Summary
Bu protokol, yenidoğan dönemi boyunca sıçanlarda ve farelerde kullanılabilecek tekrarlanabilir bir venöz uygulama yolunu göstermeyi amaçlamaktadır. Bu prosedür, öncelikle intravenöz uygulama kullanarak yenidoğan bakım ünitelerinde ilaç uygulamasını yansıtmak isteyen klinik öncesi kemirgen çalışmaları için önemlidir.
Abstract
İntravenöz (iv) enjeksiyon, klinik ortamda yenidoğanlarda en çok kullanılan ilaç uygulama yöntemidir. Bu nedenle, retroorbital ven enjeksiyonu, başarılı kavram kanıtlama çalışmalarının çok ihtiyaç duyulan yenidoğan klinik çalışmalarına ilerleyebileceği araştırmalarda bileşik uygulama için önemli bir yöntemdir. Yenidoğan kemirgenlerinde yapılan intravenöz çalışmaların çoğu yüzeysel temporal / fasiyal veni kullanır. Bununla birlikte, cilt koyulaştıktan ve damar artık görünmedikten sonra 2 günden daha eski yenidoğan kemirgenlerinde retroorbital enjeksiyon güvenilmez hale gelir. Bu protokolde, yüzeyel temporal venin artık görünmediği, ancak gözlerin henüz açılmadığı yaşlarda hem yenidoğan faresinde hem de sıçanlarda venöz sinüsün retroorbital enjeksiyonunu tanımladık. Göz açıklığı, araştırmacının iğneyi yerleştirirken gözü delmediğini net bir şekilde görmesini sağlayarak retro-orbital enjeksiyonu kolaylaştırır. Bu tekniğin yan etkiler olmadan güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde uygulanabileceğini gösteriyoruz. Ek olarak, yenidoğan beyin hasarını incelemek için bileşiklerin uygulanması gibi birçok çalışmada kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Introduction
Hayvan araştırmaları, klinik araştırmalara yol açan önemli bir adımdır ve bu nedenle, hayvan çalışmalarının klinik ortamda gerçekleştirilen prosedürleri ve tedavileri yakından taklit etmesi önemlidir. Bununla birlikte, klinik uygulamaların yenidoğan kemirgen çalışmalarına çevrilmesinde çeşitli zorluklar vardır. Bunlar, yenidoğan kemirgeninin küçük boyutunu ve diğerlerinin yanı sıra yetişkin araştırmalarına kıyasla yenidoğan araştırma ve bilgisindeki boşluğu içerir 1,2.
İlaçlar veya hücreler gibi farklı maddelerin uygulanması, intraperitoneal (ip), subkutan (sc) ve intravenöz (iv) enjeksiyonlar dahil olmak üzere birden fazla yolla gerçekleştirilebilir. İv ile enjeksiyon, insan yenidoğanlarında bileşiklerin uygulanmasının tercihli yoludur. Yenidoğanlarda IV uygulama yolu, ilaçların sistemik dağılımını en üst düzeye çıkarması ve yüksek biyoyararlanıma sahip olması nedeniyle diğer yollara göre avantajlıdır 3,4. Tekrarlanan ilaç uygulaması için bakımlı bir iv hatları kullanılabilir. Kemirgen çalışmalarında, iv enjeksiyonları kuyrukta, yüz/temporal damarlarda veya retroorbital sinüs5'te yapılmalıdır. Kuyruk damarı enjeksiyonu,5 arasından seçim yapabileceğiniz iki lateral kaudal paralel damar sağladığı için yetişkin kemirgenlerde rutin olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu damarlar, yenidoğanlarda kullanımlarını dışlayan küçük bir çapa sahiptir. Yenidoğan iv enjeksiyonlarının çoğu, doğum sonrası 0 (P0)-P2'den görülebildiği ve nispeten büyük hacimli bir uygulamaya izin verdiği için yüzeysel fasiyal / temporal vende gerçekleştirilmiştir5. Bununla birlikte, hayvan cilt rengini kazandığında bu yol P36 civarında güvenilmez hale gelir, böylece yüzeysel yüz/temporal damarın yardımsız gözle görülmesini zorlaştırır. Yenidoğan transvers sinüs yoluyla uygulama iv bir çalışmadatanımlanmıştır 7; ancak bu, transvers sinüsün üzerindeki cildin açılmasını ve bir mikroskop yardımıyla P0-P1'de AAV9'un enjekte edilmesini gerektirir.
Potansiyel bir tedaviyi araştırırken veya ilgili bir yenidoğan yaralanma modeli oluştururken, yenidoğan kemirgenlerinin insanlara kıyasla farklı organ gelişim zamanlamasına sahip olabileceğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Protokolümüz, insanlar ve kemirgenler arasındaki yenidoğan merkezi sinir sistemi gelişimindeki farklılıklara dayanmaktadır. Örnek olarak, yeni doğan insan beyni terimi yaklaşık olarak bir P7 sıçan ve bir P10 fare beyni8'e karşılık gelir. Retroorbital olarak enjekte edilen maddelerin dağılımı diğer iv bölgelerinkine benzer olduğundan, yüksek kan seviyelerine hızla ulaşıldığından, bunu uygun bir yol olarak görüyoruz. Bu teknik, P1-P2 farelerinde oftalmik venöz sinüse bileşikler enjekte edenYardeni ve meslektaşları tarafından iyi tanımlanmıştır 9. Mevcut protokolde, henüz gözlerini açmamış yaşlı yenidoğan kemirgenlerinde retroorbital enjeksiyonların gerçekleştirilmesi için basit ve uygulanabilir bir yöntem gösterilmektedir.
Protocol
Bu protokolde listelenen tüm prosedürler İsveç Tarım Kurulu'na uygundur ve Göteborg Hayvan Etik Komitesi (825-2017 ve 2195-19) tarafından onaylanmıştır. C57BL / 6 fareleri ve Wistar sıçanları, 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsü ve yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile şirket içinde yetiştirildi. Tüm deneysel prosedürler ARRIVE yönergelerini takip etti10.
1. Çalışma alanı kurulumu
- Bu prosedür süresince, deney hayvanlarını baraj kafesinden toplayın ve ısıtılmış bir ped (35-37 ° C) üzerinde ayrı bir kafese yerleştirin.
NOT: Bir ışık kaynağı (albino hayvanlar) kullanılıyorsa, hayvanın başının altına yerleştirilebilen ısı olmayan bir ışık kaynağı kullanılmalıdır.
2. İğne ve çözelti
- 29-31 G'lik (yaklaşık 0,30 mm) bir iğne kullanın.
- Doğru hacimler için, enjekte edilecek çözeltiyi pipetlenmiş bir hacimden hazırlayın.
NOT: Her retroorbital sinüse maksimum 5 μL/g vücut ağırlığı enjekte edilmelidir.
3. Kurulum
- Hayvanları düz bir yüzeye yerleştirin (Şekil 1A) yanal yaslanma (Şekil 1C).
- Tüm vücut izofluran anestezisini indükleyin (% 5 indüksiyon,% 3 idame).
NOT: Hayvanlar bir ağızlık kullanılarak anestezi altına alınmalıdır. Göz kapağı ve gözyaşı kanalı bölgesi kapatılmamalıdır (Şekil 1D). - Pençe çekme refleks yöntemini kullanarak anestezi derinliğini kontrol edin.
NOT: İnvaziv bir prosedür olarak kabul edilmediğinden ameliyat öncesi analjezi gerekmez11.
4. Enjeksiyon prosedürü
NOT: Mümkünse, venöz sinüsün görülmesini kolaylaştırmak için hayvanın başının altında bir ışık kaynağı kullanın (Şekil 1C) (Şekil 1E). Göz kapağı hala kapalı olduğu için enjekte edilen alanın sterilizasyonuna gerek yoktur.
- Başı sağa bakacak şekilde, enjeksiyonu sağ retroorbital sinüse uygulayın (sağ elini kullanan operatör örneği).
- İğneyi, eğim aşağı, göz yuvasının önüne yerleştirin - medial kantusun eşdeğeri, yaklaşık 40°'lik bir açıyla. Bu açı, iğnenin göz yörüngesinin arkasına yönlendirilmesini sağlar.
- İğnenin 1 / 3'ünü (yaklaşık 2 mm) göz yörüngesinin arkasında bulunan retroorbital sinüs alanına ilerletin.
- Nazik, pürüzsüz ve akıcı bir hareketle enjekte edin.
- Geri akışı önlemek için iğneyi yavaşça çekmeden önce bir süre bekleyin.
DİKKAT: Aspire etmeyin. - Kontaminasyonu önlemek için her hayvan için yeni bir steril şırınga kullanın.
NOT: Berrak bir çözelti enjekte ederken, damar anlık olarak berraklaşmalıdır.
5. Enjeksiyon sonrası bakım
- Yavruyu kurtarma kutusuna yerleştirin, korumalı bir ısıtma cihazında (35-37 °C) dinlendirin.
- İyileşmeyi bekleyin ve yavruyu baraja geri göndermeden önce herhangi bir sıkıntı belirtisi olup olmadığını kontrol edin.
NOT: Boya enjekte edilen uygulama hayvanları, IACUC onaylı protokollere göre derhal ötenazi yapılmalıdır.
DİKKAT: Enjeksiyon sırasında göz şişerse, iğnenin venöz pleks içine sokulmadığı ve bunun yerine göz yörüngesinde olduğu anlamına gelir. Yenidoğan kafatası çok yumuşaktır, eğer iğne onu delerse, enjeksiyon meninkslere ve hatta beyin parankimine gidecektir.
Representative Results
Bu teknik, global anestezi için bir ağızlık ile düz bir yüzeyde gerçekleştirildi (Şekil 1A). Ağızlık, medial kantusa erişimi engellememelidir (Şekil 1B). Albino hayvanlarda, damarların görselleştirilmesine yardımcı olmak için hayvanın altına bir fiber optik ışık kaynağı yerleştirildi (Şekil 1B). İğne yaklaşık 40°'lik bir açıyla yerleştirildi ve medial kantusa yaklaşık 2 mm ilerletildi (Şekil 1C). Bir P5 albino sıçanına tripan mavisi boyanın enjeksiyonu, retroorbital sinüsteki boyanın net bir şekilde görüntülenmesini sağladı (Şekil 1C).
Bu protokolde tarif edilen retroorbital enjeksiyon tekniği, izleyici biotin-dekstran'ı (BDA, 10.000 Da) uygulamak için başarıyla kullanıldı12. Vasküler araştırmalarda görünür izleyicilerin kullanılması, örneğin, kan damarlarından radyoaktif sükroz ekstravazasyonunun kullanılmasına bir alternatif sağlayabilir ve aynı beyinlerin diğer histolojik ölçümler için kullanılmasını sağlayabilir12.
Son zamanlarda, germinal matriks kanamasının (GMH) yenidoğan sıçan modelini oluşturduk13. Kısaca, P5 Wistar sıçanlarına medial striatuma tek bir intrakraniyal 0.3 U kollajenaz VII enjeksiyonu yapıldı. GMH, germinal matriksteki damarların yırtılmasına neden olur ve erken beyin hasarı ve mortalitenin yaygın nedenlerinden biridir14. GMH modelini daha fazla karakterize etmek için, GMH'nin kan-beyin bariyeri fonksiyonu ve bütünlüğündeki etkilerini araştırmak için BDA izleyicisinin retroorbital enjeksiyonunu kullandık (Şekil 2)14.
Salin enjeksiyonlu kontrollerle karşılaştırıldığında (Şekil 2A), BDA izleyici14'ün başarılı retroorbital enjeksiyonu, BDA enjeksiyonundan 10 dakika sonra beyin damar sistemindeki izleyici varlığının değerlendirilmesine izin verdi (Şekil 2B). Bu teknik daha sonra GMH ile yaralanmış hayvanlarda bireysel kan damarı seviyesinde BDA'nın penumbra vasküler sızıntısını tespit etmek için kullanıldı (Şekil 2C, kırmızı oklar) ve daha sonra10 ölçülebilir.
Şekil 1: Tripan mavisi boya uygulamasından sonra kan damarlarının diyagram görünümü ile deney düzeneği. (A) Fiber optik ışık kaynağı olmadan (B) ve (C) anestezi kurulumu. (D) P10 C5BL / 6 farede tripan mavisi boyanın retroorbital enjeksiyonu. (E) Tripan mavisi boya enjeksiyonunu takiben P5 Wistar sıçanındaki kan damarlarının diyagram görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: BDA izleyicisinin dağılımını gösteren temsili beyin mikrografları. (A) Salin enjekte edilen kontrol hayvanlarında pozitif leke yok. (B) Beynin kan damarlarında (korteks) hayvan başına 2.0 - 2.5 mg'lık bir doz konsantrasyonunda salin içinde çözünmüş BDA izleyici görüldü. (C) GMH'yi (kırmızı oklar) takiben beyin parankimine sızan BDA izleyicisi. Ölçek çubuğu = 200 μm. Andersson ve ark., 202114'ten uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokol, yenidoğan farelerin ve sıçanların retroorbital sinüsüne madde enjeksiyonu için açık ve kesin bir yöntem sağlar. Bu önemlidir, çünkü retroorbital enjeksiyonların, yüzeysel temporal/fasiyal venin artık fark edilemediği P2'den yaşlı kemirgenlerde ve göz kapaklarının henüz açılmadığı ve göz küresinin açığa çıkmadığı P12'den genç hayvanlarda güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde yapılabileceğini göstermektedir. Ayrıca, yenidoğan retroorbital enjeksiyonu hem yavrular hem de barajlar tarafından iyi tolere edilir ve tekniğe hakim olduktan sonra minimum yan etki riski vardır.
IV yoluyla enjeksiyonlar, damarın yırtılmasını önlemek için enjeksiyon hızının sabit ve düşük tutulmasını şart koşarak, hem düşük hem de yüksek pH'ın yanı sıra yüksek konsantrasyonlu enjeksiyona izin verdikleri için diğer uygulama yollarına göre bir avantaja sahiptir. Ayrıca, iv enjeksiyonları, bileşiklerin doğrudan sistemik dolaşıma girerken daha hızlı dağılmasına izin verir, böylece diğer uygulama yollarında gözlenen zayıf emilimden kaynaklanan potansiyel gecikmeleri atlar. Bu, bileşiklere anında erişim ve yaklaşık% 100 biyoyararlanım sağlar.
Klinik olarak iv, yenidoğanlarda (28 günlük <) tercih edilen uygulama yoludur. Bu, özellikle yenidoğan yoğun bakım ortamlarında geçerlidir, çünkü iv kanülasyon, ilaçlar / sıvılar sağlamak için kolay erişim sağlar. SC yolu ile enjeksiyonlar, yenidoğanlarda, özellikle eritropoietin15'in uygulanması için bir şekilde kullanılmıştır. Bununla birlikte, iv infüzyonunu üstün bir alternatif olarak öneren bir çalışma ile endişeler dile getirilmiştir16. Oral uygulama, yenidoğanlar hastane yoğun ünite ortamında olduğunda genellikle pratik bir seçenek değildir. Ek olarak, yetişkinlerle karşılaştırıldığında, yenidoğanların gastrointestinal sistemlerinde, gecikmiş mide boşalması ve ilaç emilimini etkileyebilecek azalmış bağırsak hareketliliği dahil olmak üzere farklılıklar vardır. Yenidoğanların küçük kas kütlesinin bir sonucu olarak kas içi enjeksiyonların uygulanması zordur 3,4.
Kemirgen araştırmalarında en yaygın kullanılan iv enjeksiyon yöntemlerinden biri kuyruk damarı enjeksiyonudur. Bununla birlikte, yenidoğanlarla çalışırken bu yöntem uygun değildir. Yüzeyel temporal/fasiyal ven6 gibi diğer iv bölgeleri P3'te görünmez hale gelir. Neonatal transvers sinüs bir çalışmada tanımlanmıştır ve P0-P1'de gerçekleştirilmiştir ve mikroskop yardımıyla cildi açarak ve kafatasından transvers sinüse bir kılcal iğne ilerleterek 2-4 μl hacimli enjeksiyonlara izin vermiştir7. Sıçanlarda P7'de dış juguler venin kullanımını belgeleyen az sayıda çalışmavardır 17. Ancak bu, cildin cerrahi olarak açılmasını ve dış juguler venin18 açığa çıkarılmasını gerektiren invaziv bir tekniktir. Yetişkin kemirgenlerde yapılan çalışmalarda, retroorbital uygulamanın kuyruk ven enjeksiyonu5 kadar etkili olduğu ve böylece retroorbital yolun canlılığını ve alaka düzeyini güçlendirdiği gösterilmiştir. Retroorbital enjeksiyon minimum sıkıntıya neden olur ve bir kez ustalaştıktan sonra minimum ekipmanla tek bir kişi tarafından gerçekleştirilebilir ve birden fazla enjeksiyona izin verir (gözlerin değiştirilmesini sağlar). Önceki çalışmalar, retroorbital enjeksiyonun, P0-P1 veya P14-P2111'de veya P1719'da FITC-dekstran'da farelerde adeno-ilişkili virüs 9'u uygulamak için kullanıldığını göstermiştir, bu da bu yöntemin artan bir şekilde kabul edildiğini göstermektedir.
Yenidoğanlarda retroorbital enjeksiyonla ilişkili bazı sınırlamalar vardır. Tüm iv enjeksiyonlarında olduğu gibi, enjekte edilen hacim sınırlıdır ve bu prosedür için 5 μL / g öneriyoruz. Ek olarak, retroorbital enjeksiyon tüm vücut anestezisi gerektirir. Komplikasyonları en aza indirmek için, anestezi indüksiyonunda daha hızlı oldukları, hızlı metabolizmaya sahip oldukları ve hızlı iyileşme oranına sahip oldukları için izofluran gibi inhale anestezi ajanlarının kullanılması önerilmektedir. İğne eğiminin yanlış yerleştirilmesi nedeniyle enjeksiyon bölgesi çevresinde potansiyel şişmeyi veya göz travmasını önlemek için, tercihen terminal anestezi uygulanmış hayvanlarda renkli boya kullanılarak eğitim gereklidir. Bu hayvanların küçük boyutları nedeniyle, küçük iğne ölçülü daha ince iğneler gereklidir. Damarların tıkanmasını önlemek ve hücre canlılığını sağlamak için hücre enjeksiyonu tek hücreli süspansiyonda yapılmalıdır. Cesaret verici bir şekilde, Amer ve meslektaşları tarafından yapılan bir çalışma, 30 G şırınga kullanılarak memeli hücrelerinin enjeksiyonunun, yüksek hücre yoğunluğu ejeksiyonunda bile güvenilir hücre canlılığı sağladığını göstermiştir20.
Özetle, yenidoğanlarda güvenilir bir iv yolunun oluşturulması, insanlarda tercih edilen uygulama yolu olduğu için klinik öneme sahiptir. Retroorbital enjeksiyon kolayca yönetilebilir, tekrarlanabilir ve kemirgen yenidoğan dönemi boyunca güvenilir bir şekilde kullanılamayan kuyruk ve temporal/fasiyal ven gibi diğer iv enjeksiyon bölgelerine uygun bir alternatif sağlar. Böylece, yenidoğan retroorbital enjeksiyonu, ilaçların, hücrelerin ve diğer bileşiklerin uygun yenidoğan yaşlarında verilmesine izin verir.
Disclosures
Yazarlar, bu protokolün araştırılması, yazarlığı veya yayınlanması ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu protokolde gerçekleştirilen çalışmalar Hasselblad Vakfı (2020-2021, ERF), Åke Wibergs Vakfı (M19-0660, ERF), İsveç Araştırma Konseyi (2019-01320, HH; 2021-01872, CM), Sahlgrenska Üniversite Hastanesi Halk Sağlığı Servisi (ALFGBG-965174, HH; ALFGBG-966107, CM), İsveç Beyin Vakfı (FO2022-0110, CM), Åhlen Vakfı (223005, CM) ve Avrupa Birliği Horizon 2020 Çerçeve Programı (hibe sözleşmesi no. 87472/PREMSTEM, HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
References
- Laughon, M. M., et al. Drug labeling and exposure in neonates. JAMA Pediatr. 168 (2), 130-136 (2014).
- Das, A., et al. Methodological issues in the design and analyses of neonatal research studies: Experience of the nichd neonatal research network. Semin Perinatol. 40 (6), 374-384 (2016).
- Ku, L. C., Smith, P. B. Dosing in neonates: Special considerations in physiology and trial design. Pediatr Res. 77 (1-1), 2-9 (2015).
- Linakis, M. W., et al. Challenges associated with route of administration in neonatal drug delivery. Clin Pharmacokinet. 55 (2), 185-196 (2016).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D.
- Hamodi, A. S., Martinez Sabino, A., Fitzgerald, N. D., Moschou, D., Crair, M. C. Transverse sinus injections drive robust whole-brain expression of transgenes. Elife. 9, 53639 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Kilkenny, C., et al. Animal research: Reporting in vivo experiments: The arrive guidelines). Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).
- Ek, C. J., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M., Potter, A., Saunders, N. R. Permeability and route of entry for lipid-insoluble molecules across brain barriers in developing monodelphis domestica. J Physiol. 536, 841-853 (2001).
- Jinnai, M., et al. A model of germinal matrix hemorrhage in preterm rat pups). Front Cell Neurosci. 14, 535320 (2020).
- Andersson, E. A., Rocha-Ferreira, E., Hagberg, H., Mallard, C., Ek, C. J. Function and biomarkers of the blood-brain barrier in a neonatal germinal matrix haemorrhage model. Cells. 10 (7), (2021).
- Ohls, R. K., et al. Effects of early erythropoietin therapy on the transfusion requirements of preterm infants below 1250 grams birth weight: A multicenter, randomized, controlled trial. Pediatrics. 108 (4), 934-942 (2001).
- Costa, S., et al. How to administrate erythropoietin, intravenous or subcutaneous. Acta Paediatr. 102 (6), 579-583 (2013).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Sugiyama, Y., et al. Intravenous administration of bone marrow-derived mesenchymal stem cell, but not adipose tissue-derived stem cell, ameliorated the neonatal hypoxic-ischemic brain injury by changing cerebral inflammatory state in rat. Front Neurol. 9, 757 (2018).
- Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. J Pharm Pharmacol. 67 (5), 640-650 (2015).
