Summary
Ce protocole vise à démontrer une voie d’administration veineuse reproductible qui peut être utilisée chez le rat et la souris tout au long de la période néonatale. Cette procédure est importante pour les études précliniques sur les rongeurs qui souhaitent refléter l’administration de médicaments dans les unités de soins néonatals, principalement par voie intraveineuse.
Abstract
L’injection intraveineuse (iv) est la voie d’administration de médicament la plus utilisée chez les nouveau-nés en milieu clinique. Par conséquent, l’injection de veines rétroorbitaires est une méthode importante pour l’administration de composés dans la recherche, où des études de preuve de concept réussies peuvent progresser vers des essais cliniques néonatals indispensables. La plupart des études intraveineuses chez les rongeurs nouveau-nés utilisent la veine temporale/faciale superficielle. Cependant, l’injection rétroorbitaire devient peu fiable chez les rongeurs nouveau-nés âgés de plus de 2 jours après que la peau s’assombrit et que la veine ne soit plus visible. Dans le présent protocole, nous décrivons l’injection rétroorbitaire du sinus veineux chez la souris et le rat nouveau-nés à des âges où la veine temporale superficielle n’est plus visible, mais où les yeux ne se sont pas encore ouverts. L’ouverture de l’œil facilite l’injection rétro-orbitaire en permettant au chercheur de voir clairement qu’il ne perfore pas l’œil lors de l’insertion de l’aiguille. Nous démontrons que cette technique peut être réalisée de manière fiable et reproductible sans effets indésirables. De plus, nous montrons qu’il peut être utilisé dans de nombreuses études, telles que l’administration de composés pour étudier les lésions cérébrales néonatales.
Introduction
La recherche sur les animaux est une étape essentielle menant aux essais cliniques et, à ce titre, il est important que les études sur les animaux imitent étroitement les procédures et les traitements effectués en milieu clinique. Cependant, il y a plusieurs défis à relever pour traduire les pratiques cliniques en études néonatales sur les rongeurs. Il s’agit notamment de la petite taille du rongeur nouveau-né et de l’écart entre la recherche et les connaissances néonatales par rapport à la recherche sur les adultes, entre autres 1,2.
L’administration de différentes substances telles que des médicaments ou des cellules peut être effectuée par plusieurs voies, y compris les injections intrapéritonéales (IP), sous-cutanées (sc) et intraveineuses (IV). L’injection par voie intraveineuse est la voie d’administration préférentielle des composés chez les nouveau-nés humains. Chez les nouveau-nés, la voie d’administration IV est avantageuse par rapport aux autres voies car elle maximise la distribution systémique des médicaments et présente une biodisponibilité élevée 3,4. Des lignes intraveineuses bien entretenues peuvent être utilisées pour l’administration répétée de médicaments. Dans les études sur les rongeurs, les injections intraveineuses doivent être effectuées dans la queue, les veines faciales/temporales ou dans le sinus rétroorbitaire5. L’injection de veines caudales est couramment utilisée chez les rongeurs adultes, car elle fournit deux veines caudales parallèles latérales au choixparmi 5. Cependant, ces veines ont un petit diamètre, ce qui exclut leur utilisation chez les nouveau-nés. La plupart des injections intraveineuses néonatales ont été réalisées dans la veine superficielle du visage/temporale, car elle est visible dès le jour postnatal 0 (P0)-P2 et permet une administration d’un volume relativement important5. Cependant, cette voie devient peu fiable vers P36 une fois que l’animal a acquis une coloration de la peau, ce qui rend la veine faciale/temporale superficielle difficile à voir à l’œil nu. L’administration iv par le sinus transverse néonatal a été décrite dans une étude7 ; cependant, cela nécessite d’ouvrir la peau au-dessus du sinus transverse et d’injecter AAV9 à P0-P1 à l’aide d’un microscope.
Lors de l’étude d’un traitement potentiel ou de l’établissement d’un modèle pertinent de lésions néonatales, il est important de tenir compte du fait que les rongeurs nouveau-nés peuvent avoir un moment de développement des organes différent de celui des humains. Notre protocole est basé sur les différences de développement du système nerveux central néonatal entre l’homme et les rongeurs. À titre d’exemple, le terme cerveau humain nouveau-né correspond approximativement à un cerveau de rat P7 et à un cerveau de souris P108. Étant donné que la distribution des substances injectées par voie rétroorbitaire est similaire à celle des autres sites IV, avec des taux sanguins élevés rapidement atteints, nous considérons qu’il s’agit d’une voie appropriée. Cette technique a été bien décrite par Yardeni et ses collègues, qui ont injecté des composés dans le sinus veineux ophtalmique chez des souris P1-P29. Dans le protocole actuel, nous montrons une méthode simple et réalisable pour effectuer des injections rétroorbitales chez des rongeurs néonatals plus âgés qui n’ont pas encore ouvert les yeux.
Protocol
Toutes les procédures énumérées dans ce protocole étaient conformes au Conseil suédois de l’agriculture et ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de Göteborg (825-2017 et 2195-19). Les souris C57BL/6 et les rats Wistar ont été élevés en interne avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures et un accès libre à la nourriture et à l’eau. Toutes les procédures expérimentales ont suivi les lignes directrices de l’ARRIVE10.
1. Configuration de l’espace de travail
- Pendant la durée de cette procédure, récupérez les animaux de laboratoire de la cage de barrage et placez-les dans une cage séparée sur un coussin chauffant (35-37 °C).
REMARQUE : Si vous utilisez une source de lumière (animaux albinos), une source de lumière non thermique qui peut être positionnée sous la tête de l’animal doit être utilisée.
2. Aiguille et solution
- Utilisez une aiguille de 29 à 31 G (environ 0,30 mm).
- Pour des volumes précis, prélever la solution à injecter à partir d’un volume pipeté.
REMARQUE : Un maximum de 5 μL / g de poids corporel doit être injecté dans chaque sinus rétroorbitaire.
3. Mise en place
- Placez les animaux sur une surface plane (figure 1A) en position couchée latérale (figure 1C).
- Induire une anesthésie à l’isoflurane du corps entier (5 % d’induction, 3 % d’entretien).
REMARQUE : Les animaux doivent être placés sous anesthésie à l’aide d’un embout buccal. La zone de la paupière et du canal lacrymal ne doit pas être couverte (Figure 1D). - Vérifiez la profondeur de l’anesthésie à l’aide de la méthode du réflexe de retrait de la patte.
REMARQUE : Aucune analgésie préopératoire n’est nécessaire car il ne s’agit pas d’une procédure invasive11.
4. Procédure d’injection
REMARQUE : Si possible, utilisez une source de lumière sous la tête de l’animal (figure 1C) pour faciliter la vue du sinus veineux (figure 1E). Aucune stérilisation de la zone injectée n’est nécessaire, car la paupière est toujours fermée.
- La tête tournée vers la droite, administrer l’injection dans le sinus rétroorbitaire droit (exemple d’opérateur droitier).
- Insérez l’aiguille, biseauté vers le bas, à l’avant de l’orbite - l’équivalent du canthus médial, à un angle d’environ 40°. Cet angle permet à l’aiguille d’être dirigée vers l’arrière de l’orbite de l’œil.
- Avancez 1/3 de l’aiguille (environ 2 mm) dans la zone du sinus rétroorbitaire située derrière l’orbite de l’œil.
- Injectez dans un mouvement doux, doux et fluide.
- Attendez un moment, avant de retirer lentement l’aiguille pour éviter le reflux.
ATTENTION : Ne pas aspirer. - Utilisez une nouvelle seringue stérile pour chaque animal afin d’éviter toute contamination.
REMARQUE : Lors de l’injection d’une solution claire, la veine doit devenir momentanément claire.
5. Soins post-injection
- Placez le chiot dans la boîte de récupération, reposé sur un dispositif de réchauffement protégé (35-37 °C).
- Attendez le rétablissement et vérifiez s’il y a des signes de détresse avant de remettre le chiot à la mère.
REMARQUE : Les animaux d’entraînement ayant reçu un colorant injecté doivent être immédiatement euthanasiés conformément aux protocoles approuvés par l’IACUC.
ATTENTION : Si l’œil gonfle pendant l’injection, cela signifie que l’aiguille n’est pas insérée dans le plex veineux et qu’elle se trouve plutôt dans l’orbite de l’œil. Le crâne néonatal est très mou, si l’aiguille le perfore, alors l’injection ira dans les méninges ou même dans le parenchyme cérébral.
Representative Results
La présente technique a été réalisée sur une surface plane, avec un embout buccal pour l’anesthésie globale (Figure 1A). L’embout buccal ne doit pas bloquer l’accès au canthus médial (figure 1B). Chez les animaux albinos, une source de lumière à fibre optique a été placée sous l’animal, pour aider à la visualisation des veines (Figure 1B). L’aiguille a été placée à un angle d’environ 40° et avancée d’environ 2 mm dans le canthus médian (figure 1C). L’injection de colorant bleu trypan chez un rat albinos P5 a permis de visualiser clairement le colorant dans le sinus rétroorbitaire (Figure 1C).
La technique d’injection rétroorbitale décrite dans ce protocole a été utilisée avec succès pour administrer le traceur biotine-dextran (BDA, 10 000 Da)12. L’utilisation de traceurs visibles dans la recherche vasculaire peut, par exemple, fournir une alternative à l’utilisation de l’extravasation du saccharose radioactif à partir des vaisseaux sanguins, permettant l’utilisation des mêmes cerveaux pour d’autres mesures histologiques12.
Récemment, nous avons établi un modèle néonatal d’hémorragie de la matrice germinale (GMH)13 chez le rat. En bref, les rats P5 Wistar ont reçu une seule injection intracrânienne de 0,3 U de collagénase VII dans le striatum médial. Le GMH entraîne la rupture des vaisseaux de la matrice germinale et est l’une des causes les plus fréquentes de lésions cérébrales prématurées et de mortalité14. Pour mieux caractériser le modèle GMH, nous avons utilisé une injection rétroorbitale du traceur BDA (Figure 2) pour étudier les effets du GMH sur la fonction et l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique14.
Par rapport aux témoins injectés de solution saline (Figure 2A), l’injection rétroorbitaire réussie du traceur BDA14 a permis d’évaluer la présence du traceur dans le système vasculaire cérébral 10 min après l’injection de BDA (Figure 2B). Cette technique a ensuite été utilisée pour détecter les fuites vasculaires de BDA dans la pénombre au niveau des vaisseaux sanguins individuels chez les animaux blessés par le GMH (Figure 2C, flèches rouges) qui peuvent ensuite être quantifiées10.
Figure 1 : Dispositif expérimental avec vue schématique des vaisseaux sanguins après l’administration d’un colorant bleu trypan. (A) Installation d’anesthésie, (B) sans et (C) avec source de lumière à fibre optique. (D) Injection rétroorbitale de colorant bleu trypan chez la souris P10 C5BL/6. (E) Vue schématique des vaisseaux sanguins chez le rat Wistar P5 après injection de colorant bleu trypan. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Micrographies cérébrales représentatives montrant la distribution du traceur BDA. (A) Pas de coloration positive chez les animaux témoins ayant reçu une injection de solution saline. (B) Le traceur BDA dissous dans une solution saline, à une concentration de dose de 2,0 à 2,5 mg par animal, était visible dans les vaisseaux sanguins du cerveau (cortex). (C) Traceur BDA fuyant dans le parenchyme cérébral après GMH (flèches rouges). Barre d’échelle = 200 μm. Adapté de Andersson et al., 202114. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
Ce protocole fournit une méthode claire et précise pour l’injection de substances dans le sinus rétroorbitaire des souris et des rats nouveau-nés. Ceci est important car cela montre que les injections rétroorbitaires peuvent être effectuées de manière fiable et reproductible chez les rongeurs plus âgés que P2, où la veine temporale/faciale superficielle n’est plus discernable, et chez les animaux plus jeunes que P12, où les paupières ne se sont pas encore ouvertes et le globe oculaire n’est pas exposé. De plus, l’injection néonatale rétroorbitaire est bien tolérée tant par les chiots que par les mères, avec des risques minimes d’effets secondaires une fois la technique maîtrisée.
Les injections par voie intraveineuse présentent un avantage par rapport aux autres voies d’administration car elles permettent une injection à forte concentration, ainsi qu’à pH faible et élevé, à condition que le taux d’injection soit maintenu constant et bas pour éviter la rupture du vaisseau. De plus, les injections intraveineuses permettent une distribution plus rapide des composés car ils pénètrent directement dans la circulation systémique, contournant ainsi les retards potentiels dus à une mauvaise absorption observée dans d’autres voies d’administration. Cela permet un accès immédiat et une biodisponibilité de près de 100 % des composés.
Cliniquement, l’IV est la voie d’administration privilégiée chez les nouveau-nés (< de 28 jours). Cela est particulièrement vrai dans les établissements de soins intensifs néonatals, car la canulation intraveineuse permet un accès facile aux médicaments et aux liquides. Les injections par voie sc ont été quelque peu utilisées chez les nouveau-nés, en particulier pour l’administration d’érythropoïétine15. Cependant, des inquiétudes ont été soulevées, une étude suggérant la perfusion intraveineuse comme une alternative supérieure16. L’administration orale n’est pas souvent une option pratique lorsque les nouveau-nés se trouvent dans une unité de soins intensifs hospitaliers. De plus, par rapport aux adultes, les nouveau-nés présentent des différences dans leur tractus gastro-intestinal, notamment un retard de vidange gastrique et une diminution de la motilité intestinale, ce qui peut affecter l’absorption des médicaments. Les injections intramusculaires sont difficiles à administrer en raison de la faible masse musculaire des nouveau-nés 3,4.
Dans la recherche sur les rongeurs, l’une des méthodes d’injections intraveineuses les plus utilisées est l’injection dans la veine caudale. Cependant, cette méthode n’est pas viable lorsqu’on travaille avec des nouveau-nés. D’autres sites IV tels que la veine temporale/facialesuperficielle 6 deviennent invisibles à P3. Le sinus transverse néonatal a été décrit dans une étude et a été réalisé à P0-P1 et, à l’aide d’un microscope, en ouvrant la peau et en faisant avancer une aiguille capillaire à travers le crâne dans le sinus transverse, permettant des injections de volume de 2 à 4 μl7. Peu d’études ont documenté l’utilisation de la veine jugulaire externe à P7 chez le rat17. Cependant, il s’agit d’une technique invasive qui nécessite une ouverture chirurgicale de la peau et une exposition de la veine jugulaire externe18. Dans des études chez des rongeurs adultes, l’administration rétroorbitaire s’est avérée aussi efficace que l’injection dans la veine caudale5 , renforçant ainsi la viabilité et la pertinence de la voie rétroorbitaire. L’injection rétroorbitaire provoque une détresse minimale et, une fois maîtrisée, peut être réalisée par une seule personne avec un équipement minimal et permet des injections multiples (en veillant à ce que les yeux soient alternés). Des études antérieures ont montré que l’injection rétroorbitaire a été utilisée pour administrer le virus adéno-associé 9 chez la souris à P0-P1 ou à P14-P2111 ou le FITC-dextran à P1719 , ce qui indique une acceptation croissante de cette méthode.
Il existe certaines limites associées à l’injection rétroorbitaire chez les nouveau-nés. Comme pour toutes les injections intraveineuses, le volume injecté est limité et nous recommandons 5 μL/g pour cette procédure. De plus, l’injection rétroorbitaire nécessite une anesthésie complète du corps. Pour minimiser les complications, il est suggéré d’utiliser des agents anesthésiques inhalés tels que l’isoflurane, car ils sont plus rapides dans l’induction de l’anesthésie, ont un métabolisme rapide et ont un taux de récupération rapide. Une formation est nécessaire, de préférence à l’aide d’un colorant coloré chez les animaux anesthésiés en phase terminale, afin d’éviter un gonflement potentiel autour du site d’injection ou un traumatisme oculaire dû à un mauvais placement du biseau de l’aiguille. En raison de la petite taille de ces animaux, des aiguilles plus fines sont nécessaires, avec un petit calibre d’aiguille. L’injection de cellules doit être effectuée en suspension unicellulaire, afin d’éviter l’obstruction des vaisseaux et d’assurer la viabilité des cellules. Fait encourageant, une étude menée par Amer et ses collègues a montré que l’injection de cellules de mammifères à l’aide de seringues de 30 G assure toujours une viabilité cellulaire fiable, même en cas d’éjection à haute densité cellulaire20.
En résumé, l’établissement d’une voie IV fiable chez les nouveau-nés est d’importance clinique, car il s’agit de la voie d’administration préférée chez l’homme. L’injection rétroorbitaire peut être facilement maîtrisée, est reproductible et constitue une alternative pertinente aux autres sites d’injection intraveineuse, tels que la queue et la veine temporale/faciale qui ne peuvent pas être utilisés de manière fiable tout au long de la période néonatale chez les rongeurs. Ainsi, l’injection néonatale rétroorbitaire permet l’administration de médicaments, de cellules et d’autres composés à des âges néonatals appropriés.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts en ce qui concerne la recherche, la paternité ou la publication de ce protocole.
Acknowledgments
Les travaux réalisés dans le cadre de ce protocole ont été financés par la Fondation Hasselblad (2020-2021, ERF), la Fondation Åke Wibergs (M19-0660, ERF), le Conseil suédois de la recherche (2019-01320, HH ; 2021-01872, CM), le Service de santé publique de l’hôpital universitaire Sahlgrenska (ALFGBG-965174, HH ; ALFGBG-966107, CM), la Fondation suédoise du cerveau (FO2022-0110, CM), la Fondation Åhlen (223005, CM) et le programme-cadre Horizon 2020 de l’Union européenne (convention de subvention n° 87472/PREMSTEM, HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
References
- Laughon, M. M., et al. Drug labeling and exposure in neonates. JAMA Pediatr. 168 (2), 130-136 (2014).
- Das, A., et al. Methodological issues in the design and analyses of neonatal research studies: Experience of the nichd neonatal research network. Semin Perinatol. 40 (6), 374-384 (2016).
- Ku, L. C., Smith, P. B. Dosing in neonates: Special considerations in physiology and trial design. Pediatr Res. 77 (1-1), 2-9 (2015).
- Linakis, M. W., et al. Challenges associated with route of administration in neonatal drug delivery. Clin Pharmacokinet. 55 (2), 185-196 (2016).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D.
- Hamodi, A. S., Martinez Sabino, A., Fitzgerald, N. D., Moschou, D., Crair, M. C. Transverse sinus injections drive robust whole-brain expression of transgenes. Elife. 9, 53639 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Kilkenny, C., et al. Animal research: Reporting in vivo experiments: The arrive guidelines). Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).
- Ek, C. J., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M., Potter, A., Saunders, N. R. Permeability and route of entry for lipid-insoluble molecules across brain barriers in developing monodelphis domestica. J Physiol. 536, 841-853 (2001).
- Jinnai, M., et al. A model of germinal matrix hemorrhage in preterm rat pups). Front Cell Neurosci. 14, 535320 (2020).
- Andersson, E. A., Rocha-Ferreira, E., Hagberg, H., Mallard, C., Ek, C. J. Function and biomarkers of the blood-brain barrier in a neonatal germinal matrix haemorrhage model. Cells. 10 (7), (2021).
- Ohls, R. K., et al. Effects of early erythropoietin therapy on the transfusion requirements of preterm infants below 1250 grams birth weight: A multicenter, randomized, controlled trial. Pediatrics. 108 (4), 934-942 (2001).
- Costa, S., et al. How to administrate erythropoietin, intravenous or subcutaneous. Acta Paediatr. 102 (6), 579-583 (2013).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Sugiyama, Y., et al. Intravenous administration of bone marrow-derived mesenchymal stem cell, but not adipose tissue-derived stem cell, ameliorated the neonatal hypoxic-ischemic brain injury by changing cerebral inflammatory state in rat. Front Neurol. 9, 757 (2018).
- Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. J Pharm Pharmacol. 67 (5), 640-650 (2015).
