Summary
Este protocolo tiene como objetivo demostrar una vía de administración venosa reproducible que pueda ser utilizada en ratas y ratones durante todo el período neonatal. Este procedimiento es importante para los estudios preclínicos en roedores que desean reflejar la administración de fármacos en las unidades de cuidados neonatales, principalmente mediante la administración intravenosa.
Abstract
La inyección intravenosa (iv) es la vía de administración de fármacos más utilizada en neonatos en el ámbito clínico. Por lo tanto, la inyección venosa retroorbitaria es un método importante para la administración de compuestos en la investigación, donde los estudios exitosos de prueba de concepto pueden convertirse en ensayos clínicos neonatales muy necesarios. La mayoría de los estudios intravenosos en roedores neonatos utilizan la vena temporal/facial superficial. Sin embargo, la inyección retroorbitaria se vuelve poco confiable en roedores neonatos mayores de 2 días después de que la piel se oscurece y la vena ya no es visible. En el presente protocolo, describimos la inyección retroorbitaria del seno venoso tanto en el ratón neonatal como en la rata a edades en las que la vena temporal superficial ya no es visible, pero los ojos aún no se han abierto. La apertura de los ojos facilita la inyección retroorbitaria al permitir al investigador ver claramente que no está perforando el ojo al insertar la aguja. Demostramos que esta técnica se puede realizar de forma fiable y reproducible sin efectos adversos. Además, demostramos que se puede utilizar en muchos estudios, como la administración de compuestos para estudiar la lesión cerebral neonatal.
Introduction
La investigación con animales es un paso esencial que conduce a los ensayos clínicos y, como tal, es importante que los estudios con animales imiten de cerca los procedimientos y tratamientos realizados en el entorno clínico. Sin embargo, existen varios desafíos en la traducción de las prácticas clínicas a los estudios neonatos en roedores. Entre otros, se encuentran el pequeño tamaño del roedor neonatal y la brecha en la investigación y el conocimiento neonatal en comparación con la investigación en adultos, entre otros 1,2.
La administración de diferentes sustancias, como fármacos o células, puede realizarse por múltiples vías, incluidas las inyecciones intraperitoneales (ip), subcutáneas (sc) e intravenosas (iv). La inyección por vía intravenosa es la vía preferente de administración de compuestos en neonatos humanos. En neonatos, la vía de administración intravenosa es ventajosa en comparación con otras vías, ya que maximiza la distribución sistémica de los fármacos y tiene una alta biodisponibilidad 3,4. Se puede utilizar una vía intravenosa bien mantenida para la administración repetida del fármaco. En estudios con roedores, las inyecciones intravenosas deben realizarse en la cola, las venas faciales/temporales o en el seno retroorbitario5. La inyección en la vena de la cola se utiliza de forma rutinaria en roedores adultos, ya que proporciona dos venas laterales caudales paralelas para elegir5. Sin embargo, estas venas tienen un diámetro pequeño, lo que excluye su uso en neonatos. La mayoría de las inyecciones intravenosas neonatales se han realizado en la vena superficial facial/temporal, ya que es visible desde el día postnatal 0 (P0)-P2 y permite una administración de volumen relativamente grande5. Sin embargo, esta ruta se vuelve poco confiable alrededor de P36 una vez que el animal adquiere coloración de la piel, lo que dificulta la visión superficial de la vena facial/temporal con el ojo sin ayuda. La administración iv a través del seno transverso neonatal ha sido descrita en un estudio7; sin embargo, esto requiere abrir la piel por encima del seno transverso e inyectar AAV9 en P0-P1 con la ayuda de un microscopio.
Al investigar un posible tratamiento o establecer un modelo de lesión neonatal relevante, es importante tener en cuenta que los roedores neonatos pueden tener un tiempo de desarrollo de órganos diferente en comparación con los humanos. Nuestro protocolo se basa en las diferencias en el desarrollo del sistema nervioso central neonatal entre humanos y roedores. Por ejemplo, el término cerebro humano recién nacido corresponde aproximadamente a una rata P7 y a un cerebro de ratón P108. Dado que la distribución de las sustancias inyectadas por vía retroorbital es similar a la de los otros sitios intravenosos, con niveles elevados en sangre que se alcanzan rápidamente, consideramos que es una vía adecuada. Esta técnica ha sido bien descrita por Yardeni y sus colegas, quienes inyectaron compuestos en el seno venoso oftálmico en ratones P1-P29. En el protocolo actual, mostramos un método simple y factible para realizar inyecciones retroorbitarias en roedores neonatos mayores que aún no han abierto los ojos.
Protocol
Todos los procedimientos enumerados en este protocolo se ajustan a la Junta de Agricultura de Suecia y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de Gotemburgo (825-2017 y 2195-19). Los ratones C57BL/6 y las ratas Wistar se criaron en casa con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y libre acceso a alimentos y agua. Todos los procedimientos experimentales siguieron las directrices ARRIVE10.
1. Configuración del espacio de trabajo
- Durante este procedimiento, recoja los animales de experimentación de la jaula de la madre y colóquelos en una jaula separada sobre una almohadilla térmica (35-37 °C).
NOTA: Si se utiliza una fuente de luz (animales albinos), se debe utilizar una fuente de luz sin calor que pueda colocarse debajo de la cabeza del animal.
2. Aguja y solución
- Utilice una aguja con 29-31 G (alrededor de 0,30 mm).
- Para obtener volúmenes precisos, extraiga la solución que se va a inyectar a partir de un volumen pipeteado.
NOTA: Se debe inyectar un máximo de 5 μL/g de peso corporal en cada seno retroorbitario.
3. Configuración
- Coloque a los animales sobre una superficie plana (Figura 1A) en decúbito lateral (Figura 1C).
- Inducir anestesia de isoflurano en todo el cuerpo (5% de inducción, 3% de mantenimiento).
NOTA: Los animales deben ser anestesiados con una boquilla. El párpado y el área del conducto lagrimal no deben cubrirse (Figura 1D). - Verifique la profundidad de la anestesia usando el método del reflejo de retirada de la pata.
NOTA: No se requiere analgesia preoperatoria, ya que no se considera un procedimiento invasivo11.
4. Procedimiento de inyección
NOTA: Si es posible, utilice una fuente de luz debajo de la cabeza del animal (Figura 1C), para facilitar la visión del seno venoso (Figura 1E). No es necesario esterilizar el área que se está inyectando, ya que el párpado aún está cerrado.
- Con la cabeza hacia la derecha, administre la inyección en el seno retroorbitario derecho (ejemplo de operador diestro).
- Inserte la aguja, biselada hacia abajo, en la parte delantera de la cuenca del ojo, el equivalente al canto medial, en un ángulo de aproximadamente 40°. Este ángulo permite que la aguja se dirija a la parte posterior de la órbita del ojo.
- Avance 1/3 de la aguja (alrededor de 2 mm) en el área del seno retroorbitario ubicado detrás de la órbita del ojo.
- Inyecte con un movimiento suave, suave y fluido.
- Espere un momento antes de retirar la aguja lentamente para evitar el reflujo.
PRECAUCIÓN: No aspirar. - Utilice una jeringa estéril nueva para cada animal para evitar la contaminación.
NOTA: Al inyectar una solución transparente, la vena debe aclararse momentáneamente.
5. Cuidados posteriores a la inyección
- Coloque al cachorro en la caja de recuperación, apoyado sobre un dispositivo de calentamiento protegido (35-37 °C).
- Espere a que se recupere y verifique si hay signos de angustia antes de devolver al cachorro a la madre.
NOTA: Los animales de práctica inyectados con tinte deben ser sacrificados inmediatamente según los protocolos aprobados por la IACUC.
PRECAUCIÓN: Si el ojo se hincha durante la inyección, significa que la aguja no se inserta en el plexo venoso y, en cambio, está en la órbita del ojo. El cráneo neonatal es muy blando, si la aguja lo perfora, entonces la inyección irá a las meninges o incluso al parénquima cerebral.
Representative Results
La presente técnica se realizó sobre una superficie plana, con una boquilla para anestesia global (Figura 1A). La boquilla no debe bloquear el acceso al canto medial (Figura 1B). En animales albinos, se colocó una fuente de luz de fibra óptica debajo del animal, para ayudar con la visualización de las venas (Figura 1B). La aguja se colocó en un ángulo de aproximadamente 40° y avanzó alrededor de 2 mm en el canto medial (Figura 1C). La inyección de colorante azul de tripano en una rata albina P5 permitió una visualización clara del colorante en el seno retroorbitario (Figura 1C).
La técnica de inyección retroorbitaria descrita en este protocolo se utilizó con éxito para administrar el trazador biotina-dextrano (BDA, 10.000 Da)12. El uso de trazadores visibles en la investigación vascular puede, por ejemplo, proporcionar una alternativa al uso de la extravasación radiactiva de sacarosa de los vasos sanguíneos, permitiendo el uso de los mismos cerebros para otras mediciones histológicas12.
Recientemente, hemos establecido un modelo de hemorragia de matriz germinal (GMH) en ratas neonatas13. En resumen, las ratas P5 Wistar recibieron una única inyección intracraneal de 0,3 U de colagenasa VII en el cuerpo estriado medial. La GMH provoca la ruptura de los vasos de la matriz germinal y es una de las causas prevalentes de lesión cerebral prematura y mortalidad14. Para caracterizar aún más el modelo de GMH, utilizamos una inyección retroorbitaria del trazador BDA (Figura 2) para investigar los efectos de GMH en la función e integridad de la barrera hematoencefálica14.
En comparación con los controles inyectados con solución salina (Figura 2A), la inyección retroorbitaria exitosa del marcador14 de BDA permitió evaluar la presencia del marcador en la vasculatura cerebral 10 minutos después de la inyección de BDA (Figura 2B). Esta técnica se utilizó para detectar la fuga vascular de BDA en penumbra a nivel de los vasos sanguíneos individuales en animales lesionados por GMH (Figura 2C, flechas rojas) que luego se puede cuantificar10.
Figura 1: Configuración experimental con vista de diagrama de los vasos sanguíneos después de la administración del colorante azul de tripano. (A) Configuración de anestesia (B) sin y (C) con fuente de luz de fibra óptica. (D) Inyección retroorbitaria de colorante azul de tripano en el ratón P10 C5BL/6. (E) Vista del diagrama de los vasos sanguíneos en la rata P5 Wistar después de la inyección de tinte azul de tripano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Micrografías cerebrales representativas que muestran la distribución del trazador BDA. (A) No hay tinción positiva en animales control inyectados con solución salina. (B) El trazador de BDA disuelto en solución salina, a una concentración de dosis de 2,0 - 2,5 mg por animal fue visible dentro de los vasos sanguíneos del cerebro (corteza). (C) Marcador de BDA que se filtra en el parénquima cerebral después de GMH (flechas rojas). Barra de escala = 200 μm. Adaptado de Andersson et al., 202114. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este protocolo proporciona un método claro y preciso para la inyección de sustancias en el seno retroorbitario de ratones y ratas neonatos. Esto es importante porque demuestra que las inyecciones retroorbitarias pueden realizarse de forma fiable y reproducible en roedores de más de P2, en los que la vena temporal/facial superficial ya no es discernible, y en animales menores de P12, en los que los párpados aún no se han abierto y el globo ocular no está expuesto. Además, la inyección retroorbitaria neonatal es bien tolerada tanto por las crías como por las madres, con riesgos mínimos de efectos secundarios una vez que se ha dominado la técnica.
Las inyecciones por vía intravenosa tienen una ventaja sobre otras vías de administración, ya que permiten la inyección de alta concentración, así como de pH bajo y alto, siempre que la tasa de inyección se mantenga constante y baja para evitar la ruptura del vaso. Además, las inyecciones intravenosas permiten una distribución más rápida de los compuestos, ya que entran directamente en la circulación sistémica, evitando así los posibles retrasos por mala absorción observados en otras vías de administración. Esto permite un acceso inmediato y una biodisponibilidad de casi el 100% de los compuestos.
Clínicamente, la vía de administración iv es la vía de administración preferida en neonatos (< 28 días de edad). Esto es especialmente cierto en entornos de cuidados intensivos neonatales, ya que la canulación intravenosa permite un fácil acceso para proporcionar medicamentos/líquidos. Las inyecciones por vía sc se han utilizado de alguna manera en neonatos, particularmente para la administración de eritropoyetina15. Sin embargo, se han planteado preocupaciones, con un estudio que sugiere la infusión intravenosa como una alternativa superior16. La administración oral no suele ser una opción práctica cuando los neonatos se encuentran en una unidad de cuidados intensivos hospitalarios. Además, en comparación con los adultos, los neonatos tienen diferencias en su tracto gastrointestinal, incluido el retraso en el vaciamiento gástrico y la disminución de la motilidad intestinal, lo que puede afectar la absorción del fármaco. Las inyecciones intramusculares son difíciles de administrar debido a la pequeña masa muscular de los neonatos 3,4.
En la investigación con roedores, uno de los métodos más utilizados de inyecciones intravenosas es la inyección en la vena de la cola. Sin embargo, este método es inviable cuando se trabaja con neonatos. Otros sitios intravenosos, como la vena superficial temporal/facial6 , se vuelven invisibles en P3. El seno transverso neonatal ha sido descrito en un estudio y se realizó en P0-P1 y, con la ayuda de un microscopio, se abrió la piel y se hizo avanzar una aguja capilar a través del cráneo hasta el seno transverso, permitiendo inyecciones de 2-4 μl de volumen7. Pocos estudios han documentado el uso de la vena yugular externa en P7 en ratas17. Sin embargo, esta es una técnica invasiva que requiere la apertura quirúrgica de la piel y la exposición de la vena yugular externa18. En estudios en roedores adultos, se ha demostrado que la administración retroorbitaria es tan eficaz como la inyección en la vena de la cola5 , reforzando así la viabilidad y relevancia de la vía retroorbitaria. La inyección retroorbitaria causa un sufrimiento mínimo y, una vez dominada, puede ser realizada por una sola persona con un equipo mínimo y permite múltiples inyecciones (asegurando que los ojos se alternen). Estudios previos han demostrado que la inyección retroorbitaria se ha utilizado para administrar el virus adenoasociado 9 en ratones en P0-P1 o en P14-P2111 o FITC-dextrano en P1719 , lo que indica una creciente aceptación de este método.
Existen algunas limitaciones asociadas con la inyección retroorbitaria en neonatos. Al igual que con todas las inyecciones intravenosas, el volumen inyectado es limitado y recomendamos 5 μL/g para este procedimiento. Además, la inyección retroorbitaria requiere anestesia en todo el cuerpo. Para minimizar las complicaciones, se sugiere el uso de agentes anestésicos inhalados como el isoflurano, ya que estos son más rápidos en la inducción anestésica, tienen un metabolismo rápido y tienen una tasa de recuperación rápida. Se requiere entrenamiento, preferiblemente con colorante en animales anestesiados terminalmente, para evitar una posible hinchazón alrededor del lugar de la inyección o un traumatismo ocular debido a la colocación incorrecta del bisel de la aguja. Debido al pequeño tamaño de estos animales, se requieren agujas más finas, con un calibre de aguja pequeño. La inyección de células debe realizarse en suspensión unicelular, para evitar la obstrucción de los vasos y garantizar la viabilidad celular. De manera alentadora, un estudio realizado por Amer y sus colegas ha demostrado que la inyección de células de mamíferos utilizando jeringas de 30 G todavía proporciona una viabilidad celular confiable incluso con una eyección de alta densidad celular20.
En resumen, el establecimiento de una vía intravenosa fiable en neonatos es de importancia clínica, ya que es la vía de administración preferida en humanos. La inyección retroorbitaria se puede dominar fácilmente, es reproducible y proporciona una alternativa relevante a otros sitios de inyección intravenosa, como la cola y la vena temporal/facial, que no se pueden usar de manera confiable durante todo el período neonatal de roedores. Por lo tanto, la inyección retroorbitaria neonatal permite la administración de fármacos, células y otros compuestos a edades neonatales adecuadas.
Disclosures
Los autores declaran que no existe conflicto de intereses con respecto a la investigación, autoría o publicación de este protocolo.
Acknowledgments
El trabajo realizado en este protocolo fue financiado por la Fundación Hasselblad (2020-2021, ERF), la Fundación Åke Wibergs (M19-0660, ERF), el Consejo Sueco de Investigación (2019-01320, HH; 2021-01872, CM), el Servicio de Salud Pública del Hospital Universitario Sahlgrenska (ALFGBG-965174, HH ; ALFGBG-966107, CM), la Fundación Sueca del Cerebro (FO2022-0110, CM), la Fundación Åhlen (223005, CM) y el Programa Marco Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención n.º 87472/PREMSTEM, HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Micro-Fine Demi 0,3 ml 30G (0,30mm) | BD | 256370 | 1 per animal per injection |
| Biotin-dextran (BDA) tracer | ThermoFischer | D1956 | 2.0-2.5 mg per animal |
| Fiber optic light source | Euromex | ||
| HP 062 Heating Plate | Labotect | ||
| Isoflurane | Vetmedic | Vnr 17 05 79 | |
| Tryptan blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | 5 μl/ g body weight |
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