Vergleich zu Erwachsenen Unterschiede in ihrem Magen-Darm-Trakt auf, einschließlich einer verzögerten Magenentleerung und einer verminderten Darmmotilität, die die Arzneimittelabsorption beeinträchtigen kann. Intramuskuläre Injektionen sind aufgrund der geringen Muskelmasse von Neugeborenen schwierig zu verabreichen 3,4.
In der Nagetierforschung ist eine der am weitesten verbreiteten Methoden der IV-Injektion die Schwanzveneninjektion. Diese Methode ist jedoch bei der Arbeit mit Neugeborenen nicht praktikabel. Andere Infusionsstellen, wie z.B. die oberflächliche Schläfen-/Gesichtsvene6, werden bei P3 unsichtbar. Der neonatale Sinus transversum wurde in einer Studie beschrieben und bei P0-P1 durchgeführt, wobei mit Hilfe eines Mikroskops die Haut geöffnet und eine Kapillarnadel durch den Schädel in den Sinus transversum vorgeschoben wurde, was Injektionen von 2-4 μl Volumen ermöglichte7. Nur wenige Studien haben die Verwendung der Vena jugularis externa bei P7 bei Ratten17 dokumentiert. Hierbei handelt es sich jedoch um eine invasive Technik, die eine chirurgische Öffnung der Haut und eine Freilegung der Vena jugularis externaerfordert 18. In Studien an erwachsenen Nagetieren hat sich gezeigt, dass die retroorbitale Verabreichung genauso wirksam ist wie die Schwanzveneninjektion5 und damit die Lebensfähigkeit und Relevanz der retroorbitalen Route verstärkt. Die retroorbitale Injektion verursacht minimale Beschwerden und kann, sobald sie gemeistert ist, von einer einzigen Person mit minimaler Ausrüstung durchgeführt werden und ermöglicht mehrere Injektionen (wobei sichergestellt wird, dass die Augen abwechselnd sind). Frühere Studien haben gezeigt, dass die retroorbitale Injektion zur Verabreichung von Adeno-assoziiertem Virus 9 bei Mäusen bei P0-P1 oder bei P14-P2111 oder FITC-Dextran bei P17-19 verwendet wurde, was auf eine zunehmende Akzeptanz dieser Methode hindeutet.
Es gibt einige Einschränkungen im Zusammenhang mit der retroorbitalen Injektion bei Neugeborenen. Wie bei allen intravenösen Injektionen ist das injizierte Volumen begrenzt, und wir empfehlen für dieses Verfahren 5 μl/g. Zusätzlich erfordert die retroorbitale Injektion eine Ganzkörperanästhesie. Um Komplikationen zu minimieren, wird die Verwendung von inhalativen Anästhesiemitteln wie Isofluran empfohlen, da diese bei der Anästhesieeinleitung schneller sind, einen schnellen Stoffwechsel aufweisen und eine schnelle Genesungsrate aufweisen. Es ist eine Schulung erforderlich, vorzugsweise unter Verwendung von farbigem Farbstoff bei terminalanästhesierten Tieren, um eine mögliche Schwellung um die Injektionsstelle herum oder ein Augentrauma aufgrund einer falschen Platzierung der Nadelfase zu vermeiden. Aufgrund der geringen Größe dieser Tiere werden feinere Nadeln mit kleiner Nadelstärke benötigt. Die Injektion von Zellen muss in Einzelzellsuspension erfolgen, um eine Verstopfung der Gefäße zu vermeiden und die Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten. Ermutigend ist, dass eine Studie von Amer und Kollegen gezeigt hat, dass die Injektion von Säugetierzellen mit 30-G-Spritzen auch bei einem Auswurf mit hoher Zelldichte immer noch eine zuverlässige Zelllebensfähigkeit bietet20.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Etablierung eines zuverlässigen IV-Verabreichungswegs bei Neugeborenen von klinischer Bedeutung ist, da dies der bevorzugte Verabreichungsweg beim Menschen ist. Die retroorbitale Injektion kann leicht gemeistert werden, ist reproduzierbar und bietet eine relevante Alternative zu anderen intravenösen Injektionsstellen, wie z. B. Schwanz und Temporal-/Gesichtsvene, die während der gesamten neonatalen Periode von Nagetieren nicht zuverlässig verwendet werden können. Somit ermöglicht die retroorbitale Injektion bei Neugeborenen die Verabreichung von Medikamenten, Zellen und anderen Verbindungen im entsprechenden neonatalen Alter.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt in Bezug auf die Forschung, die Autorenschaft oder die Veröffentlichung dieses Protokolls besteht.
Acknowledgments
Die in diesem Protokoll durchgeführten Arbeiten wurden von der Hasselblad Foundation (2020-2021, ERF), der Åke Wibergs Foundation (M19-0660, ERF), dem Swedish Research Council (2019-01320, HH; 2021-01872, CM), dem Public Health Service des Sahlgrenska University Hospital (ALFGBG-965174, HH ; ALFGBG-966107, CM), The Swedish Brain Foundation (FO2022-0110, CM), Åhlen Foundation (223005, CM) und Horizon 2020 Rahmenprogramm der Europäischen Union (Finanzhilfevereinbarung Nr. 87472/PREMSTEM, HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
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