Bioengineering

एक नवीन पंपलेस फ्लुइडिक्स सिस्टम का उपयोग करके आंख के विभिन्न ऊतक और सेल प्रकारों को बनाए रखना और उनका आकलन करना

Published: July 14, 2023 doi: 10.3791/65399

Matthew K. Grumbine¹, Varun Kamat², Khang Bao¹, Trevor Crupi¹, Kedar Mokate², Rayne Lim³, Jennifer R. Chao³, Brian M. Robbings⁴, Daniel T. Hass⁴, James B. Hurley⁴, Ian R. Sweet^1,2

¹EnTox Sciences, Inc, ²UW Medicine Diabetes Institute, University of Washington, ³Department of Ophthalmology, University of Washington, ⁴Department of Biochemistry, University of Washington

Summary

जीवित ऊतक का वास्तविक समय विश्लेषण महत्वपूर्ण कार्यात्मक और यंत्रवत डेटा उत्पन्न करता है। यह पेपर एक नए और पंप-मुक्त मल्टी-चैनल फ्लुइडिक्स सिस्टम द्वारा डेटा की सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल और महत्वपूर्ण चर का वर्णन करता है जो ऊतक और सेल मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला को बनाए रखता है और मूल्यांकन करता है।

Abstract

ऊतक समारोह और कोशिका जीव विज्ञान की जांच के लिए उपयोग किए जाने वाले कई इन विट्रो मॉडल को फ़ंक्शन और व्यवहार्यता के रखरखाव के लिए आवश्यक पर्याप्त ऑक्सीजन और इष्टतम सेल स्थितियों को प्रदान करने के लिए मीडिया के प्रवाह की आवश्यकता होती है। इस अंत में, हमने संस्कृति में ऊतक और कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए एक बहु-चैनल प्रवाह संस्कृति प्रणाली विकसित की है और इन-लाइन सेंसर और / या बहिर्वाह अंशों के संग्रह द्वारा कार्य और व्यवहार्यता का लगातार आकलन किया है। यह प्रणाली मेटाबोलाइट्स और हार्मोन स्राव की उत्पादन दर को एक साथ मापने के लिए एक अंतर्निहित अंश कलेक्टर के साथ ऑक्सीजन खपत दर के 8-चैनल, निरंतर ऑप्टिकल सेंसिंग को जोड़ती है। यद्यपि यह आइलेट्स, मांसपेशियों और हाइपोथैलेमस सहित ऊतक और सेल मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला को बनाए रखने और आकलन करने में सक्षम है, यहां हम इसके ऑपरेटिंग सिद्धांतों और प्रयोगात्मक तैयारी / प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिनका उपयोग हमने पृथक माउस रेटिना, माउस रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) -कोरॉयड-स्क्लेरा और सुसंस्कृत मानव आरपीई कोशिकाओं के बायोएनर्जेटिक विनियमन की जांच करने के लिए किया है। सिस्टम के डिजाइन में नवाचार, जैसे कि पंपलेस द्रव प्रवाह, ने एक बहु-चैनल प्रवाह प्रणाली के बहुत सरल संचालन का उत्पादन किया है। वीडियो और चित्र दिखाए जाते हैं जो बताते हैं कि कैसे इकट्ठा किया जाए, एक प्रयोग के लिए उपकरण तैयार किया जाए, और विभिन्न ऊतक / सेल मॉडल को पेरिफ्यूजन कक्षों में लोड किया जाए। इसके अलावा, प्रोटोकॉल- और ऊतक-विशिष्ट प्रयोगों के लिए शर्तों का चयन करने के लिए दिशानिर्देश चित्रित और चर्चा किए जाते हैं, जिसमें सुसंगत और स्थिर संस्कृति स्थितियों और खपत और उत्पादन दरों के सटीक निर्धारण प्राप्त करने के लिए ऊतक अनुपात में सही प्रवाह दर निर्धारित करना शामिल है। इष्टतम ऊतक रखरखाव और कई मापदंडों के वास्तविक समय के मूल्यांकन का संयोजन अत्यधिक सूचनात्मक डेटा सेट उत्पन्न करता है जो आंख के शरीर विज्ञान में अनुसंधान और बिगड़ा हुआ दृष्टि के उपचार के लिए दवा की खोज के लिए बहुत उपयोगिता होगी।

Introduction

पेरिफ्यूजन सिस्टम का जीवन विज्ञान में एक लंबा इतिहास है। विशेष रूप से, आइलेट्स द्वारा स्रावी कार्य के अध्ययन के लिए, उनका उपयोग स्रावित 1 के जवाब में इंसुलिन स्राव^के कैनेटीक्स को चिह्नित करने के लिए किया गया है। हार्मोन और मेटाबोलाइट्स के बाद के परख के लिए बहिर्वाह अंशों को इकट्ठा करने के अलावा, वास्तविक समय सेंसर को शामिल किया गया है, मुख्य रूप से ऑक्सीजन की खपत^का पता लगाने के लिए ^2,3,4। आंखों के रोगों की मध्यस्थता करने वाले तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए व्यापक प्रयास रेटिना, रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) -कोरॉयड-श्वेतपटल और सुसंस्कृत आरपीई कोशिकाओं सहित आंख के विभिन्न पृथक घटकों के चयापचय विनियमन और विकृति का आकलन करने के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक तरीकों की कमी से सीमित हैं। सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए डिज़ाइन किए गए स्थैतिक प्रणालियों को ऊतक⁵ के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन ऊतक को पर्याप्त ऑक्सीजन के लिए प्रवाह की आवश्यकता होती है। फ्लो सिस्टम रेटिना और आरपीई-कोरॉइड-स्क्लेरा द्वारा ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) में वास्तविक समय की प्रतिक्रियाओं को सटीक और पुन: मापने में सफल रहे हैं, और ऊतक 8 घंटे से अधिक समय तक चयापचय रूप से स्थिर रहते हैं, जिससे कई परीक्षण यौगिकों 4,6,7,8,9 से जुड़े अत्यधिक सूचनात्मक प्रोटोकॉल की अनुमति मिलती है।. बहरहाल, फ्लुइडिक्स सिस्टम के संचालन के लिए ऐतिहासिक रूप से एक कस्टम-निर्मित उपकरण और गैर-मानकीकृत पद्धतियों में प्रशिक्षित तकनीकी कर्मचारियों की आवश्यकता होती है। ऐसी प्रणालियों को अधिकांश प्रयोगशालाओं में मानक पद्धति के रूप में नहीं अपनाया गया है। बैरोफ्यूज एक नव विकसित तरल पदार्थ प्रणाली है जो पंपों पर निर्भर नहीं करती है, बल्कि कई चैनलों और ऊतक कक्षों के माध्यम से प्रवाह को चलाने के लिए गैस के दबाव पर निर्भर करती है (चित्रा 1)। प्रत्येक चैनल को ओसीआर के लिए लगातार निगरानी की जाती है, और सामग्री के बाद के परख के लिए प्लेट-आधारित अंश कलेक्टर के साथ बहिर्वाह एकत्र किया जाता है। महत्वपूर्ण रूप से, उपकरण के लिए ऊतक पेरिफ्यूजन कक्ष ों को विभिन्न ज्यामिति और आकार के ऊतकों को समायोजित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

उपकरण का दिल फ्लुइडिक्स सिस्टम है, जहां प्रवाह को छोटे आंतरिक व्यास (आईडी) ट्यूबिंग (द्रव सर्किट में सबसे महत्वपूर्ण प्रवाह प्रतिरोध का योगदान) के माध्यम से एक सीलबंद, दबाव वाले जलाशय से ऊतक को रखने वाले कांच के ऊतक कक्षों में संचालित किया जाता है। मीडिया जलाशय मॉड्यूल (एमआरएम) को दबाव की आपूर्ति गैसों के मिश्रण (आमतौर पर 21% ओ 2, 5% सीओ 2, बैलेंस एन ₂) वाले गैस सिलेंडर से जुड़े कम दबाव और उच्च दबाव नियामकों द्वारा की जाती है, और जलाशय को पेरिफ्यूजन चैंबर मॉड्यूल (पीसीएम) द्वारा शीर्ष से सील किया जाता है जो ऊतक कक्ष असेंबली (टीसीए) रखता है। प्रवाह दर प्रतिरोध ट्यूबों की लंबाई और आईडी और कम दबाव नियामक की दबाव सेटिंग द्वारा नियंत्रित की जाती है। ऊतक कक्षों के शीर्ष से जुड़े बहिर्वाह ट्यूब तरल पदार्थ को या तो अपशिष्ट रिसेप्टेक (जिसे प्रवाह दर के स्वचालित निर्धारण के लिए लगातार तौला जाता है) या अंश कलेक्टर द्वारा नियंत्रित 96-वेल प्लेट के कुओं में पहुंचाता है। ओ 2 डिटेक्शन सिस्टम ऊतक के डाउनस्ट्रीम ग्लास ऊतक कक्षों में से प्रत्येक के अंदर चित्रित ओ_{2-संवेदनशील} डाई के जीवनकाल को मापता है। इस जानकारी का उपयोग लगातार ओसीआर की गणना करने के लिए किया जाता है। संपूर्ण तरल पदार्थ प्रणाली एक तापमान-नियंत्रित बाड़े में रहती है और गैस टैंक, अंश कलेक्टर और कंप्यूटर उपकरण के प्रमुख घटक हैं (चित्रा 2 ए)। अंत में, उपकरण चलाने वाला सॉफ्टवेयर इसके संचालन को नियंत्रित करने के लिए कार्य करता है (इंजेक्शन परीक्षण यौगिकों की तैयारी और समय, प्रवाह माप प्रणाली, और अंश कलेक्टर समय सहित), साथ ही ओसीआर डेटा और अन्य पूरक मापों को संसाधित और ग्राफ़ करना।

इस पेपर में हम आंख के विभिन्न पृथक घटकों के लिए ओसीआर और लैक्टेट उत्पादन दर (एलपीआर) का आकलन करने के लिए फ्लुइडिक्स सिस्टम का उपयोग करने के प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एलपीआर ग्लाइकोलाइटिक दर को दर्शाने वाला एक पैरामीटर है जो ओसीआर के लिए अत्यधिक पूरक है, जहां जोड़ी सेल¹⁰ में कार्बोहाइड्रेट से ऊर्जा उत्पादन की दो प्रमुख शाखाओं के लिए जिम्मेदार है। चूंकि ऊतक की तैयारी और इसे ऊतक कक्षों में लोड करना प्रक्रिया को देखकर सबसे अच्छा सीखा जाता है, वीडियो सेट अप और ऑपरेशन के दौरान किए जाने वाले कई महत्वपूर्ण चरणों को चित्रित करने में मदद करेगा जो अकेले पाठ द्वारा आसानी से व्यक्त नहीं किए जाते हैं।

प्रोटोकॉल का विवरण 8 वर्गों में विभाजित है जो प्रयोग के विभिन्न चरणों के अनुरूप हैं (चित्रा 2 बी): 1. पूर्व-प्रयोगात्मक तैयारी; 2. पेरिफ्यूसेट की तैयारी / 3. उपकरण स्थापित; 4. ऊतक संतुलन; 5. प्रायोगिक प्रोटोकॉल; 6. उपकरण टूटना; 7. डेटा प्रोसेसिंग; और 8. बहिर्वाह अंशों का आकलन।

Protocol

चूहों और चूहों से ऊतक की कटाई के लिए सभी प्रक्रियाओं को वाशिंगटन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. पूर्व-प्रयोगात्मक तैयारी

नोट: निम्नलिखित कार्य प्रयोग से कम से कम एक दिन पहले पूरा हो जाते हैं।

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल डिजाइन करना
1. चैनलों में ऊतक प्लेसमेंट का असाइनमेंट: एमआरएम के प्रत्येक तरफ 4 चैनलों में से 3 में रखे जाने के लिए ऊतक या सेल मॉडल चुनें। प्रत्येक तरफ एक ऊतक कक्ष बेसलाइन सुधार के लिए उपयोग किए जाने वाले ऊतक के बिना चलाया जाता है।
2. दो विशिष्ट डिजाइनों में से एक का उपयोग करके नमूने व्यवस्थित करें - प्रत्येक तरफ अलग-अलग परीक्षण यौगिक प्रोटोकॉल (उदाहरण के लिए, एमआरएम के एक तरफ के चैनल परीक्षण यौगिक प्राप्त करते हैं जबकि दूसरी तरफ के चैनल नियंत्रण के रूप में कार्य करते हैं); एमआरएम के दोनों किनारों पर एक ही परीक्षण यौगिक इंजेक्शन प्रोटोकॉल, लेकिन एमआरएम के दोनों तरफ अलग-अलग ऊतक या ऊतक मॉडल बनाम नियंत्रण।
3. इष्टतम ओसीआर माप के लिए प्रवाह दर और ऊतक राशि का चयन: प्रवाह दर को तब तक समायोजित करें जब तक कि जीवनकाल अनुपात समय 100 में परिवर्तन लगभग 3 न हो।
  नोट: आंख के घटकों के लिए ऊतक की विशिष्ट मात्रा और संबंधित प्रवाह दर तालिका 1 में दिखाई गई है, जहां उपकरण 6-80 μL / min / चैनल के बीच प्रवाह दर पर सबसे अच्छा कार्य करता है।
4. आवश्यक मीडिया/बफर वॉल्यूम की गणना: प्रयोग की शुरुआत में प्रत्येक एमआरएम सम्मिलित में जोड़े जाने वाले मीडिया की मात्रा की गणना करें।
  वॉल्यूम_MRM = 30 mL + प्रोटोकॉल की अवधि (मिनट में) x प्रवाह दर (mL/min में) x 4 चैनल (Eq.1)
  उदाहरण के लिए, 0.01 एमएल /मिनट पर, 60 एमएल शुरुआती वॉल्यूम एमआरएम 12.5 घंटे प्रोटोकॉल की अनुमति देगा (जहां 30 एमएल समाप्त हो जाएगा, जबकि 30 एमएल शेष रहेगा), जबकि 0.04 एमएल / मिनट पर, 90 एमएल शुरुआती वॉल्यूम_{एमआरएम} 6 घंटे प्रोटोकॉल (30 एमएल शेष के साथ) की अनुमति देगा।
5. परीक्षण यौगिक इंजेक्शन प्रोटोकॉल: मूल्यांकन करने के लिए परीक्षण यौगिकों का चयन करें, परीक्षण की जाने वाली एकाग्रता (आमतौर पर अधिकतम प्रतिक्रिया के पास या एकाग्रता निर्भरता के रूप में चुना जाता है) और जोखिम की अवधि। घुलनशीलता पर विचार करें और पानी, डीएमएसओ या इथेनॉल जैसे वांछित विलायक में स्टॉक बनाएं।
6. इंजेक्शन और बाद के इंजेक्शन के समय का चयन करें ताकि बाद के एजेंट को जोड़ने से पहले प्रतिक्रिया स्थिर स्थिति तक पहुंच जाए। प्रोटोकॉल दोहराते समय, इंजेक्शन के समय का मिलान करें ताकि कई बार पाठ्यक्रमों का औसत निकाला जा सके।
  नोट: यहां उपयोग किए जाने वाले यौगिक पिछले माइटोकॉन्ड्रियल (मिटो) तनाव परीक्षण ¹¹ से हैं और ऑलिगोमाइसिन और कार्बोनिल साइनाइड 4-(ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी) दोनों को स्टॉक समाधानों के साथ-साथ अंतिम पेरिफ्यूसेट में डीएमएसओ की आवश्यकता होती है।
7. बहिर्वाह नमूना समय: वांछित अंश संग्रह अंतराल (1-60 मिनट / नमूना से) का चयन करें, जहां तेजी से परिवर्तन के लिए तेज नमूना दर चुनी जाती है, और स्थिर स्थिति के करीब आने पर लंबे समय के अंतराल को चुना जाता है। नमूना अंतराल के दौरान अतिप्रवाह से बचने के लिए पर्याप्त अच्छी मात्रा (0.3 से 1.5 एमएल) का उपयोग करें (समय अंतराल पर प्रवाह दर x से अधिक वॉल्यूम चुनें)।
  नोट: नमूना करण समय प्रोटोकॉल की पसंद के साथ भिन्न होगा, लेकिन माइटो तनाव परीक्षण के लिए, हमने आमतौर पर बेसलाइन के दौरान 5 मिनट के अंतराल और इंजेक्शन के दौरान 15 मिनट के अंतराल का उपयोग किया है (-15, -10, -5, 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, जहां हर बार नमूना अंतराल की शुरुआत होती है)।
8. उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस (UI) में ऊपर वर्णित परीक्षण यौगिकों और अंश संग्रह के लिए चयनित मान दर्ज करें, जो इस जानकारी के ग्राफ़िकल प्रतिनिधित्व उत्पन्न करता है। समूह मूल्यांकन और चर्चा के लिए फ़ाइलों का निर्यात और प्रसार (पूरक चित्र 1)।
सामान और उपभोग्य भागों को सेट करें
1. निर्माता द्वारा प्रदान की गई और पूर्व-पैक की गई आपूर्ति को सेट करें जिसमें शामिल हैं: टीसीए (8 का पैक), बहिर्वाह ट्यूबिंग असेंबली (8 ट्यूबों का पैक), परीक्षण यौगिक इंजेक्शन ट्यूबिंग (2), फोर्सप्स, टयूबिंग क्लैंप (3), एमआरएम, एमआरएम इंसर्ट (2), स्टिर बार (2), और पर्ज टयूबिंग असेंबली (जैविक सुरक्षा कैबिनेट में रखा गया)।
2. तरल के संपर्क में आने वाले डिस्पोजेबल भागों का पुन: उपयोग न करें, क्योंकि इससे प्रयोगात्मक विफलता में वृद्धि होगी। प्रयोगों के बीच उन्हें साफ और ऑटोक्लेविंग करके बल और हलचल सलाखों का पुन: उपयोग करें।

2. पेरिफ्यूसेट की तैयारी और संतुलन (समय: 30 मिनट इनक्यूबेशन समय शामिल नहीं)

समीकरण 1, आमतौर पर 200 एमएल से गणना के आधार पर एक दिन पहले मीडिया या क्रेब्स-रिंगर बाइकार्बोनेट बफर (केआरबी) तैयार करें, और फिर टी 225 ऊतक संस्कृति फ्लास्क में 39 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ₂ इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें, जिसमें प्रत्येक फ्लास्क में 90 एमएल से अधिक नहीं है।
यदि व्यावसायिक रूप से तैयार केआरबी या मीडिया (कमरे के तापमान पर गर्म) का उपयोग किया जाता है, तो प्रयोग की सुबह पेरिफ्यूसेट तैयार करें और कम से कम 1 घंटे के लिए 5% सीओ₂ इनक्यूबेटर में रखें। सभी समाधानों को सड़न रोकनेवाला रूप से तैयार करें।
नोट: तरल पदार्थ के संपर्क में आने वाले सभी तरल पदार्थ और तरल पदार्थ प्रणाली के कुछ हिस्से प्रयोग की शुरुआत में बाँझ होते हैं। हालांकि, सिस्टम की असेंबली और ऊतक की लोडिंग हवा के लिए खुली होती है।

3. उपकरण स्थापित करने के लिए तापमान और घुलित गैस का संतुलन (समय: 75 मिनट)

एमआरएम के लिए ट्यूबिंग असेंबली का अनुलग्नक।
1. एमआरएम और एक फ्लूइडिक्स पैकेज को उपकरण के बगल में बेंच पर रखें। सुनिश्चित करें कि ट्यूबिंग क्लैंप (3), स्टिर बार (2), और फोर्सपहले से ही टूल ट्रे पर हैं।
2. एमआरएम के प्रत्येक पक्ष में एक हलचल पट्टी के साथ एक अप्रयुक्त एमआरएम सम्मिलित करें ( चित्र 3 देखें)।
3. टीसीए को एमआरएम के दोनों सिरों पर इंजेक्शन पोर्ट से संलग्न करें ताकि टयूबिंग का अंत सीधे स्टिर बार पर स्थित हो। सुनिश्चित करें कि दो परीक्षण यौगिक इंजेक्शन असेंबली में से अधिक एमआरएम के पीछे है।
4. इसके बाद, गैस प्रवाह फ़ीड लाइन और शुद्ध टयूबिंग असेंबली को क्रमशः पीछे और सामने के खाली बंदरगाहों से संलग्न करें ( चित्रा 4 ए देखें)।
एमआरएम/ट्यूबिंग असेंबली को बाड़े में रखना।
1. एमआरएम हीटर (चित्रा 4 बी) में एमआरएम (ट्यूबिंग असेंबली संलग्न के साथ) रखें।
2. चार ट्यूबिंग असेंबली को बाड़े के आधार में दीवारों के खांचे में रखें (प्रत्येक तरफ दो) ताकि मध्य बाड़े को रखने के बाद वे बाड़े के बाहरी हिस्से में फैल जाएं।
3. डिटेक्टर स्टैंड पर दो पहियों को कसकर क्लैंप के बीच एमआरएम को सुरक्षित करें।
4. बाड़े के किनारे दो ट्यूब गाइड के माध्यम से बाड़े के पीछे से निकली लंबी परीक्षण यौगिक इंजेक्शन असेंबली को खिलाएं ताकि ट्यूबों का उद्घाटन आगे की ओर हो (चित्रा 4 सी)।
5. बंद परीक्षण यौगिक इंजेक्शन असेंबली में से प्रत्येक को दबाएं।
बाड़े को इकट्ठा करना और तापमान नियंत्रकों को सक्रिय करना
1. पावर स्ट्रिप को टॉगल करें जो बाड़े के भीतर सभी विद्युत उपकरणों को बिजली की आपूर्ति करता है। डिटेक्टर स्टैंड पर पंखा चालू हो जाएगा और एमआरएम तापमान नियंत्रक को 38 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 5) के निर्धारित मूल्य को प्रदर्शित करते हुए प्रकाश देना चाहिए।
2. यह सुनिश्चित करने के लिए कि स्टिर बार सुचारू रूप से घूम रहे हैं, यूआई का उपयोग करके स्टिरर को 70 आरपीएम पर चालू करें। एक बार उचित सरगर्मी देखने के बाद, हिलाने वालों को बंद कर दें।
3. बाड़े के मध्य भाग को आधार के शीर्ष पर रखें।
4. परिवेश तापमान नियंत्रक लीवर स्विच को बिजली संलग्न करने और परिवेश के तापमान हीटर को बिजली की आपूर्ति करने के लिए बाड़े के मध्य भाग पर केबल को विद्युत बॉक्स से केबल से कनेक्ट करें।
5. बाड़े पर ढक्कन रखें और ऊपरी तापमान नियंत्रक (परिवेश तापमान नियंत्रक) का प्रदर्शन प्रकाश देगा और 36 डिग्री सेल्सियस पढ़ेगा। 30 मिनट के लिए टाइमर शुरू करें, एमआरएम हीटर को निर्धारित बिंदु तापमान तक पहुंचने में लगने वाला समय।
टीसीए को पीसीएम में सम्मिलित करना
1. 8 टीसीए सम्मिलन उपकरण में से प्रत्येक को पीसीएम छेद में डालने के लिए टीसीए सम्मिलन उपकरण का उपयोग करें, जब तक कि ऊतक कक्ष के चारों ओर लिपटी टयूबिंग आस्तीन का शीर्ष पीसीएम में छेद ों की सतह को स्पर्श न करे।
2. अगले को सम्मिलित करने से पहले एक टीसीए को पूरी तरह से डालें। आंशिक रूप से इकट्ठे पीसीएम को पीसीएम ब्रेस और 6 स्क्रू के बगल में अलग रखें।
  नोट: टीसीए का अधूरा सम्मिलन हेड स्पेस को दबाव सेट बिंदु तक पहुंचने से रोक देगा और पेरिफ्यूसेट प्रवाह नहीं करेगा।
एमआरएम में दो आवेषणों को पूर्व-समतुल्य पेरिफ्यूसेट के साथ भरना।
1. ऐसा करने के लिए, बाड़े को इकट्ठा करने के 30 मिनट बाद और एमआरएम तापमान तक पहुंच गया है, 50 एमएल पिपेट का उपयोग करके तरल को धीरे से नीचे वितरित करके पूर्व-गर्म एमआरएम डालने में पूर्व-समतुल्य पेरिफ्यूसेट को स्थानांतरित करें।
  नोट: इन चरणों के साथ-साथ धारा 3.6 में, एमआरएम और वायुमंडल में पेरिफ्यूसेट के बीच गैस के हस्तांतरण से बचने के लिए तुरंत किया जाना चाहिए।
गैस-टाइट सील बनाने और ओ₂ डिटेक्टर की स्थिति बनाने के लिए एमआरएम / पीसीएम को इकट्ठा करना
1. पीसीएम के निचले हिस्से से निकलने वाले टीसीए के प्रतिरोध ट्यूबों को एमआरएम में डालकर पीसीएम को एमआरएम पर रखें, एमआरएम डिवाइडर के प्रत्येक तरफ 4। पीसीएम को उन्मुख करें ताकि ऊतक कक्ष एक बार तैनात होने के बाद ओ₂ डिटेक्टर के खिलाफ आराम कर सकें।
2. इलेक्ट्रिक स्क्रूड्राइवर का उपयोग करके 6 स्क्रू के साथ पीसीएम और पीसीएम सपोर्ट ब्रेस को सुरक्षित करें।
3. पीसीएम सपोर्ट फिन के भीतर टीसीए को रबर गैसकेट के स्तर पर पीसीएम के पंख के चारों ओर खींचकर प्रदान किए गए लोचदार बैंड के साथ सुरक्षित करें (चित्रा 6)।
4. डिटेक्टर स्टैंड पर ओ₂ डिटेक्टर रखें ताकि इसका चेहरा पीसीएम के पंख के खिलाफ टिका हो। जांचें कि एलईडी / फोटोडिटेक्टर जोड़े ऊतक कक्षों में ओ_{2-संवेदनशील} डाई के साथ पंक्तिबद्ध हैं। यदि आवश्यक हो, तो ओ 2 डिटेक्टर धारक के किनारे सेट स्क्रू को ढीला करने के बाद ओ₂डिटेक्टर पार्श्व गाइड को समायोजित करें।
5. ढक्कन को बाड़े के ऊपर रखें।
एमआरएम में हेड स्पेस में गैस को पेरिफ्यूसेट के साथ समान करना।
1. उच्च दबाव वाल्व पूरी तरह से सुरक्षित और बंद होने के साथ, टैंक के शीर्ष पर सिलेंडर वाल्व को काउंटरक्लॉकवाइज घुमाकर गैस टैंक वाल्व खोलें।
2. नियामक पर नॉब का उपयोग करके उच्च दबाव नियामक को 10 पीएसआई के दबाव में समायोजित करें।
3. कम दबाव वाले नियामक को 1.0 पीएसआई (चित्रा 7 ए) पर सेट करके एमआरएम पर दबाव डालें।
4. 15 मिनट के लिए एमआरएम हेडस्पेस (परीक्षण यौगिक इंजेक्टर क्लैंप रहते हैं) में हवा को बदलने के लिए टैंक से गैस को बदलने की अनुमति देने के लिए शुद्ध ट्यूब (चित्रा 7 बी) को अनलैंप करें। बुदबुदाहट देखने के लिए शुद्ध ट्यूब के अंत को पानी के बीकर में डुबोकर गैस प्रवाह की पुष्टि करें।
5. एक बार प्रवाह की पुष्टि हो जाने के बाद, ओ₂ डिटेक्टर शुरू करें जैसा कि अनुभाग 3.8 में नीचे वर्णित है।
6. 15 मिनट के बाद, 70 आरपीएम पर हलचल चालू करें और बाकी प्रयोग के लिए चलना छोड़ दें। अतिरिक्त 15 मिनट के बाद, शुद्ध टयूबिंग असेंबली (चित्रा 7 सी) को दबाएं।
7. कम दबाव वाले नियामक पर दबाव को ऑपरेटिंग दबाव तक कम करें जो वांछित तरल प्रवाह दर प्राप्त करता है (जैसा कि प्रयोगात्मक पैक द्वारा निर्दिष्ट है - आमतौर पर लगभग 0.5-0.7 पीएसआई के बीच)। यदि प्रवाह दर 20 μL / min से ऊपर है, तो अस्थायी रूप से दबाव को 0.3 psi पर सेट करें ताकि कक्षों के अतिप्रवाह के बिना ऊतक को लोड करने का समय मिल सके। यह आवश्यक नहीं है यदि ऊतक को क्लैंप रखने के 15 मिनट के भीतर लोड किया जाता है।
  नोट: बफर को ऊतक कक्ष के बाहर से नीचे न जाने दें, क्योंकि द्रव ओ₂ सेंसिंग में हस्तक्षेप कर सकता है।
ओ₂ डिटेक्टर शुरू करना
1. ऑक्सीजन डिटेक्टर लेबल वाले आइकन पर क्लिक करके लैपटॉप पर ओ₂ डिटेक्टर सॉफ़्टवेयर को सक्रिय करें।
2. एक बार प्रोग्राम खुलने के बाद (पूरक चित्रा 2), पुष्टि करें कि सही COM पोर्ट का चयन किया गया है। यदि आवश्यक हो, तो कंप्यूटर से ओ₂ डिटेक्टर को अनप्लग और प्लग करके सीओएम पोर्ट की पहचान की जा सकती है ताकि पोर्ट नंबर प्रदर्शित हो। यदि अनुप्रयोग चलाते समय COM पोर्ट अनप्लग किया गया है, तो अनुप्रयोग को बंद करना होगा और उपयोग से पहले पुन: खोलना होगा।
3. प्रारंभ करें फिर रिकॉर्ड करें क्लिक करें (और डेटा बैकअप फ़ोल्डर में सहेजें). इसके बाद, ग्राफ़ क्लिक करें.
4. जीवनकाल ग्राफ ़ के निचले बाईं ओर औसत मान को 5 में बदलें (जो प्रोग्राम को लगातार 5 अंकों के साथ चलती औसत की गणना करने का निर्देश देता है)। एक मिनट बीत जाने के बाद और ग्राफ़िंग स्क्रीन पर पहला डेटा बिंदु प्रदर्शित होने के बाद, ऑटो स्केल पर क्लिक करें।

4. ऊतक लोडिंग और संतुलन अवधि (समय: 90 मिनट)

ऊतक कक्षों में फ्रिट्स की स्थिति।
1. बाड़े के ढक्कन और मध्य खंडों को हटा दें।
2. ऊतक कक्षों में पेरिफ्यूसेट के पूर्व-स्थित फ्रिट के शीर्ष से ऊपर उठने के बाद, फ्रिट के नीचे या भीतर बनने वाले किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए फ्रिट के शीर्ष पर हल्के से टैप करके फ्रिट क्यू के साथ फ्रिट को नीचे धकेलें।
3. स्थिति ऊतक कक्ष के तल से लगभग 0.25 इंच ऊपर है।
ऊतक कक्षों में ऊतक लोड करना
1. एक बार जब मीडिया का स्तर शीर्ष से 0.5 इंच हो जाता है, तो ऊतक को कक्ष में लोड करें।
2. रेटिना या आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा लोड करना: हार्वेस्ट रेटिना या आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा जैसा कि ⁶ में वर्णित है। ऊतक को लोड करने के लिए, ऊतक को धीरे-धीरे प्रत्येक कक्ष में रखने के लिए ठीक बिंदु बल का उपयोग करें, ऊतक को मोड़ने के लिए सावधान रहें, जबकि ऊतक कक्ष से तरल को ओ₂ सेंसर पर टपकने से रोकने के लिए ऊतक पोंछ का उपयोग करें। फ्रिट की ओर और ऊपर धंसने वाले ऊतक का निरीक्षण करें।
  नोट: ऊतक की कटाई और कक्षों में ऊतक लोड करने के समय के बीच, सुनिश्चित करें कि ऊतक को आघात से बचा जाता है ताकि ऊतक को 10 मिनट से अधिक समय तक इनक्यूबेटर से बाहर बाइकार्बोनेट-आधारित बफर / मीडिया में न छोड़ा जाए और यह सुनिश्चित किया जाए कि ऊतक को हाइपोक्सिक होने से बचाने और हवा के संपर्क को रोकने के लिए पर्याप्त बफर / मीडिया (कम से कम 1 एमएल / 10 मिलीग्राम ऊतक) में स्नान किया जाए।
3. ट्रांसवेल झिल्ली पर आरपीई कोशिकाओं को लोड करना: आरपीई कोशिकाओं को पहले ^{वर्णित 12} और पूरक फ़ाइल 1 में तैयार करें। पॉलीथीन टेरेफ्थेलेट पर 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए और बीज का उपयोग करने वाली मार्ग कोशिकाएं, ट्रैक-अंकित फिल्टर (सेल कल्चर इंसर्ट, छिद्र आकार 0.4 मिमी) न्यूनतम 2.0 x 10⁵ सेल / सेमी² पर। प्रयोग के दिन, झिल्ली को समान चौड़ाई की तीन पट्टियों में काट लें और ऊतक कक्षों में बल के साथ लोड करें ( चित्र 8 ए देखें)।
ऊतक कक्षों में बहिर्वाह ट्यूबिंग असेंबली को संलग्न करना।
1. पैकेजिंग से बहिर्वाह ट्यूबिंग असेंबली को हटा दें और बाड़े के मध्य भाग के होंठ पर बहिर्वाह ट्यूबिंग विभाजक रखें ताकि बहिर्वाह टयूबिंग एडेप्टर बाड़े के अंदर हों (चित्रा 8 बी, सी)।
2. टीसीए पर बहुत जोर न देने के लिए सावधान रहना (या वे एमआरएम से ढीले हो जाएंगे), ऊतक कक्षों टीसीए (चित्रा 8 डी) के शीर्ष पर बहिर्वाह ट्यूबिंग एडाप्टर संलग्न करें। बाड़े के मध्य को बदलें और परिवेश तापमान नियंत्रण केबल को फिर से कनेक्ट करें।
3. बाड़े के ढक्कन को बदलने से पहले, पुष्टि करें कि ओ₂ डिटेक्टर, पीसीएम, ऊतक कक्ष, बहिर्वाह ट्यूब, एमआरएम और हीटर सहित बाड़े के अंदर तरल पदार्थ प्रणाली के घटक सभी ठीक से तैनात हैं जैसा कि चित्र 8 ई में दिखाया गया है।
4. बाड़े के ढक्कन को बदलें। अंश कलेक्टर गाइड आर्म के माध्यम से आठ बहिर्वाह ट्यूबों को खिलाएं।
अंश कलेक्टर को सक्रिय करना
1. सुनिश्चित करें कि अंश कलेक्टर बाड़े की दाईं दीवार और बहिर्वाह ट्यूब धारक के सापेक्ष केंद्रित है: अंश कलेक्टर बेस का बायां समर्थन बाड़े की दीवार के किनारे के खिलाफ होना चाहिए।
2. लैपटॉप पर, UI शॉर्टकट पर क्लिक करें और प्रयोगात्मक जानकारी पृष्ठ खुल जाएगा (पूरक चित्रा 3 शीर्ष)।
3. प्रयोगात्मक जानकारी पृष्ठ पर उपयुक्त बक्से में जानकारी भरें (यह प्रयोग शुरू होने से पहले किया जा सकता है) और फिर शीर्ष पर प्रवाह और अंश कलेक्टर पृष्ठ (पूरक चित्रा 3 नीचे) पर क्लिक करें।
स्वचालित प्रवाह दर माप के लिए पैरामीटर सेट करना
1. शीर्ष मध्य पर नमूना अधिग्रहण समय ड्रॉप-डाउन मेनू में वांछित एकीकरण समय का चयन करें जो वांछित सटीकता (जो एकीकरण समय के आनुपातिक है) और अस्थायी रिज़ॉल्यूशन को संतुलित करता है।
2. यदि प्रयोग में कोई बहिर्वाह अंश एकत्र नहीं किया जाएगा, तो प्रारंभ पर क्लिक करें और अनुभाग 4.7 पर जाएं। यदि बहिर्वाह अंश एकत्र किए जाएंगे, तो धारा 4.6 में दिए गए चरणों का पालन करें।
बहिर्वाह अंशों को इकट्ठा करना
1. UI सॉफ़्टवेयर में, अंशों को एकत्रित करें की जाँच करें? या तो प्रयोग जानकारी पृष्ठ या प्रवाह और अंश कलेक्टर पृष्ठ पर बॉक्स. फिर कंप्यूट एफसी सेटिंग्स बटन पर क्लिक करें।
2. जब नई विंडो खुलती है, तो प्रोटोकॉल में पहले इंजेक्शन का समय भरें (समय = 0 के रूप में परिभाषित) और प्रति चैनल प्रवाह दर, साथ ही प्रत्येक नमूने के लिए समय अंतराल। उसके बाद, गणना क्लिक करें।
3. एक बार संग्रह के अंतराल सत्यापित हो जाने के बाद, जेनरेट और स्टार्ट पर क्लिक करें।
अलग-अलग चैनलों के लिए प्रवाह दरों को मापना (वैकल्पिक)
1. यदि अलग-अलग चैनलों की प्रवाह दर को मापा जाना है (जो सामान्य परिस्थितियों में केवल कुछ प्रतिशत से भिन्न होता है), तो आठ (या उससे कम) माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का वजन करें, और उनके वजन को रिकॉर्ड करें।
2. प्लेट गाड़ी पर पूर्व-वजन वाले माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबयुक्त ट्यूब धारक सेट करें। अन्य उपयोगिताओं अनुभाग में मैन्युअल रूप से प्रवाह दर मापें क्लिक करें.
3. माप अवधि का चयन करें और तब टेम्पलेट जनरेट करें क्लिक करें. विंडो बंद करें और प्रारंभ क्लिक करें. अंश कलेक्टर माप अवधि के लिए बहिर्वाह ट्यूबों से तरल पदार्थ एकत्र करेगा और फिर हाथ अपनी घर की स्थिति में वापस आ जाएगा।
4. संग्रह के बाद माइक्रोफ्यूज ट्यूबों का वजन करें और प्रवाह दर की गणना करने के लिए माप अवधि से विभाजित वजन में अंतर का उपयोग करें (जहां 1 मिलीग्राम = 1 μL)।
बेसलाइन स्थिरीकरण
1. एक बार ऊतक और / या कोशिकाओं को ऊतक कक्षों में लोड करने के बाद, सिस्टम को ओ₂ खपत की एक सपाट आधार रेखा स्थापित करने के लिए 90 मिनट के लिए संतुलन करने की अनुमति दें, जिस समय पहला परीक्षण यौगिक इंजेक्ट किया जा सकता है (समय = 0 माना जाता है)।
2. पहले इंजेक्शन से 30 मिनट पहले, परीक्षण यौगिक इंजेक्शन तैयार करने के लिए इंजेक्शन पृष्ठ में औसत अंतिम 3 एफआर प्रति चैनल मूल्य दर्ज करें।

5. प्रायोगिक प्रोटोकॉल (समय: 2-6 घंटे)

नोट: एक बार बेसलाइन स्थिरीकरण चल रहा है, तो अगले कार्य परीक्षण यौगिकों को इंजेक्ट कर रहे हैं और अंश कलेक्टर पर प्लेटों को बदल रहे हैं यदि एक से अधिक का उपयोग किया जाएगा।

परीक्षण यौगिक इंजेक्शन तैयार करना
1. इंजेक्शन पृष्ठ पर यूआई में तालिका में यौगिकों के नाम, वांछित सांद्रता (अंतिम और स्टॉक समाधान), और परीक्षण यौगिकों के इंजेक्शन समय दर्ज करें। कार्यक्रम में प्रदर्शित जानकारी की पुष्टि करें, जिसमें इंजेक्शन के समय छोड़े गए एमआरएम में वॉल्यूम शामिल हैं और वांछित सांद्रता प्राप्त करने के लिए कितना स्टॉक समाधान इंजेक्ट करना है (पूरक चित्रा 4)।
2. यह गणना करने के लिए कि इंजेक्शन के लिए कितने पेरिफ्यूसेट और स्टॉक की आवश्यकता है, इंजेक्शन टेबल के सफेद बक्से भरें और गणना करें पर क्लिक करें। गणना किए गए मूल्यों का उपयोग करके, इंजेक्शन से पहले पेरिफ्यूसेट के साथ परीक्षण यौगिक स्टॉक समाधान को पतला करें ताकि इंजेक्शन के बाद एमआरएम में मात्रा का 5% हो।
3. स्टॉक घोल और पेरिफ्यूसेट को मिलाकर प्रत्येक परीक्षण यौगिक तैयार करें। इंजेक्शन के समय से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए सिरिंज लोड करें और इंजेक्शन के लिए तैयार होने तक सीओ₂ इनक्यूबेटर (37-40 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान पर बनाए रखा गया) में रखें।
परीक्षण यौगिकों को इंजेक्ट करना
1. परीक्षण यौगिक युक्त सिरिंज को इंजेक्शन लाइनों से कनेक्ट करें (चित्रा 9 ए)। इंजेक्शन लाइन की ओर जाने वाली नरम दीवार वाले फार्म टयूबिंग को अनलैंप करें और धीरे-धीरे लगभग 3 एमएल / मिनट की दर से परीक्षण यौगिकों (चित्रा 9 बी) को इंजेक्ट करें। इंजेक्शन लाइन पर टयूबिंग को फिर से दबाएं और फिर सिरिंज को हटा दें (चित्रा 9 सी); एमआरएम के दूसरी तरफ के लिए दोहराएं।
2. प्रत्येक परीक्षण यौगिक को इंजेक्ट करने के बाद, प्रत्येक बाद के परीक्षण यौगिक को यूआई इंजेक्शन पृष्ठ के अनुसार इंजेक्ट करने के लिए तैयार करें।
प्रत्येक चैनल के लिए इनफ्लो ओ₂ सिग्नल का निर्धारण
1. प्रत्येक प्रयोग के अंत में, प्रत्येक चैनल के लिए इनफ्लो लाइफटाइम सिग्नल निर्धारित करने के लिए श्वसन अवरोधक केसीएन (3 एमएम) इंजेक्ट करें जिसका उपयोग बेसलाइन सेंसर जीवनकाल और ऑक्सीजन की गैर-माइटोकॉन्ड्रियल खपत में भिन्नता को ठीक करने के लिए किया जाता है।

6. प्रयोग समाप्त करना और सिस्टम को तोड़ना (समय: 30 मिनट)

ऑक्सीजन डेटा सहेजना
1. ऑक्सीजन डिटेक्टर सॉफ्टवेयर पर ग्राफिंग विंडो के शीर्ष बाईं ओर सहेजें बटन पर क्लिक करें; फ़ाइल को नाम दें और इसे उस फ़ोल्डर में संग्रहीत करें जहाँ फ़ाइल रखी जाएगी। बैकअप फ़ाइल को सहेजने के लिए मुख्य विंडो पर रिकॉर्डिंग रोकें बटन क्लिक करें।
UI प्रयोगात्मक जानकारी फ़ाइल सहेजना
1. UI के सामान्य पृष्ठ के ऊपरी बाईं ओर प्रोफ़ाइल सहेजें बटन पर क्लिक करें; फ़ाइल को नाम दें और इसे उस फ़ोल्डर में संग्रहीत करें जहाँ फ़ाइल रखी जाएगी। UI के अंश और प्रवाह पृष्ठ पर, उपकरण ड्रॉप डाउन मेनू क्लिक करें और फिर सहेजें. जेनरेट किया गया नाम रखें या दूसरा चुनें और जहां चाहें वहां फ़ाइल स्टोर करें। यदि आवश्यक हो, तो बैकअप फाइलें हैं जिन्हें एक्सेस और सहेजा जा सकता है।
उपकरण को तोड़ना
1. चूंकि केसीएन अस्थिर है, इसलिए फ्लुइडिक्स असेंबली को फ्यूम हुड में निपटाएं; एमआरएम और एफसी वेस्ट ट्रे से मीडिया को एक अपशिष्ट कंटेनर में डालें, और एमआरएम डालने और सलाखों को पानी से अच्छी तरह से धो लें। अपशिष्ट कंटेनर (केसीएन युक्त) की सामग्री को रासायनिक सुरक्षा द्वारा बाद के निपटान के लिए एक लेबल रासायनिक अपशिष्ट कंटेनर में डालें। अगले प्रयोग से पहले, हलचल सलाखों और बल को अच्छी तरह से साफ और आटोक्लेव करें।

7. डेटा प्रोसेसिंग (समय: 15-45 मिनट)

किसी Mac या PC कंप्यूटर पर डेटा प्रोसेसर अनुप्रयोग खोलें। किसी प्रयोग द्वारा जनरेट की गई .csv डेटा फ़ाइल का चयन करें. यदि इस प्रयोग का प्रोटोकॉल पहले से विश्लेषित प्रयोग के समान है, तो उस सेटिंग्स फ़ाइल का चयन करें और अगला चरण क्लिक करें. अन्यथा प्रयोग की सेटिंग्स दर्ज करना शुरू करने के लिए बस अगला चरण क्लिक करें।
प्रयोग की विभिन्न सेटिंग्स भरें। संदर्भ समय बिंदु के निर्धारण पर, केसीएन के प्रभावी होने और जीवनकाल मान कम होने से पहले सीधे समय बिंदु का चयन करें। स्लाइडर के उपयोग से या बॉक्स में समय मान लिखकर इस बिंदु का चयन करें।
समीकरण 2 के अनुसार OCR ग्राफ़ उत्पन्न करने के लिए परिकलित करें क्लिक करें:
OCR = ([O 2]_in- [O 2]आउट) x FR = (217 nmol/mL - [O 2]_आउट) x FR/ऊतक आधार (Eq. ₂)।
जहां 37 डिग्री सेल्सियस पर 21% ओ 2 के साथ संतुलन में होने पर केआरबी में ओ₂ एकाग्रता 217 एनएमओएल / एमएल है, एफआर प्रवाह दर (एमएल / मिनट में) है, ऊतक आधार कक्ष में लोड किए गए ऊतक की मात्रा है (यानी, रेटिना, आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा या आरपीई कोशिकाओं की संख्या)।
निर्यात ग्राफ़ बटन दबाकर ग्राफ़ को .pdf फ़ाइलों के रूप में सहेजें. संपादन सेटिंग्स पृष्ठ में 1 पर सेट किए जाने वाले परीक्षण यौगिक के अनुरूप बक्से की जांच करके ओसीआर को या तो पूर्ण मानों के रूप में, या स्थिर स्थिति मान के अंश के रूप में ग्राफ़ करें।

8. बहिर्वाह अंशों की परख

यदि प्रयोग के तुरंत बाद नमूने की परख नहीं की जा सकती है, तो प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें यदि अगले दिन परख की जाती है, या लंबे समय तक संग्रहीत होने पर जमे हुए हैं। यदि प्लेटें जमी हुई हैं, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने पिघलाएं (ताकि नमूने ठंडे रहें)।
एक बार चयनित बहिर्वाह अंशों पर परख करने के बाद, डेटा के कॉलम (प्रति चैनल एक) को बाएं कॉलम में समय (मिनट में) और दाईं ओर एकाग्रता (या तो nmol / mL या ng / mL में) के साथ एक .csv फ़ाइल में दर्ज किया जाता है; डेटा प्रोसेसिंग प्रोग्राम में एक लिंक दबाए जाने पर टेम्पलेट अपलोड करता है।
डेटा की गणना और प्लॉट करने के लिए इस फ़ाइल को डेटा प्रोसेसर में अपलोड करें।

Representative Results

आंख के पृथक घटकों से उत्पन्न डेटा के संकल्प को स्पष्ट करने के लिए, ओसीआर और एलपीआर को आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले प्रोटोकॉल (माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण¹⁰) के बाद तीन प्रकार के ऊतक (रेटिना, आरपीई-कोरॉयड-श्वेतपटल, और आरपीई कोशिकाओं) के साथ मापा गया था। चित्र 10, चित्र 11, और चित्र 12)। प्रत्येक ऊतक के लिए उपयोग किए जाने वाले ऊतक की मात्रा तालिका 1 में दिखाई गई है। फ्लूडिक्स सिस्टम के लिए विकसित किए गए सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग करके डेटा को संसाधित और ग्राफ़ किया गया था। रेटिना और आरपीई-कोरॉइड-स्क्लेरा की तैयारी अपेक्षाकृत सीधी है और प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए 20 मिनट से कम समय लेती है। ओसीआर उस समय के दौरान स्थिर था जब परीक्षण यौगिकों को इंजेक्ट किया गया था, ऊतक के स्थिर स्वास्थ्य और कार्य का संकेत देता है और विधि की वैधता का समर्थन करता है (चित्रा 10)। एक बार प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए मान्य होने के बाद, हमने उन नियंत्रणों को चलाने के लिए आवश्यक नहीं पाया है जहां प्रत्येक प्रयोग के लिए कोई परीक्षण यौगिक इंजेक्ट नहीं किया जाता है। अधिक पारंपरिक पेरिफ्यूजन विधियों ^6,8,13 का उपयोग करके प्राप्त आंकड़ों के अनुरूप^, ओलिगोमाइसिन के जवाब में ओसीआर में कमी और एफसीसीपी के जवाब में ओसीआर में वृद्धि हुई। एलपीआर में परिवर्तन ओसीआर के लिए देखे गए लोगों के विपरीत दिशा में थे: ऑलिगोमाइसिन ने एलपीआर में वृद्धि की, जो तब एफसीसीपी (चित्रा 11) के जवाब में कम हो गई (लेकिन केवल थोड़ा)। प्रत्येक अनुक्रमिक परीक्षण यौगिक के प्रभाव के सांख्यिकीय महत्व की तुलना करने के लिए, टी-परीक्षण किए गए थे (जिनकी गणना उपकरण के साथ आने वाले सॉफ़्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से की जाती है)। चूंकि पेपर का लक्ष्य यह वर्णन करना था कि विधि कैसे निष्पादित की जाए, इसलिए सांख्यिकीय महत्व उत्पन्न करने के लिए किए गए प्रतिकृति की संख्या हमेशा पर्याप्त नहीं थी। सामान्य तौर पर, हालांकि, जब प्रतिकृति की संख्या 3 या अधिक थी, तो ओसीआर और एलपीआर दोनों पर एफसीसीपी और ऑलिगोमाइसिन के प्रभाव महत्वपूर्ण थे।

आरपीई कोशिकाओं का पहले प्रवाह प्रणालियों के साथ विश्लेषण नहीं किया गया है, लेकिन आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा के समान प्रतिक्रिया दी गई है (इस दृष्टिकोण के अनुरूप कि ओसीआर का एक बड़ा अंश आरपीई कोशिकाओं के कारण है; चित्र 11)। ये उदाहरण नियंत्रण चैनलों में ओसीआर की स्थिरता द्वारा परिलक्षित ऊतक व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए सिस्टम की क्षमता को उजागर करते हैं, और ऑलिगोमाइसिन और एफसीसीपी द्वारा प्रेरित परिमाण के ओसीआर में परिवर्तन के लिए उच्च सिग्नल टू शोर अनुपात, जो 100 से 1 से अधिक था। इसके अलावा, बहिर्वाह अंशों के परख का उपयोग बाह्य तरल पदार्थ के साथ आदान-प्रदान करने वाले यौगिकों की एक विस्तृत श्रृंखला के उत्थान या उत्पादन की दर को सहसंबंधित करने के लिए किया जा सकता है जो ओसीआर (इस मामले में, एलपीआर) के पूरक हैं। उपकरण की इन विशेषताओं ने समानांतर में किए गए ऊतक प्रकारों के बीच ऊतक प्रतिक्रियाओं में विशिष्ट अंतर की सटीक मात्रा का ठहराव करने की अनुमति दी। आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा और आरपीई कोशिकाओं द्वारा ओसीआर रेटिना की तुलना में ऑलिगोमाइसिन के प्रति लगातार अधिक संवेदनशील होते हैं (चित्रा 11 और चित्रा 12), हालांकि आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा के लिए एफसीसीपी के संपर्क की अवधि स्थिर अवस्था तक पहुंचने के लिए पर्याप्त नहीं थी। डीएमएसओ को विलायक के रूप में उपयोग करते समय विचार करने के लिए एक बिंदु उत्पन्न हुआ। उच्च सांद्रता पर, (0.2%) डीएमएसओ का रेटिना द्वारा ओसीआर पर क्षणिक प्रभाव पड़ा (संभवतः झिल्ली पारगम्यता पर डीएमएसओ के प्रभाव से लाए गए आसमाटिक दबाव में बदलाव के प्रभाव को दर्शाता है)।

इस धारणा के आधार पर कि केसीएन साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेज पर अपनी प्रत्यक्ष कार्रवाई से श्वसन को पूरी तरह से रोकता है, केसीएन एक्सपोजर के अंत में ओसीआर 0 पर सेट होता है और सभी ओसीआर मूल्यों की गणना केसीएन मूल्य के सापेक्ष परिवर्तन के आधार पर की जाती है। ओसीआर श्वसन श्रृंखला और साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेज से स्वतंत्र हो सकता है। हालांकि, समग्र ओसीआर में इस योगदान का परिमाण आम तौर पर कुछ प्रतिशत से अधिक नहीं होता है (डेटा नहीं दिखाया गया है) और केसीएन के संपर्क में आने वाले ऊतक की विस्तारित लंबाई यह सुनिश्चित करती है कि ऑक्सीडेज के सब्सट्रेट जो इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला का हिस्सा नहीं हैं, समाप्त हो गए हैं।

सांख्यिकीय विश्लेषण
एकल प्रयोगों को आंकड़ों में इंगित किया गया था, लेकिन कई चैनलों के साथ जो औसत थे। डेटा को तब मानक त्रुटि (एसई; एसडी / √ एन के रूप में गणना) ± औसत के रूप में ग्राफ़ किया गया था।

चित्र 1. द्रव/मूल्यांकन प्रणाली की योजना। प्रमुख घटकों में बाड़े, तापमान नियंत्रण तत्व, तरल पदार्थ और ऊतक कक्ष प्रणाली, पेरिफ्यूसेट के ऊपर हेड स्पेस में गैस के दबाव का विनियमन, अंश कलेक्टर / प्रवाह दर निगरानी, और ओ₂ डिटेक्टर शामिल हैं। संक्षेप: एमआरएम = मीडिया जलाशय मॉड्यूल, पीसीएम = पेरिफ्यूजन चैंबर मॉड्यूल, टीसीए = ऊतक कक्ष विधानसभा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 2. (ए) उपकरण के प्रमुख घटकों का चित्र। प्रमुख घटकों में गैस टैंक (दबाव नियामक), बाड़े, अंश कलेक्टर और कंप्यूटर शामिल हैं। (बी) चरणों की प्रमुख श्रेणियों और उन्हें पूरा करने में लगने वाले समय को दर्शाने वाला प्रायोगिक प्रवाह चार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 3. एमआरएम का दृश्य। एमआरएम को एमआरएम इंसर्ट (बाएं) और स्टर बार (दाएं) के साथ एमआरएम इंसर्ट (एमआरएम डिवाइडर के प्रत्येक तरफ रखा गया) के निचले हिस्से में रखा गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 4. एमआरएम में ट्यूबिंग असेंबली और पर्ज टयूबिंग असेंबली। (ए) एमआरएम पर बंदरगाहों से जुड़ी टेस्ट कंपाउंड इंजेक्शन ट्यूबिंग असेंबली और पर्ज टयूबिंग असेंबली। (B-C) परीक्षण यौगिक इंजेक्शन असेंबली और पर्ज टयूबिंग असेंबली (बी) को बाड़े (सी) के सामने नाली में रखा गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 5. एमआरएम तापमान नियंत्रक को पावर देना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 6. ऊतक कक्ष और गैस टैंक। डिटेक्टर स्टैंड पर ओ₂ डिटेक्टर की स्थिति (जो एमआरएम और पीसीएम का भी समर्थन करता है), और पीसीएम के पंखों के चारों ओर बैंड का प्लेसमेंट जो ऊतक कक्षों को सुरक्षित करने में मदद करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 7. (ए) गैस टैंक पर उच्च और निम्न दबाव नियामक। (B-C) शुद्ध ट्यूब. पर्ज ट्यूब एमआरएम में हेडस्पेस को हवा से साफ करने और आपूर्ति टैंक से गैस से भरने की अनुमति देता है। खुली शुद्ध ट्यूब (बी) और बंद शुद्ध ट्यूब (सी) दिखाने वाले चित्र। टेस्ट कंपाउंड इंजेक्शन असेंबली शुद्ध प्रक्रिया के माध्यम से बंद रहती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 8. ऊतक कक्ष और बहिर्वाह सेटअप। (ए) समान चौड़ाई की तीन पट्टियों में काटने के बाद ट्रांसवेल झिल्ली के आयाम। (बी) बहिर्वाह मल्टी-ट्यूब समर्थन। (सी) ऊतक कक्षों के पास ट्यूबिंग एडेप्टर के साथ बाड़े के होंठ पर स्थित बहिर्वाह मल्टी-ट्यूब समर्थन। (डी) ऊतक कक्षों से जुड़ी बहिर्वाह ट्यूबिंग असेंबली का चित्र। (ई) ढक्कन के बिना बाड़े का हवाई दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 9. एमआरएम में यौगिक का इंजेक्शन। 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करके एमआरएम में इंजेक्शन पोर्ट के माध्यम से एक परीक्षण यौगिक इंजेक्ट करना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 10. परीक्षण यौगिकों के जवाब में ओसीआर और एलपीआर वक्र। परीक्षण यौगिकों की उपस्थिति या अनुपस्थिति (नियंत्रण) के जवाब में चूहों (1 रेटिना / चैनल) से रेटिना द्वारा ओसीआर और एलपीआर को अलग किया गया है। प्रत्येक वक्र एक ही प्रयोग से 6 प्रतिकृतियों का औसत है (त्रुटि पट्टियाँ एसई हैं; पी-मानों की गणना पिछले परीक्षण एजेंट के साथ प्रत्येक परीक्षण एजेंट के लिए स्थिर राज्य मूल्यों की तुलना करते हुए युग्मित टी-परीक्षण करके की जाती है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 11. ओसीआर कर्व्स। आरपीई-कोरॉइड-स्क्लेरा और रेटिना द्वारा ओसीआर चूहों (1 रेटिना या 2 आरपीई-कोरॉइड-स्क्लेरा / चैनल) से अलग किया गया है, जैसा कि संकेत दिया गया है। डेटा एक एकल प्रयोग से प्रतिकृति का औसत है (आरपीई-कोरॉइड-स्क्लेरा और रेटिना के लिए क्रमशः एन = 2 और 4; पी-मानों की गणना पिछले परीक्षण एजेंट के साथ प्रत्येक परीक्षण एजेंट के लिए स्थिर राज्य मूल्यों की तुलना करते हुए युग्मित टी-परीक्षण करके की जाती है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 12. ओसीआर और एलपीआर आरपीई कोशिकाओं से वक्र। ट्रांसवेल झिल्ली से जुड़ी आरपीई कोशिकाओं से ओसीआर और एलपीआर जिन्हें स्ट्रिप्स में काट दिया गया और पेरिफ्यूजन कक्षों में लोड किया गया। डेटा एक एकल प्रयोग से प्रतिकृति का औसत है (एन = 3, 1.5 झिल्ली / चैनल (360,000 कोशिकाओं / चैनल) के साथ; पी-मानों की गणना पिछले परीक्षण एजेंट के साथ प्रत्येक परीक्षण एजेंट के लिए स्थिर राज्य मूल्यों की तुलना में युग्मित टी-परीक्षण करके की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ऊतक/कोशिका	राशि/चैनल	प्रवाह दर: एमएल /
रेटिना (माउस)	1	0.025
आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा (माउस)	2	0.02
ट्रांसवेल झिल्ली पर आरपीई कोशिकाएं	360,000 कक्ष (4 x 1/3 फ़िल्टर स्ट्रिप्स)	0.016

तालिका 1. विभिन्न ऊतक के लिए अनुशंसित ऑपरेटिंग विनिर्देश।

अनुपूरक चित्र 1. प्रयोगात्मक डिजाइन का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। परीक्षण यौगिकों के संपर्क का समय और संरचना, और अंश संग्रह का समय। एकाग्रता वृद्धि (कॉन्क इंक) लागू की जाने वाली एकाग्रता में परिवर्तन है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 2. स्टार्टअप पर उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस. ओ 2 डिटेक्शन सॉफ्टवेयर की स्टार्टअप विंडो का यूआई जो पीसीएम में डाले गए ऊतक कक्षों में ओ₂ की निगरानी करता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 3. प्रयोग सेटिंग्स के लिए उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस. प्रयोगात्मक जानकारी दर्ज करने के लिए यूआई (बाएं) और बहिर्वाह अंशों (दाएं) के संग्रह के लिए समय का चयन करना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 4. इंजेक्शन पृष्ठ का उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस। इंजेक्शन पृष्ठ जो एमआरएम में परीक्षण यौगिक और शेष मात्रा की वांछित सांद्रता के आधार पर इंजेक्शन वॉल्यूम की गणना करता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: ऊतक नमूना तैयारी के लिए तरीके। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

सेल फ़ंक्शन के सभी पहलुओं और आंख के विभिन्न घटकों के रखरखाव में बायोएनर्जेटिक के महत्व के कारण, इसके विनियमन का अध्ययन करने के तरीकों की महत्वपूर्ण आवश्यकता है। विशेष रूप से, तंत्रिका रेटिना और आरपीई ऊर्जा की पीढ़ी के साथ-साथ इंट्रा-और इंटर-सेलुलर सिग्नलिंग^14,15,16,17 दोनों के लिए चयापचय पर निर्भर करते हैं। उनकी उच्च ऑक्सीडेटिव क्षमता के कारण, आंख के पृथक ऊतकों को स्थैतिक स्थितियों^18,19 के तहत अच्छी तरह से बनाए नहीं रखा जाता है और इसलिए आंख के पृथक घटकों के अध्ययन के लिए प्रवाह प्रणालियों की आवश्यकता होती है जो चयापचय प्रक्रियाओं को बनाए रख सकते हैं और उनका आकलन कर सकते हैं। फ्लूडिक्स सिस्टम को ऊतक प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला से ओसीआर और एलपीआर डेटा उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया था और इस पेपर में हमने विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए जो इष्टतम परिणाम उत्पन्न करने के लिए पाए गए थे।

प्रवाह प्रणाली का उपयोग करके मजबूत डेटा उत्पन्न करने के लिए प्रमुख निर्धारक में 39 डिग्री सेल्सियस पर सीओ_{2-आधारित} मीडिया / बफर का पूर्व-संतुलन शामिल है (यह सुनिश्चित करने के लिए कि पेरिफ्यूसेट भंग गैस से सुपरसैचुरेटेड नहीं है जो प्रयोग के दौरान विघटित हो जाएगा)। विशेष रूप से, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत मीडिया या केआरबी बफर 37 डिग्री सेल्सियस के सापेक्ष सुपरसैचुरेटेड होगा और प्रयोग के दौरान डेगास होगा यदि पूर्व-संतुलन समय अपर्याप्त है। इसके अलावा, ऊतक कक्षों में लोड किए गए ऊतक को ऊतक के फटने या अपूर्ण पृथक्करण के कारण ऊतक के अनुचित अलगाव से आघात नहीं होना चाहिए, या बहुत लंबे समय तक वायुमंडलीय हवा में बाइकार्बोनेट-आधारित बफर की कम मात्रा में ऊतक को उजागर करके। तापमान नियंत्रण, प्रवाह स्थिरता और ओ₂ डिटेक्शन की विश्वसनीयता में बहुत कम परिवर्तनशीलता है और ये कारक विफलता दर में महत्वपूर्ण योगदान नहीं देते हैं।

उपकरण में आठ प्रवाह चैनल / ऊतक कक्ष हैं जो एक साथ चलते हैं जिन्हें प्रत्येक जलाशय के लिए दो जलाशयों, चार ऊतक कक्षों से पेरिफ्यूसेट के साथ आपूर्ति की जाती है। ओसीआर के सबसे सटीक समय-पाठ्यक्रम प्राप्त करने के लिए, गतिज वक्रों को उन कक्षों द्वारा बेसलाइन सही किया जाता है जो ऊतक से भरे नहीं होते हैं। इस प्रकार, एक विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में तीन ऊतक कक्षों के दो समूह शामिल होंगे। सामान्य रूप से प्रोटोकॉल दो श्रेणियों में आते हैं: एक प्रत्येक तरफ अलग-अलग परीक्षण यौगिक प्रोटोकॉल है (उदाहरण के लिए एमआरएम के एक तरफ दवा / वाहन, और दूसरी तरफ सिर्फ वाहन); दूसरा एमआरएम के दोनों किनारों पर एक ही परीक्षण यौगिक इंजेक्शन प्रोटोकॉल है, लेकिन एमआरएम के प्रत्येक तरफ अलग-अलग ऊतक या ऊतक मॉडल है। इस पेपर में, रेटिना पर ऑलिगोमाइसिन और एफसीसीपी के प्रभावों की तुलना ऊतक द्वारा ओसीआर से की गई थी जो किसी भी परीक्षण यौगिकों के संपर्क में नहीं थे, और ऊतक-विशिष्ट व्यवहार की पहचान करने के लिए एक ही प्रोटोकॉल और शर्तों के तहत दो ऊतकों का सहवर्ती मूल्यांकन किया गया था। उत्तरार्द्ध को इस अध्ययन में एक ही प्रयोग में समानांतर में रेटिना के सापेक्ष आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा द्वारा चयापचय दर की बढ़ी हुई गतिशील सीमा दिखाकर चित्रित किया गया था। अन्य रिपोर्टों ने अध्ययन डिजाइनों की एक विस्तृत श्रृंखला का वर्णन किया है जिसमें ओसीआर और एलपीआर पर ओ₂ स्तरों के प्रभावों को मापना और ईंधन, दवाओं और विषाक्त पदार्थों की एकाग्रता^{निर्भरता 20,21} शामिल है। इसके अलावा, हालांकि हमने बहिर्वाह अंशों के विश्लेषण को लैक्टेट के माप और एलपीआर की गणना तक सीमित कर दिया है, एक प्रयोग की सूचना सामग्री बहुत बढ़ जाती है यदि बहिर्वाह अंशों में कई यौगिकों और यौगिकों के वर्गों को हार्मोन, न्यूरोट्रांसमीटर, सेल सिग्नल और मेटाबोलाइट्स जैसे परख लिया जाता है^{जो कोशिकाओं से} बाहर निकल सकते हैं^।²³.

पृथक रेटिना या आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरा का लोडिंग सीधा है, और एक बार अलग होने के बाद इन ऊतकों को केवल ऊतक कक्षों के शीर्ष पर बल के साथ रखा जाता है और फ्रिट तक डूबने की अनुमति दी जाती है। फिल्टर इंसर्ट पर संवर्धित आरपीई कोशिकाएं संस्कृति में 4-8 सप्ताह के बाद आरपीई परिपक्वता के उपयुक्त ध्रुवीकरण और मार्कर विकसित करती हैं। ट्रांसवेल झिल्ली से जुड़े होने के बाद लाइव सेल विश्लेषण के लिए आरपीई को हटाना संभव नहीं है, अगर आरपीई परिपक्वता और ध्रुवीकरण^{को बनाए रखा} जाना है। पेरिफ्यूजन कक्ष ट्रांसवेल झिल्ली की स्ट्रिप्स को समायोजित कर सकता है जो एक स्केलपेल के साथ कट जाते हैं जबकि बफर में डूबे होते हैं और ऊतक कक्षों में तेजी से डाले जाते हैं। यद्यपि कटिंग फिल्टर स्ट्रिप्स को एक स्थिर प्रणाली²⁴ में रखा गया है, इन महत्वपूर्ण सेल प्रकारों का आकलन करने के लिए कोई अन्य तरल पदार्थ विधि उपलब्ध नहीं है। आरपीई कोशिकाओं की प्रतिक्रियाएं रेटिना या आरपीई-कोरॉइड-स्क्लेरा की तुलना में तेजी से और अधिक गतिशील थीं, संभवतः झिल्ली डालने पर मोनोलेयर के रूप में कॉन्फ़िगर किए गए आरपीई कोशिकाओं के एपिकल और बेसल दोनों पहलुओं की तत्काल पहुंच के कारण।

डेटा को सुनिश्चित करने में एक और कारक शोर के लिए उच्चतम संकेत है, प्रवाह दर के सापेक्ष पेरिफ्यूजन कक्षों में लोड किए गए ऊतक के इष्टतम अनुपात का चयन कर रहा है। प्रवाह दर के सापेक्ष बहुत कम ऊतक के परिणामस्वरूप प्रवाह और बहिर्वाह के बीच घुलित ओ₂ एकाग्रता का अंतर होता है जो बहुत छोटा होता है और मज़बूती से मापना मुश्किल होता है। इसके विपरीत, यदि प्रवाह बहुत धीमा है, तो ओ₂ की एकाग्रता इतनी कम हो जाती है कि ऊतक हाइपोक्सिया से प्रभावित होता है। बहरहाल, गैस दबाव-संचालित तरल प्रवाह को 5 एमएल / मिनट तक प्रवाह दरों पर बनाए रखा जा सकता है, जिसमें सटीक ओसीआर और एलपीआर माप के लिए केवल थोड़ी मात्रा में ऊतक की आवश्यकता होती है। यहां दिखाए गए प्रयोगों में, लगभग 20 एमएल / मिनट / चैनल का उपयोग किया गया था जो या तो एक रेटिना, दो आरपीई-कोरॉयड-स्क्लेरस, या 360,000 आरपीई कोशिकाओं के लिए उपयुक्त था। सिस्टम प्रभावों को कम करने के लिए जो इंजेक्शन परीक्षण यौगिक के लिए ऊतक के जोखिम में देरी और फैलाव करते हैं, ऊतक कक्षों के कई आकारों की आपूर्ति की जाती है, ताकि ऊतक की मात्रा (और प्रवाह दर) कक्ष के उपयुक्त आकार के साथ मेल खाती है।

इस पेपर में दिखाए गए विश्लेषणों के डेटा को दो तरीकों से दर्शाया गया था: दर के संबंध में पूर्ण परिमाण, या स्थिर-राज्य या बेसलाइन के सापेक्ष आंशिक परिवर्तन। परीक्षण यौगिकों के लिए प्रतिक्रियाओं के माप के चित्रण पर ध्यान केंद्रित किया गया था। हालांकि, फ्लुइडिक्स सिस्टम पेरिफ्यूजन विश्लेषण जैसे आनुवंशिक संशोधनों से पहले ऊतक उपचार के प्रभावों का आकलन और तुलना करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। परीक्षण यौगिकों की सामान्यीकृत प्रतिक्रियाओं पर उपचार के प्रभावों का विश्लेषण किया जाता है तो परीक्षण करना कि क्या उपचार नियंत्रण से अलग है, सबसे मजबूत है। यदि विश्लेषण के लिए पूर्ण परिमाण की आवश्यकता होती है, तो पूर्वनिर्धारित नमूनों के विश्लेषण की सांख्यिकीय शक्ति को अधिकतम किया जाता है यदि उनका मूल्यांकन और नियंत्रण एक ही पेरिफ्यूजन प्रयोग में किया जाता है।

हलचल को छोड़कर, तरल के संपर्क में आने वाले सभी भागों को निर्माता द्वारा उपभोग्य सामग्रियों के रूप में आपूर्ति की जाती है और उन्हें निष्फल कर दिया गया है। इन भागों का पुन: उपयोग नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि अपूर्ण सफाई और दूषित सतहों के कारण प्रयोग कभी-कभी खो जाएंगे। सेटअप की शुरुआत में सिस्टम बाँझ है। हालांकि, मीडिया को एमआरएम में जोड़ा जाता है, और ऊतक को गैर-बाँझ परिस्थितियों में कक्षों में लोड किया जाता है। हमने उस प्रणाली में ओसीआर को मापा है जो बाँझ भागों के साथ इकट्ठा होता है, लेकिन जहां प्रयोग स्वयं गैर-बाँझ परिस्थितियों में किया जाता है। बैक्टीरिया को मापने योग्य ओसीआर (अप्रकाशित परिणाम) होने के बिंदु तक जमा होने में लगभग 14 घंटे लगते हैं। यदि प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाता है जो 10 घंटे या उससे कम है, तो बैक्टीरिया का संचय और इनके कारण कोई भी प्रभाव नगण्य होगा।

कई जांचकर्ता उन उपकरणों का उपयोग करते हैं जो अपेक्षाकृत उच्च थ्रूपुट^25,26 के साथ कोशिकाओं के मोनोलेयर के स्थिर इनक्यूबेशन के तहत ओसीआर को मापने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। इसके विपरीत, इस पेपर में हमने जिस फ्लुइडिक्स उपकरण का परीक्षण और वर्णन किया है, वह पर्याप्त ओ₂ डिलीवरी सुनिश्चित करके ऊतक को बनाए रखता है जो ऊतक नमूनों में मौजूद अधिक प्रसार दूरी के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यह ओसीआर के समानांतर कई मापदंडों के मूल्यांकन की अनुमति देने वाले अंशों को इकट्ठा करने में सक्षम है जो उनके बीच संबंधों का अध्ययन करने की क्षमता को बढ़ाता है। अंत में, विघटित गैस सांद्रता (जैसे ओ 2 और सीओ 2) को नियंत्रित किया जा सकता है, जिससे बाइकार्बोनेट-आधारित मीडिया और बफर के साथ प्रयोगों की अवधि बढ़ जाती है, जिससे उपयोगकर्ता ओ₂ के प्रभावों का अध्ययन कर सकता है। यह इंगित किया जाना चाहिए, दोनों पद्धतियों के लिए एक सीमा परीक्षण यौगिकों के वॉशआउट का अध्ययन करने में असमर्थता है, एक कार्यक्षमता जो अन्य पेरिफ्यूजन सिस्टम में ^4,27,28 है। इष्टतम विश्लेषण पद्धति का निर्धारण करते समय एक और विचार यह तथ्य है कि फ्लुइडिक्स सिस्टम स्थिर प्रणालियों की तुलना में अधिक मीडिया और परीक्षण यौगिकों का उपयोग करते हैं। अतिरिक्त खर्च को वर्तमान फ्लुइडिक्स सिस्टम के साथ कम से कम किया जाता है, हालांकि कम प्रवाह दरों के कारण सिस्टम का उपयोग किया जा सकता है।

कुल मिलाकर, एक नए प्रवाह / मूल्यांकन उपकरण के साथ प्रयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण वर्णित है। रेटिना और आरपीई-कोरॉइड-स्क्लेरा के साथ उत्पन्न डेटा ने उन प्रणालियों के साथ प्राप्त पिछले परिणामों को दोहराया जो उपयोग करने में अधिक कठिन हैं (और आसानी से उपलब्ध नहीं हैं)। यह भी प्रदर्शित किया गया था कि सिस्टम ट्रांसवेल झिल्ली से जुड़ी आरपीई कोशिकाओं को बनाए रख सकता है और उनका आकलन कर सकता है, एक बहुत ही महत्वपूर्ण सेलुलर मॉडल जिसे पहले कोशिकाओं की नाजुकता के कारण प्रवाह प्रणालियों के साथ विश्लेषण नहीं किया गया है। प्रोटोकॉल के मुख्य भागों में 75 मिनट का सेटअप समय होता है, इसके बाद 90 मिनट की अवधि और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल होता है जो इसे प्रयोगशालाओं द्वारा नियमित उपयोग के लिए उपयुक्त बनाता है जो फ्लुइडिक्स सिस्टम के संचालन में विशेषज्ञ नहीं हैं। यद्यपि हमने परीक्षण यौगिकों के लिए ऊतक की तीव्र प्रतिक्रिया को मापने पर ध्यान केंद्रित किया, सिस्टम विभिन्न स्रोतों जैसे पशु मॉडल या कोशिकाओं के मॉडल से ऊतक की तुलना करने के लिए बहुत उपयुक्त है जो आनुवंशिक रूप से बदल गए हैं या परीक्षण उपचार / शर्तों से गुजरे हैं। इसके अलावा, बहिर्वाह अंशों पर आयोजित किए जा सकने वाले परख का दायरा व्यापक है और इसमें मेटाबोलाइट्स, सेल सिग्नलिंग अणु और स्रावित हार्मोन / न्यूरोट्रांसमीटर के साथ-साथ अंशों के साथ-साथ ऊतक पर मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा उत्पन्न बहु-घटक विश्लेषण शामिल हैं।

Disclosures

आई.आर.एस., एम.जी., और के.बी. के पास एनटॉक्स साइंसेज, इंक (मर्सर द्वीप, डब्ल्यूए) के साथ वित्तीय संबंध हैं, जो इस अध्ययन में वर्णित बैरोफ्यूज पेरिफ्यूजन सिस्टम के निर्माता / वितरक हैं। अन्य सभी लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (आर01 GM148741 आई.आर.एस.), यू01 EY034591, आर01 EY034364, ब्राइटफोकस फाउंडेशन, रिसर्च टू प्रिवेंशन ब्लाइंडनेस (जे.आर.सी.) और आर01 EY006641, आर01 EY017863 और आर21 EY032597 (जे.बी.एच.) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOLOGICAL SAMPLES
C57BL/6J mice	Envigo Harlan (Indianapolis, IN)	N/A
REAGENTS
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920L9795
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270G
KCN	Sigma-Aldrich	60178
Lactate	MilliporeSigma	L6661
Oliigomycin A	Sigma-Aldrich	75351L9795
CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING
Beuthanasia-D	Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ	N/A
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3059
Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital	Virbac	RXEUTHASOL
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	12303C
Hank’s Buffered Salt Solution	GIBCO	14065056
Krebs Ringer Bicarbonate (KRB)	Thermo Fisher Scientific	J67795L9795
Matrigel	ThermoFisher	#CB-40230
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
ROCKi	Selleck Chemicals	Y-27632
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	#25-200-072
SUPPLIES
Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2	Praxair Distribution, Inc	N/A
Transwell filters	MilliporeSigma	3470
COMMERCIAL ASSAYS
Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit	ThermoFisher	A22189
Glucose Oxidase from Aerococcus viridans	Invitrogen (Carlsbad, CA)	A22189L9795
Lactate Oxidase	Sigma-Aldrich	L9795
EQUIPMENT
BaroFuse Multi-Channel Perifusion system	EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA	Model 001-08
Synergy 4 Fluorometer	BioTek (Winooski, VT)	S4MLFPTA

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References

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Bioengineering

एक नवीन पंपलेस फ्लुइडिक्स सिस्टम का उपयोग करके आंख के विभिन्न ऊतक और सेल प्रकारों को बनाए रखना और उनका आकलन करना

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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