Summary
Realtidsanalyse af levende væv giver vigtige funktionelle og mekanistiske data. Dette papir beskriver protokoller og kritiske variabler for at sikre nøjagtig og reproducerbar generering af data ved hjælp af et nyt og pumpefrit flerkanals fluidiksystem, der vedligeholder og vurderer en bred vifte af vævs- og cellemodeller.
Abstract
Mange in vitro-modeller , der anvendes til at undersøge vævsfunktion og cellebiologi, kræver en strøm af medier for at give tilstrækkelig iltning og optimale cellebetingelser, der kræves for at opretholde funktion og levedygtighed. Til dette formål har vi udviklet et multikanals flowkultursystem til at opretholde væv og celler i kultur og løbende vurdere funktion og levedygtighed ved hjælp af enten in-line sensorer og/eller opsamling af udstrømningsfraktioner. Systemet kombinerer 8-kanals, kontinuerlig optisk sensing af iltforbrugshastigheden med en indbygget fraktionssamler for samtidig at måle produktionshastigheder af metabolitter og hormonsekretion. Selvom det er i stand til at opretholde og vurdere en bred vifte af vævs- og cellemodeller, herunder øer, muskler og hypothalamus, beskriver vi her dets driftsprincipper og de eksperimentelle præparater / protokoller, som vi har brugt til at undersøge bioenergetisk regulering af isoleret musenethinden, musens retinale pigmentepitel (RPE) -choroid-sclera og dyrkede humane RPE-celler. Innovationer i designet af systemet, såsom pumpeløs væskestrøm, har produceret en stærkt forenklet drift af et flerkanals flowsystem. Der vises videoer og billeder, der illustrerer, hvordan man samler, forbereder instrumentet til et eksperiment og indlæser de forskellige væv/cellemodeller i perifusionskamrene. Derudover afgrænses og diskuteres retningslinjer for udvælgelse af betingelser for protokol- og vævsspecifikke eksperimenter, herunder fastsættelse af det korrekte flowforhold mellem hastighed og væv for at opnå konsistente og stabile dyrkningsbetingelser og nøjagtige bestemmelser af forbrug og produktionshastigheder. Kombinationen af optimal vævsvedligeholdelse og realtidsvurdering af flere parametre giver meget informative datasæt, der vil have stor nytte til forskning i øjets fysiologi og lægemiddelopdagelse til behandling af nedsat syn.
Introduction
Perifusionssystemer har en lang historie inden for biovidenskab. Især til undersøgelse af sekretorisk funktion af øer er de blevet brugt til at karakterisere kinetikken af insulinsekretion som reaktion på sekretagoger1. Ud over at indsamle udstrømningsfraktioner til efterfølgende analyse af hormoner og metabolitter er der indbygget realtidssensorer, overvejende til påvisning af iltforbrug 2,3,4. Udbredte bestræbelser på bedre at forstå mekanismer, der medierer sygdomme i øjet, har været begrænset af mangel på fysiologisk relevante metoder til vurdering af metabolisk regulering og dysregulering af de forskellige isolerede komponenter i øjet, herunder nethinden, retinal pigmentepitel (RPE)-choroid-sclera og dyrkede RPE-celler. Statiske systemer designet til dyrkede celler er blevet tilpasset væv5, men væv kræver flow for tilstrækkelig iltning. Flowsystemer har haft succes med nøjagtigt og reproducerbart at måle realtidsresponser i iltforbrugshastighed (OCR) ved nethinden og RPE-choroid-sclera, og vævene forbliver metabolisk stabile i mere end 8 timer, hvilket muliggør meget informative protokoller, der involverer flere testforbindelser 4,6,7,8,9 . Ikke desto mindre har driften af fluidiksystemer historisk krævet et specialfremstillet apparat og uddannet teknisk personale i ikke-standardiserede metoder. Sådanne systemer er ikke blevet vedtaget som standardmetode i de fleste laboratorier. BaroFuse er et nyudviklet fluidiksystem, der ikke er afhængig af pumper, men snarere af gastryk for at drive flow gennem flere kanaler og vævskamre (figur 1). Hver kanal overvåges kontinuerligt for OCR, og udstrømningen opsamles med en pladebaseret fraktionssamler til efterfølgende analyse af indholdet. Det er vigtigt, at vævsperifusionskamrene til instrumentet er designet til at rumme væv af forskellige geometrier og størrelser.
Hjertet i instrumentet er fluidiksystemet, hvor strømmen drives fra et forseglet, trykreservoir gennem små slanger med indre diameter (ID) (der bidrager med den mest betydningsfulde strømningsmodstand i væskekredsløbet) op i glasvævskamrene, der huser vævet. Trykket til mediebeholdermodulet (MRM) leveres af lavtryks- og højtryksregulatorer, der er forbundet til en gasflaske, der indeholder en blanding af gasser (typisk 21%O2, 5% CO 2, balance N2), og reservoiret forsegles ovenfra af perifusionskammermodulet (PCM), der holder vævskammersamlingerne (TCA'er). Strømningshastigheden styres af modstandsrørenes længde og ID og trykindstillingen for en lavtryksregulator. Udstrømningsrør, der er forbundet til toppen af vævskamre, leverer væske til enten en affaldsbeholder (der kontinuerligt vejes til automatisk bestemmelse af strømningshastighed) eller i brønde på en 96-brøndplade, der styres af fraktionsopsamleren. O2-detekteringssystemet måler levetiden for etO2-følsomt farvestof, der er malet på indersiden af hvert af glasvævskamrene nedstrøms for vævet. Disse oplysninger bruges derefter til løbende at beregne OCR. Hele fluidiksystemet befinder sig i et temperaturstyret kabinet, og gastanken, fraktionsopsamleren og computeren er instrumentets hovedkomponenter (figur 2A). Endelig tjener software, der kører instrumentet, til at kontrollere dets funktion (herunder forberedelse og timing af injicerede testforbindelser, flowmålingssystem og brøkkollektortiming) samt behandling og graftegning af OCR-data og andre supplerende målinger.
I dette papir beskriver vi protokollerne for brug af fluidiksystemet til perifuse og vurdere OCR og laktatproduktionshastighed (LPR) for forskellige isolerede komponenter i øjet. LPR er en parameter, der afspejler glykolytisk hastighed, der er meget komplementær til OCR, hvor parret tegner sig for de to hovedgrene af energigenerering fra kulhydrater i cellen10. Da forberedelse af vævet og indlæsning af det i vævskamrene bedst læres ved at se proceduren, hjælper videoen med at illustrere flere af de kritiske trin, der udføres under opsætning og drift, som ikke let formidles med tekst alene.
Beskrivelsen af protokollen er opdelt i 8 sektioner, der svarer til forskellige faser af eksperimentet (figur 2B): 1. præeksperimentel forberedelse; 2. forberedelse/ligevægt af perifusattet 3. oprettelse af et instrument 4. vævsligevægt 5. forsøgsprotokol 6. instrumentets nedbrydning 7. databehandling; og 8. analyser af udstrømningsfraktioner.
Protocol
Alle procedurer til høstning af væv fra rotter og mus blev godkendt af University of Washington Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Præeksperimentel forberedelse
BEMÆRK: Følgende opgaver udføres mindst en dag før eksperimentet.
- Design af den eksperimentelle protokol
- Tildeling af vævsplacering i kanaler: Vælg vævs- eller cellemodel, der skal placeres i 3 af de 4 kanaler på hver side af MRM. Et vævskammer på hver side køres uden væv, der skal bruges til baselinekorrektion.
- Arranger prøverne ved hjælp af et af de to typiske designs - forskellige testsammensætningsprotokoller på hver side (f.eks. Kanaler på den ene side af MRM modtager testforbindelser, mens kanalerne på den anden side fungerer som kontrol); samme injektionsprotokol for teststoffer på begge sider af MRM, men forskellige væv eller vævsmodel versus kontrol på begge sider af MRM.
- Valg af strømningshastighed og vævsmængde for optimal OCR-måling: Juster strømningshastigheden, indtil ændringen i levetidsforhold gange 100 er ca. 3.
BEMÆRK: Typiske vævsmængder og tilsvarende strømningshastigheder er vist i tabel 1 for komponenter i øjet, hvor instrumentet fungerer bedst ved strømningshastigheder mellem 6-80 μL/min/kanal. - Beregning af krævet medie-/buffervolumen: Det medievolumen, der skal tilsættes hver MRM-indsats ved forsøgets begyndelse, beregnes som
VolumenMRM = 30 ml + protokollens varighed (i min) x strømningshastighed (i ml/min) x 4 kanaler (eq.1)
For eksempel ved 0,01 ml / min vil en 60 ml startvolumen MRM tillade en 12,5 timers protokol (hvor 30 ml vil blive udtømt, mens 30 ml vil være tilbage), mens ved 0,04 ml / min vil 90 ml startvolumenMRM tillade en 6 timers protokol (med 30 ml tilbage). - Teststoffers injektionsprotokol: Vælg teststoffer, der skal vurderes, den koncentration, der skal testes (typisk valgt til at give næsten maksimal respons eller som koncentrationsafhængigheder) og eksponeringens varighed. Overvej opløselighed og fyld op i det ønskede opløsningsmiddel såsom vand, DMSO eller ethanol.
- Vælg tidspunktet for injektioner og efterfølgende injektioner, så responsen når en stabil tilstand, før der tilsættes et efterfølgende middel. Når du gentager protokoller, skal du matche tidspunktet for injektioner, så flere tidsforløb kan beregnes i gennemsnit.
BEMÆRK: De forbindelser, der anvendes her, er fra en tidligere mitokondriel (Mito) stresstest 11 , og både oligomycin og carbonylcyanid 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazon (FCCP) kræver DMSO både i stamopløsningerne såvel som det endelige perifusat. - Udstrømningsprøvetagningstider: Vælg de ønskede brøkindsamlingsintervaller (fra 1-60 min/prøve), hvor der vælges hurtigere prøvetagningshastigheder for hurtige ændringer, og længere tidsintervaller vælges, når steady state nærmer sig. Brug tilstrækkelige brøndmængder (0,3 til 1,5 ml) for at undgå overløb i prøvetagningsintervallet (vælg volumener, der er større end strømningshastigheden x tidsintervallet).
BEMÆRK: Prøvetagningstiderne varierer afhængigt af valg af protokol, men til en Mito-stresstest har vi almindeligvis brugt 5 minutters intervaller under baseline og 15 minutters intervaller under injektionerne (-15, -10, -5, 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, hvor hver gang er starten på prøveudtagningsintervallet). - Indtast de valgte værdier for teststoffer og fraktionsopsamling beskrevet ovenfor i brugergrænsefladen (UI), som genererer grafiske repræsentationer af disse oplysninger. Eksport og formidling af filer til gruppeevaluering og diskussioner (supplerende figur 1).
- Angiv tilbehør og forbrugsdele
- Angiv de forsyninger, der leveres og færdigpakkes aseptisk af producenten, og som omfatter: TCA'er (pakke med 8), udstrømningsslangesamlinger (pakke med 8 rør), injektionsslanger til testblandinger (2), tang, slangeklemmer (3), MRM, MRM-indsatser (2), omrøringsstænger (2) og renseslanger (anbragt i et biologisk sikkerhedsskab).
- Genbrug ikke engangsdele, der kommer i kontakt med væske, da dette vil føre til en stigning i eksperimentel fiasko. Genbrug tang og rørestænger ved at rengøre og autoklavere dem mellem eksperimenter.
2. Forberedelse og ligevægt af perifusat (tid: 30 min ekskl. inkubationstid)
- Dagen før fremstilles medie- eller Krebs-Ringer-bicarbonatbufferen (KRB) baseret på beregninger fra ligning 1, typisk 200 ml, og inkuberes derefter natten over i en 39 °C/5% CO2 -inkubator i T225 vævskulturkolber med højst 90 ml i hver kolbe.
- Hvis du bruger kommercielt fremstillet KRB eller medier (opvarmet til stuetemperatur), skal du forberede perifusatet om morgenen af eksperimentet og placere i 5% CO2 -inkubatoren i mindst 1 time. Forbered alle opløsninger aseptisk.
BEMÆRK: Alle væsker og dele af fluidiksystemet, der kommer i kontakt med væske, er sterile ved forsøgets begyndelse. Imidlertid udføres samling af systemet og indlæsning af vævet åbent for luften.
3. Ligevægt mellem temperatur og opløst gas for at opsætte instrumentet (Tid: 75 min)
- Fastgørelse af slangeenheder til MRM
- Placer MRM og en fluidikpakke på bænken ved siden af instrumentet. Sørg for, at slangeklemmerne (3), rørstængerne (2) og pincetten allerede sidder på værktøjsbakken.
- Anbring en ubrugt MRM-indsats med en omrøringsstang i hver side af MRM (se figur 3).
- Sæt TCA'erne på injektionsportene i begge ender af MRM, så enden af slangen er placeret direkte over omrøringsstangen. Sørg for, at den længste af de to injektionsenheder med testblanding er på bagsiden af MRM'en.
- Fastgør derefter gasindstrømningsfødeledningen og renserørsenheden til henholdsvis de bageste og forreste ledige porte (se figur 4A).
- Anbringelse af MRM-/slangeenhederne i prøvelokalet
- MRM (med slangeenhederne monteret) anbringes i MRM-varmeapparatet (figur 4B).
- Placer de fire rørsamlinger i rillerne på væggene i bunden af kabinettet (to på hver side), så de stikker igennem til ydersiden af kabinettet, når det midterste kabinet er sat på plads.
- Fastgør MRM mellem klemmerne ved at stramme de to hjul på detektorstativet.
- Den længere injektionsenhed til testblandingen, der stikker ud fra bagsiden af prøvelokalet, føres gennem de to rørstyr på siden af prøvelokalet, så åbningen af glassene vender fremad (figur 4C).
- Klem hver af de lukkede injektionsaggregater til testblandingen.
- Montering af kabinettet og aktivering af temperaturregulatorerne
- Skift strømstikket, der leverer strøm til alle de elektriske enheder i kabinettet, til ON-position. Ventilatoren på detektorstativet tændes, og MRM-temperaturregulatoren skal lyse og vise en indstillet værdi på 38 °C (figur 5).
- Tænd omrørerne til 70 o / min ved hjælp af brugergrænsefladen for at sikre, at omrøringsstængerne roterer jævnt. Når korrekt omrøring er observeret, skal du slukke for omrørerne.
- Placer den midterste del af kabinettet oven på bunden.
- Tilslut kablet på den midterste del af kabinettet til kablet fra den elektriske boks for at aktivere strøm til kontakten til omgivelsestemperaturregulatorens håndtag og levere strøm til omgivelsestemperaturvarmeren.
- Placer låget på kabinettet, og displayet på den øvre temperaturregulator (omgivelsestemperaturregulatoren) lyser og læser 36 °C. Start en timer i 30 minutter, den tid det tager for MRM-varmeren at nå indstillet punkttemperatur.
- Indsættelse af TCA'erne i PCM
- Brug TCA-indføringsværktøjet til at indsætte hver af de 8 TCA'er i PCM-hullerne ved at trykke hårdt på adapteren med forsiden af indføringsværktøjet, indtil toppen af slangebøsningen, der er viklet rundt om vævskammeret, berører overfladen, der omskriver hullerne i PCM.
- Indsæt en TCA helt, før du indsætter den næste. Sæt den delvist samlede PCM til side ved siden af PCM-bøjlen og 6 skruer.
BEMÆRK: Ufuldstændig indsættelse af en TCA forhindrer hovedrummet i at nå tryksætpunktet, og perifusat flyder ikke.
- Fyldning af de to indsatser i MRM med præekvilibreret perifusat
- For at gøre dette skal du 30 minutter efter, at kabinettet er samlet, og MRM har nået temperaturen, overføre det præekvilibrerede perifusat til det forvarmede MRM-skær ved forsigtigt at dispensere væsken ned ad siderne ved hjælp af en 50 ml pipette.
BEMÆRK: Disse trin såvel som dem i punkt 3.6 skal udføres straks for at undgå overførsel af gas mellem perifusatet i MRM og atmosfæren.
- For at gøre dette skal du 30 minutter efter, at kabinettet er samlet, og MRM har nået temperaturen, overføre det præekvilibrerede perifusat til det forvarmede MRM-skær ved forsigtigt at dispensere væsken ned ad siderne ved hjælp af en 50 ml pipette.
- Montering af MRM/PCM for at skabe en gastæt forsegling og placering afO2-detektoren
- Placer PCM på MRM ved at indsætte modstandsrørene på TCA'erne, der stammer fra bunden af PCM'en, i MRM-indsatserne, 4 på hver side af MRM-deleren. Vend PCM, så vævskamrene kan hvile modO2-detektoren , når den er placeret.
- Fastgør PCM og PCM Support Brace med de 6 skruer ved hjælp af den elektriske skruetrækker.
- TCA'erne fastgøres inden for PCM-støtteribberne med elastikken ved at strække den rundt om PCM'ens finner i niveau med gummipakningerne (figur 6).
- PlacerO2-detektoren på detektorstativet, så forsiden af den hviler mod PCM'ens finner. Kontroller, atLED/fotodetektorparrene er på linje med det O2-følsomme farvestof i vævskamrene. Hvis det er nødvendigt, justeres O 2 detektorens sidestyr, når du har løsnet sætskruerne på siden af O2 detektorholderen.
- Placer låget oven på kabinettet.
- Ligevægt af gassen i hovedrummet i MRM med perifusatet
- Når højtryksventilen er helt fastgjort og lukket, skal du åbne gastankventilen ved at dreje cylinderventilen oven på tanken mod uret.
- Juster højtryksregulatoren til et tryk på 10 psi ved hjælp af knappen på regulatoren.
- Tryk på MRM ved at indstille lavtryksregulatoren til 1,0 psi (figur 7A).
- Løsn renserøret (figur 7B) for at lade gassen fra tanken erstatte luften i MRM-headspace (testforbindelsesinjektorerne forbliver fastspændt) i 15 minutter. Bekræft gasstrømmen ved at nedsænke enden af renserøret i et bægerglas vand for at observere boblende.
- Når flowet er bekræftet, startesO2-detektoren som beskrevet nedenfor i punkt 3.8.
- Efter 15 minutter tændes omrøreren ved 70 o / min, og lad den køre resten af eksperimentet. Efter yderligere 15 minutter klemmes renseslangen (figur 7C).
- Sænk trykket på lavtryksregulatoren til driftstrykket, der opnår den ønskede væskestrømningshastighed (som specificeret af forsøgspakken - normalt mellem ca. 0,5-0,7 psi). Hvis strømningshastigheden er over 20 μL/min, indstilles trykket midlertidigt til 0,3 psi for at give tid til at belaste vævet, uden at kamrene løber over. Dette er ikke nødvendigt, hvis vævet belastes inden for 15 minutter efter, at klemmen er placeret.
BEMÆRK: Lad ikke bufferen løbe ned ad ydersiden af vævskammeret, da væsken kan forstyrreO2-sensing .
- Start afO2-detektoren
- AktivérO2-detektorsoftwaren på den bærbare computer ved at klikke på ikonet mærket Oxygen Detector.
- Når programmet åbnes (supplerende figur 2), skal du kontrollere, at den korrekte COM-port er valgt. Hvis det er nødvendigt, kan COM-porten identificeres ved at tageO2-detektoren ud og tilslutte den fra computeren, så portnummeret vises. Hvis COM-porten frakobles, mens programmet kører, skal programmet lukkes og åbnes igen før brug.
- Klik på Start og derefter Optag (og gem dataene i sikkerhedskopimappen). Klik derefter på Graf.
- Skift gennemsnitsværdien nederst til venstre i levetidsgrafen til 5 (som instruerer programmet om at beregne et glidende gennemsnit med 5 på hinanden følgende punkter). Når der er gået et minut, og det første datapunkt vises på grafskærmen, skal du klikke på Automatisk skalering.
4. Vævsbelastning og ligevægtsperiode (Tid: 90 min)
- Placering af fritterne i vævskamrene
- Fjern låget og de midterste sektioner af kabinettet.
- Når perifusatet i vævskamrene er steget over toppen af den forudplacerede frit, skubbes fritten ned med fritte-cuen ved let at banke på toppen af fritten for at fjerne eventuelle luftbobler, der er dannet under eller inden i fritten.
- Placer frits ca. 0,25 tommer over bunden af vævskammeret.
- Indlæsning af væv i vævskamrene
- Når medieniveauet er 0,5 tommer fra toppen, skal du indlæse vævet i kammeret.
- Indlæsning af nethinden eller RPE-choroid-sclera: Høst nethinden eller RPE-choroid-sclera som beskrevet i 6. For at indlæse vævet skal du bruge fine spidstang til forsigtigt at placere vævet i hvert kammer, og pas på ikke at folde vævet, mens du bruger en vævsserviet for at forhindre, at væske fra vævskammeret drypper påO2-sensoren . Se væv, der synker mod og på fritten.
BEMÆRK: Mellem tidspunktet for høst af vævet og indlæsning af væv i kamrene skal du sikre, at traumer i vævet undgås ved ikke at efterlade vævet i en bicarbonatbaseret buffer / medier ud af inkubatoren i mere end 10 minutter og sikre, at vævet bades i tilstrækkelig buffer / medier (mindst 1 ml / 10 mg væv) for at forhindre vævet i at blive hypoxisk og forhindre udsættelse for luft. - Ilægning af RPE-celler på transwellmembraner: Forbered RPE-celler som beskrevet tidligere 12 og i supplerende fil 1. Passageceller med 0,25% trypsin-EDTA og frø på polyethylenterephthalat, sporætsede filtre (cellekulturindsatser, porestørrelse 0,4 mm) ved mindst 2,0 x 105 celler /cm 2. På forsøgsdagen skæres membranerne i tre strimler af samme bredde og fyldes med tang ind i vævskamrene (se figur 8A).
- Fastgørelse af udstrømningsrørsamlingerne til vævskamre
- Fjern udstrømningsrørene fra emballagen, og anbring udstrømningsrørseparatoren på kanten af den midterste del af kabinettet, så udstrømningsrøradapterne er på indersiden af kabinettet (figur 8B, C).
- Pas på ikke at skubbe for hårdt på TCA'erne (ellers løsner de sig fra MRM), fastgør udstrømningsslangeadapterne på toppen af vævskamrene TCA'er (figur 8D). Sæt midten af kabinettet på igen, og tilslut kontrolkablet til omgivelsestemperaturen igen.
- Før prøvelokalets låg sættes på igen, skal det kontrolleres, at komponenterne i fluidiksystemet inde i prøvelokalet, herunderO2-detektoren , PCM, vævskamre, udstrømningsrør, MRM og varmelegeme, alle er placeret korrekt som vist i figur 8E.
- Sæt låget på kabinettet på igen. Før de otte udstrømningsrør gennem fraktionsopsamlerstyrearmen.
- Aktivering af fraktionsopsamleren
- Sørg for, at brøkopsamleren er centreret i forhold til kabinettets højre væg og udstrømningsrørholderen: den venstre understøtning af fraktionsopsamlingsbasen skal hvile mod kanten af kabinetvæggen.
- På den bærbare computer skal du klikke på UI-genvejen, og den eksperimentelle infoside åbnes (Supplerende figur 3 øverst).
- Udfyld oplysningerne i de relevante felter på siden med eksperimentelle oplysninger (dette kan gøres inden eksperimentets start), og klik derefter på siden Flow & Fraction Collector øverst (supplerende figur 3 nederst).
- Indstilling af parametre til automatiseret flowhastighedsmåling
- Vælg den ønskede integrationstid i rullemenuen Prøveanskaffelsestid øverst i midten, der afbalancerer den ønskede nøjagtighed (som er proportional med integrationstiden) og den tidsmæssige opløsning.
- Hvis der ikke indsamles udstrømningsfraktioner i eksperimentet, skal du klikke på Start og gå til afsnit 4.7. Hvis udstrømningsfraktioner opsamles, skal du udføre trin i afsnit 4.6.
- Indsamling af udstrømningsfraktioner
- I UI-softwaren skal du kontrollere Collect-fraktionerne? på enten siden med eksperimentoplysninger eller siden Indsamler af flow og brøk. Klik derefter på knappen Beregn FC-indstillinger .
- Når det nye vindue åbnes, skal du udfylde tidspunktet for den første injektion i protokollen (defineret som tid = 0) og strømningshastigheden pr. kanal samt tidsintervallerne for hver prøve. Klik derefter på Beregn.
- Når intervallerne for samlingen er verificeret, skal du klikke på Generer og Start.
- Måling af flowhastigheder for individuelle kanaler (valgfrit)
- Hvis strømningshastigheder for individuelle kanaler skal måles (som under normale forhold kun varierer med nogle få procent), skal du veje otte (eller mindre) mikrocentrifugerør og registrere deres vægt.
- Anbring rørholderen med de vejede mikrocentrifugeglas på pladevognen. Klik på Mål flowhastighed manuelt i afsnittet Andre hjælpeprogrammer.
- Vælg målingens varighed, og klik derefter på Opret skabelon. Luk vinduet, og klik på Start. Fraktionsopsamleren opsamler væske fra udstrømningsrørene i målevarigheden, og derefter vender armen tilbage til sin startposition.
- Mikrofugerørene vejes efter opsamlingen, og vægtforskellen divideret med målevarigheden anvendes til beregning af strømningshastigheden (hvor 1 mg = 1 μL).
- Baseline stabilisering
- Når vævet og/eller cellerne er blevet indlæst i vævskamrene, lades systemet ekvilibrere i 90 minutter for at etablere en flad basislinje forO2-forbruget , hvorefter det første teststof kan injiceres (anses for at være tid = 0).
- 30 minutter før den første injektion indtastes den gennemsnitlige værdi for de sidste 3 FR pr. kanal på injektionssiden til klargøring af injektioner med testblanding.
5. Eksperimentel protokol (tid: 2-6 timer)
BEMÆRK: Når baselinestabiliseringen er i gang, er de næste opgaver at injicere testforbindelserne og skifte plader på fraktionsopsamleren, hvis mere end en vil blive brugt.
- Forberedelse af teststof injicere
- Indtast navnene på forbindelserne, de ønskede koncentrationer (slutopløsninger og stamopløsninger) og injektionstiderne for teststofferne i tabellen i brugergrænsefladen på siden Injektion. Bekræft de oplysninger, der vises i programmet, herunder volumener i MRM, der er tilbage på injektionstidspunktet, og hvor meget stamopløsning der skal injiceres for at opnå de ønskede koncentrationer (supplerende figur 4).
- For at beregne, hvor meget perifusat og lager der er nødvendigt til injektionen, skal du udfylde de hvide felter i injektionstabellen og klikke på Beregn. Ved hjælp af de beregnede værdier fortyndes stamopløsningen med perifusat før injektion, således at det indsprøjtede volumen er 5 % af volumenet i MRM efter injektion.
- Hver testforbindelse fremstilles ved at blande stamopløsningen og perifusat. Fyld sprøjterne i mindst 10 minutter før injektionstiden og opbevar dem i en CO2 -inkubator (opretholdt ved temperaturer mellem 37-40 °C), indtil de er klar til injektion.
- Injektion af teststoffer
- Sprøjten med teststoffet forbindes med injektionsslangerne (figur 9A). Spænd den blødvæggede pharming-slange, der fører til injektionsledningen, løs, og injicer langsomt teststoffer (figur 9B) med en hastighed på ca. 3 ml/min. Klem slangen på injektionsslangen igen, og fjern derefter sprøjten (figur 9C); Gentag for den anden side af MRM.
- Efter injektion af hvert teststof skal hvert efterfølgende teststof klargøres i henhold til UI-injektionssiden.
- Bestemmelse af tilstrømningO2-signal for hver kanal
- Ved afslutningen af hvert eksperiment injiceres respiratorikhæmmeren KCN (3 mM) for at bestemme inflow-levetidssignalet for hver kanal, der bruges til at korrigere for variationen i baseline-sensorens levetid og ikke-mitokondrieforbrug af ilt.
6. Afslutning af eksperimentet og nedbrydning af systemet (Tid: 30 min)
- Lagring af iltdata
- Klik på Gem knappen øverst til venstre i grafvinduet på iltdetektorsoftwaren; Navngiv filen, og gem den i den mappe, hvor filen opbevares. Klik på Stop optagelse knappen i hovedvinduet for at gemme sikkerhedskopifilen.
- Gemme den eksperimentelle infofil for brugergrænsefladen
- Klik på knappen Gem profil øverst til venstre på brugergrænsefladens generelle side; Navngiv filen, og gem den i den mappe, hvor filen opbevares. På siden Brøkdel & flow i brugergrænsefladen skal du klikke på rullemenuen Funktioner og derefter på Gem. Behold det genererede navn, eller vælg et andet, og gem filen, hvor det ønskes. Om nødvendigt er der sikkerhedskopifiler, der kan tilgås og gemmes.
- Nedbrydning af instrumentet
- Da KCN er flygtig, skal du bortskaffe fluidiske samlinger i en stinkhætte; hæld medier fra MRM og FC affaldsbakke i en affaldsbeholder, og skyl MRM-indsatserne og omrøringsstængerne grundigt med vand. Hæld indholdet af affaldsbeholderen (indeholdende KCN) i en mærket kemisk affaldsbeholder til efterfølgende bortskaffelse ved kemisk sikkerhed. Før det næste eksperiment skal du rengøre og autoklave rørstængerne og tangen grundigt.
7. Databehandling (tid: 15-45 min)
- Åbn databehandlingsprogrammet på en Mac- eller pc-computer. Vælg den .csv datafil, der genereres af et eksperiment. Hvis dette eksperiments protokol ligner et tidligere analyseret eksperiment, skal du vælge indstillingsfilen og klikke på Næste trin. Ellers skal du bare klikke på Næste trin for at begynde at indtaste eksperimentets indstillinger.
- Udfyld eksperimentets forskellige indstillinger. Ved bestemmelse af referencetidspunkt skal du vælge tidspunktet umiddelbart før KCN trådte i kraft, og levetidsværdierne faldt. Vælg dette punkt ved hjælp af en skyder eller ved at skrive tidsværdien i feltet.
- Klik på Beregn for at generere OCR-grafer i henhold til ligning 2:
OCR = ([O 2]ind- [O 2]ud) x FR = (217 nmol/ml - [O 2]ud) x FR/vævsbasis (ækv. 2)
hvor O2-koncentrationen i KRB i ligevægt med 21 %O2 ved 37 °C er 217 nmol/ml, FR er strømningshastigheden (i ml/min), vævsbasis er mængden af væv, der er indlæst i kammeret (dvs. antal nethinder, RPE-choroid-sclera eller RPE-celler). - Gem graferne som .pdf filer ved at trykke på knappen Eksporter graf . Graf OCR som enten absolutte værdier eller som en brøkdel af en steady state-værdi ved at markere de felter, der svarer til testforbindelsen, der skal indstilles til 1 på siden Rediger indstillinger.
8. Assays af udstrømningsfraktioner
- Hvis prøverne ikke kan analyseres umiddelbart efter forsøget, anbringes pladerne ved 4 °C, hvis de analyseres næste dag, eller fryses, hvis de opbevares længere. Hvis pladerne er frosne, tøs prøverne op ved 4 °C (så prøverne forbliver kolde).
- Når analyser er udført på de valgte udstrømningsfraktioner, indtastes datakolonnerne (en pr. kanal) i en .csv fil med tid (i min) i kolonnen længst til venstre og koncentration i højre (i enten nmol/ml eller ng/ml); Et link i databehandlingsprogrammet, når der trykkes på uploader en skabelon.
- Upload denne fil til databehandleren for at beregne og plotte dataene.
Representative Results
For at illustrere opløsningen af de data, der blev genereret fra isolerede komponenter i øjet, blev OCR og LPR målt med tre typer væv (nethinden, RPE-choroid-sclera og RPE-celler) efter en almindeligt anvendt protokol (mitokondriestresstest10; Figur 10, figur 11 og figur 12). Mængden af væv, der anvendes til hvert væv, er vist i tabel 1. Data blev behandlet og graferet ved hjælp af softwarepakken, der blev udviklet til fluidiksystemet. Forberedelsen af nethinden og RPE-choroid-sclera er relativt ligetil og tager mindre end 20 minutter for hver vævstype. OCR var konstant i den tid, hvor testpræparaterne blev injiceret, hvilket indikerer vævets stabile sundhed og funktion og understøtter metodens validitet (figur 10). Når vi først er valideret for hver vævstype, har vi ikke fundet det nødvendigt at køre kontroller, hvor der ikke injiceres teststoffer til hvert forsøg. I overensstemmelse med data opnået ved hjælp af mere konventionelle perifusionsmetoder 6,8,13, faldt OCR som respons på oligomycin og øget OCR som reaktion på FCCP. Ændringer i LPR var i modsat retning af dem, der blev observeret for OCR: oligomycin øgede LPR, som derefter faldt (men kun lidt) som reaktion på FCCP (figur 11). For at sammenligne den statistiske signifikans af effekten af hver sekventiel testforbindelse blev t-tests udført (som beregnes automatisk af den software, der følger med instrumentet). Da målet med papiret var at beskrive, hvordan man udfører metoden, var antallet af transporterede replikater ikke altid højt nok til at producere statistisk signifikans. Generelt, når antallet af replikater var 3 eller mere, var virkningerne af FCCP og oligomycin på både OCR og LPR signifikante.
RPE-celler er ikke tidligere blevet analyseret med flowsystemer, men reagerede på samme måde som RPE-choroid-sclera (i overensstemmelse med det synspunkt, at en stor del af OCR skyldes RPE-celler; Figur 11). Disse illustrative eksempler fremhæver systemets evne til at opretholde vævets levedygtighed som afspejlet af stabiliteten af OCR i kontrolkanalerne og det høje signal / støjforhold for ændringer i OCR af den størrelsesorden induceret af oligomycin og FCCP, som var mere end 100 til 1. Derudover kan analyser af udstrømningsfraktioner anvendes til at korrelere optagelseshastigheden eller produktionen af en lang række forbindelser, der udveksles med den ekstracellulære væske, er komplementære til OCR (i dette tilfælde LPR). Disse egenskaber ved instrumentet tillod nøjagtig kvantificering af karakteristiske forskelle i vævsresponser mellem vævstyper udført parallelt. OCR ved RPE-choroid-sclera og RPE-celler er konsekvent mere følsomme over for oligomycin end nethinden (figur 11 og figur 12), selvom varigheden af eksponeringen for FCCP for RPE-choroid-sclera ikke var lang nok til at nå steady state. Et punkt at overveje opstod, når man bruger DMSO som opløsningsmiddel. Ved højere koncentrationer (0,2%) havde DMSO en forbigående effekt på OCR via nethinden (formodentlig reflekterende en effekt af en ændring i osmotisk tryk forårsaget af DMSO's virkning på membranpermeabilitet).
Baseret på antagelsen om, at KCN fuldstændigt hæmmer respiration ved sin direkte virkning på cytokrom c oxidase, er OCR ved afslutningen af KCN-eksponeringen sat til 0, og alle OCR-værdier beregnes ud fra ændringen i forhold til KCN-værdien. OCR kan forekomme uafhængigt af respirationskæden og cytokrom c oxidase. Imidlertid er størrelsen af dette bidrag til den samlede OCR generelt ikke mere end et par procent (data ikke vist), og den forlængede tid, som væv udsættes for KCN, sikrer, at substrater af oxidaser, der ikke er en del af elektrontransportkæden, er blevet udtømt.
Statistisk analyse
Enkelte eksperimenter blev vist som angivet i figurerne, men med flere kanaler, der blev gennemsnitlige. Data blev derefter graferet som gennemsnittet ± standardfejlen (SE; beregnet som SD/√n).
Figur 1. Skematisk oversigt over fluidik/vurderingssystem. Hovedkomponenter omfatter kabinettet, temperaturkontrolelementer, fluidik og vævskammersystemer, regulering af gastryk i hovedrummet over perifusat, fraktionsopsamler / strømningshastighedsovervågning ogO2-detektorer . Forkortelser: MRM = mediereservoirmodul, PCM = perifusionskammermodul, TCA = vævskammersamlinger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. (A) Billede af instrumentets vigtigste komponenter. Hovedkomponenterne består af gastank (trykregulatorer), kabinet, fraktionsopsamler og computer. (B) Eksperimentelt rutediagram, der viser de vigtigste kategorier af trin og den tid, det tager at fuldføre dem. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Udsigt over MRM. MRM vises med en MRM-indsats (venstre) og omrøringsstænger (højre) placeret i bunden af MRM-indsatserne (placeret i hver side af MRM-skillelinjen). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Slangesamling og renseslangesamling i MRM. A) Enhed til testblanding, injektionsrør og renserør, der er fastgjort til porte på MRM'en. (B-C) Injektionsenheden med testblandingen og renseslangen (B) anbringes i rillen foran på prøvelokalet (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5. Tænd for MRM-temperaturregulatoren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6. Vævskamre og gastank. Placering afO2-detektoren på detektorstativet (som også understøtter MRM og PCM) og placering af båndet omkring PCM's finner, der hjælper med at sikre vævskamrene på plads. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7. (A) Høj- og lavtryksregulatorer på gastanken. (B-C) Rens rør. Rens rør gør det muligt for frihøjden i MRM at rense luft og fylde med gas fra forsyningstanken. Billeder, der viser åbent renserør (B) og tæt renserør (C). Testblandingens injektionsenhed forbliver lukket gennem rensningsprocessen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8. Vævskammer og udstrømningsopsætning. (A) Transwell-membranens dimensioner, efter at den er skåret i tre strimler af samme bredde. (B) Udstrømning af flerrørsstøtte. C) Udstrømning af flerrørsstøtte placeret på prøvelokalets kant med slangeadapterne nær vævskamrene. D) Billede af udstrømningsrør, der er fastgjort til vævskamrene. (E) Luftfoto af kabinettet uden låg. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9. Injektion af forbindelse i MRM. Injektion af et teststof gennem injektionsporten i MRM ved hjælp af en 5 ml sprøjte. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10. OCR- og LPR-kurver som reaktion på testforbindelser. OCR og LPR med nethinden isoleret fra mus (1 nethinde/kanal) som reaktion på tilstedeværelse eller fravær (kontrol) af teststoffer som indikeret. Hver kurve er gennemsnittet af 6 replikater fra et enkelt eksperiment (fejlbjælker er SE; p-værdier beregnes ved at udføre parrede t-tests, der sammenligner steady state-værdier for hvert testmiddel med værdierne for det foregående testmiddel). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11. OCR-kurver. OCR ved RPE-choroid-sclera og retina isoleret fra mus (1 nethinden eller 2 RPE-choroid-sclera/kanal) målt parallelt som reaktion på teststoffer som angivet. Data er gennemsnittet af replikater fra et enkelt eksperiment (n = 2 og 4 for henholdsvis RPE-choroid-sclera og nethinden; p-værdier beregnes ved at udføre parrede t-test, der sammenligner steady state-værdier for hvert testmiddel med værdierne for det foregående testmiddel). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 12. OCR- og LPR-kurver fra RPE-celler. OCR og LPR fra RPE-celler fastgjort til transwellmembraner, der blev skåret i strimler og indlæst i perifusionskamrene. Data er gennemsnittet af replikater fra et enkelt eksperiment (n = 3 med 1,5 membraner/kanal (360.000 celler/kanal); p-værdier beregnes ved at udføre parrede t-test, der sammenligner steady state-værdier for hvert testmiddel med værdierne for det foregående testmiddel). Klik her for at se en større version af denne figur.
| VÆV/CELLE | Beløb/kanal | FLOWHASTIGHED: ml / min |
| Nethinden (mus) | 1 | 0.025 |
| RPE-choroid-sclera (mus) | 2 | 0.02 |
| RPE-celler på Transwell-membraner | 360.000 celler (4 x 1/3 filterstrimler) | 0.016 |
Tabel 1. Anbefalede driftsspecifikationer for forskellige væv.
Supplerende figur 1. Grafisk repræsentation af eksperimentelt design. Tidspunkt for og sammensætning af eksponering for teststoffer og tidspunkt for fraktionsindsamling. Koncentrationsforøgelse (Conc Inc) er den ændring i koncentrationen, der skal implementeres. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2. Brugergrænseflade ved opstart. Brugergrænsefladen i opstartsvinduet for O2-detektionssoftwaren, der overvågerO2 i vævskamrene, der er indsat i PCM. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3. Brugergrænseflade til eksperimentindstillinger. Brugergrænseflade til indtastning af eksperimentelle oplysninger (venstre) og valg af tidspunkter for indsamling af udstrømningsfraktioner (højre). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4. Brugergrænseflade på injektionssiden. Injektionsside, der beregner injektionsvolumen baseret på ønskede koncentrationer af teststof og volumen tilbage i MRM. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 1: Metoder til fremstilling af vævsprøver. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
På grund af betydningen af bioenergetik i alle aspekter af cellefunktion og vedligeholdelse af forskellige komponenter i øjet er der et kritisk behov for metoder til at studere dets regulering. Især neurale nethinden og RPE afhænger af stofskiftet for både generering af energi samt intra- og intercellulær signalering14,15,16,17. På grund af deres høje oxidative kapacitet er isolerede væv i øjet ikke godt vedligeholdt under statiske forhold18,19, og derfor kræver undersøgelse af isolerede komponenter i øjet flowsystemer, der både kan opretholde og vurdere metaboliske processer. Fluidiksystemet blev udviklet til at generere OCR- og LPR-data fra en lang række vævstyper, og i dette papir præsenterede vi detaljerede protokoller, der viste sig at give optimale resultater.
Den vigtigste determinant for generering af robuste data ved hjælp af flowsystemet omfatter præ-ligevægt af CO2 -baserede medier/buffer ved 39 °C (for at sikre, at perifusat ikke overmættes med opløst gas, der ville afgasses under forsøget). Navnlig vil medier eller KRB-buffere, der opbevares ved 4 °C, være overmættede i forhold til 37 °C og vil afgasses under forsøget, hvis tiden før ligevægt er utilstrækkelig. Derudover må væv, der er indlæst i vævskamrene, ikke traumatiseres ved forkert isolering af væv på grund af rivning eller ufuldstændig adskillelse af væv eller ved at udsætte væv i lav mængde bicarbonatbaseret buffer for atmosfærisk luft for for længe. Temperaturreguleringen, flowstabiliteten og pålideligheden afO2-detektion har ringe variation, og disse faktorer bidrager ikke væsentligt til fejlfrekvensen.
Instrumentet har otte flowkanaler/vævskamre, der løber samtidigt, som forsynes med perifusat fra to reservoirer, fire vævskamre for hvert reservoir. For at få de mest nøjagtige tidsforløb af OCR korrigeres kinetiske kurver ved baseline af kamre, der ikke er fyldt med væv. Således ville en typisk eksperimentel protokol involvere to grupper af tre vævskamre. Protokoller falder generelt i to kategorier: den ene er de forskellige testblandingsprotokoller på hver side (f.eks. narkotika / køretøj på den ene side af MRM og kun køretøj på den anden); den anden er samme testforbindelsesinjektionsprotokol på begge sider af MRM, men forskellig vævs- eller vævsmodel på hver side af MRM. I dette papir blev virkningerne af oligomycin og FCCP på nethinden sammenlignet med OCR af væv, der ikke blev udsat for nogen testforbindelser, og to væv blev samtidig vurderet under samme protokol og betingelser for at identificere vævsspecifik adfærd. Sidstnævnte blev illustreret i denne undersøgelse ved at vise øget dynamisk område af metabolisk hastighed ved RPE-choroid-sclera i forhold til nethinden parallelt i samme eksperiment. Andre rapporter har beskrevet en bredere vifte af undersøgelsesdesign, herunder måling af virkningerne varierendeO2-niveauer på OCR og LPR og koncentrationsafhængigheder af brændstoffer, lægemidler og toksiner20,21. Derudover, selvom vi har begrænset analysen af udstrømningsfraktioner til måling af lactat og beregning af LPR, øges informationsindholdet i et eksperiment kraftigt, hvis flere forbindelser og klasser af forbindelser i udstrømningsfraktionerne analyseres, såsom hormoner, neurotransmittere, cellesignaler og metabolitter, der kan forlade cellerne20,22, 23.
Indlæsningen af isoleret nethinden eller RPE-choroid-sclera er ligetil, og når de er isoleret, placeres disse væv simpelthen i toppen af vævskamrene med tang og får lov til at synke ned til fritten. RPE-celler dyrket på filterindsatser udvikler passende polarisering og markører for RPE-modenhed efter 4-8 uger i kultur. Det er ikke muligt at fjerne RPE til levende celleanalyse, når den først er fastgjort til transwellmembranen, hvis RPE-modenhed og polarisering skal opretholdes24. Perifusionskammeret kan rumme strimler af transwellmembranen, der skæres med en skalpel, mens den er nedsænket i buffer og hurtigt indsættes i vævskamrene. Selv om skæring af filterstrimler er blevet anbragt i et statisk system24, findes der ingen anden fluidikmetode til vurdering af disse vigtige celletyper. Reaktionerne fra RPE-celler var hurtige og mere dynamiske end enten nethinden eller RPE-choroid-sclera, sandsynligvis delvis på grund af øjeblikkelig adgang til både de apikale og basale aspekter af RPE-cellerne konfigureret som et monolag på membranindsatsen.
En anden faktor til sikring af, at data har det højeste signal til støj, er at vælge det optimale forhold mellem væv, der er indlæst i perifusionskamrene i forhold til strømningshastigheden. For lidt væv i forhold til strømningshastigheden resulterer i en forskel i opløstO2-koncentration mellem tilstrømning og udstrømning, der er meget lille og vanskelig at måle pålideligt. I modsætning hertil, hvis strømmen er for langsom, bliver koncentrationen afO2 så lav, at vævet påvirkes af hypoxi. Ikke desto mindre kan den gastrykdrevne væskestrøm opretholdes ved strømningshastigheder ned til 5 ml / min, hvilket kun kræver små mængder væv til nøjagtige OCR- og LPR-målinger. I de her viste eksperimenter blev der brugt ca. 20 ml / min / kanal, som var egnet til enten en nethinde, to RPE-choroid-scleras eller 360.000 RPE-celler. For at minimere systemeffekterne, der forsinker og spreder vævets eksponering for den injicerede testforbindelse, leveres flere størrelser af vævskamrene, således at mængden af væv (og strømningshastighed) matches med kammerets passende størrelse.
Data fra analyserne vist i denne artikel var repræsenteret på to måder: absolut størrelsesorden med hensyn til hastighed eller fraktionelle ændringer i forhold til en steady-state eller baseline. Fokus var på illustration af måling af respons på teststoffer. Imidlertid er fluidiksystemet velegnet til at vurdere og sammenligne effekter af vævsbehandling forud for perifusionsanalysen, såsom genetiske modifikationer. Testning af, om en behandling er forskellig fra kontrol, er mest robust, hvis virkningerne af behandlingen på normaliserede responser af testforbindelser analyseres. Hvis analysen kræver absolutte størrelser, maksimeres den statistiske styrke af analyserne af prøver, der forbehandles, hvis deres vurdering og kontrol udføres i samme perifusionseksperiment.
Bortset fra omrøreren leveres alle dele, der kommer i kontakt med væske, af producenten som forbrugsstoffer og er blevet steriliseret. Disse dele bør ikke genbruges, da eksperimenter lejlighedsvis vil gå tabt på grund af ufuldstændig rengøring og forurenede overflader. Systemet i starten af opsætningen er sterilt. Imidlertid tilsættes medier til MRM, og væv lægges i kamrene under ikke-sterile forhold. Vi har målt OCR i systemet, der er samlet med dele, der er sterile, men hvor selve forsøget udføres under ikke-sterile forhold. Det tager cirka 14 timer for bakterier at akkumulere til det punkt, at de har målbar OCR (upublicerede resultater). Hvis der anvendes protokoller, der er mindre end 10 timer eller deromkring, vil akkumulering af bakterier og eventuelle virkninger på grund af disse være ubetydelige.
Mange forskere bruger instrumenter, der er designet til at måle OCR under statisk inkubation af et monolag af celler med en relativt høj gennemstrømning25,26. I modsætning hertil opretholder det fluidikinstrument, vi har testet og beskrevet i dette papir, væv ved at sikre tilstrækkeligO2-levering, hvilket er kritisk for de større diffusionsafstande, der er til stede i vævsprøver. Derudover er det i stand til at indsamle fraktioner, der muliggør vurdering af flere parametre parallelt med OCR, hvilket i høj grad forbedrer evnen til at studere forholdet mellem dem. Endelig kan koncentrationerne af opløst gas (såsomO2 og CO 2) kontrolleres, hvilket øger varigheden af eksperimenter med bicarbonatbaserede medier og buffer, hvilket gør det muligt for brugeren at studere virkningerne af O2. Det skal påpeges, at en begrænsning for begge metoder er manglende evne til at studere udvaskningen af testforbindelser, en funktionalitet, som andre perifusionssystemer har 4,27,28. En anden overvejelse ved bestemmelse af den optimale analysemodalitet er, at fluidiksystemer bruger flere medier og testforbindelser end statiske systemer. Den ekstra udgift minimeres dog med de nuværende fluidiksystemer på grund af de lave strømningshastigheder, som systemet kan bruges.
Overordnet beskrives en detaljeret beskrivelse af protokollerne til udførelse af forsøg med et nyt flow/vurderingsinstrument. Data genereret med nethinden og RPE-choroid-sclera rekapitulerede tidligere resultater opnået med systemer, der er meget vanskeligere at bruge (og ikke let tilgængelige). Det blev også demonstreret, at systemet kan opretholde og vurdere RPE-celler bundet til transwellmembraner, en meget vigtig cellulær model, der ikke tidligere er blevet analyseret med flowsystemer på grund af cellernes skrøbelighed. Hoveddelene af protokollen består af en 75 minutters opsætningstid efterfulgt af en 90 minutters ligevægtsperiode og den eksperimentelle protokol, der gør den velegnet til rutinemæssig brug af laboratorier, der ikke specialiserer sig i drift af fluidiksystemer. Selvom vi fokuserede på at måle vævets akutte respons på teststoffer, er systemet meget velegnet til at sammenligne væv fra forskellige kilder såsom dyremodeller eller cellemodeller, der er blevet genetisk ændret eller gennemgået testbehandlinger / tilstande. Derudover er omfanget af assays, der kan udføres på udstrømningsfraktionerne, vidtrækkende og omfatter metabolitter, cellesignalmolekyler og udskillede hormoner / neurotransmittere samt multikomponentanalyse genereret af massespektrometri på fraktionerne såvel som vævet.
Disclosures
I.R.S., M.G. og K.B. har økonomiske bånd til EnTox Sciences, Inc. (Mercer Island, WA), producenten/distributøren af BaroFuse perifusionssystemet beskrevet i denne undersøgelse. Alle de øvrige forfattere erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af tilskud fra National Institutes of Health (R01 GM148741 I.R.S.), U01 EY034591, R01 EY034364, BrightFocus Foundation, Research to Prevent Blindness (J.R.C.) og R01 EY006641, R01 EY017863 og R21 EY032597 (JBH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BIOLOGICAL SAMPLES | |||
| C57BL/6J mice | Envigo Harlan (Indianapolis, IN) | N/A | |
| REAGENTS | |||
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920L9795 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270G | |
| KCN | Sigma-Aldrich | 60178 | |
| Lactate | MilliporeSigma | L6661 | |
| Oliigomycin A | Sigma-Aldrich | 75351L9795 | |
| CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING | |||
| Beuthanasia-D | Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ | N/A | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital | Virbac | RXEUTHASOL | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | 12303C | |
| Hank’s Buffered Salt Solution | GIBCO | 14065056 | |
| Krebs Ringer Bicarbonate (KRB) | Thermo Fisher Scientific | J67795L9795 | |
| Matrigel | ThermoFisher | #CB-40230 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| ROCKi | Selleck Chemicals | Y-27632 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25-200-072 | |
| SUPPLIES | |||
| Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2 | Praxair Distribution, Inc | N/A | |
| Transwell filters | MilliporeSigma | 3470 | |
| COMMERCIAL ASSAYS | |||
| Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit | ThermoFisher | A22189 | |
| Glucose Oxidase from Aerococcus viridans | Invitrogen (Carlsbad, CA) | A22189L9795 | |
| Lactate Oxidase | Sigma-Aldrich | L9795 | |
| EQUIPMENT | |||
| BaroFuse Multi-Channel Perifusion system | EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA | Model 001-08 | |
| Synergy 4 Fluorometer | BioTek (Winooski, VT) | S4MLFPTA |
References
- Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin. Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).
- Doliba, N. M., et al. Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).
- Sweet, I. R., et al.
- Chertov, A. O., et al.
- Kooragayala, K., et al. Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Bisbach, C. M., et al. Succinate Can Shuttle Reducing Power from the Hypoxic Retina to the O2-Rich Pigment Epithelium. Cell Reports. 31 (5), 107606 (2020).
- Du, J., et al. Inhibition of mitochondrial pyruvate transport by zaprinast causes massive accumulation of aspartate at the expense of glutamate in the retina. The Journal of Biological Chemistry. 288 (50), 36129-36140 (2013).
- Hass, D. T., et al. Succinate metabolism in the retinal pigment epithelium uncouples respiration from ATP synthesis. Cell Reports. 39 (10), 110917 (2022).
- Kamat, V., et al. Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism. Elife. 10, e66716 (2021).
- Stryer, L. Biochemistry. , 4th edn, Freeman and Company, New York. (1995).
- Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).
- Engel, A. L., et al. Extracellular matrix dysfunction in Sorsby patient-derived retinal pigment epithelium. Experimental Eye Research. 215, 108899 (2022).
- Zhang, R., et al. Inhibition of Mitochondrial Respiration Impairs Nutrient Consumption and Metabolite Transport in Human Retinal Pigment Epithelium. Journal of Proteome Research. 20 (1), 909-922 (2021).
- Hurley, J. B. Retina Metabolism and Metabolism in the Pigmented Epithelium: A Busy Intersection. Annual Review of Vision Science. 7, 665-692 (2021).
- Xiao, J., et al. Autophagy activation and photoreceptor survival in retinal detachment. Experimental Eye Research. 205, 108492 (2021).
- Okawa, H., Sampath, A. P., Laughlin, S. B., Fain, G. L. ATP consumption by mammalian rod photoreceptors in darkness and in light. Current Biology. 18 (24), 1917-1921 (2008).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. , 100846 (2020).
- Yu, J., et al. Emerging strategies of engineering retinal organoids and organoid-on-a-chip in modeling intraocular drug delivery: Current progress and future perspectives. Advanced Drug Delivery Reviews. 197, 114842 (2023).
- Arjamaa, O., Nikinmaa, M. Oxygen-dependent diseases in the retina: role of hypoxia-inducible factors. Experimental Eye Research. 83 (3), 473-483 (2006).
- Kamat, V., et al. A Versatile Multi-Channel Fluidics System for the Maintenance and Real-Time Metabolic and Functional Assessment of Tissue or Cells. Cell Reports Methods. In Press. , (2023).
- Neal, A., et al. Quantification of Low-Level Drug Effects Using Real-Time, in vitro Measurement of Oxygen Consumption Rate. Toxicological Sciences. 148 (2), 594-602 (2015).
- Jung, S. R., et al. Reduced cytochrome C is an essential regulator of sustained insulin secretion by pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 286 (20), 17422-17434 (2011).
- Rountree, A. M., et al. Control of insulin secretion by cytochrome C and calcium signaling in islets with impaired metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 289 (27), 19110-19119 (2014).
- Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers. Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).
- Jarrett, S. G., Rohrer, B., Perron, N. R., Beeson, C., Boulton, M. E. Assessment of mitochondrial damage in retinal cells and tissues using quantitative polymerase chain reaction for mitochondrial DNA damage and extracellular flux assay for mitochondrial respiration activity. Methods in Molecular Biology. 935, 227-243 (2013).
- Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2008).
- Doliba, N. M., Qin, W., Vinogradov, S. A., Wilson, D. F., Matschinsky, F. M. Palmitic acid acutely inhibits acetylcholine- but not GLP-1-stimulated insulin secretion in mouse pancreatic islets. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 299 (3), E475-E485 (2010).
