Summary
이 프로토콜은 신생아 기간 동안 쥐와 생쥐에서 사용할 수 있는 재현 가능한 정맥 투여 경로를 입증하는 것을 목표로 합니다. 이 절차는 주로 정맥 투여를 사용하는 신생아 치료실에서 약물 투여를 미러링하고자 하는 전임상 설치류 연구에 중요합니다.
Abstract
정맥 주사(iv) 주사는 임상 환경에서 신생아에게 가장 많이 사용되는 약물 투여 경로입니다. 따라서 후안와 정맥 주사는 성공적인 개념 증명 연구가 절실히 필요한 신생아 임상 시험으로 진행될 수 있는 연구에서 화합물 투여를 위한 중요한 방법입니다. 신생아 설치류에 대한 대부분의 정맥 주사 연구는 표재성 측두/안면 정맥을 사용합니다. 그러나 피부가 어두워지고 정맥이 더 이상 보이지 않는 후 2일이 지난 신생아 설치류에서는 역안와 주사를 신뢰할 수 없게 됩니다. 본 프로토콜에서는 표재성 측두정맥이 더 이상 보이지 않지만 눈이 아직 열리지 않은 나이에 신생아 마우스와 쥐 모두에서 정맥동의 후안와 주사를 설명합니다. 눈을 뜨면 연구자가 바늘을 삽입할 때 눈에 천공이 없다는 것을 명확하게 볼 수 있으므로 후안와 주입이 용이합니다. 우리는 이 기술이 부작용 없이 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방식으로 수행될 수 있음을 입증합니다. 또한 신생아 뇌 손상을 연구하기 위해 화합물을 투여하는 것과 같은 많은 연구에서 사용할 수 있음을 보여줍니다.
Introduction
동물 연구는 임상시험으로 이어지는 필수 단계이므로 동물 연구가 임상 환경에서 수행되는 절차 및 치료를 밀접하게 모방하는 것이 중요합니다. 그러나 임상 실습을 신생아 설치류 연구로 전환하는 데에는 몇 가지 문제가 있습니다. 여기에는 신생아 설치류의 크기가 작고, 성인 연구와 비교하여 신생아 연구 및 지식의 격차가 포함됩니다 1,2.
약물 또는 세포와 같은 다양한 물질의 투여는 복강내(IP), 피하(SC) 및 정맥(IV) 주사를 포함한 여러 경로를 통해 수행할 수 있습니다. IV에 의한 주사는 인간 신생아에서 화합물을 투여하는 우선적인 경로입니다. 신생아의 경우, 정맥 투여 경로는 약물의 전신 분포를 극대화하고 생체이용률이 높기 때문에 다른 경로에 비해 유리합니다 3,4. 반복적인 약물 투여를 위해 잘 관리된 IV 라인을 사용할 수 있습니다. 설치류 연구에서는 꼬리, 안면/측두정맥 또는 후안와 부비동에 정맥 주사를 놓아야 한다5. 꼬리 정맥 주사는 성인 설치류에서 일상적으로 사용되며,5 중에서 선택할 수 있는 두 개의 측면 꼬리 평행 정맥을 제공합니다. 그러나 이러한 정맥은 직경이 작기 때문에 신생아에 사용할 수 없습니다. 대부분의 신생아 정맥 주사는 표재성 안면/측두정맥에서 시행되는데, 이는 출생 후 0일째 (P0)-P2에서 볼 수 있고 비교적 많은 양의 투여가 가능하기 때문이다5. 그러나, 이 경로는 일단 동물이 피부색을 얻게 되면, P36 부근에서 신뢰할 수 없게 되어, 표재성 안면/측두맥을 육안으로 보기 어렵게 만든다. 신생아 횡동을 통한 투여 iv는 한 연구에서 기술되었다7; 그러나 이를 위해서는 횡동 위의 피부를 열고 현미경의 도움을 받아 P0-P1에서 AAV9를 주입해야 합니다.
잠재적인 치료법을 조사하거나 관련 신생아 손상 모델을 수립할 때 신생아 설치류는 인간과 다른 장기 발달 시기를 가질 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 우리의 프로토콜은 인간과 설치류 사이의 신생아 중추 신경계 발달의 차이를 기반으로 합니다. 예를 들어, 신생아 인간의 뇌라는 용어는 대략 P7 쥐와 P10 쥐의 뇌8에 해당한다. 후궤도로 주입된 물질의 분포가 다른 IV 부위와 유사하고 높은 혈중 농도가 빠르게 이루어지기 때문에 적절한 경로라고 생각합니다. 이 기술은 P1-P2 마우스의 안과 정맥동에 화합물을 주입한 Yardeni와 동료들에 의해 잘 설명되었습니다9. 현재 프로토콜에서는 아직 눈을 뜨지 않은 고령 신생아 설치류에서 후안와 주사를 수행하는 간단하고 실현 가능한 방법을 보여줍니다.
Protocol
이 프로토콜에 나열된 모든 절차는 스웨덴 농업 위원회를 준수했으며 예테보리 동물 윤리 위원회(825-2017 및 2195-19)의 승인을 받았습니다. C57BL/6 마우스와 Wistar 쥐는 12시간 라이트/다크 사이클과 음식과 물에 대한 자유로운 접근으로 사내에서 사육되었습니다. 모든 실험 절차는 ARRIVE 지침10을 따랐습니다.
1. 작업 공간 설정
- 이 절차가 진행되는 동안 댐 케이지에서 실험 동물을 수집하여 가열된 패드(35-37°C) 위의 별도 케이지에 넣습니다.
알림: 광원(알비노 동물)을 사용하는 경우 동물의 머리 아래에 위치할 수 있는 비열 광원을 사용해야 합니다.
2. 바늘과 용액
- 29-31G (약 0.30 mm)의 바늘을 사용하십시오.
- 정확한 부피를 위해 피펫 부피에서 주입할 용액을 작성하십시오.
참고: 각 후안와 부비동에 최대 5μL/g의 체중을 주입해야 합니다.
3. 설정
- 동물을 평평한 표면(그림 1A)에 놓고 측면 누운 자세(그림 1C)에 놓습니다.
- 전신 이소플루란 마취를 유도합니다(5% 유도, 3% 유지).
알림: 동물은 마우스피스를 사용하여 마취해야 합니다. 눈꺼풀과 눈물관 부위를 덮지 않아야 합니다(그림 1D). - 발 철수 반사 방법을 사용하여 마취 깊이를 확인합니다.
참고: 수술 전 진통제는 침습적 시술로 간주되지 않으므로 필요하지 않습니다11.
4. 주입 절차
알림: 가능하면 동물의 머리 아래에 광원을 사용하여 정맥동을 쉽게 볼 수 있습니다(그림 1E). 눈꺼풀이 여전히 닫혀 있기 때문에 주입되는 부위의 멸균이 필요하지 않습니다.
- 머리가 오른쪽을 향하도록 오른쪽 후안와 부비동에 주사를 놓습니다(오른손잡이 시술자 예).
- 바늘을 안와(내측 안각에 해당)의 앞쪽에 비스듬히 삽입하여 약 40° 각도로 삽입합니다. 이 각도를 통해 바늘이 안와 뒤쪽으로 향할 수 있습니다.
- 바늘의 1/3(약 2mm)을 안와 뒤쪽에 위치한 후안와 부비동 부위로 전진시킵니다.
- 부드럽고 매끄럽고 유려한 동작으로 주입합니다.
- 역류를 방지하기 위해 바늘을 천천히 빼기 전에 잠시 기다리십시오.
주의: 흡입하지 마십시오. - 오염을 방지하기 위해 각 동물에 대해 새로운 멸균 주사기를 사용하십시오.
알림: 맑은 용액을 주입할 때 정맥이 순간적으로 맑아져야 합니다.
5. 주사 후 관리
- 강아지를 보호 된 보온 장치 (35-37 ° C)에 놓인 회수 상자에 넣으십시오.
- 강아지를 댐으로 돌려보내기 전에 회복을 기다렸다가 조난의 징후가 있는지 확인하십시오.
참고: 염료를 주입한 실습 동물은 IACUC 승인 프로토콜에 따라 즉시 안락사시켜야 합니다.
주의: 주사 중 눈이 붓는다면 바늘이 정맥 플렉스에 삽입되지 않고 대신 안와에 있다는 의미입니다. 신생아 두개골은 매우 부드러워서 바늘이 구멍을 뚫으면 주사가 수막이나 뇌 실질에 들어갑니다.
Representative Results
본 기술은 전반 마취용 마우스피스를 사용하여 평평한 표면에서 수행되었습니다(그림 1A). 마우스피스가 내측 안각에 대한 접근을 차단해서는 안 됩니다(그림 1B). 알비노 동물의 경우, 광섬유 광원을 동물 아래에 배치하여 정맥의 시각화를 지원했습니다(그림 1B). 바늘을 약 40° 각도로 배치하고 내측 안각 안쪽으로 약 2mm 전진시켰습니다(그림 1C). P5 알비노 쥐에 트리판 블루 염료를 주입한 결과, 후안와 부비동의 염료를 명확하게 시각화할 수 있었습니다(그림 1C).
이 프로토콜에 기술된 후안와 주입 기술은 추적자 비오틴-덱스트란(BDA, 10,000Da)을 투여하는 데 성공적으로 사용되었다12. 예를 들어, 혈관 연구에서 가시광선 추적자의 사용은 혈관으로부터의 방사성 슈크로스 유출을 사용하는 것에 대한 대안을 제공할 수 있으며, 다른 조직학적 측정에 동일한 뇌를 사용할 수 있게 한다12.
최근에는 생식기질 출혈(GMH)13의 신생아 쥐 모델을 확립했습니다. 간단히 말해서, P5 Wistar 쥐는 내측 선조체에 0.3U의 콜라겐 분해 효소 VII를 단일 두개내 주사를 받았습니다. GMH는 생식 기질의 혈관 파열을 초래하며 조기 뇌 손상 및 사망률의 흔한 원인 중 하나이다14. GMH 모델을 추가로 특성화하기 위해 BDA 추적자(그림 2)의 역궤도 주입을 사용하여 GMH가 혈액-뇌 장벽 기능 및 무결성에 미치는 영향을 조사했습니다14.
식염수 주입 대조군(그림 2A)과 비교할 때, BDA 추적자14 의 성공적인 후안와 주입은 BDA 주입 10분 후 뇌 혈관 조직 내 추적자 존재를 평가할 수 있었습니다(그림 2B). 이 기술은 GMH에 손상을 입은 동물의 개별 혈관 수준에서 BDA의 반그림자 혈관 누출을 감지하는 데 사용되었으며(그림 2C, 빨간색 화살표)10을 정량화할 수 있습니다.
그림 1: 트리판 블루 염료 투여 후 혈관의 다이어그램 보기를 사용한 실험 설정. (A) 광섬유 광원이 없는 마취 설정 (B) 및 (C). (D) P10 C5BL/6 마우스에서 트리판 블루 염료의 후궤도 주입. (E) 트리판 블루 염료 주입 후 P5 Wistar 쥐의 혈관 다이어그램 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: BDA 추적자의 분포를 보여주는 대표적인 뇌 현미경 사진. (A) 식염수 주입 대조군 동물에서 양성 염색이 없음. (B) 식염수에 용해된 BDA 추적자는, 동물 당 2.0 - 2.5 mg의 용량 농도로 뇌 (피질)의 혈관 내에서 보였다. (C) GMH(빨간색 화살표)에 따라 뇌 실질로 누출되는 BDA 추적자. 스케일 바 = 200μm. Andersson et al., 202114에서 발췌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 신생아 마우스와 랫트의 후안와 부비동에 물질을 주입하기 위한 명확하고 정확한 방법을 제공합니다. 이는 표재성 측두/안면 정맥을 더 이상 식별할 수 없는 P2 이상의 설치류와 눈꺼풀이 아직 열리지 않고 안구가 노출되지 않은 P12 미만의 동물에서 후안와 주사가 안정적이고 재현성 있게 수행될 수 있음을 보여주기 때문에 중요합니다. 또한, 신생아 후안와 주사는 새끼와 댐 모두에서 잘 견디며 기술을 숙달하면 부작용의 위험이 최소화됩니다.
iv를 통한 주입은 혈관의 파열을 방지하기 위해 주입 속도가 일정하고 낮게 유지된다는 점을 감안할 때 낮은 pH와 높은 pH뿐만 아니라 고농도의 주입이 가능하기 때문에 다른 투여 경로에 비해 이점이 있습니다. 또한, iv 주입은 화합물이 전신 순환에 직접 들어갈 때 화합물의 더 빠른 분포를 허용하여 다른 투여 경로에서 관찰되는 흡수 불량으로 인한 잠재적 지연을 우회합니다. 이를 통해 화합물에 대한 즉각적인 접근과 거의 100% 생체이용률이 가능합니다.
임상적으로 IV는 신생아(생후 28일 <)에서 선호되는 투여 경로입니다. 이는 IV 캐뉼레이션을 통해 약물/수액을 제공하기 위해 쉽게 접근할 수 있기 때문에 신생아 집중 치료 환경에서 특히 그렇습니다. sc 경로를 통한 주사는 신생아, 특히 적혈구 형성15의 투여를 위해 다소 사용되었습니다. 그러나 IV 주입을 우수한 대안으로 제시하는 연구가 나오면서 우려가 제기되고 있다16. 경구 투여는 신생아가 병원 중환자실에 있을 때 실용적인 옵션이 아닌 경우가 많습니다. 또한 성인에 비해 신생아는 위 배출이 지연되고 약물 흡수에 영향을 미칠 수 있는 장 운동성 감소를 포함하여 위장관에 차이가 있습니다. 근육 주사는 신생아의 근육 질량이 작기 때문에 투여하기가 어렵습니다 3,4.
설치류 연구에서 가장 널리 사용되는 IV 주사 방법 중 하나는 꼬리 정맥 주사입니다. 그러나 이 방법은 신생아와 함께 일할 때 사용할 수 없습니다. 표재성 측두정맥/안면정맥(superficial temporal/facial vein 6)과 같은 다른 iv 부위는 P3에서 보이지 않게 된다. 신생아 횡동은 한 연구에서 기술되어 있으며 P0-P1에서 현미경의 도움을 받아 피부를 열고 두개골을 통해 모세혈관 바늘을 횡동으로 전진시켜 2-4μl 부피의 주사를 허용했다7. 쥐17에서 P7의 외부 경정맥의 사용을 문서화한 연구는 거의 없다. 그러나, 이것은 피부의 외과적 개방과 외부 경정맥의 노출을 필요로 하는 침습적 기술이다(18). 성인 설치류를 대상으로 한 연구에서, 후안와 투여는 꼬리 정맥 주사5 만큼 효과적인 것으로 나타났으며, 따라서 후안와 경로의 생존 가능성과 관련성을 강화한다. 후안와 주사는 최소한의 고통을 유발하며 일단 숙달되면 최소한의 장비로 한 사람이 수행할 수 있으며 여러 번 주사할 수 있습니다(눈이 번갈아 가도록 함). 이전 연구들은 P0-P1 또는 P14-P2111 또는 P1719 에서 마우스에서 아데노-관련 바이러스 9를 투여하기 위해 후안와 주입이 사용되었음을 보여주었으며, 이는 이 방법의 수용이 증가하고 있음을 나타낸다.
신생아의 후안와 주사와 관련된 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 모든 IV 주입과 마찬가지로 주입 용량이 제한되어 있으므로 이 시술에는 5μL/g을 권장합니다. 또한 후안와 주사는 전신 마취가 필요합니다. 합병증을 최소화하기 위해 이소플루란과 같은 흡입 마취제는 마취 유도가 빠르고 신진대사가 빠르며 회복 속도가 빠르기 때문에 사용하는 것이 좋습니다. 바늘 경사의 잘못된 배치로 인한 주사 부위 주변의 잠재적인 부종이나 눈 외상을 방지하기 위해 말기 마취된 동물에서 유색 염료를 사용하는 것이 좋습니다. 이 동물의 크기가 작기 때문에 바늘 게이지가 작은 더 미세한 바늘이 필요합니다. 세포 주입은 혈관 막힘을 방지하고 세포 생존력을 보장하기 위해 단일 세포 현탁액으로 수행되어야 합니다. 고무적이게도, Amer와 동료들의 연구는 30G 주사기를 사용하여 포유류 세포를 주입하는 것이 높은 세포 밀도 방출에서도 여전히 신뢰할 수 있는 세포 생존력을 제공한다는 것을 보여주었다20.
요약하면, 신생아에서 신뢰할 수 있는 IV 경로를 확립하는 것은 인간에서 선호되는 투여 경로이기 때문에 임상적으로 중요합니다. 후안와 주사는 쉽게 마스터할 수 있고, 재현 가능하며, 설치류 신생아 기간 동안 안정적으로 사용할 수 없는 꼬리 및 측두/안면 정맥과 같은 다른 IV 주사 부위에 대한 적절한 대안을 제공합니다. 따라서, 신생아 후안와 주사는 적절한 신생아 연령에 약물, 세포 및 기타 화합물의 전달을 허용한다.
Disclosures
저자는 이 프로토콜의 연구, 저자 또는 출판과 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 프로토콜에서 수행된 작업은 Hasselblad Foundation(2020-2021, ERF), Åke Wibergs Foundation(M19-0660, ERF), Swedish Research Council(2019-01320, HH; 2021-01872, CM), Sahlgrenska University Hospital의 공중 보건 서비스(ALFGBG-965174, HH ; ALFGBG-966107, CM), 스웨덴 뇌 재단(FO2022-0110, CM), 올렌 재단(223005, CM) 및 유럽 연합 Horizon 2020 프레임워크 프로그램(보조금 계약 번호 87472/PREMSTEM, HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
References
- Laughon, M. M., et al. Drug labeling and exposure in neonates. JAMA Pediatr. 168 (2), 130-136 (2014).
- Das, A., et al. Methodological issues in the design and analyses of neonatal research studies: Experience of the nichd neonatal research network. Semin Perinatol. 40 (6), 374-384 (2016).
- Ku, L. C., Smith, P. B. Dosing in neonates: Special considerations in physiology and trial design. Pediatr Res. 77 (1-1), 2-9 (2015).
- Linakis, M. W., et al. Challenges associated with route of administration in neonatal drug delivery. Clin Pharmacokinet. 55 (2), 185-196 (2016).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D.
- Hamodi, A. S., Martinez Sabino, A., Fitzgerald, N. D., Moschou, D., Crair, M. C. Transverse sinus injections drive robust whole-brain expression of transgenes. Elife. 9, 53639 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Kilkenny, C., et al. Animal research: Reporting in vivo experiments: The arrive guidelines). Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).
- Ek, C. J., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M., Potter, A., Saunders, N. R. Permeability and route of entry for lipid-insoluble molecules across brain barriers in developing monodelphis domestica. J Physiol. 536, 841-853 (2001).
- Jinnai, M., et al. A model of germinal matrix hemorrhage in preterm rat pups). Front Cell Neurosci. 14, 535320 (2020).
- Andersson, E. A., Rocha-Ferreira, E., Hagberg, H., Mallard, C., Ek, C. J. Function and biomarkers of the blood-brain barrier in a neonatal germinal matrix haemorrhage model. Cells. 10 (7), (2021).
- Ohls, R. K., et al. Effects of early erythropoietin therapy on the transfusion requirements of preterm infants below 1250 grams birth weight: A multicenter, randomized, controlled trial. Pediatrics. 108 (4), 934-942 (2001).
- Costa, S., et al. How to administrate erythropoietin, intravenous or subcutaneous. Acta Paediatr. 102 (6), 579-583 (2013).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Sugiyama, Y., et al. Intravenous administration of bone marrow-derived mesenchymal stem cell, but not adipose tissue-derived stem cell, ameliorated the neonatal hypoxic-ischemic brain injury by changing cerebral inflammatory state in rat. Front Neurol. 9, 757 (2018).
- Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. J Pharm Pharmacol. 67 (5), 640-650 (2015).
