Summary
Este protocolo tem como objetivo demonstrar uma via de administração venosa reprodutível que possa ser utilizada em ratos e camundongos durante todo o período neonatal. Esse procedimento é importante para estudos pré-clínicos com roedores que desejam espelhar a administração de medicamentos em unidades neonatais, principalmente por via intravenosa.
Abstract
A injeção intravenosa (iv) é a via de administração de fármacos mais utilizada em neonatos no contexto clínico. Portanto, a injeção de veia retroorbital é um método importante para administração de compostos em pesquisa, onde estudos bem-sucedidos de prova de conceito podem progredir para ensaios clínicos neonatais muito necessários. A maioria dos estudos intravenosos em roedores neonatais utiliza a veia temporal superficial/facial. No entanto, a injeção retroorbital torna-se pouco confiável em roedores neonatais com mais de 2 dias após o escurecimento da pele e o não aparecimento da veia. No presente protocolo, descrevemos a injeção retroorbital do seio venoso em camundongos e ratos neonatos em idades em que a veia temporal superficial não é mais visível, mas os olhos ainda não se abriram. A abertura ocular facilita a injeção retro-orbital, permitindo que o pesquisador veja claramente que eles não estão perfurando o olho ao inserir a agulha. Demonstramos que esta técnica pode ser realizada de forma confiável e reprodutível, sem efeitos adversos. Além disso, mostramos que ele pode ser usado em muitos estudos, como a administração de compostos para estudar lesão cerebral neonatal.
Introduction
A pesquisa em animais é uma etapa essencial que leva a ensaios clínicos e, como tal, é importante que os estudos em animais mimetizem de perto os procedimentos e tratamentos realizados no ambiente clínico. No entanto, existem vários desafios na tradução das práticas clínicas para estudos com roedores neonatais. Estes incluem o pequeno tamanho do roedor neonatal e a lacuna na pesquisa neonatal e no conhecimento em comparação com a pesquisa em adultos, entre outros 1,2.
A administração de diferentes substâncias, como drogas ou células, pode ser realizada por múltiplas vias, incluindo injeções intraperitoneais (ip), subcutâneas (sc) e intravenosas (iv). A injeção por via iv é a via preferencial de administração de compostos em neonatos humanos. Em neonatos, a via de administração IV é vantajosa em relação a outras vias, pois maximiza a distribuição sistêmica dos fármacos e apresenta alta biodisponibilidade 3,4. Uma linha IV bem mantida pode ser usada para administração repetida de medicamentos. Em estudos com roedores, injeções iv devem ser realizadas na cauda, veias faciais/temporais ou no seio retroorbital5. A injeção da veia caudal é rotineiramente usada em roedores adultos, pois fornece duas veias laterais paralelas caudais para escolherentre 5. No entanto, essas veias têm um diâmetro pequeno, o que exclui seu uso em neonatos. A maioria das injeções intravenosas neonatais tem sido realizada na veia superficial facial/temporal, pois é visível a partir do dia 0 (P0)-P2 pós-natal e permite a administração de um volume relativamente grande5. No entanto, essa via torna-se pouco confiável em torno de P36 uma vez que o animal ganha coloração da pele, dificultando a visualização da veia superficial facial/temporal a olho nu. A administração iv via seio transverso neonatal foi descrita em um estudo7; no entanto, isso requer a abertura da pele acima do seio transverso e a injeção de AAV9 em P0-P1 com auxílio de um microscópio.
Ao investigar um potencial tratamento ou estabelecer um modelo relevante de lesão neonatal, é importante considerar que os roedores neonatais podem ter um tempo de desenvolvimento de órgãos diferente do humano. Nosso protocolo é baseado nas diferenças no desenvolvimento do sistema nervoso central neonatal entre humanos e roedores. Como exemplo, o termo cérebro humano recém-nascido corresponde aproximadamente aum cérebro de rato P7 e um cérebro de camundongo P108. Como a distribuição das substâncias injetadas retroorbitalmente é semelhante à dos outros sítios iv, com níveis sanguíneos elevados sendo rapidamente alcançados, consideramos que é uma via adequada. Essa técnica foi bem descrita por Yardeni e colaboradores, que injetaram compostos no seio venoso oftálmico em camundongos P1-P29. No protocolo atual, mostramos um método simples e viável de realizar injeções retroorbitárias em roedores neonatais mais velhos que ainda não abriram os olhos.
Protocol
Todos os procedimentos listados neste protocolo estavam em conformidade com o Conselho de Agricultura da Suécia e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal de Gotemburgo (825-2017 e 2195-19). Camundongos C57BL/6 e ratos Wistar foram criados internamente com ciclo claro/escuro de 12 h e livre acesso a água e ração. Todos os procedimentos experimentais seguiram as diretrizes do ARRIVE10.
1. Configuração do espaço de trabalho
- Durante este procedimento, recolher os animais experimentais da gaiola da barragem e colocá-los numa gaiola separada sobre uma almofada aquecida (35-37 °C).
NOTA: Se estiver usando uma fonte de luz (animais albinos), uma fonte de luz não quente que possa ser posicionada abaixo da cabeça do animal deve ser usada.
2. Agulha e solução
- Use uma agulha com 29-31 G (cerca de 0,30 mm).
- Para volumes precisos, extrair a solução a ser injetada a partir de um volume pipetado.
NOTA: Um máximo de 5 μL/g de peso corporal deve ser injetado em cada seio retroorbital.
3. Configuração
- Colocar os animais em superfície plana (Figura 1A) em decúbito lateral (Figura 1C).
- Induzir anestesia com isoflurano de corpo inteiro (5% indução, 3% manutenção).
NOTA: Os animais devem ser colocados sob anestesia usando um bocal. A área da pálpebra e do ducto lacrimal não deve ser coberta (Figura 1D). - Verifique a profundidade da anestesia usando o método do reflexo de retirada da pata.
OBS: Não é necessária analgesia pré-operatória, pois não é considerado um procedimento invasivo11.
4. Procedimento de injeção
OBS: Se possível, utilizar uma fonte de luz sob a cabeça do animal (Figura 1C), para facilitar a visualização do seio venoso (Figura 1E). Não é necessária a esterilização da área a ser injetada, pois a pálpebra ainda está fechada.
- Com a cabeça voltada para a direita, administrar a injeção no seio retroorbital direito (exemplo de operador destro).
- Insira a agulha, chanfro para baixo, na frente da cavidade ocular - o equivalente ao canto medial, em um ângulo de aproximadamente 40°. Este ângulo permite que a agulha seja direcionada para a parte de trás da órbita do olho.
- Avançar 1/3 da agulha (cerca de 2 mm) para a área do seio retroorbital localizada atrás da órbita do olho.
- Injete em um movimento suave, suave e fluido.
- Aguarde um momento, antes de retirar a agulha lentamente para evitar o refluxo.
ATENÇÃO: Não aspirar. - Use uma nova seringa estéril para cada animal para evitar contaminação.
NOTA: Ao injetar uma solução clara, a veia deve ficar momentaneamente clara.
5. Cuidados pós-injeção
- Coloque o filhote na caixa de recuperação, apoiado em um dispositivo de aquecimento protegido (35-37 °C).
- Aguarde a recuperação e verifique se há sinais de aflição antes de devolver o filhote à represa.
NOTA: Os animais de prática injetados com corante devem ser imediatamente eutanasiados de acordo com os protocolos aprovados pela IACUC.
CUIDADO: Se o olho inchar durante a injeção, significa que a agulha não é inserida no plexo venoso e, em vez disso, está na órbita do olho. O crânio neonatal é muito macio, se a agulha perfurá-lo, então a injeção irá para as meninges ou mesmo o parênquima cerebral.
Representative Results
A presente técnica foi realizada em superfície plana, com bocal para anestesia global (Figura 1A). O bocal não deve bloquear o acesso ao canto medial (Figura 1B). Nos animais albinos, uma fonte de luz de fibra óptica foi colocada abaixo do animal, para auxiliar na visualização das veias (Figura 1B). A agulha foi posicionada em um ângulo de aproximadamente 40° e avançou cerca de 2 mm em direção ao canto medial (Figura 1C). A injeção do corante azul de tripano em um rato albino P5 permitiu nítida visualização do corante no seio retroorbital (Figura 1C).
A técnica de injeção retroorbitária descrita neste protocolo foi utilizada com sucesso para administrar o traçador biotina-dextran (BDA, 10.000 Da)12. O uso de traçadores visíveis em pesquisas vasculares pode, por exemplo, fornecer uma alternativa ao uso do extravasamento de sacarose radioativa dos vasos sanguíneos, possibilitando o uso dos mesmos cérebros para outras medidas histológicas12.
Recentemente, estabelecemos um modelo neonatal de hemorragia da matriz germinativa (GMH) em ratos13. Em resumo, ratos P5 Wistar receberam uma única injeção intracraniana de 0,3 U de colagenase VII no estriado medial. O GMH resulta em ruptura dos vasos da matriz germinativa e é uma das causas prevalentes de lesão cerebral pré-termo e mortalidade14. Para caracterizar melhor o modelo de GMH, utilizamos uma injeção retroorbital do traçador BDA (Figura 2) para investigar os efeitos do GMH na função e integridade da barreira hematoencefálica14.
Quando comparado aos controles injetados com solução salina (Figura 2A), a injeção retroorbital bem sucedida do traçador BDA14 permitiu avaliar a presença do traçador na vasculatura cerebral 10 min após a injeção de BDA (Figura 2B). Essa técnica foi então utilizada para detectar extravasamento vascular penumbra de BDA ao nível dos vasos sanguíneos individuais em animais lesados por GMH (Figura 2C, setas vermelhas), que pode então ser quantificado10.
Figura 1: Montagem experimental com visualização em diagrama dos vasos sanguíneos após administração do corante azul de tripano. (A) Instalação anestésica (B) sem e (C) com fonte de luz de fibra óptica. (D) Injeção retroorbital do corante azul de tripano no camundongo P10 C5BL/6. (E) Visualização diagramática dos vasos sanguíneos no rato Wistar P5 após injeção de corante azul de tripano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Micrografias cerebrais representativas mostrando a distribuição do traçador BDA. (A) Nenhuma coloração positiva nos animais controle injetados com solução salina. (B) O traçador BDA dissolvido em solução salina, na concentração de dose de 2,0 - 2,5 mg por animal, era visível dentro dos vasos sanguíneos do cérebro (córtex). (C) Extravasamento do traçador BDA para o parênquima cerebral após GMH (setas vermelhas). Barra de escala = 200 μm. Adaptado de Andersson et al., 202114. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este protocolo fornece um método claro e preciso para a injeção de substâncias no seio retroorbital de camundongos e ratos neonatais. Isso é importante, pois mostra que as injeções retroorbitárias podem ser realizadas de forma confiável e reprodutível em roedores mais velhos que P2, onde a veia temporal superficial/facial não é mais discernível, e em animais mais jovens que P12, onde as pálpebras ainda não abriram e o globo ocular não está exposto. Além disso, a injeção retroorbital neonatal é bem tolerada tanto pelos filhotes quanto pelas mães, com riscos mínimos de efeitos colaterais, uma vez dominada a técnica.
As injeções via iv têm vantagem sobre outras vias de administração, pois permitem a injeção de alta concentração, bem como pH baixo e alto, desde que a taxa de injeção seja mantida constante e baixa para evitar a ruptura do vaso. Além disso, as injeções iv permitem uma distribuição mais rápida dos compostos à medida que entram diretamente na circulação sistêmica, contornando assim os atrasos potenciais da má absorção observados em outras vias de administração. Isso permite acesso imediato e quase 100% de biodisponibilidade dos compostos.
Clinicamente iv é a via de administração preferencial em neonatos (< 28 dias de idade). Isso é especialmente verdadeiro em ambientes de terapia intensiva neonatal, pois a canulação IV permite fácil acesso para fornecer medicamentos/fluidos. Injeções por via sc têm sido pouco utilizadas em neonatos, particularmente para a administração de eritropoetina15. No entanto, preocupações têm sido levantadas, com um estudo sugerindo a infusão iv como uma alternativa superior16. A administração oral muitas vezes não é uma opção prática quando os neonatos estão em uma unidade hospitalar intensiva. Além disso, em comparação com adultos, os neonatos apresentam diferenças no trato gastrointestinal, incluindo retardo no esvaziamento gástrico e diminuição da motilidade intestinal, o que pode afetar a absorção da droga. Injeções intramusculares são de difícil administração devido à pequena massa muscular dos neonatos 3,4.
Na pesquisa de roedores, um dos métodos mais utilizados de injeções iv é a injeção da veia da cauda. No entanto, esse método é inviável quando se trabalha com neonatos. Outros sítios iv, como a veia temporal superficial/facial6 , tornam-se invisíveis em P3. O seio transverso neonatal foi descrito em um estudo e foi realizado no P0-P1 e, com auxílio de microscópio, abertura da pele e avanço de agulha capilar através do crânio para o seio transverso, permitindo injeções de volume de 2-4 μl7. Poucos estudos documentaram o uso da veia jugular externa no P7 emratos17. Entretanto, trata-se de uma técnica invasiva que requer abertura cirúrgica da pele e exposição da veia jugularexterna18. Em estudos em roedores adultos, a administração retroorbitária tem se mostrado tão eficaz quanto a injeção na veia caudal5 , reforçando a viabilidade e relevância da via retroorbitária. A injeção retroorbital causa sofrimento mínimo e, uma vez dominada, pode ser realizada por uma única pessoa com equipamento mínimo e permite múltiplas injeções (garantindo que os olhos sejam alternados). Estudos prévios mostraram que a injeção retroorbital tem sido usada para administrar vírus adenoassociado 9 em camundongos em P0-P1 ou em P14-P2111 ou FITC-dextran em P1719 , indicando uma aceitação crescente deste método.
Existem algumas limitações associadas à injeção retroorbitária em neonatos. Como em todas as injeções intravenosas, o volume injetado é limitado, e recomendamos 5 μL/g para esse procedimento. Além disso, a injeção retroorbital requer anestesia de corpo inteiro. Para minimizar as complicações, sugere-se o uso de agentes anestésicos inalatórios, como o isoflurano, por serem mais rápidos na indução anestésica, terem metabolismo rápido e rápida taxa de recuperação. É necessário treinamento, preferencialmente com corante colorido em animais anestesiados terminalmente, para evitar possíveis inchaços ao redor do local da injeção ou trauma ocular devido à colocação incorreta do bisel da agulha. Devido ao pequeno tamanho desses animais, são necessárias agulhas mais finas, com agulha de pequeno calibre. A injeção de células deve ser realizada em suspensão unicelular, para evitar o bloqueio dos vasos e garantir a viabilidade celular. De forma encorajadora, um estudo realizado por Amer e colaboradores mostrou que a injeção de células de mamíferos usando seringas de 30 G ainda fornece viabilidade celular confiável mesmo em ejeção de alta densidade celular20.
Em resumo, o estabelecimento de uma via IV confiável em neonatos é de importância clínica, pois esta é a via preferencial de administração em humanos. A injeção retroorbital pode ser facilmente dominada, é reprodutível e fornece uma alternativa relevante para outros locais de injeção IV, como cauda e veia temporal/facial, que não podem ser usados de forma confiável durante todo o período neonatal de roedores. Assim, a injeção retroorbital neonatal permite a liberação de fármacos, células e outros compostos em idades neonatais adequadas.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflito de interesses com relação à pesquisa, autoria ou publicação deste protocolo.
Acknowledgments
O trabalho realizado neste protocolo foi financiado pela Fundação Hasselblad (2020-2021, ERF), Fundação Åke Wibergs (M19-0660, ERF), Conselho de Pesquisa Sueco (2019-01320, HH; 2021-01872, CM), Serviço de Saúde Pública do Hospital Universitário Sahlgrenska (ALFGBG-965174, HH ; ALFGBG-966107, CM), The Swedish Brain Foundation (FO2022-0110, CM), Åhlen Foundation (223005, CM) e Horizonte 2020 Programa-Quadro da União Europeia (acordo de subvenção n.º 87472/PREMSTEM, HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
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