Summary
Detta protokoll syftar till att demonstrera en reproducerbar venös administreringsväg som kan användas på råttor och möss under hela nyföddhetsperioden. Denna procedur är viktig för prekliniska gnagarstudier som vill spegla läkemedelsadministrering på neonatalvårdsavdelningar med i första hand intravenös administrering.
Abstract
Intravenös (iv) injektion är den mest använda administreringsvägen för nyfödda i den kliniska miljön. Därför är retroorbital veninjektion en viktig metod för administrering av substanser inom forskning, där framgångsrika proof-of-concept-studier kan utvecklas till välbehövliga neonatala kliniska prövningar. De flesta intravenösa studier på neonatala gnagare använder den ytliga temporal-/ansiktsvenen. Retroorbital injektion blir dock opålitlig hos nyfödda gnagare som är äldre än 2 dagar efter att huden mörknat och venen inte längre är synlig. I detta protokoll beskriver vi den retroorbitala injektionen av venus sinus hos både den neonatala musen och råttan vid åldrar då den ytliga temporalvenen inte längre är synlig, men ögonen inte har öppnats ännu. Ögonöppning underlättar retroorbital injektion genom att forskaren tydligt kan se att de inte perforerar ögat när de sätter in nålen. Vi visar att denna teknik kan utföras på ett tillförlitligt och reproducerbart sätt utan negativa effekter. Dessutom visar vi att det kan användas i många studier, till exempel för att administrera föreningar för att studera neonatal hjärnskada.
Introduction
Djurförsök är ett viktigt steg som leder till kliniska prövningar, och därför är det viktigt att djurstudier efterliknar procedurer och behandlingar som utförs i den kliniska miljön. Det finns dock flera utmaningar när det gäller att översätta klinisk praxis till studier på nyfödda gnagare. Dessa inkluderar bland annat den nyfödda gnagarens ringa storlek och gapet i neonatal forskning och kunskap jämfört med vuxenforskning, bland annat 1,2.
Administrering av olika substanser som läkemedel eller celler kan utföras via flera vägar, inklusive intraperitoneala (ip), subkutana (sc) och intravenösa (iv) injektioner. Injektion med iv är den föredragna administreringsvägen för föreningar hos humana nyfödda. Hos nyfödda är den intravenösa administreringsvägen fördelaktig jämfört med andra administreringsvägar eftersom den maximerar den systemiska distributionen av läkemedel och har hög biotillgänglighet 3,4. En väl underhållen intravenös infart kan användas för upprepad administrering av läkemedel. I studier på gnagare måste intravenösa injektioner utföras i svansen, ansikts-/temporalvenerna eller i sinus5 retroorbital. Svansvensinjektion används rutinmässigt hos vuxna gnagare, eftersom det ger två laterala svansparallella vener att välja mellan5. Dessa vener har dock en liten diameter, vilket utesluter deras användning hos nyfödda. De flesta neonatala intravena injektioner har utförts i den ytliga ansikts-/temporalvenen, eftersom den är synlig från postnatal dag 0 (P0)-P2 och möjliggör en relativt stor volymadministrering5. Denna väg blir dock opålitlig runt P36 när djuret får hudfärg, vilket gör det svårt att se den ytliga ansikts-/temporalvenen med blotta ögat. Administrering iv via den neonatala tvärgående sinus har beskrivits i en studie7; Detta kräver dock att huden öppnas ovanför den tvärgående sinus och AAV9 injiceras vid P0-P1 med hjälp av ett mikroskop.
När man undersöker en potentiell behandling eller etablerar en relevant modell för neonatal skada är det viktigt att ta hänsyn till att neonatala gnagare kan ha en annan tidpunkt för organutveckling jämfört med människor. Vårt protokoll är baserat på skillnaderna i utvecklingen av det neonatala centrala nervsystemet mellan människor och gnagare. Som ett exempel motsvarar termen nyfödd mänsklig hjärna ungefär en P7-råtta och en P10-mushjärna8. Eftersom fördelningen av substanser som injiceras retroorbitalt liknar den på de andra intravenösa ställena, med höga blodnivåer som snabbt uppnås, anser vi att det är en lämplig väg. Denna teknik har beskrivits väl av Yardeni och kollegor, som injicerade föreningar i den oftalmiska venösa sinus i P1-P2-möss9. I det nuvarande protokollet visar vi en enkel och genomförbar metod för att utföra retroorbitala injektioner i äldre neonatala gnagare som ännu inte har öppnat ögonen.
Protocol
Alla rutiner som listas i detta protokoll överensstämmer med Jordbruksverket och är godkända av Göteborgs djurförsöksetiska kommitté (825-2017 och 2195-19). C57BL/6-möss och Wistar-råttor föddes upp internt med en 12 timmars ljus/mörker-cykel och fri tillgång till mat och vatten. Alla experimentella procedurer följde ARRIVE-riktlinjerna10.
1. Inställning av arbetsyta
- Under denna procedur samlas försöksdjuren upp från moderdjursburen och placeras i en separat bur på en uppvärmd dyna (35–37 °C).
OBS: Om du använder en ljuskälla (albinodjur) bör en icke-värmeljuskälla som kan placeras under djurets huvud användas.
2. Nål och lösning
- Använd en nål med 29-31 G (cirka 0,30 mm).
- För exakta volymer, dra upp lösningen som ska injiceras från en pipetterad volym.
OBS: Maximalt 5 μL/g kroppsvikt bör injiceras i varje retroorbital sinus.
3. Inställning
- Placera djuren på en plan yta (Figur 1A) i sidoläge (Figur 1C).
- Inducera isoflurananestesi för hela kroppen (5 % induktion, 3 % underhåll).
OBS: Djuren ska sövas med hjälp av ett munstycke. Ögonlocket och tårkanalen ska inte täckas över (Figur 1D). - Kontrollera anestesidjupet med hjälp av tassens tillbakadragande reflexmetod.
OBS: Ingen preoperativ smärtlindring krävs eftersom detta inte anses vara ett invasivt ingrepp11.
4. Injektion
OBS: Använd om möjligt en ljuskälla under djurets huvud (Figur 1C) för att underlätta view av venösa sinus (Figur 1E). Ingen sterilisering av området som injiceras krävs, eftersom ögonlocket fortfarande är stängt.
- Med huvudet vänt åt höger, administrera injektionen i höger retroorbital sinus (högerhänt operatör example).
- Stick in nålen, avfasad nedåt, på framsidan av ögonhålan - motsvarande den mediala kantusen, i en vinkel på cirka 40°. Denna vinkel gör att nålen kan riktas mot den bakre delen av ögonhålan.
- För in 1/3 av nålen (ca 2 mm) i det område av den retroorbitala sinus som ligger bakom ögonhålan.
- Injicera med mjuka, mjuka och flytande rörelser.
- Vänta en stund innan du drar ut nålen långsamt för att undvika återflöde.
VARNING: Aspirera inte. - Använd en ny steril spruta för varje djur för att undvika kontaminering.
OBS: Vid injektion av en klar lösning ska venen tillfälligt bli klar.
5. Vård efter injektion
- Placera valpen i återhämtningslådan, vilande på en skyddad uppvärmningsanordning (35-37 °C).
- Vänta på återhämtningen och kontrollera om det finns några tecken på nöd innan du återför valpen till dammen.
OBS: Färginjicerade försöksdjur bör omedelbart avlivas enligt de IACUC-godkända protokollen.
VARNING: Om ögat svullnar under injektionen betyder det att nålen inte förs in i venplex utan istället befinner sig i ögonhålan. Den neonatala skallen är mycket mjuk, om nålen perforerar den, kommer injektionen att gå in i hjärnhinnorna eller till och med hjärnans parenkym.
Representative Results
Den aktuella tekniken utfördes på en plan yta, med ett munstycke för global anestesi (Figur 1A). Munstycket får inte blockera åtkomsten till den mediala kantusen (Figur 1B). Hos albinodjur placerades en fiberoptisk ljuskälla under djuret för att hjälpa till med visualiseringen av venerna (Figur 1B). Nålen placerades i en vinkel på cirka 40° och fördes in cirka 2 mm i den mediala kantusen (Figur 1C). Injektion av trypanblått färgämne i en P5-albinoråtta möjliggjorde tydlig visualisering av färgämnet i den retroorbitala sinus (Figur 1C).
Den retroorbitala injektionstekniken som beskrivs i detta protokoll användes framgångsrikt för att administrera spårämnet biotin-dextran (BDA, 10 000 Da)12. Användningen av synliga spårämnen i kärlforskning kan till exempel vara ett alternativ till att använda extravasering av radioaktivt sackaros från blodkärlen, vilket gör det möjligt att använda samma hjärna för andra histologiska mätningar12.
Nyligen har vi etablerat en neonatal råttmodell av germinal matrix hemorrhage (GMH)13. I korthet fick P5 Wistar-råttor en enda intrakraniell injektion av 0,3 U kollagenas VII i mediala striatum. GMH leder till att kärlen i germinalmatrisen brister, och är en av de vanligaste orsakerna till för tidig hjärnskada och dödlighet14. För att ytterligare karakterisera GMH-modellen använde vi en retroorbital injektion av BDA-spårämnet (Figur 2) för att undersöka effekterna av GMH i blod-hjärnbarriärens funktion och integritet14.
Jämfört med kontroller som injicerats med koksaltlösning (Figur 2A) möjliggjorde framgångsrik retroorbital injektion av BDA-spårämne14 en bedömning av förekomsten av spårämne i hjärnans kärl 10 minuter efter BDA-injektionen (Figur 2B). Denna teknik användes sedan för att detektera penumbravaskulärt läckage av BDA på individuell blodkärlsnivå hos GMH-skadade djur (Figur 2C, röda pilar) som sedan kan kvantifieras10.
Figur 1: Experimentell uppställning med diagramvy av blodkärlen efter administrering av trypanblått färgämne. (A) Anestesiinställning (B) utan och (C) med fiberoptisk ljuskälla. D) Retroorbital injektion av trypanblått färgämne i P10 C5BL/6-musen. (E) Diagrambild av blodkärlen i P5 Wistar-råttan efter injektion av trypanblått färgämne. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa hjärnmikroskop som visar fördelningen av BDA-spårämnet. A) Ingen positiv infärgning hos kontrolldjur som injicerats med koksaltlösning. (B) BDA-spårämne upplöst i koksaltlösning, vid en doskoncentration på 2,0 - 2,5 mg per djur var synligt i blodkärlen i hjärnan (cortex). (C) BDA-spårämne som läcker in i hjärnans parenkym efter GMH (röda pilar). Skalstapel = 200 μm. Anpassad från Andersson et al., 202114. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Detta protokoll ger en tydlig och exakt metod för injektion av ämnen i den retroorbitala sinus hos neonatala möss och råttor. Detta är viktigt eftersom det visar att retroorbitala injektioner kan utföras på ett tillförlitligt och reproducerbart sätt hos gnagare som är äldre än P2, där den ytliga temporal-/ansiktsvenen inte längre kan urskiljas, och hos djur som är yngre än P12, där ögonlocken ännu inte har öppnats och ögongloben inte är exponerad. Dessutom tolereras den neonatala retroorbitala injektionen väl av både ungarna och mödrarna, med minimal risk för biverkningar när tekniken väl behärskas.
Injektioner via intravenöst har en fördel jämfört med andra administreringssätt eftersom de möjliggör injektion med hög koncentration, samt både lågt och högt pH, förutsatt att injektionshastigheten hålls konstant och låg för att undvika att kärlet brister. Dessutom möjliggör intravenösa injektioner snabbare distribution av föreningar eftersom de går direkt in i den systemiska cirkulationen och därmed kringgår potentiella fördröjningar från dålig absorption som observerats vid andra administreringsvägar. Detta möjliggör omedelbar tillgång och nästan 100 % biotillgänglighet av föreningar.
Kliniskt intravenöst administreringssätt är den föredragna administreringsvägen till nyfödda (< 28 dagars ålder). Detta gäller särskilt i neonatala intensivvårdsmiljöer eftersom iv kanylering möjliggör enkel åtkomst för att tillhandahålla läkemedel/vätskor. Injektioner via sc har använts i viss utsträckning hos nyfödda, särskilt för administrering av erytropoietin15. Farhågor har dock väckts, och en studie tyder på intravenös infusion som ett överlägset alternativ16. Oral administrering är ofta inte ett praktiskt alternativ när nyfödda är på en intensivvårdsavdelning på sjukhus. Dessutom, jämfört med vuxna, har nyfödda skillnader i mag-tarmkanalen, inklusive försenad magtömning och minskad tarmmotilitet som kan påverka läkemedelsabsorptionen. Intramuskulära injektioner är svåra att administrera på grund av den lilla muskelmassan hos nyfödda 3,4.
Inom gnagarforskning är en av de mest använda metoderna för iv-injektioner svansvensinjektionen. Denna metod är dock ogenomförbar när man arbetar med nyfödda. Andra iv-ställen som den ytliga temporal-/ansiktsvenen6 blir osynliga vid P3. Neonatal tvärgående sinus har beskrivits i en studie och utfördes vid P0-P1 och med hjälp av mikroskop öppnade huden och förde in en kapillärnål genom skallen in i den tvärgående sinusen, vilket möjliggjorde injektioner med 2-4 μl volym7. Få studier har dokumenterat användningen av den yttre halsvenen vid P7 hos råttor17. Detta är dock en invasiv teknik som kräver kirurgisk öppning av huden och exponering av den yttre halsvenen18. I studier på vuxna gnagare har retroorbital administrering visat sig vara lika effektiv som injektion i svansvenen5 , vilket förstärker livskraften och relevansen av den retroorbitala vägen. Den retroorbitala injektionen orsakar minimalt lidande och när den väl behärskas kan den utföras av en enda person med minimal utrustning och tillåter flera injektioner (vilket säkerställer att ögonen alternerar). Tidigare studier har visat att retroorbital injektion har använts för att administrera adenoassocierat virus 9 hos möss vid P0-P1 eller vid P14-P2111 eller FITC-dextran vid P1719 , vilket indikerar en ökande acceptans för denna metod.
Det finns vissa begränsningar förknippade med retroorbital injektion hos nyfödda. Som med alla intravenösa injektioner är den injicerade volymen begränsad och vi rekommenderar 5 μL/g för denna procedur. Dessutom kräver den retroorbitala injektionen helkroppsbedövning. För att minimera komplikationer föreslås användning av inhalerade anestesimedel som isofluran, eftersom dessa är snabbare vid anestesiinduktion, har snabb ämnesomsättning och har en snabb återhämtningshastighet. Träning, helst med färgämne på terminalsövda djur, krävs för att undvika eventuell svullnad runt injektionsstället eller ögontrauma på grund av felaktig placering av nålfasen. På grund av den lilla storleken på dessa djur krävs finare nålar, med liten nåltjocklek. Injektion av celler måste utföras i encellssuspension för att undvika blockering av kärl och för att säkerställa cellviabilitet. Uppmuntrande nog har en studie av Amer och kollegor visat att injektion av däggdjursceller med 30 G-sprutor fortfarande ger tillförlitlig cellviabilitet även vid utstötning med hög celldensitet20.
Sammanfattningsvis är etablering av en tillförlitlig intravenös administrering hos nyfödda av klinisk betydelse, eftersom detta är den administreringsväg som föredras hos människa. Den retroorbitala injektionen kan lätt bemästras, är reproducerbar och ger ett relevant alternativ till andra intravenösa injektionsställen, såsom svans och temporal/ansiktsven som inte kan användas på ett tillförlitligt sätt under hela den neonatala perioden hos gnagare. Således möjliggör den neonatala retroorbitala injektionen leverans av läkemedel, celler och andra föreningar vid lämpliga neonatala åldrar.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt med avseende på forskningen, författarskapet eller publiceringen av detta protokoll.
Acknowledgments
Arbetet som utförs i detta protokoll har finansierats av Hasselbladstiftelsen (2020-2021, ERF), Åke Wibergs stiftelse (M19-0660, ERF), Vetenskapsrådet (2019-01320, HH; 2021-01872, CM), Folkhälsomyndigheten vid Sahlgrenska Universitetssjukhuset (ALFGBG-965174, HH ; ALFGBG-966107, CM), Hjärnfonden (FO2022-0110, CM), Åhlenstiftelsen (223005, CM) och Horizon 2020 Framework Program of European Union (bidragsavtal nr 87472/PREMSTEM, HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
References
- Laughon, M. M., et al. Drug labeling and exposure in neonates. JAMA Pediatr. 168 (2), 130-136 (2014).
- Das, A., et al. Methodological issues in the design and analyses of neonatal research studies: Experience of the nichd neonatal research network. Semin Perinatol. 40 (6), 374-384 (2016).
- Ku, L. C., Smith, P. B. Dosing in neonates: Special considerations in physiology and trial design. Pediatr Res. 77 (1-1), 2-9 (2015).
- Linakis, M. W., et al. Challenges associated with route of administration in neonatal drug delivery. Clin Pharmacokinet. 55 (2), 185-196 (2016).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D.
- Hamodi, A. S., Martinez Sabino, A., Fitzgerald, N. D., Moschou, D., Crair, M. C. Transverse sinus injections drive robust whole-brain expression of transgenes. Elife. 9, 53639 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Kilkenny, C., et al. Animal research: Reporting in vivo experiments: The arrive guidelines). Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).
- Ek, C. J., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M., Potter, A., Saunders, N. R. Permeability and route of entry for lipid-insoluble molecules across brain barriers in developing monodelphis domestica. J Physiol. 536, 841-853 (2001).
- Jinnai, M., et al. A model of germinal matrix hemorrhage in preterm rat pups). Front Cell Neurosci. 14, 535320 (2020).
- Andersson, E. A., Rocha-Ferreira, E., Hagberg, H., Mallard, C., Ek, C. J. Function and biomarkers of the blood-brain barrier in a neonatal germinal matrix haemorrhage model. Cells. 10 (7), (2021).
- Ohls, R. K., et al. Effects of early erythropoietin therapy on the transfusion requirements of preterm infants below 1250 grams birth weight: A multicenter, randomized, controlled trial. Pediatrics. 108 (4), 934-942 (2001).
- Costa, S., et al. How to administrate erythropoietin, intravenous or subcutaneous. Acta Paediatr. 102 (6), 579-583 (2013).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Sugiyama, Y., et al. Intravenous administration of bone marrow-derived mesenchymal stem cell, but not adipose tissue-derived stem cell, ameliorated the neonatal hypoxic-ischemic brain injury by changing cerebral inflammatory state in rat. Front Neurol. 9, 757 (2018).
- Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. J Pharm Pharmacol. 67 (5), 640-650 (2015).
