Summary
Этот протокол направлен на демонстрацию воспроизводимого венозного пути введения, который может быть использован на крысах и мышах в течение всего неонатального периода. Эта процедура важна для доклинических исследований грызунов, которые хотят отразить введение лекарств в отделениях неонатальной помощи, в основном с использованием внутривенного введения.
Abstract
Внутривенные (в/в) инъекции являются наиболее часто используемым способом введения препарата новорожденным в клинических условиях. Таким образом, инъекция в ретроорбитальную вену является важным методом введения соединения в научных исследованиях, где успешные экспериментальные исследования могут перерасти в столь необходимые неонатальные клинические испытания. В большинстве внутривенных исследований у новорожденных грызунов используется поверхностная височно-лицевая вена. Однако ретроорбитальная инъекция становится ненадежной у новорожденных грызунов старше 2 дней после того, как кожа потемнела и вена больше не была видна. В настоящем протоколе мы описываем ретроорбитальную инъекцию венозного синуса как у новорожденных мышей, так и у крыс в возрасте, когда поверхностная височная вена уже не видна, но глаза еще не открылись. Открытие глаз облегчает ретроорбитальную инъекцию, позволяя исследователю четко видеть, что он не прокалывает глаз при введении иглы. Мы демонстрируем, что этот метод может быть выполнен надежным и воспроизводимым способом без побочных эффектов. Кроме того, мы показываем, что он может быть использован во многих исследованиях, таких как введение соединений для изучения травмы головного мозга новорожденных.
Introduction
Исследования на животных являются важным шагом, ведущим к клиническим испытаниям, и поэтому важно, чтобы исследования на животных точно имитировали процедуры и методы лечения, выполняемые в клинических условиях. Тем не менее, существует ряд проблем при переводе клинической практики в исследования новорожденных грызунов. К ним относятся, в частности, небольшой размер новорожденного грызуна и пробел в неонатальных исследованиях и знаниях по сравнению с исследованиями взрослых особей.
Введение различных веществ, таких как лекарства или клетки, может осуществляться несколькими способами, включая внутрибрюшинные (ip), подкожные (sc) и внутривенные (iv) инъекции. Внутривенное введение является предпочтительным путем введения соединений новорожденным человека. У новорожденных внутривенный способ введения более выгоден по сравнению с другими путями, поскольку он максимизирует системное распределение препаратов и обладает высокой биодоступностью 3,4. Хорошо обслуживаемые внутривенные капельницы могут быть использованы для повторного введения препарата. В исследованиях на грызунах необходимо проводить внутривенные инъекции в хвост, лицевые/височные вены или в ретроорбитальный синус5. Инъекция в хвостовую вену обычно используется у взрослых грызунов, так как она обеспечивает две боковые каудальные параллельные вены на выбор из5. Однако эти вены имеют небольшой диаметр, что исключает их применение у новорожденных. Большинство неонатальных внутривенных инъекций выполняются в поверхностную лицевую/височную вену, так как она видна с постнатального дня 0 (P0)-P2 ипозволяет вводить относительно большой объем 5. Тем не менее, этот путь становится ненадежным в районе P36, как только животное приобретает цвет кожи, тем самым затрудняя видимость поверхностной лицевой/височной вены невооруженным глазом. Внутривенное введение через поперечный синус новорожденного было описано в одном исследовании7; однако для этого необходимо вскрыть кожу над поперечным синусом и ввести AAV9 в P0-P1 с помощью микроскопа.
При изучении потенциального лечения или создании соответствующей модели неонатальной травмы важно учитывать, что у неонатальных грызунов могут быть другие сроки развития органов по сравнению с людьми. Наш протокол основан на различиях в развитии центральной нервной системы новорожденных у людей и грызунов. Например, термин «мозг новорожденного человека» приблизительно соответствует мозгу крысы P7 и мыши P108. Поскольку распределение веществ, вводимых ретроорбитально, аналогично распределению в других местах внутривенного введения, с быстрым достижением высоких уровней в крови, мы считаем этот путь подходящим. Этот метод был хорошо описан Ярдени и его коллегами, которые вводили соединения в глазной венозный синус мышам P1-P29. В текущем протоколе мы показываем простой и осуществимый метод выполнения ретроорбитальных инъекций у пожилых неонатальных грызунов, которые еще не открыли глаза.
Protocol
Все процедуры, перечисленные в этом протоколе, соответствовали требованиям Шведского совета по сельскому хозяйству и были одобрены Гётеборгским комитетом по этике животных (825-2017 и 2195-19). Мыши C57BL/6 и крысы Wistar были выведены в домашних условиях с 12-часовым циклом света/темноты и свободным доступом к пище и воде. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами ПРИБК10.
1. Настройка рабочего пространства
- На время этой процедуры подопытных животных забирают из клетки матери и помещают в отдельную клетку на грелку (35-37 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании источника света (животные-альбиносы) следует использовать источник света без нагрева, который можно расположить под головой животного.
2. Игла и раствор
- Используйте иглу с давлением 29-31 г (около 0,30 мм).
- Для получения точных объемов наберите раствор для инъекции из пипетированного объема.
ПРИМЕЧАНИЕ: В каждый ретроорбитальный синус следует вводить не более 5 мкл/г массы тела.
3. Настройка
- Положите животных на ровную поверхность (Рисунок 1А) в положении лежа на боку (Рисунок 1С).
- Индуцируйте анестезию всего тела изофлураном (5% индукция, 3% поддерживающая).
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные должны находиться под наркозом с помощью мундштука. Область век и слезных протоков не должна быть закрыта (рисунок 1D). - Проверьте глубину анестезии методом рефлексного отдергивания лапы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предоперационное обезболивание не требуется, так как это не считается инвазивной процедурой11.
4. Процедура инъекции
ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности используйте источник света под головой животного (Рисунок 1C), чтобы облегчить обзор венозного синуса (Рисунок 1E). Стерилизация области инъекции не требуется, так как веко по-прежнему закрыто.
- Повернув голову вправо, ввести инъекцию в правый ретроорбитальный синус (пример праворукого оператора).
- Введите иглу скосом вниз в переднюю часть глазницы - эквивалент медиального кантуса, под углом примерно 40°. Этот угол позволяет направить иглу в заднюю часть глазной орбиты.
- Продвиньте 1/3 иглы (около 2 мм) в область ретроорбитального синуса, расположенного за глазной орбитой.
- Вводите мягкими, плавными и плавными движениями.
- Подождите немного, прежде чем медленно вытащить иглу, чтобы избежать обратного потока.
ВНИМАНИЕ: Не аспирируйте. - Используйте новый стерильный шприц для каждого животного, чтобы избежать заражения.
ПРИМЕЧАНИЕ: При введении прозрачного раствора вена должна мгновенно стать прозрачной.
5. Постинъекционный уход
- Поместите щенка в контейнер для восстановления, положив его на защищенное устройство для обогрева (35-37 °C).
- Дождитесь выздоровления и проверьте, нет ли признаков бедствия, прежде чем возвращать щенка на плотину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, которым вводят краситель, должны быть немедленно подвергнуты эвтаназии в соответствии с протоколами, утвержденными IACUC.
ВНИМАНИЕ: Если глаз опух во время инъекции, это означает, что игла введена не в венозный сплетение, а находится в глазной орбите. Неонатальный череп очень мягкий, если игла его проткнет, то укол пойдет в мозговые оболочки или даже паренхиму мозга.
Representative Results
Данная методика выполнялась на плоской поверхности с мундштуком для глобальной анестезии (рис. 1А). Мундштук не должен перекрывать доступ к медиальному кантусу (рис. 1Б). У животных-альбиносов под животным помещали оптоволоконный источник света, чтобы помочь визуализировать вены (рис. 1B). Иглу помещали под углом примерно 40° и продвигали примерно на 2 мм в медиальный кантус (рис. 1C). Инъекция красителя трипанового синего крысе-альбиносу P5 позволила четко визуализировать краситель в ретроорбитальном синусе (рис. 1C).
Техника ретроорбитальной инъекции, описанная в этом протоколе, была успешно использована для введения индикаторного биотин-декстрана (BDA, 10 000 Da)12. Использование видимых индикаторов в сосудистых исследованиях может, например, обеспечить альтернативу использованию экстравазации радиоактивной сахарозы из кровеносных сосудов, что позволит использовать тот же мозг для других гистологических измерений12.
Недавно мы создали неонатальную модель кровоизлияния в зародышевой матрикс (ГМГ)13. Вкратце, крысы P5 Wistar получили однократную внутричерепную инъекцию 0,3 ЕД коллагеназы VII в медиальное стриатум. ГМГ приводит к разрыву сосудов в зародышевом матриксе и является одной из распространенных причин преждевременных повреждений головного мозга и смертности14. Для дальнейшей характеристики модели ГМГ мы использовали ретроорбитальную инъекцию индикатора BDA (рис. 2) для изучения влияния ГМГ на функцию и целостность гематоэнцефалического барьера14.
По сравнению с контрольной группой, вводимой физиологическим раствором (рис. 2A), успешная ретроорбитальная инъекция индикатора BDA14 позволила оценить присутствие индикатора в сосудистой сети головного мозга через 10 мин после инъекции BDA (рис. 2B). Затем этот метод был использован для обнаружения сосудистой утечки BDA в полутени на уровне отдельных кровеносных сосудов у животных, пострадавших от ГМГ (рис. 2C, красные стрелки), которые затем могут быть количественно оценены10.
Рисунок 1: Экспериментальная установка с диаграммным видом кровеносных сосудов после введения трипанового синего красителя. (A) Установка анестезии (B) без и (C) с оптоволоконным источником света. (D) Ретроорбитальная инъекция трипанового синего красителя мыши P10 C5BL/6. (E) Диаграмма кровеносных сосудов у крысы P5 Wistar после инъекции трипанового синего красителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные микрофотографии головного мозга, показывающие распределение индикатора BDA. (A) У контрольных животных, которым вводили физиологический раствор, не было положительного окрашивания. (Б) Индикатор БДА, растворенный в физиологическом растворе, в дозе 2,0 - 2,5 мг на животное был виден в кровеносных сосудах головного мозга (коры). (C) Утечка индикатора BDA в паренхиму головного мозга после ГМГ (красные стрелки). Масштабная линейка = 200 мкм. По материалам Andersson et al., 202114. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Этот протокол обеспечивает четкий и точный метод введения веществ в ретроорбитальный синус новорожденных мышей и крыс. Это важно, поскольку показывает, что ретроорбитальные инъекции могут быть выполнены надежно и воспроизводимо у грызунов старше P2, у которых поверхностная височная/лицевая вена больше не различима, и у животных моложе P12, у которых веки еще не открылись, а глазное яблоко не обнажено. Кроме того, неонатальная ретроорбитальная инъекция хорошо переносится как щенками, так и самками, с минимальным риском побочных эффектов после освоения техники.
Внутривенные инъекции имеют преимущество перед другими способами введения, поскольку они позволяют вводить как с высокой концентрацией, так и с низким и высоким pH, при условии, что скорость инъекции поддерживается постоянной и низкой, чтобы избежать разрыва сосуда. Кроме того, внутривенные инъекции позволяют быстрее распределить соединения, поскольку они попадают непосредственно в системный кровоток, тем самым минуя потенциальные задержки из-за плохой абсорбции, наблюдаемые при других путях введения. Это обеспечивает немедленный доступ и почти 100% биодоступность соединений.
Клинически внутривенное введение является предпочтительным способом введения у новорожденных (< возрасте до 28 дней). Это особенно актуально в условиях интенсивной терапии новорожденных, поскольку внутривенная канюляция обеспечивает легкий доступ к лекарствам/жидкостям. Инъекции через/к в некоторой степени используются у новорожденных, особенно для введения эритропоэтина15. Тем не менее, были высказаны опасения, поскольку исследование показало, что внутривенная инфузия является лучшей альтернативой16. Пероральный прием не часто является практичным вариантом, когда новорожденные находятся в условиях интенсивной терапии больницы. Кроме того, по сравнению со взрослыми, новорожденные имеют различия в желудочно-кишечном тракте, включая задержку опорожнения желудка и снижение перистальтики кишечника, что может повлиять на всасывание лекарств. Внутримышечные инъекции трудно вводить из-за малой мышечной массы новорожденных 3,4.
В исследованиях на грызунах одним из наиболее широко используемых методов внутривенных инъекций является инъекция в хвостовую вену. Однако этот метод нежизнеспособен при работе с новорожденными. Другие участки внутривенного введения, такие как поверхностная височная/лицевая вена6 , становятся невидимыми в точке Р3. Неонатальный поперечный синус был описан в одном исследовании и выполнялся в P0-P1 и с помощью микроскопа вскрывал кожу и продвигал капиллярную иглу через череп в поперечный синус, что позволяло вводить инъекции в объеме 2-4 мкл7. В нескольких исследованиях было задокументировано использование наружной яремной вены на P7 у крыс17. Однако это инвазивный метод, требующий хирургического вскрытия кожи и обнажения наружной яремной вены18. В исследованиях на взрослых грызунах было показано, что ретроорбитальное введение так же эффективно, как и инъекция в хвостовую вену5 , что усиливает жизнеспособность и актуальность ретроорбитального пути. Ретроорбитальная инъекция вызывает минимальный дискомфорт и после освоения может быть выполнена одним человеком с минимальным оборудованием и допускает несколько инъекций (гарантируя, что глаза чередуются). Предыдущие исследования показали, что ретроорбитальная инъекция использовалась для введения аденоассоциированного вируса 9 мышам при P0-P1 или P14-P2111 или FITC-декстрана при P1719 , что указывает на растущее признание этого метода.
Существуют некоторые ограничения, связанные с ретроорбитальной инъекцией у новорожденных. Как и при всех внутривенных инъекциях, объем вводимых инъекций ограничен, и мы рекомендуем 5 мкл/г для этой процедуры. Кроме того, ретроорбитальная инъекция требует анестезии всего тела. Чтобы свести к минимуму осложнения, рекомендуется использовать ингаляционные анестезии, такие как изофлуран, так как они быстрее вводят анестезию, имеют быстрый метаболизм и быструю скорость восстановления. Требуется обучение, предпочтительно с использованием цветного красителя у животных, находящихся под терминальной анестезией, чтобы избежать потенциального отека вокруг места инъекции или травмы глаза из-за неправильного размещения скоса иглы. Из-за небольшого размера этих животных требуются более тонкие иглы, с маленьким калибром иглы. Инъекции клеток должны выполняться в одноклеточной суспензии, чтобы избежать закупорки сосудов и обеспечить жизнеспособность клеток. Обнадеживает то, что исследование, проведенное Амером и его коллегами, показало, что инъекция клеток млекопитающих с помощью шприцев 30 G по-прежнему обеспечивает надежную жизнеспособность клеток даже при высокой плотностивыброса клеток.
Таким образом, установление надежного внутривенного введения у новорожденных имеет клиническое значение, поскольку это предпочтительный способ введения у людей. Ретроорбитальная инъекция может быть легко освоена, воспроизводима и представляет собой соответствующую альтернативу другим местам внутривенных инъекций, таким как хвост и височная/лицевая вена, которые не могут быть надежно использованы на протяжении всего неонатального периода грызунов. Таким образом, неонатальная ретроорбитальная инъекция позволяет доставлять лекарства, клетки и другие соединения в соответствующем неонатальном возрасте.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении исследования, авторства или публикации настоящего протокола.
Acknowledgments
Работа, выполненная в рамках этого протокола, финансировалась Фондом Hasselblad (2020-2021 гг., ERF), Фондом Оке Вибергса (M19-0660, ERF), Шведским исследовательским советом (2019-01320, HH; 2021-01872, CM), Службой общественного здравоохранения Университетской больницы Сальгренска (ALFGBG-965174, HH ; ALFGBG-966107, CM), Шведский фонд мозга (FO2022-0110, CM), Фонд Алена (223005, CM) и Рамочная программа Европейского Союза «Горизонт 2020» (грантовое соглашение No 87472/PREMSTEM, HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
References
- Laughon, M. M., et al. Drug labeling and exposure in neonates. JAMA Pediatr. 168 (2), 130-136 (2014).
- Das, A., et al. Methodological issues in the design and analyses of neonatal research studies: Experience of the nichd neonatal research network. Semin Perinatol. 40 (6), 374-384 (2016).
- Ku, L. C., Smith, P. B. Dosing in neonates: Special considerations in physiology and trial design. Pediatr Res. 77 (1-1), 2-9 (2015).
- Linakis, M. W., et al. Challenges associated with route of administration in neonatal drug delivery. Clin Pharmacokinet. 55 (2), 185-196 (2016).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D.
- Hamodi, A. S., Martinez Sabino, A., Fitzgerald, N. D., Moschou, D., Crair, M. C. Transverse sinus injections drive robust whole-brain expression of transgenes. Elife. 9, 53639 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Kilkenny, C., et al. Animal research: Reporting in vivo experiments: The arrive guidelines). Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).
- Ek, C. J., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M., Potter, A., Saunders, N. R. Permeability and route of entry for lipid-insoluble molecules across brain barriers in developing monodelphis domestica. J Physiol. 536, 841-853 (2001).
- Jinnai, M., et al. A model of germinal matrix hemorrhage in preterm rat pups). Front Cell Neurosci. 14, 535320 (2020).
- Andersson, E. A., Rocha-Ferreira, E., Hagberg, H., Mallard, C., Ek, C. J. Function and biomarkers of the blood-brain barrier in a neonatal germinal matrix haemorrhage model. Cells. 10 (7), (2021).
- Ohls, R. K., et al. Effects of early erythropoietin therapy on the transfusion requirements of preterm infants below 1250 grams birth weight: A multicenter, randomized, controlled trial. Pediatrics. 108 (4), 934-942 (2001).
- Costa, S., et al. How to administrate erythropoietin, intravenous or subcutaneous. Acta Paediatr. 102 (6), 579-583 (2013).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Sugiyama, Y., et al. Intravenous administration of bone marrow-derived mesenchymal stem cell, but not adipose tissue-derived stem cell, ameliorated the neonatal hypoxic-ischemic brain injury by changing cerebral inflammatory state in rat. Front Neurol. 9, 757 (2018).
- Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. J Pharm Pharmacol. 67 (5), 640-650 (2015).
