Summary
このプロトコルは、新生児期を通じてラットおよびマウスで使用できる再現性のある静脈投与経路を実証することを目的としています。この手順は、主に静脈内投与を使用して新生児ケアユニットでの薬物投与を反映したい前臨床げっ歯類研究にとって重要です。
Abstract
静脈内(iv)注射は、臨床現場で新生児に最もよく使用される薬物投与経路です。したがって、眼窩後静脈注射は、研究における化合物投与の重要な方法であり、概念実証研究が成功すると、切望されている新生児臨床試験に進むことができます。新生児げっ歯類のほとんどの静脈内研究は、表在性側頭静脈/顔面静脈を使用します。しかし、眼窩後注射は、皮膚が暗くなり、静脈が見えなくなってから2日以上経過した新生児げっ歯類では信頼できなくなります。本プロトコルでは、新生仔マウスとラットの両方で、表在性側頭静脈が見えなくなったが、目がまだ開いていない年齢での静脈洞の眼窩後注射について説明します。開眼は、針を刺すときに眼穿孔していないことを研究者がはっきりと確認できるようにすることで、眼窩後注射を容易にします。この手法は、悪影響を及ぼすことなく、信頼性と再現性のある方法で実行できることを実証します。さらに、新生児脳損傷を研究するための化合物の投与など、多くの研究で使用できることを示しています。
Introduction
動物実験は臨床試験に繋がる重要なステップであり、動物実験は臨床現場で行われる手順や治療を忠実に模倣することが重要です。しかし、臨床診療を新生児げっ歯類研究に変換するには、いくつかの課題があります。これらには、新生児げっ歯類のサイズが小さいことや、成人の研究と比較した新生児の研究と知識のギャップなどが含まれます1,2。
薬物や細胞などのさまざまな物質の投与は、腹腔内(ip)、皮下(sc)、静脈内(iv)注射など、複数の経路で行うことができます。ivによる注射は、ヒト新生児における化合物の優先投与経路である。新生児では、静脈内投与経路は、薬物の全身分布を最大化し、高いバイオアベイラビリティを有するため、他の経路と比較して有利である3,4。手入れの行き届いたIVラインは、反復投与に使用できます。げっ歯類の研究では、静脈注射は尾部、顔面/側頭静脈、または眼窩後洞で行う必要があります5。尾静脈注射は、成体のげっ歯類で日常的に使用されており、2つの側尾平行静脈を5本から選択できます。しかし、これらの静脈は直径が小さいため、新生児での使用は除外されます。ほとんどの新生児静脈注射は、出生後0日目(P0)-P2から見え、比較的大量の投与を可能にするため、表在性顔面/側頭静脈で行われてきました5。しかし、この経路は、動物が皮膚の色を獲得すると、P36付近で信頼できなくなり、それによって肉眼では表在性の顔面/側頭静脈が見えにくくなります。新生児横洞を介したIV投与は、1件の研究7で報告されている。ただし、これには横洞の上の皮膚を開き、顕微鏡の助けを借りてP0-P1にAAV9を注入する必要があります。
潜在的な治療法を調査したり、関連する新生児傷害モデルを確立したりする場合、新生児げっ歯類はヒトとは異なる臓器の発達タイミングを持つ可能性があることを考慮することが重要です。私たちのプロトコルは、ヒトとげっ歯類の間の新生児中枢神経系の発達の違いに基づいています。一例として、新生児ヒト脳という用語は、P7ラットおよびP10マウス脳にほぼ対応する8。眼窩後から注入される物質の分布は、他のIV部位と類似しており、急速に高い血中濃度が達成されているため、適切な経路であると考えています。この手法は、P1-P2マウスの眼静脈洞に化合物を注入したYaldeniらによってよく説明されています9。現在のプロトコルでは、まだ目を開けていない高齢の新生児げっ歯類に眼窩後注射を行う簡単で実行可能な方法を示します。
Protocol
このプロトコルに記載されているすべての手順は、スウェーデン農業委員会に準拠しており、ヨーテボリ動物倫理委員会(825-2017および2195-19)によって承認されています。C57BL/6マウスとWistarラットは、12時間の明暗サイクルと餌と水への自由なアクセスで社内で飼育されました。すべての実験手順は、ARRIVEガイドライン10に従った。
1. ワークスペースの設定
- この手順の間、実験動物をダムケージから集め、加熱パッド(35〜37°C)の別のケージに入れます。
注意: 光源(アルビノの動物)を使用する場合は、動物の頭の下に配置できる非熱光源を使用する必要があります。
2.針と溶液
- 針は29〜31G(約0.30mm)のものを使用してください。
- 正確な容量を得るには、ピペットで留めた容量から注入する溶液を採取します。
注:最大5μL / g体重を各眼窩後洞に注射する必要があります。.
3. セットアップ
- 動物を横臥(図1C)の平らな面(図1A)に置きます。
- 全身イソフルラン麻酔を誘発します(5%導入、3%維持)。
注:動物はマウスピースを使用して麻酔下に置かれるべきです。まぶたと涙管の領域は覆わないでください(図1D)。 - 足引き戻し反射法で麻酔の深さを確認します。
注:これは侵襲的な手順とは見なされないため、術前の鎮痛は必要ありません11。
4.注射手順
注意: 可能であれば、動物の頭の下に光源を使用して(図1C)、静脈洞の視界を容易にします(図1E)。まぶたはまだ閉じているため、注射する部分の滅菌は必要ありません。
- 頭を右に向けて、右眼窩後洞に注射します(右利きのオペレーターの例)。
- 針を下向きに斜めに、眼窩の前面(内側眼窩に相当)に約40°の角度で挿入します。この角度により、針を眼窩の後ろに向けることができます。
- 針の1/3(約2 mm)を眼窩の後ろにある眼窩後洞の領域に進めます。
- 穏やかで滑らかで滑らかな動きで注入します。
- しばらく待ってから、逆流を防ぐために針をゆっくりと引き抜きます。
注意:吸引しないでください。 - 汚染を避けるために、動物ごとに新しい滅菌シリンジを使用してください。
注意: 透明な溶液を注入すると、静脈が一時的に透明になるはずです。
5.注射後のケア
- 子犬を回復ボックスに入れ、保護された加温装置(35〜37°C)の上に置きます。
- 回復を待ち、苦痛の兆候がないか確認してから、子犬をダムに戻します。
注:染料を注入された練習動物は、IACUCが承認したプロトコルに従って直ちに安楽死させる必要があります。
注意:注射中に目が腫れる場合は、針が静脈叢に挿入されず、代わりに眼窩にあることを意味します。新生児の頭蓋骨は非常に柔らかく、針に穴が開くと、注射は髄膜や脳実質にも入ります。
Representative Results
本技術は、全身麻酔用のマウスピースを用いて、平らな面で実施した(図1A)。マウスピースは内側カンサスへのアクセスを妨げてはなりません(図1B)。アルビノの動物では、静脈の視覚化を支援するために、動物の下に光ファイバー光源を配置しました(図1B)。針を約40°の角度で配置し、内側歯に約2mm前進させました(図1C)。P5アルビノラットにトリパンブルー色素を注入したところ、眼窩後洞内の色素が明確に可視化されました(図1C)。
このプロトコルで記述されている後眼窩注入技術が、トレーサービオチンデキストラン(BDA、10,000 Da)12の投与に成功裏に使用されました。血管研究における目に見えるトレーサーの使用は、例えば、血管からの放射性スクロース血管外漏出を使用する代替手段を提供し、他の組織学的測定に同じ脳を使用することを可能にします12。
最近では、胚基質出血(GMH)の新生仔ラットモデルを確立した13。簡単に言うと、P5 Wistarラットは、内側線条体に0.3UのコラゲナーゼVIIを頭蓋内注射を1回受けました。GMHは胚基質の血管の破裂をもたらし、早産脳損傷と死亡率の最も一般的な原因の1つです14。GMHモデルをさらに特徴付けるために、BDAトレーサーの眼窩後注射(図2)を使用して、血液脳関門の機能と完全性におけるGMHの影響を調査しました14。
生理食塩水注入対照(図2A)と比較すると、BDAトレーサー14 の眼窩後注入が成功し、BDA注入の10分後に脳血管系におけるトレーサーの存在を評価することができました(図2B)。次に、この技術を使用して、GMH損傷動物の個々の血管レベルでBDAの半影血管漏出を検出し(図2C、赤い矢印)、定量化することができます10。
図1:トリパンブルー色素投与後の血管の図による実験セットアップ。 (A)麻酔セットアップ(B)なし、(C)光ファイバー光源付き。(D)P10 C5BL/6マウスにおけるトリパンブルー色素の眼窩後注入。(E)トリパンブルー色素注入後のP5 Wistarラットの血管の図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:BDAトレーサーの分布を示す代表的な脳顕微鏡写真。 (A)生理食塩水注射対照動物に陽性染色なし。(B)BDAトレーサーを生理食塩水に溶解し、1匹あたり2.0〜2.5mgの用量濃度で脳(皮質)の血管内に見えました。(C)BDAトレーサーがGMHに続いて脳実質に漏れ出している(赤い矢印)。スケールバー = 200 μm。Andersson et al., 202114より引用。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルは新生児のマウスおよびラットのretroorbital洞に物質の注入のための明確で、精密な方法を提供する。これは、P2より古いげっ歯類では、表在性側頭静脈/顔面静脈がもはや識別できない、およびP12よりも若い動物では、まぶたがまだ開いておらず、眼球が露出していない動物で、眼窩後注射を確実かつ再現性よく実行できることを示しているため、重要です。さらに、新生児の眼窩後注射は、仔犬とダムの両方に忍容性が高く、技術が習得されれば副作用のリスクは最小限に抑えられます。
ivによる注射は、血管の破裂を避けるために注入速度が一定かつ低く保たれていることを条件に、高濃度、低pHと高pHの両方の注射を可能にするため、他の投与経路よりも有利です。さらに、静脈注射は、化合物が体循環に直接入るので、化合物のより速い分布を可能にし、他の投与経路で観察される吸収不良による潜在的な遅延を回避します。これにより、化合物の即時アクセスとほぼ100%のバイオアベイラビリティが可能になります。
臨床的には、新生児(生後28日<)における好ましい投与経路です。.これは、点滴カニューレ挿入により薬物/輸液を提供するための容易なアクセスを可能にするため、新生児集中治療室の環境に特に当てはまります。sc経路を介した注射は、新生児、特にエリスロポエチン15の投与にいくらか使用されています。しかし、懸念が提起されており、点滴が優れた代替手段として示唆されている研究があります16。経口投与は、新生児が病院の集中病棟にいる場合、しばしば実用的な選択肢ではありません。さらに、成人と比較して、新生児は胃内容排出の遅延や腸の運動性の低下など、消化管に違いがあり、薬物吸収に影響を与える可能性があります。筋肉内注射は、新生児の筋肉量が少ないため、投与が困難です3,4。
げっ歯類の研究では、静脈注射の最も広く使用されている方法の1つは尾静脈注射です。ただし、この方法は新生児を扱う場合には実行不可能です。表在性側頭静脈/顔面静脈6 などの他のIV部位は、P3で見えなくなります。新生児の横洞は1つの研究で説明されており、P0-P1で実施され、顕微鏡の助けを借りて、皮膚を開き、頭蓋骨から毛細血管針を横静脈洞に進め、2〜4μlの容量の注射を可能にしました7。ラットのP7での外頸静脈の使用を記録した研究はほとんどありません17。しかしながら、これは皮膚の外科的開口および外頸静脈18の露出を必要とする侵襲的技術である。成体のげっ歯類を用いた研究では、眼窩後投与は尾静脈注射5 と同等の効果があることが示されており、眼窩後経路の生存率と関連性が強化されています。眼窩後注射は最小限の苦痛を引き起こし、一度習得すれば、最小限の機器で1人で行うことができ、複数の注射を可能にします(目が交互に行われることを確実にします)。以前の研究では、P0-P1またはP14-P2111 またはP1719 のマウスにアデノ随伴ウイルス9を投与するために眼窩後注射が使用されていることが示されており、この方法の受け入れが増加していることを示しています。
新生児の眼窩後注射にはいくつかの制限があります。すべての静脈内注射と同様に、注入量は限られているため、この手順では5μL/gを推奨します。さらに、眼窩後注射には全身麻酔が必要です。合併症を最小限に抑えるために、イソフルランなどの吸入麻酔薬の使用が推奨されています。注射部位の周囲の腫れや、針の面取りの誤った配置による眼の外傷を避けるために、できれば末期麻酔動物に着色染料を使用したトレーニングが必要です。これらの動物はサイズが小さいため、針ゲージが小さい、より細い針が必要です。細胞の注入は、血管の閉塞を防ぎ、細胞の生存率を確保するために、単一細胞懸濁液で行う必要があります。有望なことに、Amerらの研究は、30Gシリンジを使用して哺乳類細胞を注入すると、高細胞密度の駆出でも信頼性の高い細胞生存率が得られることが示されています20。
要約すると、新生児における信頼できるIV経路の確立は、これがヒトにおける好ましい投与経路であるため、臨床的に重要である。眼窩後注射は簡単に習得でき、再現性があり、げっ歯類の新生児期を通じて確実に使用できない尾部や側頭/顔面静脈など、他の静脈注射部位に関連する代替手段を提供します。したがって、新生児眼窩後注射は、適切な新生児年齢における薬物、細胞および他の化合物の送達を可能にする。
Disclosures
著者らは、このプロトコルの研究、著作者、または出版に関して利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
このプロトコルで実施された研究は、ハッセルブラッド財団(2020-2021、ERF)、オーケ・ウィベルグス財団(M19-0660、ERF)、スウェーデン研究評議会(2019-01320、HH;2021-01872、CM)、サールグレンスカ大学病院の公衆衛生サービス(ALFGBG-965174、HH;ALFGBG-966107, CM)、スウェーデン脳財団(FO2022-0110, CM)、Åhlen Foundation(223005, CM)、欧州連合のHorizon 2020 Framework Program(助成金契約番号87472/PREMSTEM, HH)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
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