Summary
Denne protokollen tar sikte på å demonstrere en reproduserbar venøs administrasjonsvei som kan brukes på rotter og mus gjennom hele nyfødtperioden. Denne prosedyren er viktig for prekliniske gnagerstudier som ønsker å speile legemiddeladministrasjon i nyfødtavdelinger primært ved intravenøs administrasjon.
Abstract
Intravenøs (iv) injeksjon er den mest brukte ruten for legemiddeladministrasjon hos nyfødte i klinisk setting. Derfor er retroorbital veneinjeksjon en viktig metode for sammensatt administrasjon i forskning, hvor vellykkede proof-of-concept-studier kan utvikle seg til sårt tiltrengte neonatale kliniske studier. De fleste intravenøse studier hos nyfødte gnagere bruker vena temporal/facial overfladisk. Imidlertid blir retroorbital injeksjon upålitelig hos nyfødte gnagere eldre enn 2 dager etter at huden mørkner og venen ikke lenger er synlig. I denne protokollen beskriver vi retroorbital injeksjon av venøs sinus hos både nyfødtmus og rotte i aldre hvor vena temporalis ikke lenger er synlig, men øynene ikke har åpnet seg ennå. Øyeåpning muliggjør retro-orbital injeksjon ved at forskeren tydelig kan se at de ikke perforerer øyet når de setter inn nålen. Vi demonstrerer at denne teknikken kan utføres på en pålitelig og reproduserbar måte uten bivirkninger. I tillegg viser vi at det kan brukes i mange studier, for eksempel administrering av forbindelser for å studere neonatal hjerneskade.
Introduction
Dyreforsøk er et viktig skritt som fører til kliniske studier, og som sådan er det viktig at dyreforsøk nøye etterligner prosedyrer og behandlinger utført i klinisk setting. Det er imidlertid flere utfordringer med å oversette klinisk praksis til nyfødte gnagerstudier. Disse inkluderer den lille størrelsen på nyfødtgnageren og gapet i nyfødtforskning og kunnskap sammenlignet med voksenforskning, blant annet 1,2.
Administrasjon av forskjellige stoffer som legemidler eller celler kan utføres via flere ruter, inkludert intraperitoneal (ip), subkutan (sc) og intravenøs (iv) injeksjoner. Injeksjon av iv er den foretrukne administrasjonsveien for forbindelser hos humane nyfødte. Hos nyfødte er den i.v. administrasjonsveien fordelaktig sammenlignet med andre ruter fordi den maksimerer systemisk distribusjon av legemidler og har høy biotilgjengelighet 3,4. En godt vedlikeholdt iv linjer kan brukes til gjentatt legemiddeladministrasjon. I gnagerstudier må i.v. injeksjoner utføres i hale, ansikts-/temporalvener eller i retroorbital sinus5. Tail vein injeksjon brukes rutinemessig hos voksne gnagere, da det gir to laterale kaudale parallelle vener å velge mellom5. Imidlertid har disse venene en liten diameter, som utelukker deres bruk hos nyfødte. De fleste intravena nyfødtinjeksjoner i.v. er utført i vena facialis/temporalis superficialis, da den er synlig fra postnatal dag 0 (P0)-P2 og muliggjør et relativt stortvolum 5. Imidlertid blir denne ruten upålitelig rundt P36 når dyret får hudfarge, og dermed gjør den overfladiske ansikts-/temporalvenen vanskelig å se med det uassisterte øyet. Administrering iv via neonatal transvers sinus er beskrevet i en studie7; Dette krever imidlertid åpning av huden over sinus transversus og injeksjon av AAV9 på P0-P1 ved hjelp av mikroskop.
Når man undersøker en potensiell behandling eller etablerer en relevant modell for neonatal skade, er det viktig å ta i betraktning at nyfødte gnagere kan ha forskjellig organutviklingstidspunkt sammenlignet med mennesker. Vår protokoll er basert på forskjellene i neonatal utvikling av sentralnervesystemet mellom mennesker og gnagere. Som et eksempel tilsvarer begrepet nyfødt menneskelig hjerne omtrent en P7-rotte og en P10-musehjerne8. Siden distribusjonen av substanser injisert retroorbitalt er lik distribusjonen på de andre intravenøse stedene, med høye blodnivåer som raskt oppnås, anser vi det som en egnet rute. Denne teknikken har blitt godt beskrevet av Yardeni og kolleger, som injiserte forbindelser i den oftalmiske venøse sinus i P1-P2-mus9. I den nåværende protokollen viser vi en enkel og gjennomførbar metode for å utføre retroorbitale injeksjoner hos eldre nyfødte gnagere som ennå ikke har åpnet øynene.
Protocol
Alle prosedyrene i denne protokollen var i samsvar med Landbruksstyrelsen og ble godkjent av Göteborgs dyreetiske komité (825-2017 og 2195-19). C57BL/6 mus og Wistar-rotter ble avlet internt med en 12 timers lys / mørk syklus og fri tilgang til mat og vann. Alle eksperimentelle prosedyrer fulgte ARRIVE-retningslinjene10.
1. Oppsett av arbeidsområde
- I løpet av denne prosedyren, samle forsøksdyrene fra damburet og plasser dem i et eget bur på en oppvarmet pute (35-37 ° C).
MERK: Hvis du bruker en lyskilde (albino dyr), bør en ikke-varmelyskilde som kan plasseres under dyrets hode brukes.
2. Kanyle og oppløsning
- Bruk en nål med 29-31 G (rundt 0,30 mm).
- For nøyaktige volumer, trekk opp løsningen som skal injiseres fra et pipettert volum.
MERK: Maksimalt 5 μL / g kroppsvekt skal injiseres i hver retroorbital sinus.
3. Oppsett
- Plasser dyrene på et flatt underlag (figur 1A) i lateral liggelengde (figur 1C).
- Indusere isoflurananestesi for hele kroppen (5 % induksjon, 3 % vedlikehold).
MERK: Dyrene skal legges under anestesi ved hjelp av et munnstykke. Øyelokk- og tårekanalområdet skal ikke dekkes til (figur 1D). - Kontroller dybden av anestesi ved hjelp av poteuttaksrefleksmetoden.
MERK: Ingen preoperativ analgesi er nødvendig, da dette ikke regnes som en invasiv prosedyre11.
4. Prosedyre for injeksjon
MERK: Hvis mulig, bruk en lyskilde under dyrets hode (figur 1C), for å lette sikten til venøs sinus (figur 1E). Ingen sterilisering av området som injiseres er nødvendig, da øyelokket fortsatt er lukket.
- Med hodet vendt mot høyre, administrer injeksjonen i høyre retroorbitale sinus (høyrehendt operatøreksempel).
- Sett nålen, skrått ned, på forsiden av øyehulen - tilsvarende mediale canthus, i en vinkel på ca. 40 °. Denne vinkelen gjør at nålen kan rettes mot baksiden av øyebanen.
- Før 1/3 av nålen (ca. 2 mm) inn i området av den retroorbitale sinus som ligger bak øyets bane.
- Injiser i en mild, jevn og flytende bevegelse.
- Vent et øyeblikk før kanylen trekkes sakte ut for å unngå tilbakestrømning.
FORSIKTIG: Ikke aspirer. - Bruk en ny steril sprøyte til hvert dyr for å unngå kontaminering.
MERK: Når du injiserer en klar oppløsning, bør venen bli øyeblikkelig klar.
5. Pleie etter injeksjon
- Plasser valpen i restitusjonsboksen, hvilt på et beskyttet varmeapparat (35-37 °C).
- Vent på utvinningen og sjekk for tegn på nød før du returnerer valpen til dammen.
MERK: Fargestoffinjiserte praksisdyr skal umiddelbart avlives i henhold til IACUC-godkjente protokoller.
FORSIKTIG: Hvis øyet hovner opp under injeksjonen, betyr det at nålen ikke settes inn i venøs plex og i stedet er i øyebanen. Den nyfødte skallen er veldig myk, hvis nålen perforerer den, vil injeksjonen gå inn i meningene eller til og med hjerneparenchymen.
Representative Results
Den nåværende teknikken ble utført på en flat overflate, med et talerør for global anestesi (figur 1A). Munnstykket skal ikke blokkere tilgangen til mediale canthus (figur 1B). I albino dyr ble en fiberoptisk lyskilde plassert under dyret, for å hjelpe til med visualisering av venene (figur 1B). Nålen ble plassert i en vinkel på ca. 40°, og beveget seg ca. 2 mm inn i mediale canthus (figur 1C). Injeksjon av trypanblått fargestoff i en P5 albino rotte tillot klar visualisering av fargestoffet i retroorbital sinus (figur 1C).
Den retroorbitale injeksjonsteknikken beskrevet i denne protokollen ble vellykket brukt til å administrere sporstoffet biotin-dextran (BDA, 10 000 Da)12. Bruk av synlige sporstoffer i karforskning kan for eksempel være et alternativ til å bruke ekstravasasjon av radioaktivt sukrose fra blodkarene, slik at den samme hjernen kan brukes til andre histologiske målinger12.
Nylig har vi etablert en neonatal rottemodell av germinal matriksblødning (GMH)13. Kort fortalt fikk P5 Wistar-rotter én enkelt intrakraniell injeksjon med 0,3 E kollagenase VII i medialt striatum. GMH resulterer i ruptur av karene i germinalmatrisen og er en av de utbredte årsakene til for tidlig hjerneskade og dødelighet14. For ytterligere å karakterisere GMH-modellen benyttet vi retroorbital injeksjon av BDA-tracer (figur 2) for å undersøke effekten av GMH på blod-hjernebarrierefunksjon og integritet14.
Sammenlignet med saltvannsinjiserte kontroller (figur 2A), tillot vellykket retroorbital injeksjon av BDA-tracer14 vurdering av sporstofftilstedeværelsen i hjernevaskulaturen 10 minutter etter BDA-injeksjon (figur 2B). Denne teknikken ble deretter brukt til å påvise penumbra vaskulær lekkasje av BDA på det enkelte blodkarnivå hos GMH-skadde dyr (figur 2C, røde piler) som deretter kan kvantifiseres10.
Figur 1: Eksperimentelt oppsett med diagramvisning av blodårene etter administrering av trypanblått fargestoff. (A) Anestesioppsett (B) uten og (C) med fiberoptisk lyskilde. (D) Retroorbital injeksjon av trypanblått fargestoff i P10 C5BL/6-musen. (E) Diagramvisning av blodårene i P5 Wistar-rotten etter injeksjon av trypanblått fargestoff. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative hjernemikrografer som viser fordelingen av BDA-sporstoffet. (A) Ingen positiv flekk i saltvannsinjiserte kontrolldyr. (B) BDA tracer oppløst i saltvann, ved en dosekonsentrasjon på 2,0 - 2,5 mg per dyr var synlig i blodkar i hjernen (cortex). (C) BDA-sporstoff som lekker inn i hjerneparenkymet etter GMH (røde piler). Skala bar = 200 μm. Tilpasset fra Andersson et al., 202114. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne protokollen gir en klar og presis metode for injeksjon av stoffer i retroorbital sinus av nyfødte mus og rotter. Dette er viktig fordi det viser at retroorbitale injeksjoner kan utføres pålitelig og reproduserbart hos gnagere eldre enn P2, hvor den overfladiske temporale / ansiktsvenen ikke lenger er merkbar, og hos dyr yngre enn P12, hvor øyelokkene ennå ikke har åpnet seg, og øyebollet ikke er eksponert. Videre tolereres den neonatale retroorbitale injeksjonen godt av både valpene og dammene, med minimal risiko for bivirkninger når teknikken er mestret.
Injeksjoner via iv har en fordel i forhold til andre administrasjonsveier, da de tillater injeksjon av høy konsentrasjon, samt både lav og høy pH, forutsatt at injeksjonshastigheten holdes konstant og lav for å unngå brudd på karet. Videre tillater intravenøse injeksjoner raskere distribusjon av forbindelser når de kommer direkte inn i den systemiske sirkulasjonen, og dermed omgår potensielle forsinkelser fra dårlig absorpsjon observert i andre administrasjonsveier. Dette gir umiddelbar tilgang og nesten 100% biotilgjengelighet av forbindelser.
Klinisk intravenøst er den foretrukne administrasjonsmåten hos nyfødte (< 28 dager). Dette gjelder spesielt i neonatal intensiv omsorg innstillinger som iv kanylering gir enkel tilgang til å gi medisiner / væsker. Injeksjoner via sc-ruten har blitt noe brukt hos nyfødte, spesielt for administrering av erytropoietin15. Imidlertid har det blitt reist bekymringer, med en studie som tyder på intravenøs infusjon som et overlegent alternativ16. Oral administrasjon er ikke ofte et praktisk alternativ når nyfødte er i en sykehusintensiv enhet. I tillegg, sammenlignet med voksne, har nyfødte forskjeller i mage-tarmkanalen, inkludert forsinket gastrisk tømming og redusert tarmmotilitet som kan påvirke legemiddelabsorpsjonen. Intramuskulære injeksjoner er vanskelige å administrere som følge av den lille muskelmassen til nyfødte 3,4.
I gnagerforskning er en av de mest brukte metodene for iv-injeksjoner injeksjon av halevenen. Denne metoden er imidlertid ikke levedyktig når du arbeider med nyfødte. Andre steder som overfladisk temporal/facialisvene6 blir usynlige ved P3. Neonatal transvers sinus er beskrevet i en studie og ble utført ved P0-P1 og, ved hjelp av et mikroskop, åpnet huden og førte en kapillærnål gjennom skallen inn i den tverrgående sinus, slik at 2-4 μl voluminjeksjoner7. Få studier har dokumentert bruk av vena jugularis utvendig ved P7 hos rotter17. Dette er imidlertid en invasiv teknikk som krever kirurgisk åpning av huden og eksponering av den ytre halsvenen18. I studier på voksne gnagere har retroorbital administrering vist seg å være like effektiv som haleveneinjeksjon5 , og dermed forsterke levedyktigheten og relevansen av den retroorbitale ruten. Den retroorbitale injeksjonen forårsaker minimal nød, og når den er mestret, kan den utføres av en enkelt person med minimalt utstyr og tillater flere injeksjoner (slik at øynene skiftes). Tidligere studier har vist at retroorbital injeksjon har blitt brukt til å administrere adenoassosiert virus 9 hos mus ved P0-P1 eller ved P14-P2111 eller FITC-dextran ved P1719 , noe som indikerer en økende aksept av denne metoden.
Det er noen begrensninger forbundet med retroorbital injeksjon hos nyfødte. Som med alle i.v. injeksjoner er injisert volum begrenset, og vi anbefaler 5 μL/g for denne prosedyren. I tillegg krever retroorbital injeksjon full kroppsbedøvelse. For å minimere komplikasjoner foreslås det bruk av inhalasjonsanestesimidler som isofluran, da disse er raskere i anestesiinduksjon, har rask metabolisme og har en rask gjenopprettingshastighet. Opplæring er nødvendig, fortrinnsvis ved bruk av farget fargestoff i terminalt bedøvede dyr, for å unngå potensiell hevelse rundt injeksjonsstedet eller øyetraumer på grunn av feil plassering av nålens skråning. På grunn av den lille størrelsen på disse dyrene, er det nødvendig med finere nåler, med liten nålmåler. Injeksjon av celler må utføres i encellesuspensjon, for å unngå blokkering av kar, og for å sikre cellens levedyktighet. Oppmuntrende har en studie av Amer og kolleger vist at injeksjon av pattedyrceller ved hjelp av 30 G-sprøyter fortsatt gir pålitelig cellelevedyktighet selv ved høy celletetthetutstøting 20.
Oppsummert er etablering av en pålitelig intravenøs vei hos nyfødte av klinisk betydning, da dette er den foretrukne administrasjonsmåten hos mennesker. Den retroorbitale injeksjonen kan lett mestres, er reproduserbar og gir et relevant alternativ til andre IV-injeksjonssteder, for eksempel hale og temporal / ansiktsvene som ikke kan brukes pålitelig gjennom hele gnagerens nyfødtperiode. Dermed tillater den neonatale retroorbitale injeksjonen levering av medisiner, celler og andre forbindelser i passende neonatal alder.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt med hensyn til forskning, forfatterskap eller publisering av denne protokollen.
Acknowledgments
Arbeidet som utføres i denne protokollen ble finansiert av Hasselblad Foundation (2020-2021, ERF), Åke Wibergs Foundation (M19-0660, ERF), Vetenskapsrådet (2019-01320, HH; 2021-01872, CM), Public Health Service ved Sahlgrenska Universitetssykehus (ALFGBG-965174, HH ; ALFGBG-966107, CM), Swedish Brain Foundation (FO2022-0110, CM), Åhlen Foundation (223005, CM) og Horizon 2020 rammeprogram for Den europeiske union (grant agreement no. 87472/PREMSTEM, HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
References
- Laughon, M. M., et al. Drug labeling and exposure in neonates. JAMA Pediatr. 168 (2), 130-136 (2014).
- Das, A., et al. Methodological issues in the design and analyses of neonatal research studies: Experience of the nichd neonatal research network. Semin Perinatol. 40 (6), 374-384 (2016).
- Ku, L. C., Smith, P. B. Dosing in neonates: Special considerations in physiology and trial design. Pediatr Res. 77 (1-1), 2-9 (2015).
- Linakis, M. W., et al. Challenges associated with route of administration in neonatal drug delivery. Clin Pharmacokinet. 55 (2), 185-196 (2016).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D.
- Hamodi, A. S., Martinez Sabino, A., Fitzgerald, N. D., Moschou, D., Crair, M. C. Transverse sinus injections drive robust whole-brain expression of transgenes. Elife. 9, 53639 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Kilkenny, C., et al. Animal research: Reporting in vivo experiments: The arrive guidelines). Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).
- Ek, C. J., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M., Potter, A., Saunders, N. R. Permeability and route of entry for lipid-insoluble molecules across brain barriers in developing monodelphis domestica. J Physiol. 536, 841-853 (2001).
- Jinnai, M., et al. A model of germinal matrix hemorrhage in preterm rat pups). Front Cell Neurosci. 14, 535320 (2020).
- Andersson, E. A., Rocha-Ferreira, E., Hagberg, H., Mallard, C., Ek, C. J. Function and biomarkers of the blood-brain barrier in a neonatal germinal matrix haemorrhage model. Cells. 10 (7), (2021).
- Ohls, R. K., et al. Effects of early erythropoietin therapy on the transfusion requirements of preterm infants below 1250 grams birth weight: A multicenter, randomized, controlled trial. Pediatrics. 108 (4), 934-942 (2001).
- Costa, S., et al. How to administrate erythropoietin, intravenous or subcutaneous. Acta Paediatr. 102 (6), 579-583 (2013).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Sugiyama, Y., et al. Intravenous administration of bone marrow-derived mesenchymal stem cell, but not adipose tissue-derived stem cell, ameliorated the neonatal hypoxic-ischemic brain injury by changing cerebral inflammatory state in rat. Front Neurol. 9, 757 (2018).
- Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. J Pharm Pharmacol. 67 (5), 640-650 (2015).
