Summary
Dit protocol heeft tot doel een reproduceerbare veneuze toedieningsroute aan te tonen die gedurende de neonatale periode bij ratten en muizen kan worden gebruikt. Deze procedure is belangrijk voor preklinische knaagdierstudies die de toediening van geneesmiddelen op neonatale zorgafdelingen willen weerspiegelen, voornamelijk met behulp van intraveneuze toediening.
Abstract
Intraveneuze (iv) injectie is de meest gebruikte toedieningsroute bij pasgeborenen in de klinische setting. Daarom is retroorbitale aderinjectie een belangrijke methode voor de toediening van verbindingen in onderzoek, waar succesvolle proof-of-concept-studies kunnen uitgroeien tot de broodnodige neonatale klinische onderzoeken. De meeste intraveneuze onderzoeken bij neonatale knaagdieren maken gebruik van de oppervlakkige temporale/faciale ader. Retroorbitale injectie wordt echter onbetrouwbaar bij neonatale knaagdieren ouder dan 2 dagen nadat de huid donkerder is geworden en de ader niet langer zichtbaar is. In dit protocol beschrijven we de retroorbitale injectie van de veneuze sinus bij zowel de neonatale muis als de rat op leeftijden waarop de oppervlakkige temporale ader niet meer zichtbaar is, maar de ogen nog niet zijn geopend. Het openen van de ogen vergemakkelijkt retro-orbitale injectie door de onderzoeker in staat te stellen duidelijk te zien dat hij het oog niet perforeert bij het inbrengen van de naald. We tonen aan dat deze techniek op een betrouwbare en reproduceerbare manier kan worden uitgevoerd zonder nadelige effecten. Bovendien laten we zien dat het in veel onderzoeken kan worden gebruikt, zoals het toedienen van verbindingen om neonataal hersenletsel te bestuderen.
Introduction
Dieronderzoek is een essentiële stap die leidt tot klinische proeven, en daarom is het belangrijk dat dierstudies procedures en behandelingen die in de klinische setting worden uitgevoerd, nauwkeurig nabootsen. Er zijn echter verschillende uitdagingen bij het vertalen van klinische praktijken naar neonatale knaagdierstudies. Deze omvatten onder andere de kleine omvang van het neonatale knaagdier en de kloof in neonataal onderzoek en kennis in vergelijking met onderzoek bij volwassenen 1,2.
Toediening van verschillende stoffen zoals medicijnen of cellen kan via meerdere routes worden uitgevoerd, waaronder intraperitoneale (ip), subcutane (sc) en intraveneuze (iv) injecties. Injectie via een infuus is de voorkeursroute voor toediening van verbindingen bij menselijke pasgeborenen. Bij pasgeborenen is de iv-toedieningsroute voordelig in vergelijking met andere routes, omdat het de systemische distributie van geneesmiddelen maximaliseert en een hoge biologische beschikbaarheid heeft 3,4. Een goed onderhouden infuuslijn kan worden gebruikt voor herhaalde toediening van het geneesmiddel. In onderzoek bij knaagdieren moeten intraveneuze injecties worden uitgevoerd in de staart, gezichts-/temporale aderen of in de retroorbitale sinus5. Injectie van staartaders wordt routinematig gebruikt bij volwassen knaagdieren, omdat het twee laterale caudale parallelle aderen biedt om uit te kiezen5. Deze aderen hebben echter een kleine diameter, waardoor ze niet kunnen worden gebruikt bij pasgeborenen. De meeste neonatale intraveneuze injecties zijn uitgevoerd in de oppervlakkige faciale/temporale ader, omdat deze zichtbaar is vanaf postnatale dag 0 (P0)-P2 en een relatief grote toediening mogelijkmaakt5. Deze route wordt echter onbetrouwbaar rond P36 zodra het dier huidskleur krijgt, waardoor de oppervlakkige gezichts-/temporale ader moeilijk te zien is met het blote oog. Toediening iv via de neonatale transversale sinus is beschreven in één onderzoek7; dit vereist echter het openen van de huid boven de transversale sinus en het injecteren van AAV9 op P0-P1 met behulp van een microscoop.
Bij het onderzoeken van een mogelijke behandeling of het opstellen van een relevant neonataal letselmodel, is het belangrijk om te bedenken dat neonatale knaagdieren een andere timing van orgaanontwikkeling kunnen hebben dan mensen. Ons protocol is gebaseerd op de verschillen in de ontwikkeling van het neonatale centrale zenuwstelsel tussen mensen en knaagdieren. De term pasgeboren menselijk brein komt bijvoorbeeld ongeveer overeen met een P7-rat en een P10-muizenbrein8. Aangezien de verdeling van stoffen die retroorbitaal worden geïnjecteerd vergelijkbaar is met die van de andere infuusplaatsen, waarbij snel hoge bloedspiegels worden bereikt, beschouwen we het als een geschikte route. Deze techniek is goed beschreven door Yardeni en collega's, die verbindingen injecteerden in de oftalmische veneuze sinus in P1-P2-muizen9. In het huidige protocol laten we een eenvoudige en haalbare methode zien om retroorbitale injecties uit te voeren bij oudere neonatale knaagdieren die hun ogen nog moeten openen.
Protocol
Alle procedures die in dit protocol worden vermeld, zijn in overeenstemming met de Zweedse Raad voor Landbouw en zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie voor dieren in Göteborg (825-2017 en 2195-19). C57BL/6 muizen en Wistar-ratten werden in eigen huis gefokt met een licht/donkercyclus van 12 uur en vrije toegang tot voedsel en water. Alle experimentele procedures volgden de ARRIVE-richtlijnen10.
1. Inrichting van de werkruimte
- Verzamel de proefdieren voor de duur van deze procedure uit de opvangkooi en plaats ze in een aparte kooi op een verwarmd kussen (35-37 °C).
NOTITIE: Als u een lichtbron (albinodieren) gebruikt, moet een niet-verwarmende lichtbron worden gebruikt die onder de kop van het dier kan worden geplaatst.
2. Naald en oplossing
- Gebruik een naald met 29-31 G (ongeveer 0,30 mm).
- Voor nauwkeurige volumes zuigt u de te injecteren oplossing op uit een gepipetteerd volume.
OPMERKING: In elke retroorbitale sinus mag maximaal 5 μL/g lichaamsgewicht worden geïnjecteerd.
3. Installatie
- Plaats de dieren op een vlakke ondergrond (figuur 1A) in zijligging (figuur 1C).
- Induceer isofluraananesthesie voor het hele lichaam (5% inductie, 3% onderhoud).
OPMERKING: De dieren moeten onder narcose worden gebracht met behulp van een mondstuk. Het ooglid en de traanbuis mogen niet bedekt zijn (Figuur 1D). - Controleer de diepte van de anesthesie met behulp van de pootterugtrekkingsreflexmethode.
OPMERKING: Er is geen preoperatieve analgesie vereist, aangezien dit niet als een invasieve procedure wordtbeschouwd11.
4. Procedure voor injectie
NOTITIE: Gebruik indien mogelijk een lichtbron onder de kop van het dier (Figuur 1C) om het zicht op de veneuze sinus te vergemakkelijken (Figuur 1E). Er is geen sterilisatie van het te injecteren gebied vereist, omdat het ooglid nog gesloten is.
- Met het hoofd naar rechts gericht, dient u de injectie toe in de rechter retroorbitale sinus (voorbeeld van de rechtshandige operator).
- Steek de naald, afgeschuind, aan de voorkant van de oogkas - het equivalent van de mediale canthus, in een hoek van ongeveer 40°. Door deze hoek kan de naald naar de achterkant van de oogkas worden gericht.
- Schuif 1/3 van de naald (ongeveer 2 mm) naar voren in het gebied van de retroorbitale sinus achter de oogbaan.
- Injecteer in een zachte, soepele en vloeiende beweging.
- Wacht even voordat u de naald langzaam terugtrekt om terugstroming te voorkomen.
LET OP: Niet aspireren. - Gebruik voor elk dier een nieuwe steriele spuit om besmetting te voorkomen.
OPMERKING: Bij het injecteren van een heldere oplossing moet de ader even helder worden.
5. Zorg na injectie
- Plaats de pup in de herstelbox, rustend op een beschermd verwarmingsapparaat (35-37 °C).
- Wacht op het herstel en controleer op tekenen van nood voordat u de pup terugbrengt naar de dam.
OPMERKING: Met kleurstof geïnjecteerde praktijkdieren moeten onmiddellijk worden geëuthanaseerd volgens de door de IACUC goedgekeurde protocollen.
LET OP: Als het oog opzwelt tijdens de injectie, betekent dit dat de naald niet in het veneuze plex wordt ingebracht en zich in plaats daarvan in de oogbaan bevindt. De neonatale schedel is erg zacht, als de naald deze perforeert, gaat de injectie in de hersenvliezen of zelfs in het hersenparenchym.
Representative Results
De huidige techniek werd uitgevoerd op een plat oppervlak, met een mondstuk voor globale anesthesie (Figuur 1A). Het mondstuk mag de toegang tot de mediale canthus niet blokkeren (Figuur 1B). Bij albinodieren werd een glasvezellichtbron onder het dier geplaatst om te helpen bij de visualisatie van de aderen (Figuur 1B). De naald werd onder een hoek van ongeveer 40° geplaatst en ongeveer 2 mm in de mediale canthus gestoken (figuur 1C). Injectie van trypanblauwe kleurstof in een P5-albinorat maakte een duidelijke visualisatie van de kleurstof in de retroorbitale sinus mogelijk (Figuur 1C).
De retroorbitale injectietechniek die in dit protocol wordt beschreven, werd met succes gebruikt om de tracer biotine-dextran (BDA, 10.000 Da)12 toe te dienen. Het gebruik van zichtbare tracers in vasculair onderzoek kan bijvoorbeeld een alternatief bieden voor het gebruik van radioactieve sucrose-extravasatie uit de bloedvaten, waardoor dezelfde hersenen kunnen worden gebruikt voor andere histologischemetingen12.
Onlangs hebben we een neonataal rattenmodel van germinale matrixbloeding (GMH) opgesteld13. Kortom, P5 Wistar-ratten kregen een enkele intracraniële injectie van 0,3 U collagenase VII in het mediale striatum. GMH resulteert in breuk van de bloedvaten in de kiemmatrix en is een van de meest voorkomende oorzaken van vroegtijdig hersenletsel en mortaliteit14. Om het GMH-model verder te karakteriseren, gebruikten we een retroorbitale injectie van de BDA-tracer (Figuur 2) om de effecten van GMH op de functie en integriteit van de bloed-hersenbarrière teonderzoeken14.
In vergelijking met met zoutoplossing geïnjecteerde controles (Figuur 2A), maakte succesvolle retroorbitale injectie van de BDA-tracer14 het mogelijk om de aanwezigheid van de tracer in de hersenvasculatuur 10 minuten na BDA-injectie te beoordelen (Figuur 2B). Deze techniek werd vervolgens gebruikt om penumbra vasculaire lekkage van BDA op het niveau van de individuele bloedvaten te detecteren bij GMH-gewonde dieren (figuur 2C, rode pijlen), die vervolgens kunnen worden gekwantificeerd10.
Figuur 1: Experimentele opstelling met schematische weergave van de bloedvaten na toediening van trypanblauwe kleurstof. (A) Anesthesie-opstelling (B) zonder en (C) met glasvezellichtbron. (D) Retroorbitale injectie van trypanblauwe kleurstof in de P10 C5BL/6-muis. (E) Diagramweergave van de bloedvaten in de P5 Wistar-rat na injectie met trypanblauwe kleurstof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve microfoto's van de hersenen die de verdeling van de BDA-tracer laten zien. (A) Geen positieve kleuring bij controledieren met zoutoplossing. (B) BDA-tracer opgelost in zoutoplossing, bij een dosisconcentratie van 2,0 - 2,5 mg per dier was zichtbaar in de bloedvaten van de hersenen (cortex). (C) BDA-tracer die in het hersenparenchym lekt na GMH (rode pijlen). Schaalbalk = 200 μm. Aangepast van Andersson et al., 202114. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit protocol biedt een duidelijke en nauwkeurige methode voor de injectie van stoffen in de retroorbitale sinus van neonatale muizen en ratten. Dit is belangrijk omdat het aantoont dat retroorbitale injecties betrouwbaar en reproduceerbaar kunnen worden uitgevoerd bij knaagdieren ouder dan P2, waar de oppervlakkige temporale/gezichtsader niet langer waarneembaar is, en bij dieren jonger dan P12, waar de oogleden nog niet zijn geopend en de oogbol niet is blootgesteld. Bovendien wordt de neonatale retroorbitale injectie goed verdragen door zowel de pups als de moederdieren, met minimale risico's op bijwerkingen als de techniek eenmaal onder de knie is.
Injecties via een iv hebben een voordeel ten opzichte van andere toedieningsroutes, omdat ze injectie met een hoge concentratie mogelijk maken, evenals zowel een lage als een hoge pH, op voorwaarde dat de injectiesnelheid constant en laag wordt gehouden om scheuren van het vat te voorkomen. Bovendien zorgen iv-injecties voor een snellere distributie van verbindingen omdat ze rechtstreeks in de systemische circulatie terechtkomen, waardoor mogelijke vertragingen als gevolg van slechte absorptie die bij andere toedieningsroutes worden waargenomen, worden omzeild. Dit zorgt voor onmiddellijke toegang en bijna 100% biologische beschikbaarheid van verbindingen.
Klinisch iv is de voorkeursroute van toediening bij pasgeborenen (< de leeftijd van 28 dagen). Dit geldt met name in neonatale intensive care-omgevingen, omdat iv-canulatie gemakkelijke toegang biedt om medicijnen/vloeistoffen te verstrekken. Injecties via de sc-route zijn enigszins gebruikt bij pasgeborenen, met name voor de toediening van erytropoëtine15. Er zijn echter zorgen geuit, met een studie die intraveneuze infusie suggereert als een superieur alternatief16. Orale toediening is vaak geen praktische optie wanneer pasgeborenen zich op een intensieve afdeling van een ziekenhuis bevinden. Bovendien hebben pasgeborenen, in vergelijking met volwassenen, verschillen in hun maagdarmkanaal, waaronder vertraagde maaglediging en verminderde darmmotiliteit, wat de opname van geneesmiddelen kan beïnvloeden. Intramusculaire injecties zijn moeilijk toe te dienen als gevolg van de kleine spiermassa van pasgeborenen 3,4.
In het onderzoek naar knaagdieren is een van de meest gebruikte methoden voor infuusinjecties de injectie van de staartader. Deze methode is echter niet levensvatbaar bij het werken met pasgeborenen. Andere iv-plaatsen, zoals de oppervlakkige temporale/faciale ader6 , worden onzichtbaar op P3. Neonatale transversale sinus is beschreven in één onderzoek en werd uitgevoerd op P0-P1 en, met behulp van een microscoop, de huid openen en een capillaire naald door de schedel in de transversale sinus brengen, waardoorinjecties met een volume van 2-4 μl mogelijk werden 7. Er zijn maar weinig studies die het gebruik van de uitwendige halsader op P7 bij ratten hebben gedocumenteerd17. Dit is echter een invasieve techniek die chirurgische opening van de huid en blootstelling van de uitwendige halsader vereist18. In onderzoeken bij volwassen knaagdieren is aangetoond dat retroorbitale toediening even effectief is als staartaderinjectie5 , waardoor de levensvatbaarheid en relevantie van de retroorbitale route wordt versterkt. De retroorbitale injectie veroorzaakt minimaal leed en kan, eenmaal onder de knie, worden uitgevoerd door één persoon met minimale apparatuur en maakt meerdere injecties mogelijk (zodat de ogen worden afgewisseld). Eerdere studies hebben aangetoond dat retroorbitale injectie is gebruikt om adeno-geassocieerd virus 9 toe te dienen bij muizen op P0-P1 of op P14-P2111 of FITC-dextran op P1719 , wat wijst op een toenemende acceptatie van deze methode.
Er zijn enkele beperkingen verbonden aan retroorbitale injectie bij pasgeborenen. Zoals bij alle intraveneuze injecties is het geïnjecteerde volume beperkt en raden we voor deze procedure 5 μL/g aan. Bovendien vereist de retroorbitale injectie anesthesie van het hele lichaam. Om complicaties tot een minimum te beperken, wordt het gebruik van inhalatie-anesthesiemiddelen zoals isofluraan aanbevolen, omdat deze sneller zijn bij anesthesie-inductie, een snel metabolisme hebben en een snel herstelpercentage hebben. Training is vereist, bij voorkeur met behulp van gekleurde kleurstof bij terminaal verdoofde dieren, om mogelijke zwelling rond de injectieplaats of oogtrauma als gevolg van onjuiste plaatsing van de naaldafschuining te voorkomen. Vanwege het kleine formaat van deze dieren zijn fijnere naalden nodig, met een kleine naalddikte. Injectie van cellen moet worden uitgevoerd in eencellige suspensie, om verstopping van bloedvaten te voorkomen en de levensvatbaarheid van de cellen te garanderen. Bemoedigend is dat een studie van Amer en collega's heeft aangetoond dat injectie van zoogdiercellen met behulp van 30 G-spuiten nog steeds een betrouwbare cellevensvatbaarheid biedt, zelfs bij ejectie met hogeceldichtheid20.
Samenvattend is het vaststellen van een betrouwbare intraveneuze toedieningsroute bij pasgeborenen van klinisch belang, aangezien dit de voorkeurstoedieningsroute is bij mensen. De retroorbitale injectie kan gemakkelijk onder de knie worden gekregen, is reproduceerbaar en biedt een relevant alternatief voor andere infuusinjectieplaatsen, zoals staart en temporale/gezichtsader, die niet betrouwbaar kunnen worden gebruikt gedurende de neonatale periode van knaagdieren. De neonatale retroorbitale injectie zorgt dus voor de toediening van medicijnen, cellen en andere verbindingen op de juiste neonatale leeftijd.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling met betrekking tot het onderzoek, het auteurschap of de publicatie van dit protocol.
Acknowledgments
Het werk dat in dit protocol werd uitgevoerd, werd gefinancierd door Hasselblad Foundation (2020-2021, ERF), Åke Wibergs Foundation (M19-0660, ERF), Swedish Research Council (2019-01320, HH; 2021-01872, CM), Public Health Service van het Sahlgrenska University Hospital (ALFGBG-965174, HH ; ALFGBG-966107, CM), De Zweedse Hersenstichting (FO2022-0110, CM), Åhlen Foundation (223005, CM) en Horizon 2020 Kaderprogramma van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 87472/PREMSTEM, HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
References
- Laughon, M. M., et al. Drug labeling and exposure in neonates. JAMA Pediatr. 168 (2), 130-136 (2014).
- Das, A., et al. Methodological issues in the design and analyses of neonatal research studies: Experience of the nichd neonatal research network. Semin Perinatol. 40 (6), 374-384 (2016).
- Ku, L. C., Smith, P. B. Dosing in neonates: Special considerations in physiology and trial design. Pediatr Res. 77 (1-1), 2-9 (2015).
- Linakis, M. W., et al. Challenges associated with route of administration in neonatal drug delivery. Clin Pharmacokinet. 55 (2), 185-196 (2016).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D.
- Hamodi, A. S., Martinez Sabino, A., Fitzgerald, N. D., Moschou, D., Crair, M. C. Transverse sinus injections drive robust whole-brain expression of transgenes. Elife. 9, 53639 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Kilkenny, C., et al. Animal research: Reporting in vivo experiments: The arrive guidelines). Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).
- Ek, C. J., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M., Potter, A., Saunders, N. R. Permeability and route of entry for lipid-insoluble molecules across brain barriers in developing monodelphis domestica. J Physiol. 536, 841-853 (2001).
- Jinnai, M., et al. A model of germinal matrix hemorrhage in preterm rat pups). Front Cell Neurosci. 14, 535320 (2020).
- Andersson, E. A., Rocha-Ferreira, E., Hagberg, H., Mallard, C., Ek, C. J. Function and biomarkers of the blood-brain barrier in a neonatal germinal matrix haemorrhage model. Cells. 10 (7), (2021).
- Ohls, R. K., et al. Effects of early erythropoietin therapy on the transfusion requirements of preterm infants below 1250 grams birth weight: A multicenter, randomized, controlled trial. Pediatrics. 108 (4), 934-942 (2001).
- Costa, S., et al. How to administrate erythropoietin, intravenous or subcutaneous. Acta Paediatr. 102 (6), 579-583 (2013).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Sugiyama, Y., et al. Intravenous administration of bone marrow-derived mesenchymal stem cell, but not adipose tissue-derived stem cell, ameliorated the neonatal hypoxic-ischemic brain injury by changing cerebral inflammatory state in rat. Front Neurol. 9, 757 (2018).
- Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. J Pharm Pharmacol. 67 (5), 640-650 (2015).
