Summary
Denne protokol har til formål at demonstrere en reproducerbar venøs administrationsvej, der kan anvendes til rotter og mus i hele den neonatale periode. Denne procedure er vigtig for prækliniske gnaverstudier, der ønsker at afspejle lægemiddeladministration på neonatalafdelinger, primært ved intravenøs administration.
Abstract
Intravenøs (iv) injektion er den mest anvendte indgivelsesvej hos nyfødte i kliniske omgivelser. Derfor er retroorbital veneinjektion en vigtig metode til administration af forbindelser i forskning, hvor vellykkede proof-of-concept-undersøgelser kan udvikle sig til tiltrængte neonatale kliniske forsøg. De fleste intravenøse undersøgelser af neonatale gnavere anvender den overfladiske temporale/ansigtsvene. Imidlertid bliver retroorbital injektion upålidelig hos neonatale gnavere, der er ældre end 2 dage efter, at huden mørkner, og venen ikke længere er synlig. I denne protokol beskriver vi retroorbital injektion af venøs sinus i både neonatal mus og rotte i aldre, hvor den overfladiske temporale vene ikke længere er synlig, men øjnene ikke har åbnet endnu. Øjenåbning letter retro-orbital injektion ved at gøre det muligt for forskeren tydeligt at se, at de ikke perforerer øjet, når nålen indsættes. Vi demonstrerer, at denne teknik kan udføres på en pålidelig og reproducerbar måde uden negative virkninger. Derudover viser vi, at det kan bruges i mange undersøgelser, såsom administration af forbindelser til undersøgelse af neonatal hjerneskade.
Introduction
Dyreforsøg er et vigtigt skridt, der fører til kliniske forsøg, og som sådan er det vigtigt, at dyreforsøg nøje efterligner procedurer og behandlinger udført i kliniske omgivelser. Der er dog flere udfordringer ved at oversætte klinisk praksis til neonatale gnaverstudier. Disse omfatter den lille størrelse af den neonatale gnaver og kløften i neonatal forskning og viden sammenlignet med voksenforskning, blandt andet 1,2.
Administration af forskellige stoffer som lægemidler eller celler kan udføres via flere ruter, herunder intraperitoneale (ip), subkutane (sc) og intravenøse (iv) injektioner. Injektion med iv er den foretrukne indgivelsesvej for forbindelser hos nyfødte. Hos nyfødte er den iv. indgivelsesvej fordelagtig sammenlignet med andre veje, fordi den maksimerer systemisk distribution af lægemidler og har høj biotilgængelighed 3,4. En velholdt iv linjer kan anvendes til gentagen lægemiddeladministration. I gnaverundersøgelser skal iv-injektioner udføres i halen, ansigts-/temporale vener eller i retroorbital sinus5. Haleveneinjektion anvendes rutinemæssigt hos voksne gnavere, da det giver to laterale kaudale parallelle vener at vælge imellem5. Disse vener har imidlertid en lille diameter, hvilket udelukker deres anvendelse hos nyfødte. De fleste neonatal iv-injektioner er blevet udført i den overfladiske ansigts-/temporale vene, da det er synligt fra postnatal dag 0 (P0)-P2 og giver mulighed for en relativt stor volumenadministration5. Denne rute bliver imidlertid upålidelig omkring P36, når dyret får hudfarve, hvilket gør den overfladiske ansigts-/temporale vene vanskelig at se med det uassisterede øje. Administration iv via den neonatale tværgående sinus er beskrevet i et studie7; Dette kræver dog åbning af huden over den tværgående sinus og injektion af AAV9 ved P0-P1 ved hjælp af et mikroskop.
Når man undersøger en potentiel behandling eller etablerer en relevant neonatal skademodel, er det vigtigt at overveje, at neonatale gnavere kan have forskellige organudviklingstidspunkter sammenlignet med mennesker. Vores protokol er baseret på forskellene i udviklingen af neonatal centralnervesystem mellem mennesker og gnavere. Som et eksempel svarer udtrykket nyfødt menneskehjerne omtrent til en P7-rotte og en P10-musehjerne8. Da fordelingen af stoffer, der injiceres retroorbitalt, svarer til fordelingen af de andre iv-steder, hvor der hurtigt opnås høje blodniveauer, anser vi det for en passende vej. Denne teknik er blevet godt beskrevet af Yardeni og kolleger, der injicerede forbindelser i den oftalmiske venøse sinus i P1-P2 mus9. I den nuværende protokol viser vi en enkel og gennemførlig metode til at udføre retroorbitale injektioner hos ældre neonatale gnavere, som endnu ikke har åbnet øjnene.
Protocol
Alle procedurer, der er anført i denne protokol, var i overensstemmelse med den svenske landbrugsstyrelse og blev godkendt af Göteborgs dyreetiske komité (825-2017 og 2195-19). C57BL/6 mus og Wistar rotter blev opdrættet internt med en 12 timers lys/mørk cyklus og fri adgang til mad og vand. Alle eksperimentelle procedurer fulgte ARRIVE-retningslinjerne10.
1. Opsætning af arbejdsområde
- Under hele denne procedure opsamles forsøgsdyrene fra moderburet og anbringes i et separat bur på en opvarmet pude (35-37 °C).
BEMÆRK: Hvis der anvendes en lyskilde (albinodyr), skal der anvendes en ikke-varmende lyskilde, der kan placeres under dyrets hoved.
2. Kanyle og opløsning
- Brug en nål med 29-31 G (ca. 0,30 mm).
- For at opnå nøjagtige volumener tegnes opløsningen, der skal injiceres, fra et pipettet volumen.
BEMÆRK: Der må maksimalt injiceres 5 μL/g legemsvægt i hver retroorbital sinus.
3. Opsætning
- Anbring dyrene på en plan overflade (figur 1A) i sideværts liggende stilling (figur 1C).
- Inducer isofluranbedøvelse i hele kroppen (5% induktion, 3% vedligeholdelse).
BEMÆRK: Dyrene skal lægges i bedøvelse ved hjælp af et mundstykke. Øjenlågs- og tårekanalområdet bør ikke være dækket (figur 1D). - Kontroller dybden af anæstesi ved hjælp af poteudtagningsrefleksmetoden.
BEMÆRK: Ingen præoperativ analgesi er påkrævet, da dette ikke betragtes som en invasiv procedure11.
4. Procedure for injektion
BEMÆRK: Brug om muligt en lyskilde under dyrets hoved (figur 1C) for at lette udsynet til venøs sinus (figur 1E). Ingen sterilisering af det område, der injiceres, er påkrævet, da øjenlåget stadig er lukket.
- Med hovedet vendt mod højre skal du administrere injektionen i højre retroorbitale sinus (højrehåndet operatøreksempel).
- Indsæt nålen, skrå ned, foran på øjenhulen - svarende til den mediale cantsåledes i en vinkel på ca. 40°. Denne vinkel gør det muligt at rette nålen mod bagsiden af øjets kredsløb.
- Skub 1/3 af nålen (ca. 2 mm) ind i området af den retroorbitale sinus placeret bag øjets kredsløb.
- Injicer i en blid, jævn og flydende bevægelse.
- Vent et øjeblik, før du trækker nålen langsomt ud for at undgå tilbageløb.
FORSIGTIG: Du må ikke aspirere. - Brug en ny steril sprøjte til hvert dyr for at undgå kontaminering.
BEMÆRK: Ved injektion af en klar opløsning skal venen dreje et øjeblik klar.
5. Pleje efter injektion
- Anbring hvalpen i restitutionsboksen, der hviler på en beskyttet opvarmningsanordning (35-37 °C).
- Vent på genopretningen, og kontroller for tegn på nød, før du returnerer hvalpen til dæmningen.
BEMÆRK: Farvestofinjicerede praksisdyr skal straks aflives i henhold til IACUC-godkendte protokoller.
FORSIGTIG: Hvis øjet hæver under injektionen, betyder det, at nålen ikke indsættes i venøs plex og i stedet er i øjets kredsløb. Den neonatale kraniet er meget blød, hvis nålen perforerer den, vil injektionen gå ind i meninges eller endda hjernens parenchyma.
Representative Results
Den nuværende teknik blev udført på en plan overflade med et mundstykke til global anæstesi (figur 1A). Mundstykket må ikke blokere adgangen til den mediale canthus (figur 1B). Hos albinodyr blev en fiberoptisk lyskilde placeret under dyret for at hjælpe med visualiseringen af venerne (figur 1B). Nålen blev anbragt i en vinkel på ca. 40° og ført ca. 2 mm ind i den mediale canthus (figur 1C). Injektion af trypanblåt farvestof i en P5 albino rotte tillod klar visualisering af farvestoffet i retroorbital sinus (figur 1C).
Den retroorbitale injektionsteknik, der er beskrevet i denne protokol, blev med succes anvendt til administration af sporstofbiotin-dextran (BDA, 10.000 Da)12. Brugen af synlige sporstoffer i vaskulær forskning kan f.eks. være et alternativ til at anvende radioaktiv saccharoseekstravasation fra blodkarrene, hvilket gør det muligt at anvende de samme hjerner til andre histologiske målinger12.
For nylig har vi etableret en neonatal rottemodel af germinal matrixblødning (GMH)13. Kort fortalt fik P5 Wistar-rotter en enkelt intrakraniel injektion på 0,3 E collagenase VII i medial striatum. GMH resulterer i brud på karrene i kimmatrixen og er en af de fremherskende årsager til for tidlig hjerneskade og dødelighed14. For yderligere at karakterisere GMH-modellen brugte vi en retroorbital injektion af BDA-sporstoffet (figur 2) til at undersøge virkningerne af GMH i blod-hjerne-barrierefunktion og integritet14.
Sammenlignet med saltvandsinjicerede kontroller (figur 2A) muliggjorde vellykket retroorbital injektion af BDA-sporstof14 vurdering af sporstoftilstedeværelsen i hjernevaskulaturen 10 minutter efter BDA-injektion (figur 2B). Denne teknik blev derefter brugt til at detektere penumbra vaskulær lækage af BDA på det individuelle blodkarniveau hos GMH-skadede dyr (figur 2C, røde pile), som derefter kan kvantificeres10.
Figur 1: Eksperimentel opsætning med diagramvisning af blodkarrene efter administration af trypanblåt farvestof. (A) Anæstesiopsætning (B) uden og (C) med fiberoptisk lyskilde. D) Retroorbital injektion af trypanblåt farvestof i P10 C5BL/6-musen. E) Diagram over blodkarrene i P5 Wistar-rotten efter injektion af trypanblåt farvestof. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative hjernemikrografier, der viser fordelingen af BDA-sporstoffet. (A) Ingen positiv plet hos kontroldyr med saltvandsindsprøjtning. (B) BDA-sporstof opløst i saltvand i en dosiskoncentration på 2,0-2,5 mg pr. dyr var synlig i blodkarrene i hjernen (cortex). (C) BDA-sporstof, der lækker ind i hjernens parenkym efter GMH (røde pile). Skalabjælke = 200 μm. Tilpasset fra Andersson et al., 202114. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Denne protokol giver en klar og præcis metode til injektion af stoffer i retroorbital sinus hos nyfødte mus og rotter. Dette er vigtigt, fordi det viser, at retroorbitale injektioner kan udføres pålideligt og reproducerbart hos gnavere ældre end P2, hvor den overfladiske temporale/ansigtsvene ikke længere kan ses, og hos dyr yngre end P12, hvor øjenlågene endnu ikke har åbnet sig, og øjeæblet ikke er eksponeret. Desuden tolereres den neonatale retroorbitale injektion godt af både hvalpe og mødre med minimal risiko for bivirkninger, når teknikken er mestret.
Injektioner via iv har en fordel i forhold til andre administrationsveje, da de giver mulighed for injektion med høj koncentration samt både lav og høj pH, forudsat at injektionshastigheden holdes konstant og lav for at undgå brud på beholderen. Desuden giver iv-injektioner mulighed for hurtigere distribution af forbindelser, da de kommer direkte ind i det systemiske kredsløb og dermed omgår potentielle forsinkelser fra dårlig absorption observeret i andre administrationsveje. Dette giver mulighed for øjeblikkelig adgang og næsten 100% biotilgængelighed af forbindelser.
Klinisk iv er den foretrukne administrationsvej hos nyfødte (< 28 dage). Dette gælder især i neonatal intensivpleje, da iv-kanylering giver nem adgang til at give medicin / væsker. Injektioner via SC-vejen er blevet anvendt til nyfødte, især til administration af erythropoietin15. Imidlertid er der blevet rejst bekymringer, med en undersøgelse, der tyder på iv-infusion som et overlegent alternativ16. Oral administration er ikke ofte en praktisk mulighed, når nyfødte er i en hospitalsintensiv enhedsindstilling. Derudover har nyfødte sammenlignet med voksne forskelle i deres mave-tarmkanal, herunder forsinket gastrisk tømning og nedsat tarmmotilitet, som kan påvirke lægemiddelabsorptionen. Intramuskulære injektioner er vanskelige at administrere på grund af den lille muskelmasse af nyfødte 3,4.
I gnaverforskning er en af de mest anvendte metoder til iv-injektioner haleveneinjektionen. Denne metode er imidlertid uigennemtrængelig, når man arbejder med nyfødte. Andre iv-steder såsom den overfladiske temporale/ansigtsvene6 bliver usynlige ved P3. Neonatal tværgående sinus er blevet beskrevet i en undersøgelse og blev udført ved P0-P1 og ved hjælp af et mikroskop åbning af huden og fremrykning af en kapillær nål gennem kraniet ind i den tværgående sinus, hvilket tillod 2-4 μl volumeninjektioner7. Få studier har dokumenteret brugen af den ydre halsvene ved P7 hos rotter17. Dette er imidlertid en invasiv teknik, der kræver kirurgisk åbning af huden og eksponering af den ydre halsvene18. I undersøgelser med voksne gnavere har retroorbital administration vist sig at være lige så effektiv som haleveneinjektion5 , hvilket styrker levedygtigheden og relevansen af den retroorbitale vej. Den retroorbitale injektion forårsager minimal nød, og når den er mestret, kan den udføres af en enkelt person med minimalt udstyr og tillader flere injektioner (hvilket sikrer, at øjnene skiftes). Tidligere undersøgelser har vist, at retroorbital injektion er blevet anvendt til administration af adenoassocieret virus 9 hos mus ved P0-P1 eller ved P14-P2111 eller FITC-dextran ved P1719 , hvilket indikerer en stigende accept af denne metode.
Der er nogle begrænsninger forbundet med retroorbital injektion hos nyfødte. Som med alle iv-injektioner er det injicerede volumen begrænset, og vi anbefaler 5 μL/g til denne procedure. Derudover kræver retroorbital injektion fuld kropsbedøvelse. For at minimere komplikationer foreslås det at anvende inhalerede anæstesimidler såsom isofluran, da disse er hurtigere i anæstesiinduktion, har hurtig metabolisme og har en hurtig genopretningshastighed. Træning er påkrævet, helst ved hjælp af farvet farvestof hos terminalt bedøvede dyr, for at undgå potentiel hævelse omkring injektionsstedet eller øjentraumer på grund af forkert placering af nåleskråningen. På grund af disse dyrs lille størrelse kræves finere nåle med lille nålemåler. Injektion af celler skal udføres i enkeltcellesuspension for at undgå blokering af kar og for at sikre cellelevedygtighed. Opmuntrende nok har en undersøgelse foretaget af Amer og kolleger vist, at injektion af pattedyrceller ved hjælp af 30 G sprøjter stadig giver pålidelig cellelevedygtighed selv ved høj celletæthedudstødning 20.
Sammenfattende er etablering af en pålidelig iv-vej hos nyfødte af klinisk betydning, da dette er den foretrukne administrationsvej hos mennesker. Den retroorbitale injektion kan let mestres, er reproducerbar og giver et relevant alternativ til andre iv-injektionssteder, såsom hale og temporal/ansigtsvene, som ikke kan anvendes pålideligt i hele gnaverens neonatale periode. Således tillader den neonatale retroorbitale injektion levering af lægemidler, celler og andre forbindelser i passende neonatale aldre.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt med hensyn til forskning, forfatterskab eller offentliggørelse af denne protokol.
Acknowledgments
Arbejdet udført i denne protokol blev finansieret af Hasselblad Foundation (2020-2021, ERF), Åke Wibergs Foundation (M19-0660, ERF), Swedish Research Council (2019-01320, HH; 2021-01872, CM), Public Health Service på Sahlgrenska University Hospital (ALFGBG-965174, HH ; ALFGBG-966107, CM), The Swedish Brain Foundation (FO2022-0110, CM), Åhlen Foundation (223005, CM) og Horizon 2020 Framework Program of European Union (tilskudsaftale nr. 87472/PREMSTEM, HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
References
- Laughon, M. M., et al. Drug labeling and exposure in neonates. JAMA Pediatr. 168 (2), 130-136 (2014).
- Das, A., et al. Methodological issues in the design and analyses of neonatal research studies: Experience of the nichd neonatal research network. Semin Perinatol. 40 (6), 374-384 (2016).
- Ku, L. C., Smith, P. B. Dosing in neonates: Special considerations in physiology and trial design. Pediatr Res. 77 (1-1), 2-9 (2015).
- Linakis, M. W., et al. Challenges associated with route of administration in neonatal drug delivery. Clin Pharmacokinet. 55 (2), 185-196 (2016).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D.
- Hamodi, A. S., Martinez Sabino, A., Fitzgerald, N. D., Moschou, D., Crair, M. C. Transverse sinus injections drive robust whole-brain expression of transgenes. Elife. 9, 53639 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Kilkenny, C., et al. Animal research: Reporting in vivo experiments: The arrive guidelines). Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).
- Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. Aav9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Exp Anim. 70 (4), 450-458 (2021).
- Ek, C. J., Habgood, M. D., Dziegielewska, K. M., Potter, A., Saunders, N. R. Permeability and route of entry for lipid-insoluble molecules across brain barriers in developing monodelphis domestica. J Physiol. 536, 841-853 (2001).
- Jinnai, M., et al. A model of germinal matrix hemorrhage in preterm rat pups). Front Cell Neurosci. 14, 535320 (2020).
- Andersson, E. A., Rocha-Ferreira, E., Hagberg, H., Mallard, C., Ek, C. J. Function and biomarkers of the blood-brain barrier in a neonatal germinal matrix haemorrhage model. Cells. 10 (7), (2021).
- Ohls, R. K., et al. Effects of early erythropoietin therapy on the transfusion requirements of preterm infants below 1250 grams birth weight: A multicenter, randomized, controlled trial. Pediatrics. 108 (4), 934-942 (2001).
- Costa, S., et al. How to administrate erythropoietin, intravenous or subcutaneous. Acta Paediatr. 102 (6), 579-583 (2013).
- Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
- Sugiyama, Y., et al. Intravenous administration of bone marrow-derived mesenchymal stem cell, but not adipose tissue-derived stem cell, ameliorated the neonatal hypoxic-ischemic brain injury by changing cerebral inflammatory state in rat. Front Neurol. 9, 757 (2018).
- Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. J Pharm Pharmacol. 67 (5), 640-650 (2015).
