Summary
Questo protocollo mira a dimostrare una via di somministrazione venosa riproducibile che può essere utilizzata nei ratti e nei topi per tutto il periodo neonatale. Questa procedura è importante per gli studi preclinici sui roditori che desiderano rispecchiare la somministrazione di farmaci nelle unità di cura neonatale utilizzando principalmente la somministrazione endovenosa.
Abstract
L'iniezione endovenosa (iv) è la via di somministrazione del farmaco più utilizzata nei neonati in ambito clinico. Pertanto, l'iniezione della vena retroorbitaria è un metodo importante per la somministrazione di composti nella ricerca, dove gli studi proof-of-concept di successo possono progredire in studi clinici neonatali tanto necessari. La maggior parte degli studi endovenosi nei roditori neonatali utilizza la vena temporale/facciale superficiale. Tuttavia, l'iniezione retroorbitale diventa inaffidabile nei roditori neonatali più vecchi di 2 giorni dopo che la pelle si è scurita e la vena non è più visibile. Nel presente protocollo, descriviamo l'iniezione retroorbitale del seno venoso sia nel topo neonatale che nel ratto in età in cui la vena temporale superficiale non è più visibile, ma gli occhi non si sono ancora aperti. L'apertura dell'occhio facilita l'iniezione retroorbitale consentendo al ricercatore di vedere chiaramente che non stanno perforando l'occhio quando si inserisce l'ago. Dimostriamo che questa tecnica può essere eseguita in modo affidabile e riproducibile senza effetti avversi. Inoltre, dimostriamo che può essere utilizzato in molti studi, come la somministrazione di composti per studiare le lesioni cerebrali neonatali.
Introduction
La ricerca sugli animali è un passo essenziale che porta agli studi clinici e, in quanto tale, è importante che gli studi sugli animali imitino da vicino le procedure e i trattamenti eseguiti in ambito clinico. Tuttavia, ci sono diverse sfide nel tradurre le pratiche cliniche in studi neonatali sui roditori. Questi includono,tra gli altri, le piccole dimensioni del roditore neonatale e il divario nella ricerca e nella conoscenza neonatale rispetto alla ricerca sugli adulti.
La somministrazione di diverse sostanze come farmaci o cellule può essere eseguita attraverso più vie, tra cui iniezioni intraperitoneali (ip), sottocutanee (sc) ed endovenose (iv). L'iniezione endovenosa è la via preferenziale di somministrazione dei composti nei neonati umani. Nei neonati, la via di somministrazione endovenosa è vantaggiosa rispetto ad altre vie perché massimizza la distribuzione sistemica dei farmaci e ha un'elevata biodisponibilità 3,4. Una linea endovenosa ben mantenuta può essere utilizzata per la somministrazione ripetuta del farmaco. Negli studi sui roditori, le iniezioni endovenose devono essere eseguite nella coda, nelle vene facciali/temporali o nel seno retroorbitale5. L'iniezione della vena caudale è utilizzata di routine nei roditori adulti, in quanto fornisce due vene parallele caudali laterali tra cui scegliere5. Tuttavia, queste vene hanno un diametro ridotto, il che esclude il loro uso nei neonati. La maggior parte delle iniezioni endovenose neonatali sono state eseguite nella vena facciale/temporale superficiale, in quanto è visibile dal giorno postnatale 0 (P0)-P2 e consente una somministrazione di volume relativamente grande5. Tuttavia, questa via diventa inaffidabile intorno a P36 una volta che l'animale acquisisce la colorazione della pelle, rendendo così la vena facciale/temporale superficiale difficile da vedere con l'occhio non assistito. La somministrazione endovenosa attraverso il seno trasverso neonatale è stata descritta in uno studio7; tuttavia, ciò richiede l'apertura della pelle sopra il seno trasverso e l'iniezione di AAV9 a P0-P1 con l'assistenza di un microscopio.
Quando si studia un potenziale trattamento o si stabilisce un modello di lesione neonatale rilevante, è importante considerare che i roditori neonatali possono avere tempi di sviluppo degli organi diversi rispetto agli esseri umani. Il nostro protocollo si basa sulle differenze nello sviluppo del sistema nervoso centrale neonatale tra l'uomo e i roditori. Ad esempio, il termine cervello umano appena nato corrisponde approssimativamente a un cervello di ratto P7 e a un cervello di topo P108. Poiché la distribuzione delle sostanze iniettate per via retroorbitale è simile a quella degli altri siti endovenosi, con livelli ematici elevati che vengono rapidamente raggiunti, la consideriamo una via adatta. Questa tecnica è stata ben descritta da Yardeni e colleghi, che hanno iniettato composti nel seno venoso oftalmico nei topi P1-P29. Nell'attuale protocollo, mostriamo un metodo semplice e fattibile per eseguire iniezioni retroorbitali in roditori neonatali più anziani che devono ancora aprire gli occhi.
Protocol
Tutte le procedure elencate in questo protocollo sono conformi al Consiglio svedese per l'agricoltura e sono state approvate dal Comitato etico per gli animali di Göteborg (825-2017 e 2195-19). I topi C57BL/6 e i ratti Wistar sono stati allevati internamente con un ciclo luce/buio di 12 ore e libero accesso a cibo e acqua. Tutte le procedure sperimentali hanno seguito le linee guida ARRIVE10.
1. Configurazione dell'area di lavoro
- Per tutta la durata di questa procedura, prelevare gli animali da esperimento dalla gabbia della diga e metterli in una gabbia separata su un tappetino riscaldato (35-37 °C).
NOTA: Se si utilizza una fonte di luce (animali albini), è necessario utilizzare una fonte di luce non riscaldante che possa essere posizionata sotto la testa dell'animale.
2. Ago e soluzione
- Utilizzare un ago con 29-31 G (circa 0,30 mm).
- Per ottenere volumi accurati, prelevare la soluzione da iniettare da un volume pipettato.
NOTA: Un massimo di 5 μL/g di peso corporeo deve essere iniettato in ciascun seno retroorbitale.
3. Impostazione
- Posizionare gli animali su una superficie piana (Figura 1A) in decubito laterale (Figura 1C).
- Indurre l'anestesia con isoflurano su tutto il corpo (5% di induzione, 3% di mantenimento).
NOTA: Gli animali devono essere sottoposti ad anestesia utilizzando un boccaglio. L'area della palpebra e del dotto lacrimale non deve essere coperta (Figura 1D). - Controllare la profondità dell'anestesia utilizzando il metodo del riflesso di ritiro della zampa.
NOTA: Non è necessaria alcuna analgesia preoperatoria in quanto non è considerata una procedura invasiva11.
4. Procedura di iniezione
NOTA: Se possibile, utilizzare una fonte di luce sotto la testa dell'animale (Figura 1C), per facilitare la visione del seno venoso (Figura 1E). Non è necessaria alcuna sterilizzazione dell'area da iniettare, poiché la palpebra è ancora chiusa.
- Con la testa rivolta verso destra, somministrare l'iniezione nel seno retroorbitale destro (esempio di operatore destrorso).
- Inserire l'ago, smussato verso il basso, nella parte anteriore dell'orbita oculare, l'equivalente del canto mediale, con un angolo di circa 40°. Questo angolo consente di dirigere l'ago verso la parte posteriore dell'orbita dell'occhio.
- Far avanzare 1/3 dell'ago (circa 2 mm) nell'area del seno retroorbitale situata dietro l'orbita oculare.
- Iniettare con un movimento delicato, fluido e fluido.
- Attendere un momento, prima di estrarre lentamente l'ago per evitare il riflusso.
ATTENZIONE: Non aspirare. - Utilizzare una nuova siringa sterile per ogni animale per evitare contaminazioni.
NOTA: Quando si inietta una soluzione limpida, la vena dovrebbe diventare momentaneamente libera.
5. Cura post-iniezione
- Posizionare il cucciolo nella scatola di recupero, appoggiato su un dispositivo di riscaldamento protetto (35-37 °C).
- Attendi il recupero e controlla eventuali segni di sofferenza prima di riportare il cucciolo alla madre.
NOTA: Gli animali sottoposti a iniezione di colorante devono essere immediatamente soppressi secondo i protocolli approvati dalla IACUC.
ATTENZIONE: Se l'occhio si gonfia durante l'iniezione, significa che l'ago non è inserito nel plesso venoso e si trova invece nell'orbita oculare. Il cranio neonatale è molto morbido, se l'ago lo perfora, l'iniezione andrà nelle meningi o anche nel parenchima cerebrale.
Representative Results
La presente tecnica è stata eseguita su una superficie piana, con un boccaglio per l'anestesia globale (Figura 1A). Il boccaglio non deve ostruire l'accesso al canto mediale (Figura 1B). Negli animali albini, una sorgente di luce a fibre ottiche è stata posizionata sotto l'animale, per aiutare la visualizzazione delle vene (Figura 1B). L'ago è stato posizionato con un angolo di circa 40° ed è avanzato di circa 2 mm nel canto mediale (Figura 1C). L'iniezione di colorante blu di tripano in un ratto albino P5 ha permesso una chiara visualizzazione del colorante nel seno retroorbitale (Figura 1C).
La tecnica di iniezione retroorbitale descritta in questo protocollo è stata utilizzata con successo per somministrare il tracciante biotina-destrano (BDA, 10.000 Da)12. L'uso di traccianti visibili nella ricerca vascolare può, ad esempio, fornire un'alternativa all'uso dello stravaso di saccarosio radioattivo dai vasi sanguigni, consentendo l'uso dello stesso cervello per altre misurazioni istologiche12.
Recentemente, abbiamo stabilito un modello di emorragia della matrice germinale (GMH) nel ratto neonatale13. In breve, i ratti P5 Wistar hanno ricevuto una singola iniezione intracranica di 0,3 U di collagenasi VII nello striato mediale. La GMH provoca la rottura dei vasi nella matrice germinale ed è una delle cause prevalenti di lesioni cerebrali pretermine e mortalità14. Per caratterizzare ulteriormente il modello GMH, abbiamo utilizzato un'iniezione retroorbitale del tracciante BDA (Figura 2) per studiare gli effetti del GMH sulla funzione e sull'integrità della barriera emato-encefalica14.
Rispetto ai controlli iniettati con soluzione salina (Figura 2A), l'iniezione retroorbitale riuscita del tracciante BDA14 ha permesso di valutare la presenza del tracciante nella vascolarizzazione cerebrale 10 minuti dopo l'iniezione di BDA (Figura 2B). Questa tecnica è stata quindi utilizzata per rilevare la perdita vascolare di penombra di BDA a livello dei singoli vasi sanguigni negli animali con lesioni da GMH (Figura 2C, frecce rosse) che possono quindi essere quantificate10.
Figura 1: Configurazione sperimentale con vista del diagramma dei vasi sanguigni dopo la somministrazione del colorante blu tripano. (A) Configurazione dell'anestesia (B) senza e (C) con sorgente luminosa in fibra ottica. (D) Iniezione retroorbitale di colorante blu tripano nel topo P10 C5BL/6. (E) Vista del diagramma dei vasi sanguigni nel ratto P5 Wistar dopo l'iniezione di colorante blu tripano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Micrografie cerebrali rappresentative che mostrano la distribuzione del tracciante BDA. (A) Nessuna colorazione positiva negli animali di controllo iniettati con soluzione salina. (B) Il tracciante BDA disciolto in soluzione fisiologica, ad una concentrazione di dose di 2,0 - 2,5 mg per animale, era visibile all'interno dei vasi sanguigni del cervello (corteccia). (C) Tracciante BDA che fuoriesce nel parenchima cerebrale dopo GMH (frecce rosse). Barra della scala = 200 μm. Adattato da Andersson et al., 202114. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo protocollo fornisce un metodo chiaro e preciso per l'iniezione di sostanze nel seno retroorbitale di topi e ratti neonatali. Questo è importante perché dimostra che le iniezioni retroorbitali possono essere eseguite in modo affidabile e riproducibile nei roditori di età superiore a P2, dove la vena temporale/facciale superficiale non è più distinguibile, e negli animali più giovani di P12, dove le palpebre non si sono ancora aperte e il bulbo oculare non è esposto. Inoltre, l'iniezione retroorbitale neonatale è ben tollerata sia dai cuccioli che dalle madri, con rischi minimi di effetti collaterali una volta che la tecnica è stata padroneggiata.
Le iniezioni per via endovenosa hanno un vantaggio rispetto ad altre vie di somministrazione in quanto consentono l'iniezione ad alta concentrazione, nonché a pH basso e alto, a condizione che la velocità di iniezione sia mantenuta costante e bassa per evitare la rottura del vaso. Inoltre, le iniezioni endovenose consentono una distribuzione più rapida dei composti in quanto entrano direttamente nella circolazione sistemica, bypassando così i potenziali ritardi dovuti allo scarso assorbimento osservato in altre vie di somministrazione. Ciò consente l'accesso immediato e una biodisponibilità quasi del 100% dei composti.
Clinicamente iv è la via di somministrazione preferita nei neonati (< 28 giorni di età). Ciò è particolarmente vero nelle strutture di terapia intensiva neonatale, poiché l'incannulamento endovenoso consente un facile accesso alla fornitura di farmaci/fluidi. Le iniezioni per via sc sono state in qualche modo utilizzate nei neonati, in particolare per la somministrazione di eritropoietina15. Tuttavia, sono state sollevate preoccupazioni, con uno studio che suggerisce l'infusione endovenosa come alternativa superiore16. La somministrazione orale non è spesso un'opzione pratica quando i neonati si trovano in un'unità intensiva ospedaliera. Inoltre, rispetto agli adulti, i neonati presentano differenze nel tratto gastrointestinale, tra cui lo svuotamento gastrico ritardato e la diminuzione della motilità intestinale che possono influenzare l'assorbimento del farmaco. Le iniezioni intramuscolari sono difficili da somministrare a causa della piccola massa muscolare dei neonati 3,4.
Nella ricerca sui roditori, uno dei metodi più utilizzati per le iniezioni endovenose è l'iniezione della vena caudale. Tuttavia, questo metodo è indispensabile quando si lavora con i neonati. Altri siti endovenosi, come la vena temporale/facciale superficiale6 , diventano invisibili in P3. Il seno trasverso neonatale è stato descritto in uno studio ed è stato eseguito a P0-P1 e, con l'aiuto di un microscopio, aprendo la pelle e facendo avanzare un ago capillare attraverso il cranio nel seno trasverso, consentendo iniezioni di volume di 2-4 μl7. Pochi studi hanno documentato l'uso della vena giugulare esterna a P7 nei ratti17. Tuttavia, si tratta di una tecnica invasiva che richiede l'apertura chirurgica della pelle e l'esposizione della vena giugulare esterna18. In studi su roditori adulti, la somministrazione retroorbitale ha dimostrato di essere efficace quanto l'iniezione della vena caudale5 , rafforzando così la vitalità e la pertinenza della via retroorbitale. L'iniezione retroorbitale provoca un disagio minimo e, una volta padroneggiata, può essere eseguita da una sola persona con un'attrezzatura minima e consente iniezioni multiple (assicurando che gli occhi siano alternati). Studi precedenti hanno dimostrato che l'iniezione retroorbitale è stata utilizzata per somministrare il virus adeno-associato 9 nei topi a P0-P1 o a P14-P2111 o FITC-destrano a P1719 , indicando una crescente accettazione di questo metodo.
Ci sono alcune limitazioni associate all'iniezione retroorbitale nei neonati. Come per tutte le iniezioni endovenose, il volume iniettato è limitato e si consiglia di assumere 5 μL/g per questa procedura. Inoltre, l'iniezione retroorbitale richiede l'anestesia di tutto il corpo. Per ridurre al minimo le complicanze, si suggerisce l'uso di agenti anestetici per via inalatoria come l'isoflurano, poiché questi sono più rapidi nell'induzione dell'anestesia, hanno un metabolismo veloce e hanno un rapido tasso di recupero. È necessaria una formazione, preferibilmente utilizzando coloranti colorati in animali anestetizzati terminalmente, per evitare potenziali gonfiori intorno al sito di iniezione o traumi oculari dovuti a un posizionamento errato dello smusso dell'ago. A causa delle piccole dimensioni di questi animali, sono necessari aghi più fini, con aghi di piccolo calibro. L'iniezione di cellule deve essere eseguita in sospensione di una singola cellula, per evitare l'ostruzione dei vasi e per garantire la vitalità cellulare. In modo incoraggiante, uno studio di Amer e colleghi ha dimostrato che l'iniezione di cellule di mammifero utilizzando siringhe da 30 G fornisce ancora una vitalità cellulare affidabile anche con l'espulsione ad alta densità cellulare20.
In sintesi, l'istituzione di una via endovenosa affidabile nei neonati è di importanza clinica, poiché questa è la via di somministrazione preferita nell'uomo. L'iniezione retroorbitale può essere facilmente padroneggiata, è riproducibile e fornisce un'alternativa rilevante ad altri siti di iniezione endovenosa, come la coda e la vena temporale/facciale, che non possono essere utilizzate in modo affidabile durante tutto il periodo neonatale dei roditori. Pertanto, l'iniezione retroorbitale neonatale consente la somministrazione di farmaci, cellule e altri composti all'età neonatale appropriata.
Disclosures
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi per quanto riguarda la ricerca, la paternità o la pubblicazione di questo protocollo.
Acknowledgments
Il lavoro svolto in questo protocollo è stato finanziato dalla Fondazione Hasselblad (2020-2021, ERF), dalla Fondazione Åke Wibergs (M19-0660, ERF), dal Consiglio svedese della ricerca (2019-01320, HH; 2021-01872, CM), dal Servizio sanitario pubblico presso l'ospedale universitario Sahlgrenska (ALFGBG-965174, HH ; ALFGBG-966107, CM), la Swedish Brain Foundation (FO2022-0110, CM), la Åhlen Foundation (223005, CM) e il programma quadro Horizon 2020 dell'Unione europea (accordo di sovvenzione n. 87472/PREMSTEM, HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
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